BIOQUÍMICA-1º de Medicina Dpto. Biología Molecular
Jesús Navas
Tema 6. ENZIMAS. Clasificación. Principios de la catálisis enzimática. Energía de activación. Velocidad de reacción y equilibrio de reacción. Cinética enzimática: ecuación de Michaelis-Menten. Ecuación de los dobles recíprocos. Inhibición enzimática. Tipos de inhibición. Mecanismos de regulación de la actividad enzimática: alosterismo, modificación covalente, proenzimas.Isoenzimas
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ENZIMAS
• Catalizadores de las reacciones biológicas.• La mayoría son proteínas aunque hay moléculas de RNA
con actividad catalítica (ribozimas)• Gran poder catalítico• Alto grado de especificidad• Actúan en soluciones acuosas a 37ºC y pH neutro• Su actividad puede regularse• El 25% de los genes humanos codifican enzimas que
catalizan reacciones metabólicas.
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( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
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IMPORTANCIA DE LOS ENZIMAS
• Cada paso de una vía metabólica está catalizado por un enzima.
• La medida de la actividad enzimática en fluidos biológicos o tejidos es importante para el diagnóstico de muchas enfermedades.
• Muchas fármacos son inhibidores de la actividad enzimática
• Importancia en la industria de alimentación y agricultura.
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ENZIMAS: RESEÑA HISTORICA
• Primera descripción (finales del siglo XVIII)
• 1850. Estudios de Pasteur
• 1897. Buchner
• 1926. Summer cristaliza la ureasa
• Segunda mitad del siglo XX: se purifican y caracterizan millares de enzimas, lo que ha permitido conocer su mecanismo de acción.
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Enzimas. Definiciones:
- Cofactor: necesario para la actividad enzimática. Pueden ser iones metálicos o una molécula orgánica, denominada coenzima. Si el cofactor está unido fuertemente al enzima se denomina grupo prostético.
- Apoenzima: parte proteica del enzima (no activa)
- Holoenzima: apoenzima + cofactor
Nomenclatura de los enzimas:
SUSTRATO + TIPO DE REACCION + ASA
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( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)33
Un tercio de los enzimas requieren algún ión metálico para catalizar
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Muchas vitaminas son cofactores o precursores de cofactores de enzimas
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
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CLASES DE ENZIMAS
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Los enzimas aceleran las reacciones disminuyendo la energía de activación
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
E + S = ES = E + P
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Los enzimas son estereoespecíficas porque forman varias interacciones entre aminoácidos del centro
activo y los distintos grupos del sustrato
(“Bioquímica”, Mathews and van HoldeMcGraw-Hill, 1998)
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El centro activo de los enzimas es complementario al estado de transición de la reacción catalizada
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Progreso de la reacción
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Cambio conformacional inducido por glucosa en la hexoquinasa(Hexoquinasa = ATP:glucosa fosfotransferasa = 2.7.1.1 )
D-Glucosa
Encajeinducido
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
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TEMA 6 17
La Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato
1/2 Vmax
Km
Vel
oci
dad
inic
ial
Concentración de sustrato [S]("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)
Vmax (S) =VoKm + (S)
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Relación entre Vo y [E]
Vo
[E]
La velocidad inicial es función lineal de la concentración de enzima siempre que la concentración de sustrato sea alta
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Ecuación de Michaelis-Menten
Vmax (S)
Km + (S)Vo =
E + S ES P
K1
K-1
K2
K2 + K-1Km =
K1
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La Vmax se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato
1/2 Vmax
Km
Vel
oci
dad
inic
ial
Concentración de sustrato [S]
("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)
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Calculo de Km y Vmax por la representación de Lineweaver-Burk
("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)
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Parámetros enzimáticos
1. Km (constante para cada enzima) = concentración de S a la que la Vo es 1/2 Vmax. Es una medida de la afinidad del enzima por S. Cuanto menor es Km, mayor es la afinidad del enzima por S
2. Kcat (constante para cada enzima) = número de recambio = número de moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima y unidad de tiempo, en condiciones de saturación de sustrato.
3. Vmax = velocidad máxima teórica = la velocidad cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato (nunca alcanzada en la realidad)
4. Unidad de enzima = cantidad de enzima que transforma 1 µmol de sustrato por min = una forma común de expresar la velocidad
5. Actividad específica = unidades por mg de proteína total de la preparación enzimática. En el caso de enzimas en suero: unidades/L
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Inhibición competitiva
+ Inhibidor
Unión del Inhibidor al centro activo, compitiendo con S• Aumenta Km• No cambia Vmax
(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Inhibidor competitivoSustrato
TEMA 6 25
Inhibición no competitiva
+ Inhibidor Unión del Inhibidor a un sitio del enzima distinto del centro activo: no compite con S• No cambia Km• Disminuye Vmax
(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Sustrato
Inhibidor no competitivo
Sustrato
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+ Inhibidor
Inhibición acompetitiva
Unión del Inhibidor a enzima-S, estabilizando el complejo enzima-S pero impidiendo la formación de producto:• Disminuye Km• Disminuye Vmax
(Adaptado de: ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Inhibidor acompetitivoSustrato
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Inhibidor acompetitivoSustrato
Inhibidor competitivo
Inhibidor no competitivo
Sustrato
Sustrato
("Biochemistry" 5th ed. Berg, Tymoczko and Stryer. Freeman and Co. 2002)
TEMA 6 28
INHIBICION COMPETITIVA INHIBICION NO COMPETITIVA
TEMA 6 29
Efecto del pH sobre la actividad enzimática
(Garret and Grisham)
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MECANISMOS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA
• Regulación de la cantidad de enzima presente en las células
• Inhibición reversible por productos
• Interacción con moduladores (proteínas u otros)
- Activacion/inhibición alostérica
- El modulador alostérico se une a un sitio distinto del centro activo- La unión del modulador es reversible e implica cambio conformacional - Suelen ser enzimas multiméricas - Tienen cinética sigmoidea
- Modificación covalente:- fosforilación- ADP-ribosilación- metilación
• Activación proteolítica de pro-enzimas
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Efectos alostéricos de moduladores positivo y negativo
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
El sustrato es modulador positivo
+ Modulador alostéricopositivo: favorece la forma R
+ Modulador alostériconegativo: favorece la forma T
TEMA 6 32( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Activación/inactivación de enzimas por fosforilaciónEjemplo: glucógeno fosforilasa
TEMA 6 33
Una enzima puede tener varios mecanismos de regulación
("Biochemistry" 2nd ed. Garrett, R.H. and Grisham, C.M. Saunders College Publishing. 1999.)
TEMA 6 34
Activación de proenzimas por proteolisis
( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed. Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)
Auto-activaciónde quimotripsina