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SYNTHÈSE DE BRASSINOSTÉROIDES ET ÉTUDE DE LEUR EFFET NEUROPROTECTEUR
Benoit Daoust, Martin Boisvert, Maria-Grazia Martinoli et Fanny Longpré
Département de Chimie-Biologie, Université du Québec à Trois-Rivières.
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Plan de la présentation •Maladie de Parkinson•Hypothèse de travail•Brassinostéroïdes (BRs)•Synthèse•Résultats in vitro neuroprotection
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Maladie de Parkinson •25 000 personnes atteintes au Québec
(130 000 au Canada)•Mort des neurones dopaminergiques
(produisant la dopamine, un neurotransmetteur) dans la substantia nigra
W. Dauer, S. Przedborski, Neuron, 2003, 39, 889.
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Maladie de Parkinson •Aucun traitement curatif disponible
–Seulement traitement des symptômes (L-DOPA) mais après quelques années de traitement → dyskinésie
•De + en + indices semblent démontrer que le stress oxydant jouerait un rôle dans la mort des cellules nerveuses
NH2
HO
HO
Dopamine
Dopa DécarboxylaseHO
HO NH2
COOH
L-dopa
L.M. Sayre et al., Curr. Med. Chem., 2001 , 8, 721.H. Ehsan et al ,Plant J., 2005, 43(2), 251.
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BRs et effet neuroprotecteur ??
• BRs et neuroprotection = nil • Étude sur la gourgane (H. Apaydin, S. Eratn, S. Ozekmekci, Movement Disorders, 15 (1), 2000)
On fait manger de la gourgane (250g, 2 X / jour) à des patients atteints du Parkinson, car gourgane riche en L-dopa. Mais la [L-dopa] n’explique pas l’effet ultrabénéfique chez les patients.• BRs présents dans la gourgane !
Gourgane
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Effet neuroprotecteur ??M. Nunez, P. Mazzafera, L.M. Mazorra, W.J. Siquiera, M.A.T. Zullo, Biologia Plantarum 47(1), 67-70 (2003/4) ; L.M. Mazorra, M. Nunez, M. Hechavarria, F.Coll, M.J. Sanchez-Blanco, Biologia Plantarum 45(4), 593-6(2002).
Étude de l’effet de BRs sur les enzymes antioxydantes de riz et de tomates.
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Effet neuroprotecteur ??Hypothèse de travail :
• Comme les BRs sont connus pour activer les enzymes anti-oxydantes de certaines plantes,• Que l’effet neuroprotecteur chez la gourgane (contient BRs) n’est pas seulement dû à la L-DOPA
Il est possible que les BRs aient un effet neuroprotecteur sur le système nerveux.
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Brassinostéroïdes
• phytostérols• dans les plantes• comestibles du Qc (betterave, carotte, maïs, radis, …)
OH
HO
HO
OH
OH
28-homocastatérone
22 23
28
• Découverts en 1979 (brassinolide) ; extrait de Brassica napus L. (colza) (4 mg à partir de 40 kg de pollen)• phytohormones (croissance)• si on traite les plantes avec BRs, leur développement augmente• [BRs] dans les plantes : 10-6 à 10-11 %.• BRs non toxique sur les mammifères (>5g/kg pour voir un effet sur souris ; Kutzmtiskii et al. , Technical Report, 1991, Institute of Bioorganic Chem., Minsk (Belarus))
Colza
A. Bajguz & A. Tretyn ,Phytochem., 2003, 62(7) ,1027.
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Brassinostéroïdes
OH
HO
HO
OH
OH
28-homocastatérone
22 23
28
2
3
24
HO cholestérol
O
HO
HO
O
O
R1R2
R1 = OH, R2 = HR1 = H, R2 = OH
O
O
O
O
OH
OH
R1
R1 = H, Me, EtR2 = H, Me
OH
OH
OH
OH
R1
R1 = H, Me
R2
R2 = H, Me
R2
70 BRs caractérisés et isolés
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Brassinostéroïdes
• synthèse totale ; non• produit de départ : stigmastérol
OH
HO
HO
OH
OH
28-homocastatérone
22 23
28
H
H
H
H
13C* (11 contigus)
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Synthèses
1HO
Stigmastérol(10g = 277$)
MsCl , Et3N . Toluène0°C, 1h , atm de N2
2MsO
3 OH
KHCO3
Acétone/Eau 3:1reflux 4h
4 O
Jones 8N-CrO3
Acétone0°C, 10 min
T.C.,McMorris et al, J. Chem. Soc.Perkin Trans. 1, 1996, 295 ; K. Mori et al.,Agric. Biol. Chem.,1987, 51(7),1909.
97%
77%
72%
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Synthèses
O4
O
5
O
HO
HO
OH
HO
+
O
HO
HO
OH
HO
6a 6b
py-HClLiBrDMAReflux 4,5h
OsO4, K3Fe(CN)6, K2CO3,
Hydroquinidine 4-chlorobenzoate MeSO2NH2, 36j
Rdt = 41%
K.B. Sharpless et al, J. Am.Chem.Soc.,1988,1968.
68%
N
Et
N
OCH3
O
O
Cl
~ 1:1
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Synthèses
O2
O
3
O
HO
HO 7py-HClLiBrDMAReflux 4,5h
OsO4
NMOAcétone/Eau 9:112h, tp 92:8 en faveur
du produit désiré
60%68%
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Synthèses
O2 8
OAcOi) AcOH ,
H2SO4, H2O, reflux , 1h30
ii) DMAP, Ac2O, Pyridine, tp, 3h,
KOH 5% dans MeOH, Tp, 1h30
Dihydroxylation(OsO4)
3-acétyl-28-Homotéastérone
OHO 10
O
AcO 9
OH
OH
70%89%
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Synthèses
p-NO2C6H4COOH, DEAD, P(Ph)3, THF, 0°C 15 min puis → tp 10h
NaOH, MeOH,tp , 1h , Dihydroxylation
(OsO4)
28-Épihomotéastérone
65%(2 étapes)
OHO10
O11
OO Ar
OHO12
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Synthèses
H2 , 1 atm, Pd/C 10%, EtOAc, 24 h
95%
OHOO
10
13HO
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BRs commerciaux
22S, 23S-28-Homobrassinolidenaturel
(pureté 96%!)non naturel
(pureté >99%)
O
HO
HO
OH
OH
O
O
HO
HO
OH
OH
O
24-épibrassinolide
24 2223
28
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Neuroprotection• Notre modèle in vitro : cellules PC12 différenciées en neurones dopaminergiques avec NGF
Cellules PC12 non-différenciées Cellules PC12 différenciées(après traitement au NGF)
L.A.Greene, A.S. Tischler, PNAS, 1976, 73(7), 2424.
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Neuroprotection• Notre modèle in vitro : cellules PC12 différenciées en neurones dopaminergiques avec NGF• La neurodégénérescence cellulaire du Parkinson reproduite avec MPP+
NMe
MPP+1-Méthyl-4-PhénylPyridinium
W. Dauer, S. Przedborski, Neuron, 2003, 39, 889.
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Neuroprotection
Dosage de la LDH par colorimétrie
• Cellules traitées avec MPP+ et nos molécules préparées• Mortalité cellulaire évaluée par dosage de la LDH libérée par les cellules abîmées
C. Korzeniewski, D.M. Callewaert, J. Immunological Methods, 1983, 64, 313.
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Neuroprotection
0
10
20
30
Ctrl Épi 10-9 M MPP+ Épi 10-9 MMPP+
Cy
toto
xic
ity
(%
ctr
l) ***
ooo
HO
HO
O
O
OH
OH
HO
HO
O
O
OH
OH
0
10
20
30
40
Ctrl Ho 10-7 M Ho 10-9 M
Cy
toto
xic
ity
(%
ctr
l)
Control
MPP+ 5 mM
*** ******
ANOVA, Student-Newman-Keuls ***p<0,001 vs Ctrl; ooop<0,001 vs MPP+ (n=3).
Épibrassinolide
22S, 23S-Homobrassinolide
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Neuroprotection
0
10
20
30
40
Ctrl 60B 10-7 M 60B 10-9 M
Cy
toto
xic
ity
(%
ctr
l) Control
MPP+ 5 mM***
ooo* ooo
O
HO
HO
OH
HO
0
10
20
30
40
Ctrl 57B 10-7 M 57B 10-9 M
Cy
toto
xic
ity
(%
ctr
l) Control
MPP+ 5 mM***
oooooo
O
HO
HO
homocastastérone
MB 57B
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Neuroprotection
0
10
20
30
40
140 10-7 M 140 10-9 M
Cy
toto
xic
ity
(%
ctr
l)
Control
MPP+ 5 mM
Ctrl MPP+
***
oooo
O
HO
22,23-Dédihydroxy-28-homotéastérones
0
10
20
30
40
145 10-7 M 145 10-9 M
Cy
toto
xic
ity
(%
ctr
l)
Control
MPP+ 5 mM
Ctrl MPP+
***
oooooo
O
HO
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Neuroprotection
O
HO
0
10
20
30
40
158 10-7 M 158 10-9 M
Cy
toto
xic
ity
(%
ctr
l)
Control
MPP+ 5 mM***
*
ooo
Ctrl MPP+MB 158 ( C=C absent)
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Conclusion
• Synthèse de 5 BRs ou précurseurs
•Molécules préparées (en particulier homocastatérone) → effet neuroprotecteur
• Les groupements OH en 22 et 23 ne contribue à l’activité neuroprotecteur que lorsque qu’ils sont en .
• Stéréochimie du 3-OH des précurseurs de la 28-homotéastérone n’influence pas l’effet de neuroprotection de manière significative
• Le précurseur sans C=C en 22-23 ne présente pas l’effet de protection recherché à faible concentration (10-9M).
• Une alimentation riche en betteraves, carottes, … pourrait aider à prévenir le Parkinson dû à la présence de BRs ? On ne peut pas le dire encore !
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Travaux futurs
• Poursuivre l’étude RSA (et aussi dihydroxylation !)
• Autres tests bioEffet antioxydant des BRs : SOD, catalase, glutathion
peroxidase, dihydrorhodamineEffet anti-apoptotique des BRs : Tunel, Caspase 3, Bax/Bcl2, fragmentation ADN (elisa)
• Métabolisme des BRs
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Travaux futurs
• BRs de structure “ergostane”
OMe
CHO
OMe
1. O3
2. DMS BRs
• Nouvelle méthodologie
ergostane
Z. Li et al., Tet. Lett., 2003, 44, 3991.T.G. Back et al., Can. J. Chem., 1993, 71, 156.B.H. Hazra et al., Tetrahedron, 1994, 50(8), 2523.
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Travaux futurs
• BRs de structure “ergostane” • Nouvelle méthodologie
CHO
CHO
OAc Acide de Lewisbidentate
OAc
OH
1.
S
S
Li
2. Ac2O, pyridine
3. NBS, BaCO3
M
M = SnBu3, SiMe3
2324
ou sans AL, borolane de Roush
Notre hypothèse de travail
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Remerciements
Martin BoisvertFanny Longpré
Maria-Grazia MartinoliJulie Carange
Jennyfer MerckléPauline Dubromez
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Questions ?
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H CH3
OMn+
O
H
R
Ac
H3C
M
H CH3
OMO
H
R
Ac
H3C
R
OAc
OH
Sélection Mallyl (état de transition non-cyclique)
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BOOAcR
H
H
O
O
CO2iPr
CO2iPr
Zimmerman-Traxler favorisé
Anti-Felkin
BOOAcR
H
H
O
O
CO2iPr
CO2iPr
HR
OAc
OH
B OR OAc
H
H
O
O
Zimmerman-Traxler défavorisé
Felkin (pas de syn-pentane)
E
E
(défavorisé)
(favorisé)
R
OAc
OH
Sélection Mallyl (état de transition cyclique)
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Brassinostéroïdes
OH
HO
HO
OH
OH
28-homocastatérone
22 23
28
2
3
24
Squelettes des brassinostéroïdes
cholestane
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Brassinostéroïdes
OH
HO
HO
OH
OH
28-homocastatérone
22 23
28
2
3
24
Squelettes des brassinostéroïdes
ergostane
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Brassinostéroïdes
OH
HO
HO
OH
OH
28-homocastatérone
22 23
28
2
3
24
Squelettes des brassinostéroïdes
stigmastane
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Brassinostéroïdes
H
R1 R2
HO
H
HO
Produits de départs ?
H
HO
OStigmastérol (R1=Et, R2=H) (10g = 277$)Crinostérol (R1=Me, R2=H) (pas commercial)Brassicastérol (R1=H, R2=Me) (5mg = 377$)
Ergostérol (10g = 112$)
Pregnénolone (25g = 120$)
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Synthèses
Signal « large » car JHax-Hax ↑ (~ 180°)
Signal « étroit » car les J ↓ (≠ 0 ou 180°)
OHO
OHO
HO
H
H
H
H
H
H
OH
H
H
H
H
A
A
cycle A
cycle A
4
ppm
6,7 Hz de largeur
4 3ppm
22,9 Hz de largeur
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Parkinson • traitement au MPP+
NMe
MPTP1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,4-TétrahydroPyridine
NMe
MPP+1-Méthyl-4-PhénylPyridinium
Passe la barrière hématoencéphalique
NMe
MPDP+MAO-B
spontanée
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Parkinson • Les cellules gliales transforment le MPTP en MPP+• MPP+ entre dans les neurones dopaminergiques par le DAT• Une fois dans le neurone, MPP+ (via différents mécanismes) augmente la production de ROS (reactive oxygen species) et diminue la synthèse de l’ATP, donc perte de neurones dopaminergiques
NMe
MPTP1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,4-TétrahydroPyridine
NMe
MPP+1-Méthyl-4-PhénylPyridinium
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Parkinson
Dauer et Al, Neuron, 2003, 39 ,1027-1046
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Synthèses
OHO N
HOHN HO
7
11
12
Ts
pTsNHNH2, PTSAMeOH/CHCl3Reflux, 4h30 (67%)
NaBH4, EtOHReflux, 8h (62%)
Dihydroxylation ?
Pas encore testé
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NeuroprotectionEffet du stigmastérol sur la toxicité du MPP+
dans les cellules PC12 neuronales.
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
Ctrl Stigma 10-7 M Stigma 10-9 M
Cy
toto
xic
ity
(%
ctr
l)
Control
MPP+ 5 mM***
ooo ooo
ANOVA, Student-Newman-Keuls ***p<0,001 vs Ctrl; ooop<0,001 vs MPP+ (n=2)
HO
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Dihydroxylation
Hydroquinidine 4-chlorobenzoate
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Dihydroxylation
![Page 45: SYNTHÈSE DE BRASSINOSTÉROIDES ET ÉTUDE DE LEUR EFFET NEUROPROTECTEUR Benoit Daoust, Martin Boisvert, Maria-Grazia Martinoli et Fanny Longpré D é partement](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062622/551d9db8497959293b8dc6ae/html5/thumbnails/45.jpg)
Dihydroxylation
Conditions Rendement Particularités%
OsO4,NMO, THF 0 pas de réaction après 30 jours
OsO4,NMO, Acétone/Eau 9 :1, t= 50-60°C 0 pas de produit désiré après 48h, dégradation
OsO4, DHDQ, K3Fe(CN)6, K2CO3, CH3SO2NH2 41% 36 jours de réaction, contamination sévère, difficile à purifier
AD Mix 0 pas de réaction après 30 joursI2 , AcOAg, AcOH , H2O 0 pas de réaction après 24 h
I2 , AcOAg, AcOH , H2O, Reflux 0 pas de produit désiré après 24h, dégradation
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Activité antioxydante des BRs
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Activité antioxydante des BRs
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Activité antioxydante des BRs
![Page 49: SYNTHÈSE DE BRASSINOSTÉROIDES ET ÉTUDE DE LEUR EFFET NEUROPROTECTEUR Benoit Daoust, Martin Boisvert, Maria-Grazia Martinoli et Fanny Longpré D é partement](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062622/551d9db8497959293b8dc6ae/html5/thumbnails/49.jpg)
Brassica vegetables
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Test LDH
Réactif
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Mitsunobu
Ph
P
Ph
PhN
N
O
EtO
O
OEt
DEAD
N
N
O
EtO
O
OEt
PPh
PhPh
N
N
O
EtO
O
OEt
PPh
Ph
+ N
HN
O
EtO
O
OEt
PPh
PhPh
N
HN
O
EtO
O
OEt
PPh
PhPh
HO
+
N
HN
O
EtO
O
OEt
PPh
PhO
Ph
H
Formation d'un lien O=P!
HOOC
NO2
DEAD, p-NO2ArCOOH, PPh3
THF (anh)
O
HO
O
HO
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Mitsunobu
+
PPh
Ph
Ph
ON
HN
O
EtO
O
OEt
Excellent groupe partantPasse par une SN2 d'òu l'inversion
Une des sources du produit secondaire
pO2NAr
O
O
PPh
Ph
Ph
OpO2NArCO2
![Page 53: SYNTHÈSE DE BRASSINOSTÉROIDES ET ÉTUDE DE LEUR EFFET NEUROPROTECTEUR Benoit Daoust, Martin Boisvert, Maria-Grazia Martinoli et Fanny Longpré D é partement](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062622/551d9db8497959293b8dc6ae/html5/thumbnails/53.jpg)
OsmylationR1
R2
OsO4 L
HO
HO
R1
R2
Os
O
O
OH
OH
-LOs
O
O
O O
L
[O]O
OsO
R1
R2O
OL
![Page 54: SYNTHÈSE DE BRASSINOSTÉROIDES ET ÉTUDE DE LEUR EFFET NEUROPROTECTEUR Benoit Daoust, Martin Boisvert, Maria-Grazia Martinoli et Fanny Longpré D é partement](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062622/551d9db8497959293b8dc6ae/html5/thumbnails/54.jpg)
Osmylation
O
OsO
R1
R2O
OL
OsO4 + R1CH=CHR2 + L
[3+2]
[2+2]
O
Os
O
R1
R2
O
O
Os
O
L
O
OL
O
R1
R2