TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS:
REAÇÕES COM ANTICORPOS MARCADOS
Utilização de anticorpos em Ensaios Sorológicos 1954: Teste
de Imunofluorescência (Weller & Coons); 1959:
Radioimunoensaio (Yalow & Berson)
Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Nakane
& Pierce, 1967; Avrameas, 1969)
Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de
anticopos monoclonais (Kohler & Milstein, 1975)
desenvolvimento de novos testes (kits comerciais)
Métodos colorimétricos, radioativos, fluorescentes,
quimioluminescentes, etc.
Agentes infecciosos, anticorpos, hormônios, alérgenos,
poluentes, etc.
Ronald & Stimson, 1998
INTRODUÇÃO
Anticorpos conjugados com fluorocromos
Fluorocromos: substâncias que absorvem luz de menor
e, quando excitados com luz ultravioleta, emitem luz de
maior (fluorescência)
Mais utilizados: isiotiocianato de fluoresceína e rodamina
(absorvem em diferentes, mas emitem luz na faixa do
visível)
Teste direto pesquisa de antígenos (células ou tecidos)
Teste indireto pesquisa de anticorpos, ou de antígenos
Referência para sorodiagnóstico de várias doenças que
acometem os animais, como para a raiva, toxoplasmose,
leishmaniose, leptospirose.
REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
Luz Incidente
(Excitação)
Luz Emitida
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Reação de Imunofluorescência Indireta
Figure 3.6a
Fig 3.6b
Principle of
Immunofluorescence
IMUNOFLUORESCÊNCIA
1
2
3
1: Vero não-infectada + soro positivo para
Coronavírus (Sars)
2: Vero infectada + soro positivo para
Coronavírus
3: Esfregaço de sangue com formas de
tripanossoma
Reação de
Imunofluorescência Direta
para o Diagnóstico do Vírus
da Raiva
FIGURE 1 - Photomicrographs of direct immunofluorescence reactions in the presence (A and B) of
rabies virus antigens in the brain tissue samples subjected to cryopreservation at -20°C for up to 2 years
(immunofluorescence microscope equipped with 400X magnification; Carl Zeiss, Germany). A:
Cryopreservation in 68% SUC for 1 year demonstrating very abundant antigens in all fields of view,
uncountable (++++). B: Cryopreservation in 68% SUC for 2 years demonstrating few antigens, 1 or more
particles in less than 100% but more than 50% of the fields of view (++). SUC: sucrose Source:
LABOVIR-UECE, 2012.
Reação de
Imunofluorescência Indireta
para o Diagnóstico do Vírus
da Leucemia Felina
Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível;
simples execução; determinação de classes e subclasses de
anticorpos
Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição
da fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura;
ausência de automação
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Identificação e separação de células baseadas na
dispersão de luz e fluorescência sob feixe de laser
Estudo de populações de leucócitos luz dispersa
tamanho e forma da célula
Identificação de populações e/ou subpopulações de
linfócitos T e B
FACS (fluorescence-activated cell sorter) separação de
uma única célula
Barrientos et al., 2000
CITOMETRIA DE FLUXO
Schematic representation of a flowcytometer. For details please see text. (1) Forward-scatter detector, (2) side-
scatter detector, (3) fluorescence detector, (4) filters and mirrors, and (5) charged deflection plates.
Anti-CD Linfocitário
Citômetro de Fluxo
Schematic representation of a flowcytometer. For details please see text. (1) Forward-scatter detector, (2) side-
scatter detector, (3) fluorescence detector, (4) filters and mirrors, and (5) charged deflection plates.
Anti-CD Linfocitário
Citômetro de Fluxo
T CD4+
/ CD3+
T CD4+
/ CD3+
T CD8+
/ CD3+
T CD4+ T CD3+
T CD8+
T CD4+
Mab
anti-CD4+
Mab
anti-CD3+
Mab
anti-CD8+
Gating strategy to define lymphocyte subsets. (i) Histogram (univariate) plot of CD3 expression; this one-
dimensional graph corresponds to a typical bar chart and is called “histogram” in flow cytometry. (ii)
Pseudocolor plot of CD3 versus CD4. This display gives a better view on the distribution of CD3 expression
than the histogram, in particular for **CD3 low expressing cells; note both axes are logarithmic, unlike the
linear axes of scatter plots in Figure 2. (iii) Cartoon detailing interpretation of quadrant gates of (ii). CD3+CD4+
cells are displayed in the top right quadrant (46.2% of lymphocytes). CD, cluster of differentiation.
Como são detectados / mensurados os
níveis de Anticorpos em Fluidos
Biológicos?
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Anticorpos
conjugados com enzimas conversão de substrato
incolor em produto colorido
Enzimas mais utilizadas (+ de 25): Peroxidase; Fosfatase
Alcalina, -Galactosidase e Glicose Oxidase
Suportes sólidos: microplacas de poliestireno e
polivinilcloreto (interação hidrofóbica)
Método direto antígenos
Método indireto anticorpos
Sandwich e Competitivo antígenos e anticorpos
Ferreira e Ávila, 1996; Butler, 2000
ELISA
ELISA
Desnaturação das proteínas
adsorvidas (>90%)
Anticopos de captura: 10 a 25%
funcionais Ag capturados são
10x mais funcionais do que os
adsorvidos na placa
Entretanto, 6% necessários para
o desenvolvimento do teste
FIGURE 6-10Variations in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, similar to
RIA except using an Enzyme (alkaline ⓟ, horseradish peroxidase, & β-galactosidase): safer & less costly.
to detect Ab
to detect Ag
to detect Ag
6. ELISA
ELISA INDIRETO
Lavagens
Antígeno
Fonte de proteínas
estranhas ao sistema
LavagensLavagens
Soro anti
Conjugado anti
Lavagens
ELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA
Lavagens
Antígeno
Fonte de proteínas
estranhas ao sistema
LavagensLavagensLavagens
Conjugadoanti
Soro anti
ELISA INDIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA
Lavagens
Conjugado anti B
Antígeno (/?)
Fonte de proteínas
estranhas ao sistema
LavagensLavagensLavagensLavagens
Soro anti (espécie A) Soro anti (espécie B) (/?)
ELISA
Transferência de proteínas separadas por eletroforese do
gel de poliacrilamida para membranas ELISA
Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura
de proteínas + especificidade de anticorpos usados como
sondas para a detecção de Antígenos
Suportes: membranas de nitrocelulose (interações
hidrofóbicas); nylon, polyvinyldifluoride (PVDF) alta
capacidade de ligação a proteínas
Quantificação de bandas por densitometria
Stott, 2000
IMMUNOBLOTTING (Western blotting)
IMMUNOBLOTTING (Western blotting)
IMMUNOBLOTTING (Western blotting)
IMMUNOBLOTTING (Western blotting)
IMMUNOBLOTTING (Western blotting)
DOT-ELISA reação imunoenzimática sobre membranas
Qualitativa ou semi-quantitativa: rápida e simples
Proteínas solúveis, fungos, protozoários, bactérias e vírus
Stott, 2000
IMMUNO-DOT
IMMUNO-DOT
Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais
Anticorpos conjugados com enzimas conversão de
substrato incolor em produto colorido (deposição pode ser
observada diretamente ao microscópio óptico)
Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina,
-Galactosidase e Glicose Oxidase
Método direto Acs primários conjugados (detecção de
antígenos)
Método indireto Acs secundários conjugados (detecção
de antígenos ou anticorpos)
Desvantagens: atividade enzimática endógena,
armazenamento inadequado dos conjugados
Ferreira & Ávila, 1996; Kumar, 2000
IMUNOHISTOQUÍMICA / IMUNOCITOQUÍMICA
Detecção de bacilos nas
vilosidades intestinais
IMUNOHISTOQUÍMICA
H2O2 + DAB H2O + 1/2 O2 + DAB (Oxidada = COR)
Peroxidase
IMUNOHISTOQUÍMICA
H2O2 + DAB H2O + 1/2 O2 + DAB (Oxidada = COR)
Peroxidase
IMUNOHISTOQUÍMICAMétodo ABC
Ags em Células / Tecidos Ags em Células / Tecidos
Ags em Células / Tecidos Ags em Células / Tecidos
H2O2 + DAB H2O + 1/2 O2 + DAB (Oxidada = COR)
Peroxidase
Substrato Produto
Peroxidase
3,3´-Diaminodenzidine tetrahydrochloride (DAB) Marrom
4-Chloro-1-naphthol (CN) Azul
P-Phenylenediamine dihydrochloride Azul-preto
Fosfatase alcalina
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT) Azul-preto
-Galactosidase
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactosidase (IbGa) Azul
Glicose Oxidase
Glicose/trinitroblue tetrazolium (TNBT)Marrom
Kumar, 2000
IMUNOHISTOQUÍMICA
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
NASA
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA
Limiar de detecção: nano ou picogramas
Quantificação de hormônios, drogas, marcadores
tumorais, alérgenos, anticorpos e antígenos microbianos
Quantidade de reagente marcado (Ag ou Ac) quantifica o
Ag ou Ac não-marcado na amostra competição
Marcação com radioisótipos (125I e 131I)
Determinação de curvas-padrão
Desvantagens: custo, vida média dos reagentes e risco
operacional
Ferreira & Ávila, 1996
RADIOIMUNOENSAIO
RADIOIMUNOENSAIO
Ac + Ag* AcAg*
Lembrando o equilíbrio!
AcAg* + Ag AcAg* + AcAg + Ag*
RADIOIMUNOENSAIO
Curva-padrão
LIMIAR DE DETECÇÃO
Rose et al, 1997
REFERÊNCIAS
http://webmed.unipv.it/immunology/agabint.html
http://www.med.sc.edu:85/book/immunol-sta.htm
http://www.biointeractive.org/
Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças
Infecciosas e Auto-Imunes. A. W. Ferreira; S. L. M. Ávila.
Editora Guanabara Koogan, 1996.