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Techniken der
Nukleinsäure- und
Protein-Biochemie
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Techniken der Nukleinsäure-Biochemie
Klonierung in einen
Expressions- Vektor
Bestimmung der DNA- Sequenz
Transformation von E.coli oder andere
Zellen
Präparation von synthetischen
Peptiden
Herstellung von spezifischen Antikörpern
Gen oder cDNA
Protein
PCR
PCR
Restriktion, Analyse Ligation Expression
(Primer-) Synthese
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Klonierung von DNA
1.) Rekombinante DNA Techniken beruhen auf der Fähigkeit große Mengen an identischen DNA Molekülen (Klone) herzustellen.
2) Durch Einbau von DNA Stücken in Vektoren, die in eine Wirtszelle eingeführt werden, können Klone erzeugt werden.
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3) Durch die Replikation des Vektors wird auch das DNA-Stück von Interesse vervielfältigt.
4) Die am häufigsten verwendeten Vektoren sind E.coli Plasmid Vektoren und λ Bakteriophagen Vektoren.
Eine Gen für eine Antibiotika-Resistenz erlaubt einfache Selektion der transformierten Zellen Ampicillin-Resistenz
“Selektionsmarker”
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Was benötigt man für eine Klonierung ?
• Vektor • Gen
• Enzyme
• Vorarbeiten: – Vektorpräparation – Gen (Insert)
mittels: PCR Verdau Synthese
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Klonierung von DNA mit Plasmid Vektoren
Transformation
DNA-Präparation
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Mit Hilfe der PCR kann eine bestimmte DNA Sequenz (z.B. Gen) durch Vervielfältigung aus einer großen Ansammlung von vielen unterschiedlichen DNA Sequenzen isoliert werden.
Allerdings muss zumindest eine kurzes Stück der DNA Sequenz am Anfang und am Ende des gewünschten Gens bekannt sein.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
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Zu vervielfältigendes Gen DNA DNA
GGATCC BamHI
Primer 1
XbaI TCTAGA
Primer 2
DNA-Polymerase
DNA-Polymerase
PCR
• Entwickelt 1985 von Kary Mullis (1993 Nobelpreis) • In vitro Vervielfältigung von DNA (= Amplifizierung)
– DNA-Vorlage (= Matrize; Template) – komplementäre Strangsynthese durch DNA-Polymerasen – Startpunkt: kurze, komplementäre, einzelsträngige DNA-
Abschnitte (= Primer, können Schnittstellen einführen)
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Komponenten im PCR-Ansatz
• Matrize/Template (DNA oder RNA → cDNA)
• DNA-Polymerase • Primer (synthetische Oligonukleotide) • dNTPs (als Bausteine) • geeigneter Puffer • Mg2+ (für die Polymerase)
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1. Erste Denaturierung: 5 min/94°C 2.
a) Denaturierung 30 sec/94°C b) Annealing 30 sec/ x °C c) Elongation x sec/72°C
3. Finale Elongation 10 min/72°C 4. Abkühlung 4°C
Die PCR ist ein zyklischer Prozess
20-35x Pol-abhängig
Primer-abhängig Gen-abhängig Pol-abhängig
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PCR (polymerase chain reaction)
2 Primer -forward -reverse
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PCR (polymerase chain reaction)
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PCR (polymerase chain reaction)
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DNA-(Primer-)Synthese
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Chemische DNA Synthese
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Chemische DNA Synthese
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Chemische DNA Synthese
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Chemische DNA Synthese
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Chemische DNA Synthese
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Analyse von DNA
-Fragmenten und
-Sequenzen
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Kontrolle der PCR durch Gelektrophorese , Trennung von DNA Fragmenten
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Visualisierung der DNA-Fragmente erfolgt durch Ethidiumbromid oder
radioaktive Markierung
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PCR erfolgreich!
-> Zusammenfügen von Vektor und Gen?
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Die Einhaltung der Sequenz und damit verbunden die Triplettabfolge muss
gewährleistet sein
GST
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Restriktionsendonucleasen schneiden dsDNA an spezifischen Sequenzen
Schnittstelle
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Restriktionsenzyme: DNA-Fragmente
1. Glatte/stumpfe Enden (blunt end) 2. 3´-überhängende Enden (sticky ends, cohesiv) 3. 5´-überhängende Enden (sticky ends)
1.
2.
3.
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Restriktionsenzyme aus verschiedenen Bakterien
schneiden unterschiedliche DNA-Sequenzen.
Diese Sequenzen sind meistens Palindrome.
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Methylierte Basen an der Schnittstelle schützen die DNA vor dem Restriktionsenzym
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Figure 7-7
Restriktionsfragmente mit komplementären ‘sticky ends’ können leicht verknüpft werden
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DNA-Ligase
• Knüpft Phosphodiesterbindungen – Schließt Strangbrüche in DNA – Replikation, Rekombination – Freie 5´-Phosphat-Gruppe + 3´-OH-Gruppe – ATP/NAD+-Verbrauch (1 – 5 mM ATP)
• Molekularbiologie – Verknüpfung von DNA-Fragmenten – T4 DNA-Ligase
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31
5´-3´-Phosphodiesterbindung
Stryer: Biochemie
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Schnittstellenproblematik
• Schnittstellen kommen mit einer gewissen Häufigkeit in jedem Genom vor
• Was wenn die Schnittstellen nicht passen oder im Genom vorhanden sind?
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Modifizierte Vektoren enthalten Polylinker, die
eine Klonierungen mit unterschiedlichen
Restriktionsenzymen ermöglichen.
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DNA Analyse
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Figure 7-24
Durch Mehrfach-Restriktionsanalyse können DNA Fragmente identifziert werden
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DNA-Sequenzierung mit der Dideoxy- Methode
(oder Sanger- oder Kettenabbruch-Methode)
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Es werden 4 getrennte DNA- Polymerase Reaktionen durchgefuehrt (jeweils mit einem der 4 Dideoxy-NTPs)
Die Sanger Methode
1 Primer -forward ODER -reverse
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Die Sanger Methode (II)
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Fluoreszenzfarbstoff-markierte Nucleotide werden für moderne DNA-Sequenziergeräte verwendet
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in vitro Mutagenese
• Deletionen N- oder C-terminale Verkürzung Entfernen von Domänen – PCR
• Substitutionen – Gerichtete Mutagenese
• Insertionen – Cassetten Mutagenese
• Designer Gene
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Deletionen
• Primerdesign auf DNA-Ebene und PCR des gewünschten Bereichs.
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Gerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis)
mit Hilfe der PCR
CAC -> GTC => Punktmutation Histidin -> Valin
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Site-directed mutagenesis (Quikchange) (Stratagene)
Bild: Caitlin Smith, Nature Methods, 2007 Schema nach Stratagene
Einführung einer Mutation in einem Plasmid mittels PCR
1. Mutagenese • Zwei komplementäre Primer mit der Mutation annealen am Template
• mittels PCR wird das gesamte restliche Plasmid hergestellt
2. Abbau des Templates • DpnI schneidet methylierte Sequenzen, (nur im Template)
3. Transformation • Bakterien werden mit dem mutierten Plasmid transformiert
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Cassetten Mutagenese
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Gezielter Genaustausch Transfervektor
Genom
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Transgene Tiere
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Spezielle PCR: Reverse Transkription Erzeugung von cDNA (= complementary DNA) aus mRNA
Translation
Protein
splicen
Transkription
Exon Exon Exon Intron Intron Intron Exon DNA
frühe mRNA
späte mRNA
Herstellung einer frühen mRNA, die noch Introns enthält
Herausschneiden der Introns
• Bei Eukaryoten sind Gene durch Introns unterbrochen • In vivo werden die Introns aus der RNA herausgeschnitten
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Reverse Transkription (RT) cDNA-Erststrangsynthese
AAAAAA 5´ 3´
Oligo-T- Primer
RNA
RNA DNA
Reverse Transkription 1 h/37°C
RNA-Degradation (RNaseH)
cDNA
cDNA: complementary/copy DNA
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DNA wird durch ‘Southern blotting’ spezifisch nachgewiesen
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mRNAs werden durch ‘Northern blotting’ spezifisch nachgewiesen
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Techniken der Protein-Biochemie
Klonierung in einen
Expressions- Vektor
Bestimmung der DNA- Sequenz
Transformation von E.coli oder andere
Zellen
Präparation von synthetischen
Peptiden
Herstellung von spezifischen Antikörpern
Gen oder cDNA
Protein
Protein
Bestimmung der Amino-
säuresequenz
Synthetische Oligonukleotide
als Sonden
Analyse einer cDNA Bank mit
Southern blotting
Herstellung spezifischer Antikörper
Expression einer DNA Library und Analyse
durch Western blotting Gen oder
cDNA
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Primärstruktur
N-Terminus Amino-Terminus
C-Terminus Carboxy-Terminus
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1. Sequenzierung
und
2. Chemische Synthese
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Edman Abbau
PITC Phenyl-isothiocyanate
DABITC 4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]phenylisothiocyanate
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Edman Abbau, 1. Schritt: Kopplung
1. Kopplung: In diesem ersten Schritt wird an die freie N-terminale Aminogruppe der Peptidkette das „EDMAN-Reagenz“ Phenylisothiocyanat (PITC) gekoppelt. Dabei entsteht in annähernd quantitativer Ausbeute ein Phenylthiocarbamylpeptid (PTC-Peptid).
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Edman Abbau, 2. Schritt: saure Spaltung
2. saure Spaltung: Durch den säurekatalysierten nucleophilen Angriff des Schwefels an der ersten Peptidbindung kommt es zur Abspaltung der N-terminalen Aminosäure als Anilinthiazolinon-Aminosäure (ATZ-Aminosäure).
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Edman Abbau, 3. Schritt: Konvertierung
3. Konvertierung, saure Hydrolyse: Die instabile ATZ-Aminosäure wird mit wäßriger Säure linearisiert und bei erhöhter Temperatur zur relativ stabilen Phenylthiohydantoin-Aminosäure (PTH-Aminosäure) umgelagert. Die PTH-Aminosäuren werden chromatographisch (HPLC) anhand der Retentionszeiten oder der Rf Werte bei Dünnschichtchromatografie, eines Referenzlaufes identifiziert.
wässrige F3CCOOH
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Dünnschichtchromatographie TLC = Thin Layer Chromatography
Rf-Wert= Strecke: Start-Protein Strecke: Start-Laufmittelfront
a b
c
Auftragung nach Lauf
1
2
a Rf1= -------- c
Laufmittel:
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Dünnschichtchromatographie TLC = Thin Layer Chromatography
1 2 1 2
Laufmittel 1 Pyridine/H2O
Laufmittel 2 Butanol/Formic acid/H2O
1. Laufrichtung 2. Laufrichtung
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Herstellung von Peptiden und Proteinen
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Synthetische Peptide werden auch durch eine Festphasen-Methode hergestellt
(Bruce Merrifield)
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Kopplung der C-terminalen Aminosäure an das Säulenmaterial
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Abspaltung der Schutzgruppe am Aminoende
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Kopplung mit der nächsten Aminosäure
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Ablösen des fertigen Peptids
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Ausbeute der Kopplung in Abhängigkeit der Zyklen
Anzahl der As im Peptid
Ausbeuten an Peptid, wenn die Effizienz pro Zyklus folgende ist
Limitierung in der Länge der Peptide !
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Herstellung rekombinanter Proteine
Überexpression eines Gens oder cDNA möglich in
- E. coli - S. cerevisiae - Insektenzellen (Bacculovirus-System)
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69
Expressionsvektoren
-Dienen der Expression des Zielproteins
-oft ein TAG an N oder C-Terminus
-oft eine Protease Schnittstelle vor der MCS
-unterschiedliche Promotoren
-Organismus spezifisch (Säuger, Hefe, Insekten, Bakterien)
GE-Healthcare, Freiburg
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Induktion mit IPTG
Isopropylthio-ß-D-galactopyranosid
Keine Verstoffwechselung durch die Zelle möglich!
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Der lac Operator
Bindung des IPTG ändert Konformation und verhindert so DNA-Bindung
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Herstellung rekombinanter Proteine
• direkte Methode • zelleigene RNA-Polymerase
wird verwendet. Zielgen ist in das Lac-Operon integriert, Expression erst druch Freilegung des Promotors möglich
• indirekte Methode • Induktion der Expression der
T7-Polymerase. Zielgen unter Kontrolle des T7 Promotors
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Variablen der Expression
• Zellstamm • Medium • Vektortyp
• Temperatur • Dichte • Expressionsdauer
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Weitere Induktoren
• Tryptophan • Arabinose
• Temperatur – Hitze – Kälte
Expressionskontrolle Auftragung vor und nach Induktion
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Übersicht ‘Tags’
• Poly-Histidin (His)-tag • Myc-tag • T7-tag • Strep-Tag • Glutathione-S-Transferase (GST)-tag • Maltose-bindendes Protein (MBP)-tag • SumoTag • Calmodulin-bindendes Protein (CBP)-tag
• Vorteil: hochspezifische Bindung an Säulenmaterial
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Glutathion-S-Transferase
12GS
GE-Healthcare
Elutionsmittel
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Eigenschaften der Tags
• N- oder C-terminal • Länge des Tags • Protease Schnittstelle erwünscht
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Protease cleavage sites
Protease recognition sequence source
Factor Xa Ile Glu/Asp Gly Arg | different distributors
Enterokinase Asp Asp Asp Asp Lys | New England Biolabs
Thrombin Leu Val Pro Arg | Gly Ser different distributors
TEV protease Glu Asn Leu Tyr Phe Gln | Gly Life Technologies
PreScission Leu Glu Val Leu Phe Gln | Gly Pro GE Healthcare
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Protease Verdau
PreScission- protease Faktor Xa
79
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Industrielle Produktion rekombinanter Proteine
Protein Beispiel /Anwendung Insulin Diabetes Gerinnungsfaktoren Faktor VIII (Hämophilie) Intereferone Virusinfektionen, Krebs Interleukine HIV, Krebs, Immunschwäche Monoklonale Antikörper Diagnostik Erythropoietin Anämie (Erythozytenprodukt.) Impfstoffe Virushüllproteine Wachstumshormon Kleinwuchs