Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Biologie
THESE
En vue de l’obtention du diplôme de DOCTORAT
en Biologie
Présentée par
Mlle AMEUR Fatma Zohra
Intitulé :
Impact de l’ingestion subchronique de la tartrazine sur l’activité
enzymatique de la Trypsine, de la Chymotrypsine, de l’Amylase et de
la Lipase chez la souris Swiss
Devant le jury :
Président : Mr KHEROUA O. Professeur, Université Oran 1
Examinateur : Mr BABA HAMED B. Professeur, ESSB Oran
Examinateur : Mr HAMMOU H.
Professeur, Université Oran 1
Examinateur : Mr BOUALGA A. Professeur, Université Oran 1
Rapporteur : Mr SAIDI D. Professeur, Université Oran 1
Co-rapporteur : Mr GONZALEZ A. Professeur, UEX, Espagne
Spécialité : Sciences de la Santé et du
Développement
Soutenue le 08/01/2019
Avant-propos
Les travaux de recherches présentés dans cette thèse ont été réalisés en grande partie
grâce au programme d’une formation résidentielle à l’étranger sous la direction de Mr Saidi
Djamel et la codirection de Mr Antonio Gonzalez. La partie pratique a été réalisée en
collaboration entre le laboratoire de physiologie de la nutrition et de la sécurité alimentaire
(LPNSA) de l’Université Oran1 Ahmed Ben Bella (Algérie), l’Institut des biomarqueurs
moléculaires de pathologie à l’Université d’Estrémadure (Espagne) et l’Institut de recherche
en sciences alimentaires à Madrid (CIAL, Espagne).
Le financement du séjour à l’étranger a été assuré par le Ministère de l’Enseignement
Supérieur et de la Recherche Scientifique (Algérie), tandis que les dépenses liées à l’activité
de recherche ont été à la charge de la Commission d’Estrémadure et du Ministère de
l’Economie et de la Compétitivité d’Espagne.
Je tiens à remercier Mr Kheroua Omar, Mr Gines Salido et Mme Cristina Soler Rivas,
les directeurs des trois laboratoires où se sont déroulés tous nos travaux de recherche. Et, c’est
grâce à cette collaboration qui a été établie que cette thèse, fruit d’un long travail, a pu être
effectuée.
A ma mère,
celle qui n’a pas vu l’aboutissement de
mon travail. Mais, je sais que tu aurais
été très fière de ta fille !
«Une mère ne meurt jamais, elle cesse
seulement d’être visible »
Remerciements
En tout premier lieu, je remercie le Bon Dieu, Le Tout Puissant, pour la volonté et la
patience qu’il m’a données durant toutes ces longues années afin d’accomplir ce travail.
A l'issue de la rédaction de cette recherche, je suis convaincue que la thèse est loin d'être
un travail solitaire. En effet, ce projet de recherche n’aurait pu aboutir sans la riche
collaboration que j’ai pu avoir avec de nombreuses personnes.
Tout d’abord, je tiens à exprimer mes plus vifs remerciements à Monsieur Saidi Djamel
qui fut pour moi un promoteur attentif et disponible malgré ses nombreuses charges et pour le
suivi régulier et l’aide qu’il a pu m’apporter tout au long de l’élaboration de cette thèse.
Je souhaite remercier Mr Antonio Gonzalez qui m’a accueillie dans son laboratoire en
Espagne, pour son soutien et ses multiples conseils. Je serai toujours reconnaissante pour
l’opportunité qu’il m’a donnée afin d’enrichir mes connaissances tant personnelles que
professionnelles.
J’exprime ensuite toute ma reconnaissance à l'ensemble des membres du jury, qui m'ont
fait l'honneur de bien vouloir étudier et juger mon travail : un grand merci à Monsieur
Kheroua Omar qui a accepté de présider ce jury, à Mr Baba Hamed Bey, à Mr Hammou
Habib et à Mr Boualga Ahmed pour avoir bien voulu juger ce travail.
Un remerciement tout particulier à Madame Mehedi Nabila pour l’intérêt qu’elle a
toujours porté à mon travail, pour ses précieux conseils et sa contribution à la correction de ce
manuscrit.
Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Madame Cristina Soler Rivas qui m’a donné
la chance de travailler quelque mois à l’Institut de recherche en sciences alimentaires à
Madrid. C’était une superbe expérience et j’en garde de très bons souvenirs. Merci pour tous
les conseils scientifiques (et non scientifiques).
Un grand merci à toute l’équipe du LPNSA, particulièrement à Chahira, Imen, Leila,
Nawel, Souhila, Soumia F, Aicha, Latifa, Wafaa, Hadria, Nesrine, Malika, Amina, Ibtissem,
Dalel, Abir, Soumia B. Merci également à l’équipe de CIAL à Madrid et je précise, Diego,
Fhernanda et Pedro. A Caceres, mes remerciements particuliers vont à Leticia (don’t worry be
happy), Mercedes, Raquel, José, Carlos, Tapia, Rosado, Isaak, Ana, José Javier pour le climat
sympathique dans lequel ils m’ont permis de travailler.
Un remerciement spécial, profond et reconnaissant à mes deux collègues et « soldats »
Matias et Noelia pour les encouragements sans cesse, pour l’aide à la paillasse, pour le sourire
et la sympathie au quotidien.
Je dois aussi remercier le personnel de l’animalerie à l’Université d’Estrémadure avec
qui j’ai fait une formation à l’expérimentation animale et j’en ai beaucoup appris. Merci les
deux Maria R et Maria A et Feliza pour avoir été si gentilles avec moi. Merci Antonio et
Manuel pour les blagues de chaque matin même si je ne comprenais pas trop au début (merci
pour les grenades aussi !).
Mention spéciale au Mr Aladin Mahamedi qui m’a supporté et m’a permis de me lever
motivée, le cœur léger et l’esprit tranquille depuis le début de ma thèse.
J’adresse toute ma gratitude à tous mes ami(e)s qui sont tous aussi géniaux, et
disponibles et d’un grand soutien en toute circonstance plus particulièrement ma proche amie
Nadia. Merci également à Amel, Soumia, Soussou, Fatima, Khadidja, Zahra, Samia, Dahbia,
Salim, Hamza, Noura, Fatima, Younes, Oubadda, Amine, Hasnaa et Ikram.
Je tiens également à dire un énorme merci à Carmen, Ana et Elena (Mujers F et C) qui
me supportent toujours et croient tellement en moi.
Sans les personnes formidables suivantes, la vie dans un pays européen sera tellement
difficile. Merci à chacun de vous pour votre amour et amitié : Elvira, Esteve, Angel, Xavier,
Bego, Borja, Juanlo, José, Hermo, Anto, Fabio, Hausi, Franchisca ,Alejandro (Batman),
Lorenzo, Miguel, Alfonso, Barri, Jerome, Diego, Melqui, Monaim, Rafi, Hasqui.
Un merci particulier à Chele (José Manuel) et ma famille espagnole : Manuela, Juan,
Carlos, Juanito pour l’accueil chaleureux, les repas délicieux et le soutien moral.
Une dédicace spéciale à mes colocataires très gentilles qui m’ont offert l’environnement
idéal pour une thésarde, merci Rocio, Caroline et Magdaline.
Enfin, les mots les plus simples étant les plus forts, j’adresse toute mon affection à ma
famille et en particulier à mon père, mon frère Lahcen et sa femme Asma, mes sœurs Zouzou,
Souad, Affef et Asmaa. Vous avez toujours été à mes cotés pour m’encourager, me soutenir et
si j’en suis là aujourd’hui c’est grâce à vous ! Je tiens également à remercier mes tantes et mes
oncles pour leur amour et leur bienveillance.
A tous ceux qui ont contribué de près ou de très loin à ce travail, cités ici ou pas, vous
avez toute ma reconnaissance !
Résumé
Les colorants alimentaires sont des ingrédients très présents dans la plupart des
aliments manufacturés. Parmi eux, la tartrazine, aussi connue sous le nom de E102, est
largement utilisée dans les industries agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétologique,
ainsi que dans certaines préparations culinaires.
S’agissant d’un colorant azoïque synthétique, de plus en plus, il est montré que la
tartrazine est incriminée dans l’apparition de troubles de santé qui touchent plusieurs
fonctions et tout particulièrement le système immunitaire, le système de reproduction, le
système nerveux. La voie par laquelle ce colorant semble affecter la santé se fait
probablement via son métabolite majeur : l’acide sulfanilique.
Le but de notre travail est d’évaluer l’effet de la tartrazine et de son métabolite sur la
fonction exocrine du pancréas à travers une étude in vivo sur des souris Swiss, une étude in
vitro à l’aide d’un modèle de digestion et une étude ex vivo sur des cellules acinaires murines
et sur des cellules AR42J de carcinome pancréatique de rat.
Les résultats obtenus montrent que :
• L’ingestion subchronique de la tartrazine chez les souris Swiss à une dose de 0,05 %
pendant 13 semaines provoque une diminution de l’activité enzymatique de la trypsine
et de la chymotrypsine.
• Aucune modification de l’activité enzymatique de la trypsine ou de la chymotrypsine
n’a été observée lorsqu’on utilise un modèle de digestion.
• La tartrazine ainsi que son métabolite, l’acide sulfanilique, peuvent altérer
significativement l’homéostasie calcique au niveau des cellules acinaires et AR42J.
• L’acide sulfanilique induit un stress oxydatif au niveau des cellules acinaires et des
cellules AR42J pancréatiques en générant des espèces réactives de l’oxygène (ERO).
• L’acide sulfanilique diminue le niveau de défense antioxydante assurée par le système
du glutathion et de la superoxyde dismutase, affecte le potentiel membranaire
mitochondrial et altère la sécrétion de la trypsine par les cellules AR42J.
En conclusion, la tartrazine et son métabolite l’acide sulfanilique semblent affecter
significativement l’activité du pancréas exocrine en favorisant le développement d’effets
délétères au niveau de cet organe. Le dysfonctionnement de cette glande peut évidemment
être à l’origine de troubles digestifs.
Mots clés : tartrazine, acide sulfanilique, pancréas exocrine, enzymes digestives,
calcium, ERO, AR42J.
Abstract
Food dyes are very important ingredients in most manufactured foods. Among them,
tartrazine, also known as E102, is widely used in the food, pharmaceutical and cosmetics
industries, as well as in some culinary preparations.
Being a synthetic azo dye, it is increasingly shown that tartrazine is incriminated in the
development of health disorders that affect several functions and especially the immune
system, the reproductive system, the nervous system. The route by which this dye appears to
affect health is probably via its major metabolite: the sulfanilic acid.
The aim of our work is to evaluate the effect of tratrazine and its metabolite on the
exocrine function of the pancreas through an in vivo study in Swiss mice, in vitro study using
a digestion model and ex vivo one on acinar cells and AR42J cells isolated from rat pancreatic
carcinoma.
The results obtained show that:
• Subchronic ingestion of tartrazine in Swiss mice at a dose of 0,05% causes a decrease
in the enzyme activity of trypsin and chymotrypsin.
• No modification of the enzymatic activity of trypsin or chymotrypsin was observed
using a digestion model.
• Tartrazine and its metabolite sulfanilic acid may alter calcium homeostasis in acinar
cells and AR42J cells.
• Sulfanilic acid induces oxidative stress in acinar cells and pancreatic AR42J cells by
generating reactive oxygen species (ROS).
• Sulfanilic acid decreases the level of antioxidant defense provided by the glutathione
and superoxide disumutase system, affects the mitochondrial membrane potential and
alters the secretion of trypsin by AR42J cells.
In conclusion, tartrazine and its metabolite sulfanilic acid appear to significantly affect
the activity of the exocrine pancreas while promoting the development of deleterious effects
in this organ. The dysfunction of this gland can obviously be at the origin of digestive
disorders.
Key words: tartrazine, sulfanilic acid, exocrine pancreas, digestive enzymes, calcium,
ERO, AR42J.
ملخص
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ل AR42Jمبكسجنالملتفلىننل،لاة لل
Liste des abréviations
[Ca2+]i : concentration du calcium intracellulaire libre
ADN : Acide Désoxyribonucléique
AESA : Autorité Européenne de Sécurité des Aliments
AS : acide sulfanilique
BALB : dimercaproltributyrate
BAPNA : L.Benzoyl- Arginine p-nitroAniline
BAPTA : acide 1,2-bis(o-aminophénoxy)éthane-.N,N,N',N'-tétraacétique
SAB : Serum AlbumineBovine
BTEE : N-Benzoyl-L-tyrosine éthyl ester
DJA : Dose Journalière Admissible
DMSO : Diméthylsulfoxide
DNS :acide 3,5-dinitrosalicylique
DTNB :acide 5,5′-dithiobis 2-nitrobenzoique
FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations
GSSG/GSH : Glutathionréduit/oxydé
H2O2 : peroxide d'hydrogène
JECFA : Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives
kDa : kilo Dalton
PBS : phosphate buffered saline
Pc : poids corporel
PMSF : fluorure de phénylméthylsulfonyle
SDS : dodécylsulfate de sodium
SOD : superoxydedismutase
SVF : Sérum de Veau Fœtal
TDAH : trouble de déficit de l’attention/ hyperactivité
TMRM : tétraméthylrhodamine ester méthylique
UE : Union Européenne
UI : Unité Internationale
Liste des figures
Figure 1. Anatomie du duodénum et du pancréas (Seeley et al., 2004). ................................... 6
Figure 2. Unité de fonction et rôle du pancréas exocrine (Saladin, 2003) ................................ 6
Figure 3. Représentation schématique de la signalisation calcique (Berridge et al., 2003). ... 11
Figure 4. Digestion des protéines (Gamet, 2006) .................................................................... 13
Figure 5. Représentation tridimensionnelle de la trypsine pancréatique (Demers, 2010)....... 15
Figure 6. Trypsine : Activation et action (Silbernagl and Despopoulos, 2001) ...................... 15
Figure 7. Représentation tridimensionnelle de la chymotrypsine pancréatique (Demers, 2010)
.................................................................................................................................................. 18
Figure 8. Représentation tridimensionnelle de la lipase pancréatique (Chen et al., 2003) ..... 18
Figure 9. Hydrolyse des lipides alimentaires (Marcil et al., 2004). ........................................ 19
Figure 10. Diagramme de la structure de l'α-amylase (Payan, 2004) ..................................... 22
Figure 11. Spécificité régionale du tractus gastro-intestinal humain mimé dans le modèle
digestif in vitro (Guerra et al., 2012) ........................................................................................ 24
Figure 12. Structure chimique de la tartrazine (Mittal et al., 2007) ........................................ 28
Figure 13. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de la trypsine. ............................. 55
Figure 14. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de la chymotrypsine. .................. 56
Figure 15. Changements de la [Ca2 +]i dans les cellules acinaires en réponse à la CCK-8. .... 59
Figure 16. Les changements de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J en réponse à la CCK-8 et la
thapsigargine. ........................................................................................................................... 60
Figure 17. Effet de la tartrazine sur la [Ca]i+2 dans les cellules acinaires. .............................. 61
Figure 18. Changements de la [Ca2+]i dans les cellules acinaires en réponse à l'acide
sulfanilique. .............................................................................................................................. 62
Figure 19. Changements de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J en réponse à l'acide
sulfanilique. .............................................................................................................................. 64
Figure 20. Effet de l'acide sulfanilique sur la mobilisation du calcium provoquée par la
thapsigargine. ........................................................................................................................... 65
Figure 21. Effet de l'acide sulfanilique sur la génération des ERO dans les cellules acinaires.
.................................................................................................................................................. 66
Figure 22. Effet de l'acide sulfanilique sur la génération des ERO dans les cellules AR42J
chargées avec l’indicateur redox MitoSOXTMRed. .................................................................. 68
Figure 23. Images de fluorescence montrant l'effet de l'acide sulfanilique sur la production
des ERO dans les cellules AR42J chargées avec le MitoSOXTMRed. ..................................... 69
Figure 24. Effet de l'acide sulfanilique sur le glutathion. ........................................................ 70
Figure 25. Effet de l'acide sulfanilique sur l'expression de la superoxyde dismutase (SOD2).
.................................................................................................................................................. 71
Figure 26. Effet de la CCK-8 et de l'acide sulfanilique sur la sécrétion de la trypsine dans les
cellules AR42J. ......................................................................................................................... 73
Figure 27. Effet de l’acide sulfanilique sur le potentiel membranaire mitochondrial (ψm) ... 75
Liste des tableaux
Tableau 1. Fonctions des organes de l’appareil digestif (OpenStaxCollege, 2013) ................. 5
Tableau 2. Caractéristiques des principales hormones intervenant dans la stimulation des
sécrétions pancréatiques (Herdt and Sayegh, 2002; Washabau et al., 2012) . ......................... 10
Tableau 3. Sécrétion exocrine principale de pancréas (Saladin, 2003) ................................... 13
Tableau 4. Liste des principaux colorants alimentaires synthétiques autorisés dans l’Union
Européenne (UE) (Issa, 2009) .................................................................................................. 28
Tableau 5. Liste des produits utilisés : Etude in vivo et in vitro ............................................. 39
Tableau 6. Liste des produits utilisés : Etude ex vivo ............................................................. 44
Tableau 7. Effet de la tartrazine sur le gain du poids corporel et la teneur en protéines totales
chez les souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05%
pendant 13 semaines. ................................................................................................................ 54
Tableau 8. Effet de la tartrazine sur la consommation de l’aliment et du liquide chez les
souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05% pendant
13 semaines. ............................................................................................................................. 54
Tableau 9. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de l’amylase et de la lipase chez
les souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05 pendant
13 semaines. ............................................................................................................................. 58
Tableau 10. Effet de la tartrazine aux doses de 7,5mg/kg/jour et 75 mg/kg/jour sur l’activité
des protéases en utilisant un modèle de digestion in vitro. ...................................................... 58
Table des matières
1. Introduction ......................................................................................................................... 1
2. Rappel bibliographique ....................................................................................................... 3
2.1. La digestion : processus et éléments ................................................................................ 3
2.1.1. Pancréas exocrine ...................................................................................................... 4
2.1.1.1. Physiologie et fonctions ......................................................................................... 4
2.1.1.2. Régulation de la sécrétion pancréatique................................................................. 4
2.1.1.3. La signalisation calcique ........................................................................................ 7
2.1.1.4. Physiopathologie du pancréas exocrine ................................................................. 8
2.1.1.5. Enzymes digestives pancréatiques ......................................................................... 9
2.1.1.5.1. Les protéases ....................................................................................................... 9
a. La trypsine ........................................................................................................................ 12
b. La chymotrypsine .............................................................................................................. 14
2.1.1.5.2. La lipase ............................................................................................................ 16
2.1.1.5.3. L’amylase .......................................................................................................... 20
2.1.2. Modèle de digestion ................................................................................................ 21
2.2. Les additifs alimentaires ................................................................................................ 23
2.2.1. Les colorants alimentaires .......................................................................................... 26
2.2.1.1. La tartrazine (E102) ............................................................................................. 27
2.2.1.1.1. Structure et propriétés ...................................................................................... 27
2.2.1.1.2. Métabolisme ...................................................................................................... 27
2.2.1.1.3. Réglementation ................................................................................................. 29
2.2.1.1.4. Estimation de la consommation du E102 .......................................................... 29
2.2.1.1.5. Détermination de la présence de la tartrazine dans les aliments ..................... 30
2.2.1.1.6. Toxicité de la tartrazine .................................................................................... 31
2.2.1.1.6.1. Effet du E102 sur le système nerveux ............................................................ 31
2.2.1.1.6.2. Effet du E102 sur le système immunitaire ...................................................... 32
2.2.1.1.6.3. Effet du E102 sur le système reproductif ....................................................... 33
2.2.1.1.6.4. Effet du E102 sur les tissus et les paramètres biochimiques ......................... 33
2.2.1.1.6.5. Génotoxicité du E102 ..................................................................................... 34
2.2.1.1.6.6. Cancérogénicité du E102 ............................................................................... 35
2.2.1.1.6.7. Le E102 et le stress oxydatif .......................................................................... 35
2.2.1.1.6.8. Effet du E102 sur le système digestif ............................................................. 35
3. Matériel et méthodes ............................................................................................................ 37
3.1. Effet de la tartrazine sur les activités enzymatiques digestives in vivo et in vitro ........ 37
3.1.1. Produits et réactifs ................................................................................................... 37
3.1.2. Etude in vivo ........................................................................................................... 37
3.1.2.1. Modèle animal et conditions d’élevage ............................................................... 37
3.1.2.2. Protocole expérimental ........................................................................................ 37
3.1.2.3. Obtention des échantillons ................................................................................... 38
3.1.2.4. Dosage des protéines totales selon la méthode de Lowry et al. (1951) ............... 38
3.1.2.5. Détermination de l’activité enzymatique de la trypsine et la chymotrypsine ...... 38
3.1.2.6. Détermination de l’activité enzymatique de la lipase .......................................... 41
3.1.2.7. Détermination de l’activité enzymatique de l’amylase ........................................ 41
3.1.3. Etude in vitro ........................................................................................................... 42
3.1.3.1. Protocole expérimental ........................................................................................ 42
3.2. Effet de la tartrazine et de son métabolite sur le pancréas exocrine : Etude ex vivo ..... 42
3.2.1. Produits et réactifs ................................................................................................... 42
3.2.2. Protocole expérimental ........................................................................................... 43
3.2.2.1. Mesure microfluorimétrique du calcium libre intracellulaire par l’imagerie en
temps réel « Real time imaging » ..................................................................................... 43
3.2.2.2. Détermination des changements de [Ca+2] libre sur les cellules AR42J ............ 45
3.2.2.3. Détermination de l’oxydation .............................................................................. 47
3.2.2.3.1. Détermination de la libération des ERO par spectrofluorimétrie .................... 47
3.2.2.3.2. Visualisation des ERO par microscopie à fluorescence ................................... 48
3.2.2.3.3. Détermination des taux de Glutathion .............................................................. 48
3.2.2.3.4. Étude de la superoxyde dismutase mitochondriale par Western blot ............... 50
3.2.2.4. Effet de l'acide sulfanilique sur la trypsine .......................................................... 51
3.2.2.5. Détermination du potentiel membranaire mitochondrial .................................... 51
3.3. Etude statistique ............................................................................................................. 52
4. Résultats ............................................................................................................................... 53
4.1. Effet de la tartrazine sur le gain de poids corporel et la teneur en protéines ................. 53
4.2. Effet de la tartrazine sur la consommation de l’aliment et de l’eau .............................. 53
4.3. Impact de la tartrazine sur l’activité enzymatique in vivo ............................................. 53
4.4. Impact de la tartrazine sur l’activité enzymatique in vitro ............................................ 57
4.5. Effet de la tartrazine et de l’acide sulfanilique sur la libération du calcium (étude ex
vivo) ...................................................................................................................................... 57
4.6. Effet de l’acide sulfanilique sur le statut redox (étude ex vivo) ..................................... 63
4.7. Effet de l’acide sulfanilique sur la trypsine (étude ex vivo) .......................................... 72
4.8. Effet de l’acide sulfanilique sur le potentiel membranaire mitochondrial (étude ex vivo)
.............................................................................................................................................. 72
5. Discussion ............................................................................................................................ 76
6. Conclusion ............................................................................................................................ 85
7. Références bibliographiques ................................................................................................ 88
INTRODUCTION
1
1. Introduction
Les colorants alimentaires sont des additifs largement utilisés au quotidien pour
ajouter une couleur souhaitée à des aliments ou redonner la couleur perdue au cours de la
fabrication de certains produits. L'avantage primordial de la couleur est sa contribution à
l'aspect attrayant de la nourriture. L'apparence de la nourriture peut être le facteur crucial qui
peut déterminer son acceptation ou son rejet.
La tartrazine (connue sous le nom de E102 ou FD & C Yellow5) est actuellement un
des colorants les plus utilisés pour les usages cités. C’est un colorant azoïque synthétique de
couleur jaune citron dérivé du goudron de houille soluble dans l'eau (Amin et al., 2010). Une
dose journalière admissible (DJA) de 0-7,5 mg / kg de poids corporel a été fixée par le Comité
mixte FAO / OMS d'experts des additifs alimentaires (JECFA, 1964) puis a été révisée à 0-10
mg / kg pc en 2016 (JECFA, 2016).
Cependant, et de plus en plus, de nombreuses études indiquent que ce colorant possède
une activité toxique. Une forte corrélation à été établie entre sa consommation et l’apparition
de l’hyperactivité chez les enfants (McCann et al., 2007). D’autre part, de nombreuses études
ont montré des effets immunotoxiques (Moutinho et al., 2007; Guendouz et al., 2013) et
génotoxiques de ce colorant alimentaire (Sasaki et al., 2002; Hassan, 2010; Khayyat et al.,
2017). De plus, des effets notables de la tartrazine sur le système reproducteur et le statut
redox ont été signalés (Mehedi et al., 2009; Cemek et al., 2014; El Golli, 2016; Boussada et
al., 2017; Bhatt et al., 2018).
Après son ingestion orale, la tartrazine peut être réduite en amines aromatiques libres.
L'acide sulfanilique (AS) en est le principal métabolite. Cet élément résulte de la réduction de
la liaison azotée N = N produite principalement par la flore gastro-intestinale (GI) (Elhkim et
al., 2007; Moutinho et al., 2007).
Fait intéressant, Wang et al. (2012) ont découvert que la tartrazine était capable
d'interagir avec les résidus His57 et Lys224 de la trypsine, entraînant l’inhibition de son
activité enzymatique. D’autre part, il a été montré que les sous-produits d'un tel métabolisme
deviennent parfois plus toxiques que la substance initiale (Onyema et al., 2006).
INTRODUCTION
2
Même si de nombreuses études ont été menées pour étudier les effets toxiques de la
tartrazine sur la santé, peu d'entre elles ont ciblé le système digestif. C’est pourquoi, le but
principal de notre travail a été d’étudier l'effet de la tartrazine et de son métabolite, l’acide
sulfanilique, sur l’activité du pancréas exocrine sachant que cette glande joue un rôle
primordial dans le processus de la digestion via la sécrétion des enzymes digestives,
principalement la trypsine, la chymotrypsine, la lipase et l’amylase.
Pour atteindre cet objectif, une étude in vivo sur des souris Swiss a été menée. Dans
cette partie, les activités enzymatiques de la trypsine, de la chymotrypsine, de la lipase et de
l’amylase ont été mesurées après une ingestion subchronique de la tartrazine aux doses de
0,005 % et 0,05 %.
Dans un deuxième temps, un modèle de digestion in vitro a été utilisé pour mettre en
évidence la relation entre la toxicité probable de la tartrazine et la nature des aliments ingérés.
Enfin, une approche ex vivo menée sur des cellules acinaires isolées du pancréas de
souris Swiss ainsi que sur des cellules AR42J a été réalisée afin d’évaluer les effets du
colorant et de son métabolite principal, l’acide sulfanilique, sur l’activité du pancréas mais
aussi pour identifier les voies de signalisation intracellulaires qui peuvent être affectées par
ces deux composants. C’est pourquoi on a évalué l’effet de la tartrazine et de l’acide
sulfanilique sur la signalisation calcique, le statut redox ainsi que sur l’activité trypsique.
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
3
2. Rappel bibliographique
2.1. La digestion : processus et éléments
La plupart des composants des aliments ne peut pas être absorbée directement par
l’organisme. C’est seulement après dégradation en petites molécules que l’organisme peut
extraire les nutriments essentiels. La digestion se réfère à la rupture mécanique et
enzymatique des aliments et à la résorption des produits résultants (Koolman and Roehm,
2005).
Les aliments, au cours de leur passage dans le tube digestif, sont exposés à des
phénomènes mécaniques et enzymatiques. La mastication en bouche, les mouvements
péristaltiques de l’estomac et de l’intestin conduisent à la déstructuration des aliments en
réduisant leur taille. Simultanément, les enzymes du tractus digestif, de la bouche à l’intestin,
modifient chimiquement l’aliment et le transforment en nutriments (Ménard and Dupont,
2014).
Bien qu’elle puisse sembler simple à première vue, la digestion des aliments est un
processus assez complexe et admirable qui nécessite une coopération et une coordination
précise entre les différents organes composant l’appareil digestif (tableau 1).
Le tractus gastro-intestinal (TGI) est un ensemble très complexe composé de plusieurs
organes qui travaillent d’une manière ajustée avec précision chez un individu sain. Outre les
glandes salivaires, les dents, l'estomac, l’intestin grêle, le gros intestin et le foie, le pancréas
joue un rôle très important dans le processus de la digestion (Mößeler and Kamphues, 2017).
Le pancréas est une glande mixte. Elle assure une fonction endocrine en sécrétant
plusieurs hormones tels que le glucagon, l’insuline, la somatostatine et le polypeptide
pancréatique (PP) tandis que le rôle exocrine implique les cellules acinaires qui sécrètent le
suc pancréatique riche en enzymes digestives, en eau et en électrolytes (OpenStaxCollege,
2013).
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
4
2.1.1. Pancréas exocrine
2.1.1.1. Physiologie et fonctions
Le pancréas se compose d'une tête reliée au duodénum (figure 1), d’un corps et d’une
queue qui s'étend jusqu'à la rate (Saladin, 2003; Seeley et al., 2004). La partie exocrine du
pancréas a pour fonction de sécréter du suc pancréatique dans le duodénum. Le transport de
ce suc est assuré par deux canaux : le canal pancréatique principal (canal de Wirsung) et le
canal pancréatique accessoire (canal de Santorini) (Tortora and Derrickson, 2009). Il est
formé de deux principaux types cellulaires : les cellules acineuses et les cellules ductales, et
adopte une structure en grappe de raisin (Vaysse, 2005). Les acini pancréatiques synthétisent
et sécrètent des enzymes comme la lipase, la trypsine et l’amylase qui hydrolysent
respectivement les lipides, les protéines et les glucides (figure 2). Les cellules du canal
pancréatique sécrètent des bicarbonates qui maintiennent un pH optimal pour les processus de
digestion et d’absorption (Pibot et al., 2010).
La cellule acineuse présente une forme plus ou moins pyramidale avec son apex dirigé
vers la lumière acinaire. Cette cellule est riche en organites. On retrouve en son sein un
réticulum endoplasmique majoritairement au niveau basal de la cellule avec des ribosomes, un
appareil de Golgi au niveau moyen de la cellule et à l’apex, des grains de zymogène (Barone,
1997; Venel, 2009).
2.1.1.2. Régulation de la sécrétion pancréatique
La sécrétion d'enzymes pancréatiques comporte trois phases : céphalique, gastrique et
intestinale. Les deux premières sont assurées par la stimulation nerveuse neuro-vagale alors
que la troisième, et probablement la plus importante, est régulée par la libération des
hormones cholécystokinine (CCK) et sécrétine de la paroi duodénale (White et al., 1963;
Anagnostides et al., 1984).
La CCK stimule la libération de la bile de la vésicule biliaire et la sécrétion du suc
pancréatique riche en enzymes digestives. Le principal stimulus pour la libération de CCK est
la présence d'acides gras et d'autres lipides dans le duodénum (Seeley et al., 2004).
Le chyme acide stimule également le duodénum pour sécréter la sécrétine qui stimule
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
5
Tableau 1. Fonctions des organes de l’appareil digestif (OpenStaxCollege, 2013)
Organe Fonction majeure
Bouche
Ingestion et mastication des aliments
Initiation de la digestion des glucides et des lipides
Déplacement de la nourriture vers le pharynx
Pharynx Déglutition de l’aliment de la cavité orale vers l’œsophage
Œsophage Propulsion de l’aliment vers l’estomac
Estomac
Formation du chyme alimentaire en mélangeant l’aliment au suc gastrique
Initiation de la digestion chimique des protéines suite à l’action de la
pepsine et de l'acide chlorhydrique (HCl)
Déversement du chyme dans le duodénum
Absorption de quelques substances (l'eau, l'alcool, l'aspirine),
Possession des propriétés antimicrobiennes
Intestin grêle
Mélange du chyme avec les sucs digestifs
Poursuite de la digestion de l’aliment
Absorption des nutriments
Organes
accessoires
Foie : produit des sels biliaires qui émulsifient les lipides afin de faciliter
leur digestion et absorption
Vésicule biliaire : stocke et libère la bile
Pancréas : produit des enzymes digestives et bicarbonates
Gros intestin
Absorption des sels, d’eau et des vitamines
Propulsion des excréments vers le rectum en vue de leur élimination
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
6
Figure 1. Anatomie du duodénum et du pancréas (Seeley et al., 2004).
(a) La tête du pancréas se trouve dans la courbure duodénale, le canal pancréatique se vide
dans le duodénum. (b) Histologie du pancréas montrant à la fois les acini et le système des
canaux pancréatiques
Figure 2. Unité de fonction et rôle du pancréas exocrine (Saladin, 2003)
(a) Un acinus. (b) L'activation des enzymes pancréatiques dans le duodénum. Le pancréas
sécrète le trypsinogène. Ce dernier est converti par l'entérokinase en trypsine. La trypsine non
seulement digère les protéines alimentaires mais active également deux autres zymogènes
pancréatiques, le chymotrypsinogène et la procarboxypeptidase.
(b) (a)
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
7
les voies biliaires hépatiques et les canaux pancréatiques pour sécréter du bicarbonate. Une
autre hormone, la gastrine sécrétée par l'estomac et le duodénum stimule la sécrétion
d'enzymes pancréatiques mais pas aussi fortement que la CCK (Saladin, 2003) (tableau 2).
A l’instar de la stimulation, l’inhibition est contrôlée par deux types de facteurs : les
facteurs nerveux et les facteurs hormonaux. C’est le système nerveux sympathique qui
provoque la diminution de la sécrétion, pour la partie neurologique (Light et al., 1993). Pour
la partie hormonale, il existe un rétrocontrôle au niveau du duodénum sur les sécrétions de
sécrétine et de la CCK. De plus, la somatostatine joue également un rôle inhibiteur de la
sécrétion pancréatique et de l’acide chlorhydrique. Une fois le chyme dans le duodénum, la
somatostatine est libérée. Elle a une action sur les cellules sécrétrices et empêche la libération
des hormones gastro-intestinales (Venel, 2009).
2.1.1.3. La signalisation calcique
L’ion calcium (Ca2+) est un second messager intracellulaire universel. Il est impliqué
dans de nombreuses fonctions cellulaires telles que la contraction musculaire, la libération de
neurotransmetteur, la sécrétion d’enzyme, l’expression génique, ou encore la mort cellulaire
(Berridge et al., 2003; Petersen, 2005) (figure 3). Les études de la signalisation du Ca2+
cellulaire ont été considérablement facilitées par la disponibilité des indicateurs fluorescents
du Ca2+(Lock et al., 2015).
La cellule acineuse du pancréas exocrine est un excellent modèle pour l’étude de la
signalisation calcique, et des messagers impliqués. Ces signaux calciques sont rendus
possibles par des gradients importants de concentration entre le cytoplasme, les différents
compartiments cellulaires, et le milieu extracellulaire (Berridge et al., 2003; Petersen and
Tepikin, 2008).
Le Ca2+ peut être retrouvé dans de nombreux organites intracellulaires fonctionnant
comme des réserves calciques, tels que les mitochondries, le noyau ou encore l'appareil de
Golgi. Néanmoins, le réticulum endoplasmique (RE) constitue la plus importante réserve
calcique intracellulaire composant ainsi, l'une des deux sources principales de Ca2+ de la
cellule, avec le milieu extracellulaire (Missiaen et al., 2004; Cabanas, 2016). La concentration
de cet ion est très faible dans le cytosol (~100 nM) par rapport au milieu extracellulaire
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
8
(~1mM) et est maintenue stable grâce à différentes protéines impliquant des transports actifs
et passifs (García et al., 2006; Clapham, 2007).
Dans les cellules exocrines du pancréas, le rôle du calcium, principalement largué du
réticulum endoplasmique (RE) en réponse à l’activation des récepteurs à l’inositol
triphosphate (IP3), est crucial dans la régulation de l’exocytose et peut impliquer un grand
nombre de canaux calciques (Wäsle and Edwardson, 2002; Papin, 2009). Le déclenchement
des ces signaux calciques complexes dépend du neurotransmetteur acétylcholine (ACh) et
l’hormone CCK qui stimulent à leur tour la sécrétion d’enzymes digestives à partir des
granules de zymogène au niveau de la membrane apicale (Palade, 1975; Maruyama and
Petersen, 1994).
2.1.1.4. Physiopathologie du pancréas exocrine
La limitation physiologique de la digestion de la nourriture peut se situer soit au
niveau de la synthèse et de la sécrétion d'enzymes, au niveau du transport des nutriments ou
encore au niveau de la capacité de synthèse des protéines musculaires (Lemieux, 1998). Ainsi,
les conditions qui conduisent à une maldigestion peuvent être soit organiques (altération de la
sécrétion des enzymes pancréatiques), fonctionnelles (altération de la coordination entre les
enzymes et les aliments), ou une combinaison des deux conditions (Vujasinovic et al., 2017).
Parmi les pathologies qui affectent le pancréas, l'insuffisance pancréatique exocrine
(IPE) est définie comme une activité enzymatique pancréatique insuffisante, due à une
production insuffisante d'enzymes, à une activation enzymatique insuffisante ou à une
dégradation précoce de l'enzyme ce qui entraîne une mauvaise digestion des aliments (Löhr et
al., 2013; Vujasinovic et al., 2017). En outre, la pancréatite correspond à une inflammation du
pancréas. Elle peut être chronique ou aigüe. Dans le cas de la pancréatite aigüe, il s'agit de
l'autodigestion du pancréas, utilisant ses propres enzymes pour sa destruction. Le mécanisme
par lequel les enzymes pancréatiques s'attaquent à leur parenchyme d'origine reste peu connu
(Annicotte, 2004).
Le développement de pancréatites aigües ou chroniques peut être provoqué par
différents mécanismes mais elles aboutissent toutes à un disfonctionnement du pancréas et
entrainent par conséquent une maldigestion des aliments.
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
9
2.1.1.5. Enzymes digestives pancréatiques
Les enzymes sont des catalyseurs très spécifiques de réactions biologiques. Cette
propriété est liée à la présence, dans leur structure, d’un site actif qui en forme une cavité au
sein de laquelle se déroule la réaction enzymatique proprement dite. De manière générale, le
site actif est d’une taille restreinte par rapport à la taille globale de l’enzyme. Il constitue donc
le site de reconnaissance spécifique de l’enzyme (Cingöz, 2009). Ces catalyseurs biologiques
sont synthétisés dans les cellules par la machinerie normale de la synthèse des protéines. La
structure d'une enzyme donnée est codée par des gènes de structure, dont la séquence d'ADN
est transcrite en un ARN messager, et l'ARNm est traduit par les ribosomes à partir de ses
codons pour former la séquence des acides aminés de la protéine souhaitée en présence des
facteurs associés (Aehle, 2007).
Suite à l’ingestion des aliments, la glande pancréatique sécrète plus de 2 L de suc par
jour, un liquide clair et incolore formé d’eau, de quelques sels, de bicarbonates de calcium et
également de proenzymes et d’enzymes digestives (Vaysse, 2005; Pezzilli, 2009; Kim et al.,
2010). La sécrétion de protéines par le pancréas est la plus importante par gramme de tissu de
tout l’organisme et plus de 85% de teneur en protéines est composée d'enzymes. Ces dernières
sont capables de digérer les lipides, protéines et glucides (Pezzilli, 2009) (tableau 3).
Le suc pancréatique est sécrété principalement en réponse à l’ingestion d’aliments.
Mais toutefois, il existe une sécrétion basale continue lors du jeûne, mais en faible quantité
(par rapport à la sécrétion suite à une stimulation, seulement 2% du bicarbonate et 10% des
enzymes) (Antomarchi, 2009).
Chez l’homme, les enzymes digestives sont aussi dégradées par les protéases pendant
la digestion une fois qu’elles ont digéré leurs substrats. Dans les conditions normales, les
niveaux des enzymes pancréatiques dans la partie distale de l’intestin et dans les fèces sont
extrêmement faibles (Najjar, 2010).
2.1.1.5.1. Les protéases
La digestion des protéines débute dans l’estomac sous l’action de la pepsine. Elle se
poursuit dans le duodénum grâce aux enzymes protéolytiques pancréatiques (Despopoulos
and Silbernagl, 2003) (figure 4). Les protéases représentent 70% des enzymes sécrétées. Elles
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
10
Tableau 2. Caractéristiques des principales hormones intervenant dans la stimulation des
sécrétions pancréatiques (Herdt and Sayegh, 2002; Washabau et al., 2012) .
Hormone Production Principaux
stimuli Cellules cibles
Principaux effets
sur le pancréas
exocrine
Sécrétine Duodénum pH duodénal
bas
Cellules
canalaires
Stimule la sécrétion
de bicarbonates
CCK duodénum,
jéjunum et iléon
Acides aminés,
lipides présents
dans le
duodénum
Cellules
acineuses
Stimule la sécrétion
d’enzymes
pancréatique, stimule
la synthèse
enzymatique
Gastrine antre gastrique
Stimulation
vagale,
présence d’acide
aminés et de
calcium
dans la lumière
gastrique
cellules
acineuses
stimule la sécrétion
d’enzymes
pancréatiques
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
11
Figure 3. Représentation schématique de la signalisation calcique (Berridge et al., 2003).
(A) : Entrée du calcium ou production de seconds messages qui provoquent la libération du
calcium contenu dans les stocks intracellulaires ; (B) : Processus physiologiques induits par le
calcium ; (C) retour à l’état de repos grâce à l’action combinée de pompes et d’échangeurs.
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
12
sont synthétisées sous une forme inactive par les cellules acineuses, où elles sont stockées
dans les grains de zymogène. Leur activation n’a lieu qu’au moment où elles sont libérées
dans la lumière duodénale (Antomarchi, 2009).
Les protéases, en tant que molécules protéiques, ne peuvent accomplir leur action que
si leur structure est préservée. Pour cela, certaines conditions physico-chimiques doivent être
respectées pour que les protéases soient actives. Il est bien connu que chaque enzyme a un
optimum d’activité dans certaines conditions de pH et de température (Nioi, 2013). Selon leur
mécanisme d’action qui est lui-même fonction de la nature du ou des acides aminés du site
actif de l’enzyme, on distingue les endopeptidases (trypsine, chymotrypsine et élastase) et les
exopeptidases (carboxypeptidases A et B) (Aluko et al., 2005; Lecleire, 2008). Dans le
contexte de notre travail, nous nous sommes intéressés à la trypsine et la chymotrypsine.
a. La trypsine
La trypsine (EC 3.4.21.4) (figure 5) possède quatre ponts disulfures et a une masse
moléculaire de 23,8 kDa pour 221 acides aminés (Cunningham, 1954). Le pH optimal pour
cette enzyme se situe autour de 7,8 (Beck, 1973). C’est une enzyme extrêmement spécifique
hydrolysant la liaison peptidique côté C-terminal après les acides aminés, lysine et arginine
(Cingöz, 2009).
Dans le pancréas, les vésicules stockent la trypsine en tant que trypsinogène pour
éviter l’autodigestion de l’organe. Les cellules acineuses pancréatiques sécrètent également
une protéine appelée inhibiteur de la trypsine qui se combine avec n'importe quelle trypsine
formée accidentellement dans le pancréas ou dans le suc pancréatique et bloque son activité
enzymatique (Kishimura and Hayashi, 2002; Tortora and Derrickson, 2009). Le pancréas
humain sécrète trois isoformes de trypsinogène. Sur la base de leur mobilité
électrophorétique, ils sont communément appelés trypsinogène cationique, trypsinogène
anionique et mésotrypsinogène. Les deux principales isoformes, cationique et anionique,
constituent la majeure partie du trypsinogène sécrété, alors que les niveaux de
mésotrypsinogène sont rapportés entre 3 et 10% de la teneur totale en trypsinogène dans le
suc pancréatique (Szmola et al., 2003).
La sécrétion sous forme de proenzyme est donc un mécanisme de régulation qui
consiste en un blocage de l’accès du substrat au site actif par une partie de la chaîne
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
13
Tableau 3. Sécrétion exocrine principale de pancréas (Saladin, 2003)
Sécrétion Fonction
Des ions bicarbonates Neutralisation de l’acidité gastrique
Zymogènes Convertis en enzymes
Trypsinogène Converti en trypsine qui digère les protéines
Chymotrypsinogène Converti en chymotrypsine qui digère les protéines
Procarboxypeptidase Converti en carboxypeptidase hydrolyse l'acide aminé terminal de
l'extrémité carboxyle (-COOH) de petits peptides
Enzymes
Amylase pancréatique Digestion de l’amidon
Lipase pancréatique Digestion des lipides
Ribonucléase Digestion de l’ARN
Désoxyribonucléase Digestion de l’ADN
Figure 4. Digestion des protéines (Gamet, 2006)
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
14
peptidique du proenzyme. Ce n’est que lors du clivage de cette région que, par un changement
de conformation, la cavité du site se retrouve libre.
Une fois libérée dans le duodénum, l’entérokinase qui est une enzyme attachée à la
bordure en brosse de l'intestin grêle, active le trypsinogène. La trypsine active alors à son tour
plus de trypsinogène, ainsi que le chymotrypsinogène et la procarboxypeptidase (Seeley et al.,
2004; Buscail and Carrière, 2010). Donc cette enzyme joue un rôle-clé dans les processus de
la digestion dans la mesure où c’est elle qui va être responsable de l’activation en cascade de
toutes les autres enzymes (figure 6).
La détermination de la présence de trypsine dans le sérum est utilisée pour établir le
diagnostic de pancréatite aiguë car les sites de production de la trypsine sont presque
exclusivement pancréatiques. En présence de pancréatite, cette concentration s’accroît de
façon remarquable (Vaysse, 2005).
b. La chymotrypsine
La chymotrypsine (EC 3.4.21.1) (figure 7) est synthétisée en même temps que la
trypsine au niveau du pancréas sous forme d’un zymogène comme le reste des protéases. Son
précurseur, le chymotrypsinogène est transformé en chymotrypsine sous l’action de la
trypsine au niveau du duodénum (Silbernagl and Despopoulos, 2001; Kim et al., 2010).
La chymotrypsine a une seule chaîne polypeptidique de 324 résidus d'acides aminés.
Elle possède une masse moléculaire de 25,7 kDa et un point isoélectrique de 9,1 (Uhlig, 1998;
Boeris et al., 2009). Son pH optimal est 8,2 (Sharma and Hopkins, 1979). Cette enzyme
hydrolyse pour sa part les liens peptidiques sur les résidus hydrophobes encombrants
(phénylalanine, tryptophane, tyrosine) (Hedstrom, 2002; Vaysse, 2005). Chez l’humain,
quatre isoformes de chymotrypsinogène sont présentes : chymotrypsinogène B1 (CTRB1),
chymotrypsinogène B2 (CTRB2), chymotrypsinogène C (CTRC), et le précurseur de
l'enzyme-1 chymotrypsin-like (CTRL1) (Sahin-Tóth and Szabó, 2011). Lors de son largage
dans la lumière intestinale, la trypsine va cliver la chymotrypsinogène entre l'Arg15 et l'Ile 16,
et ainsi activer l'enzyme (Mátrai et al., 2004; Whitcomb and Lowe, 2007).
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
15
Figure 5. Représentation tridimensionnelle de la trypsine pancréatique (Demers, 2010)
Figure 6. Trypsine : Activation et action (Silbernagl and Despopoulos, 2001)
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
16
2.1.1.5.2. La lipase
La lipase également nommée triacylglycerolacyl hydrolase ou lipase pancréatique
colipase dépendante (EC 3.1.1.3) est capable d’hydrolyser les triglycérides à longues chaînes
d’acides gras en glycérol et en acides gras correspondants (Fickers et al., 2008).
Cette enzyme est constituée d’une chaine glycoprotéique composée de 449 acides
aminés et est divisée en deux unités de pliage : un grand amino-terminal domaine contenant 1-
336 résidus et un petit carboxy-terminal domaine aux résidus 337-449. Le site actif est une
triade comprenant His-263, Asp-176 et Ser-152 dans le plus grand domaine amino-terminal
(figure 8) (Zhang et al., 2014). La lipase pancréatique possède une activité optimale entre pH
6,5 et 7,5. Elle est particulièrement adaptée au contenu de l’intestin grêle, où le pH varie entre
5 et 7 au cours d’un repas (Lengsfeld et al., 2005).
Environ 10 à 30% de l'apport en graisses alimentaires sont hydrolysés dans l'estomac,
tandis que les 70-90% restants sont dégradés dans le duodénum et la partie supérieure du
jéjunum (Silbernagl and Despopoulos, 2001). Quand le chyme entre dans le duodénum, sa
graisse se présente en grands globules exposés à la lipase, mais seulement à leur surface. La
digestion de la graisse serait plutôt lente et inefficace si elle restait de cette façon (Saladin,
2003). Pour permettre une action enzymatique optimale, il faut qu'il y ait une émulsification
préalable des lipides car les gouttelettes graisseuses relativement petites dans une émulsion
offrent aux lipases une surface d'action importante (Tortora and Derrickson, 2009).
Cette émulsification est assurée d’une part par la motricité de l’estomac et d’une autre
part sous l’action de la lécithine et des sels biliaires. En effet, sans l’interface eau / lipide de
l’émulsion formée avec les sels biliaires, la lipolyse des triglycérides serait 2 à 4 fois moins
efficace (Borgström, 1975; Fickers et al., 2008). Les sels biliaires sont des détergents
stéroïdiens biosynthétisés à partir du cholestérol dans le foie et stockés dans la vésicule
biliaire. La bile est sécrétée par le canal biliaire dans l'intestin sous l'influence d'une gamme
d’hormones gastro-intestinales. Chez l’être humain, la production de la bile est environ 0,4 à
0,8 L par jour (Maldonado-Valderrama et al., 2011).
Cependant, les lipides sont les stimulants les plus puissants de la sécrétion d'enzymes
pancréatiques et l'administration chronique d'un régime à haute teneur en matière grasse est en
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
17
permanence associée à une production d'enzymes plus élevée par rapport aux régimes riches
en hydrates de carbone ou en protéines (Keller and Layer, 2005).
La sécrétion exocrine pancréatique contient d’autres enzymes lipolytiques possédant
diverses spécificités et une moindre contribution à la lipolyse globale. La carboxylester
hydrolase (ou cholestérol estérase, ou lipase dépendante des sels biliaires) est une enzyme peu
spécifique qui hydrolyse très faiblement les triglycérides et dont le rôle physiologique
principal semble être la lipolyse des esters de cholestérol et de vitamines liposolubles. La
phospholipase A2 pancréatique hydrolyse préférentiellement la phosphatidylcholine (figure 9)
(Buscail and Carrière, 2010).
En plus, deux protéines apparentées à la lipase pancréatique (PLRP1 et PLRP2 :
pancreatic lipase-relatedprotein) ont été identifiées dans le suc pancréatique humain (Giller et
al., 1992; De Caro et al., 1998; De Caro et al., 2004). Alors que la PLRP1 ne présente aucune
activité enzymatique, la PLRP2 a une activité hydrolytique contre les triglycérides et les
phospholipides (Roussel et al., 1998; Wong and Schotz, 2002; Eydoux et al., 2007).
Contrairement à la plupart des enzymes pancréatiques, la lipase pancréatique n’est pas
produite sous la forme d’une proenzyme et elle est potentiellement fonctionnelle dès sa
synthèse, mais elle est néanmoins inefficace sans la présence de son coenzyme : la colipase,
qui permet à la lipase de traverser la couche de substances biliaires recouvrant les gouttelettes
lipidiques sans être inactivée notant que la colipase résulte de l'action de la trypsine sur une
pro-colipase provenant du suc pancréatique (Silbernagl and Despopoulos, 2001; Antomarchi,
2009). Ce système lipase pancréatique-colipase est extrêmement efficace; La quantité de
lipase dans 100 ml de contenu duodénal est capable de digérer la prise quotidienne complète
de graisse en environ 1 minute (Brogström and Hildebrand, 1975).
Bien qu'aucun ion ne semble nécessaire en tant que cofacteur-lipase absolu, les ions
calcium ont été impliqués dans le mécanisme d'action de la lipase pancréatique pendant une
longue période (Benzonana, 1968; Lairon et al., 1980; Alvarez and Stella, 1989; Wickham et
al., 2002; Golding and Wooster, 2010). Selon Borgström and Brockman (1984), le calcium est
un effecteur de la lipase pancréatique et contribue de manière significative à l'augmentation
de son activité catalytique.
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
18
Figure 7. Représentation tridimensionnelle de la chymotrypsine pancréatique (Demers,
2010)
Figure 8. Représentation tridimensionnelle de la lipase pancréatique (Chen et al., 2003)
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
19
Figure 9. Hydrolyse des lipides alimentaires (Marcil et al., 2004).
Les enzymes lipolytiques de provenance pancréatique sont essentiels à l’hydrolyse des
lipides. La lipase pancréatique s’attaque aux liens en position sn-1 et sn-3 du triacylglycérol
pour libérer deux acides gras et un monoacylglycérol ayant un acide gras en position sn-2. La
phospholipase détache l’acide gras de la position sn-2 du phospholipide pour produire un
acide gras et un lysophospholipide. La cholestérol estérase dégrade l’ester de cholestérol en
acide gras et en cholestérol libre.
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
20
En effet, plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer le rôle du calcium
pouvant augmenter la lipolyse de plus de 87 % (Scow, 1988). Les ions calcium peuvent
moduler la vitesse de la lipase ou la phase de latence jusqu'à ce que l'activité enzymatique
maximale soit atteinte. Le calcium peut diminuer les répulsions électrostatiques se produisant
à l'interface émulsion-eau, mais un excès de calcium peut induire une coalescence des
particules émulsifiées. En fait, le rôle des ions calcium n'est toujours pas clair et, par
conséquent, la dépendance en calcium de la réaction lipolytique a été déterminée en présence
de différents substrats émulsifiés (Armand et al., 1992).
Bien que la lipase gastrique participe dans la digestion des graisses, la lipase
pancréatique reste le principal enzyme responsable de la digestion des lipides alimentaires.
Ceci explique l’association de son déficience avec plusieurs maladies (Buscail and Carrière,
2010). En effet, la réduction ou l'absence de la sécrétion de la lipase pancréatique, soit en
raison d'une carence en lipase ou dans des maladies telles que la fibrose kystique, la
pancréatite chronique, les tumeurs pancréatiques, ou après une chirurgie du pancréas, entraîne
une stéatorrhée et une malabsorption des lipides, qui sont préjudiciables et se produisent
généralement des années avant la malabsorption cliniquement pertinente des hydrates de
carbone ou des protéines devient évidente (Layer and Keller, 1999; Layer and Keller, 2005).
2.1.1.5.3. L’amylase
L'amylase également connue sous plusieurs autres appellations, dont saccharidase et
diastase est une enzyme qui catalyse l’hydrolyse de l’amidon en oligosaccharide plus courts,
une étape importante vers la transformation de l’amidon en unités simples qui peuvent être
assimilées par l’organisme (Iulek et al., 2000; Payan, 2004). L'histoire des amylases a
commencé en 1811 lorsque la première enzyme dégradant l'amidon a été découverte par
Kirchhoff (Gupta et al., 2003).
Plusieurs types d'amylases existent : alpha (3.2.1.1), bêta (3.2.1.2) et gamma (3.2.1.3)
(Yamamoto, 1995). La bêta-amylase et la gamma-amylase (glucoamylase) sont généralement
d'origine végétale ou microbienne quoique la glucoamylase a été retrouvée chez certains
mammifères ou espèces aquatiques (Shetty, 2006).
L'amylase pancréatique humaine est une alpha-amylase (EC 3.2.1.1) (figure 10). Son
poids moléculaire est de 55000 daltons et ayant un point isoélectrique à 7,0 (Lévy, 2006).
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
21
Cette enzyme est secrétée sous forme active puisqu’elle n’attaque pas le pancréas comme le
font les protéases pancréatiques (OpenStaxCollege, 2013). Son pH optimal varie selon les
auteurs entre neutre et alcalin (pH=8) alors que la présence de calcium est nécessaire à
l’activité de l’amylase (Bonnin, 2002; Despopoulos and Silbernagl, 2003; Taghipoor, 2012).
De plus, la présence de 1'ion chlorure ou d'autres anions contribue également à activer
cette enzyme, mais l'ion chlorure le fait d'une manière plus importante (Buisson et al., 1987).
L’hydrolyse par L’α-amylase aboutit principalement à la formation de maltose, de
maltotriose, de dextrine ainsi que des oligosaccharides variés (Kim et al., 2010).
Des enzymes, telles que la maltase, l’isomaltase, la 1-6-glucosidase, présentes à la
surface des villosités intestinales, complètent l’action de l’α-amylase, et permettent la
libération de glucose absorbable par les entérocytes (Tortora and Derrickson, 2009; Venel,
2009).
A l’état normal, l’amylase pancréatique représente 30 à 50 % de l’amylase sanguine
(Pieper-Bigelow et al., 1990). Ceci est bien sûr radicalement différent en cas de pancréatite
aiguë (Lévy, 2006). En effet, une élévation de l’amylase sérique est couramment rencontrée
dans un grand nombre de pathologies et des valeurs normales n’excluent pas une pancréatite
(Pibot et al., 2010). De plus, la digestion des glucides devient très difficile lors de déficit en
amylase et sa carence entraine des anomalies d’activités des enzymes intestinales
(Henroteaux, 1996).
2.1.2. Modèle de digestion
Pour étudier la digestion, les études expérimentales chez l’animal ou les essais
cliniques chez l’homme demeurent la meilleure approche. Cependant, les études cliniques de
digestion chez l’homme sont éthiquement et techniquement difficiles à mettre en place. Ces
études, également très couteuses, sont impossibles à réaliser en grand nombre (Ménard and
Dupont, 2014). En conséquence, des méthodes alternatives in vitro qui déterminent des
paramètres tels que la bioaccessibilité des nutriments et des éléments non nutritifs ou la
digestibilité des macronutriments (par exemple les lipides, les protéines et les hydrates de
carbone) sont utilisées pour le criblage et la construction de nouvelles hypothèses (Minekus et
al., 2014).
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
22
Figure 10. Diagramme de la structure de l'α-amylase (Payan, 2004)
Le domaine A est représenté en rouge, le domaine B en jaune et le domaine C en violet. L'ion
calcium (sphère bleue) et l'ion chlorure (sphère jaune) sont également montré à proximité
immédiate du centre catalytique. Un dérivé de l'acarbose ligand (représentation boule-et-bâton
en vert) est lié au site actif fendu. Ligands de monosaccharide et de disaccharide (dans la
représentation de boule-et-bâton) sont montrés liés aux sites de liaison de surface.
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
23
Les modèles de digestion in vitro devraient considérer trois principales étapes : la
digestion dans la bouche, celle dans l'estomac et la dernière au niveau du duodénum. Ces trois
phases peuvent être considérées séparément ou en combinaison en fonction de l'objectif de
l'étude (figure 11) (Wickham et al., 2009). En effet, les modèles in vitro de l'intestin grêle sont
utilisés pour la mise en évidence de la digestibilité des nutriments alors que le modèle du
côlon élucide le rôle du microbiote dans le métabolisme de tous les composants non
digestibles d’un aliment (Aura, 2005).
A l’heure actuelle, la digestion gastro-intestinale simulée est largement employée dans
beaucoup de domaines des sciences alimentaires et nutritionnelles sachant que les modèles de
digestion in vitro sont rapides, simples et relativement peu coûteux pour une évaluation plus
précise des risques sans l'utilisation d'animaux (Brandon et al., 2006).
D’un autre coté, bien que ces modèles soient très sophistiqués, ils ne reflètent pas
complètement les conditions digestives de l’homme. La grande complexité des matrices
alimentaires et les mécanismes intervenant dans le processus de digestion, encore
incomplètement définis, impliquent que, quel que soit le modèle de digestion, la
caractérisation du devenir des protéines alimentaires est une tâche très difficile (Picariello et
al., 2013).
En outre, la comparaison entre les systèmes in vitro est compliquée et il est difficile de
déterminer lequel des modèles actuels fournit les valeurs les plus précises en termes de la
situation humaine (Guerra et al., 2012) sachant que ces modèles diffèrent les uns des autres en
ce qui concerne le nombre et le type d'étapes incluses dans la digestion, la composition des
fluides digestifs ainsi que les contraintes mécaniques et les écoulements de fluides utilisés
dans chaque étape (Hur et al., 2011).
2.2. Les additifs alimentaires
À partir du moment où la disponibilité alimentaire est la règle, le choix de l’aliment se
fait non seulement sur la base de ses propriétés nutritionnelles mais aussi sur celle de ses
propriétés sensorielles. À l’aliment, on attribue une fonction « plaisir » liée, entre autre, à la
satisfaction des sens olfactifs : il doit être beau à la vue, bon au goût, avoir une odeur et une
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
24
Figure 11. Spécificité régionale du tractus gastro-intestinal humain mimé dans le modèle
digestif in vitro (Guerra et al., 2012)
Bouche :
Mastication et mélange de
l’aliment avec la salive.
• pH 5-7
• Temps de transit : 10 s à 2
minutes
• Enzymes salivaires (amylase,
lipase linguale)
Colon
• Fermentation microbienne
des aliments non digérés,
réabsorption d'eau
• pH 5-7
• Temps de transit : 12 à 24
heures.
•Microbiote
Estomac :
• Digestion mécanique et
enzymatique du bol
alimentaire.
• pH 1-5
• Temps de transit : 15 min à
3 heures
• HCl, pepsine, lipase
gastrique
Intestin :
Digestion et absorption des
nutriments.
• pH 6-7,5
• Temps de transit : 2 à 5 heures
• Suc pancréatique, bile,
NaHCO3
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
25
palatabilité caractéristiques et estimées du consommateur, et même être agréable à l’oreille
(Hyardin et al., 2007).
C’est dans ce contexte que les additifs alimentaires sont communément utilisés dans le
souci d’améliorer l’apparence, le goût, l’odeur, la couleur, la texture, la valeur nutritive et
pour la conservation dans le but de rendre les aliments plus attirants et plus appétissants
(Shawish et al., 2013). Plus précisément, d’après le comité FAO–OMS, un additif alimentaire
est défini comme « une substance dotée ou non d’une valeur nutritionnelle, ajoutée
intentionnellement à un aliment dans un but technologique, sanitaire, organoleptique ou
nutritionnel. Son emploi doit améliorer les qualités du produit fini sans présenter de danger
pour la santé, aux doses utilisées » (Dutau et al., 1996; Bourrier, 2006).
Les additifs sont listés en 24 catégories : colorants (cochenille, érythrosine, riz rouge,
annatto, tartrazine), conservateurs (lysosyme, sulfites, benzoates, nitrites), antioxygènes,
émulsifiants, sels de fonte, épaississants, gélifiants (carraghénanes, gommes adragantes),
stabilisants, exhausteurs de goût (diacétyl), acidifiants, correcteur d’acidité, antiagglomérants,
amidon modifié, édulcorants, poudre à lever, antimoussants, agents d’enrobage, agents
detraitement de la farine, affermissants, humectants, séquestrants, enzymes, agents de charge,
gaz propulseur et d’emballage (Sauvage, 2010).
Sur le marché européen, il y a une liste dont la lettre E est toujours suivie de 3 chiffres
pour permettre d’identifier les différentes catégories des additifs alimentaires. Cette liste
comprend : les colorants de E100 à E180, les agents conservateurs de E200 à E290, les agents
anti-oxygène de E300 à E321, Les agents de texture : émulsifiants, stabilisants, épaississants
et gélifiants de E322 à E495, les acides alcalis de E500 à E578, les révélateurs de goût de
E620 à E637 et divers de E900 à E927 (Vimont, 2008).
L’emploi des additifs alimentaires est rigoureusement réglementé et répond à une
évaluation scientifique approfondie en termes de sécurité sous le contrôle de l’Autorité
Européenne de Sécurité des Aliments (AESA) (Gallen and Pla, 2013). En Australie et en
Nouvelle‐Zélande, le processus d’approbation des additifs est rigoureux et fondé sur deux
principes : l’additif doit remplir une fonction technologique et, utilisé à la dose proposée, il ne
doit poser aucun risque pour la santé des consommateurs. La présence des additifs autorisés
doit être déclarée sur l’étiquette des aliments (Hayder et al., 2011). Parmi les additifs
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
26
alimentaires, les colorants sont ceux qui sont les plus utilisés et souvent par intérêt
économique.
2.2.1. Les colorants alimentaires
Depuis le début de l’humanité, les colorants ont été appliqués dans pratiquement
toutes les sphères de notre vie quotidienne pour la peinture et la teinture du papier, de la peau
et des vêtements, etc. Jusqu’à la moitié du 19ème siècle, les colorants appliqués étaient
d’origine naturelle qui sont obtenus à partir de produits d’origine animale ou végétale
(Hammami, 2008). Les premiers colorants connus sont ceux utilisés à Lascaux (France) ou à
Altamira (Espagne), datant du Magdalénien. Ces colorants sont des pigments minéraux :
oxydes de fer pour les jaunes, les ocres et les rouges, oxydes de manganèse pour les bruns.
Dès 1500 avant notre ère, les Egyptiens réalisent des teintures avec le safran (jaune), le pastel
(bleu) et la garance (rouge) (Chaguer, 2007).
Les colorants alimentaires étaient d’origine naturelle (carotte, betterave, peau de raisin
noir, safran, etc.) (Gallen and Pla, 2013). Ces colorants sont souvent ajoutés aux denrées
alimentaires et des boissons afin de fournir, d'intensifier ou de restaurer leur couleur pour
créer l'apparence de couleur désirée (Schenone et al., 2013). La couleur est un des facteurs les
plus influents dans l’acceptation de la nourriture et du comportement alimentaire et a été
utilisée pour affecter de façon spectaculaire la perception par les gens d'une variété de
différents aliments et boissons (Radder and Le Roux, 2005; Zampini et al., 2007).
Ce n'est qu'en 1856 que William Henry Perkin, en essayant de synthétiser de la
quinine artificielle à partir d’allyltoluidine pour soigner la malaria, a découvert la première
matière colorante synthétique. Il l’appela "mauve", c’est l’aniline qui est un colorant basique.
L'industrie des colorants synthétiques était alors née (Barka, 2008). La production annuelle
mondiale des colorants est estimée à 800.000 tonnes par an et environ 50% sont des colorants
azoïques (Szyguła et al., 2008; Greluk and Hubicki, 2011). En Europe, les principaux
colorants synthétiques utilisés sont présentés dans le tableau 4.
Les colorants synthétiques sont largement utilisés car ils présentent de nombreux
avantages par rapport aux colorants naturels tels que la grande stabilité à la lumière, l'oxygène
et le pH, uniformité de la couleur, l'homogénéité, la faible contamination microbienne et les
coûts de production relativement bas (Schenone et al., 2013). En outre, les colorants azoïques
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
27
constituent le plus grand groupe de colorants certifiés. Plus de 15 colorants azoïques sont
autorisés dans tous les aliments, à l'exception des viandes crues ou transformées, des fruits,
des légumes, du pain blanc, thé, café et lait (Ward, 1997). La tartrazine (E102) est le colorant
le plus fréquemment étudiée en termes de troubles de santé.
2.2.1.1. La tartrazine (E102)
2.2.1.1.1. Structure et propriétés
La Tartrazine aussi connu sous le nom de FD & C Yellow No. 5 est un colorant
synthétique azoïque de couleur jaune (Gao et al., 2011). C'est le sel trisodique d'hydroxy-5-
(sulfo-4-phényl)-1-(sulfo-4-phénylazo)-4-H-pyrazole carboxylate-3.Sa formule brute est :
C16H9N4Na3O9S2 (EFSA, 2009) et sa formule développée est représentée dans la figure 12.
C’est un dérivé de goudron de houille qui est utilisé pour colorer les aliments, les cosmétiques
et autres produits.
On le trouve dans certains jus de fruits, liqueurs, boissons gazeuses colorées,
poudings instantanés, mélanges à gâteaux, poudres pour pudding, soupes, sauces, crèmes
glacées, bonbons, chewing-gums, confitures, moutardes, yaourts et de nombreux plats
cuisinés (Mittal et al., 2007). Ce colorant est également utilisé dans des produits
pharmaceutiques et cosmétiques comme les savons, les shampoings, les produits capillaires,
les vitamines, les antiacides et les médicaments en capsules (Kobylewski and Jacobson, 2010;
Ghonimi and Elbaz, 2015).
La tartrazine est souvent utilisée dans les préparations culinaires en Algérie comme un
remplaçant du safran (Mehedi et al., 2009) et en Espagne, elle est utilisée pour colorer les
plats traditionnels tel que la paella.
2.2.1.1.2. Métabolisme
La tartrazine (E102) est soluble dans l’eau mais très peu métabolisée et absorbée par
voie orale. Les études publiées dans la littérature montrent que moins de 2% de la tartrazine
ingérée est effectivement absorbée (Murdoch et al., 1987; Soares et al., 2015). L'acide
sulfanilique est le principal métabolite résultant de la réduction de la tartrazine au niveau du
lien azoïque N=N.
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
28
Tableau 4. Liste des principaux colorants alimentaires synthétiques autorisés dans l’Union
Européenne (UE) (Issa, 2009)
Nom commercial Dénomination usuelle
E102 Tartrazine
E104 Jaune de quénoline
E110 Jaune orangé S
E122 L'azorubine ou carmoisine
E123 Amarante
E124 Rouge cochenille A
E127 Erythrosine
E128 Rouge 2G
E129 Rouge Allura AC
E131 Bleu Patenté V
E132 Indigotine ou carmin d'indigo
E133 Bleu Brillant FCF
E141 a. Complexes cuivriques des chlorophylles
b. Complexes cuivriques des chlorophyllines
E142 Vert S
E151 Noir Brillant BN ou Noir PN
E154 Brun FK
E155 Brun HT
Figure 12. Structure chimique de la tartrazine (Mittal et al., 2007)
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
29
Cependant, lorsque le E102 marqué avec le C14 du groupe phénylazo était administré
par voie intrapéritonéale chez le rat et le lapin, aucun acide sulfanilique radioactif n'a été
récupéré dans l'urine (Jones et al., 1964)
Dans la même étude, quand la tartrazine a été administrée par voie orale à des rats, des
lapins et des humains, l'acide sulfanilique a été récupéré dans l'urine. Ces résultats indiquent
que la réduction du E102 se produit via la flore gastro-intestinale. Par ailleurs, cette réduction
peut avoir lieu au niveau hépatique par voie enzymatique mais les enzymes hépatiques
jouerait seulement un rôle mineur dans ce métabolisme (Chung et al., 1992; de Aragão
Umbuzeiro et al., 2005). Selon l'Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (AESA)
(EFSA, 2009), les métabolites de la tartrazine peuvent être absorbés dans une plus grande
mesure que la tartrazine elle-même.
2.2.1.1.3. Réglementation
Ce colorant azoïque autorisé en tant qu'additif alimentaire dans l’UE est
précédemment évalué par le Comité mixte FAO / OMS d'experts des additifs alimentaires
(JECFA) en 1964 et du Comité scientifique Alimentaire (SCF) en 1975 et en 1984 et
également réévalué par EFSA en 2009. Ces comités ont établi une dose journalière acceptable
(DJA) de 0-7,5 mg/kg poids corporel (pc) / jour (JECFA, 1964; EFSA, 2009). En 2016, cette
dose est révisée par le JECFA qui a établi une nouvelle DJA de 0-10 mg / kg pc (JECFA,
2016).
L’utilisation de la tartrazine est également autorisée dans plusieurs pays autre que
l’UE. En Australie, selon TherapeuticGoods Administration (TGA), la tartrazine ne semble
pas représenter un risque pour le consommateur d'un point de vue toxicologique. En
Nouvelle-Zélande, l’utilisation de la tartrazine par voie orale est également permise et la
teneur en tartrazine dans les produits est soigneusement étiquetés conformément à la TGA
(2014).
2.2.1.1.4. Estimation de la consommation du E102
L’estimation de la consommation de la tartrazine varie considérablement d’un pays à
l’autre. En Australie, la consommation de la tartrazine chez les enfants âgés de 2 à 16 ans,
même avec la consommation quotidienne la plus élevée, se situe entre 0,21 et 0,38 mg / kg de
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
30
poids corporel ce qui correspond entre 3 à 5% de la DJA (TGA, 2014). En France, la
consommation de la tartrazine chez les enfants représente 37,2 % de la DJA (Elhkim et al.,
2007). En Corée, l’estimation de l’apport quotidienne du E102 était plus élevée chez les
enfants que chez les adultes mais ne dépasse pas 2,5 % de la DJA (Ha et al., 2013).
Une étude menée en Indonésie a révélé que la valeur moyenne de la tartrazine
consommée était de 231,24 μg / kg de poids corporel (3,08% de DJA) et que les enfants
représentent la population la plus exposée en raison de leur consommation alimentaire élevée
et de leur faible poids corporel (Anisyah et al., 2011). En plus, une étude britannique estime
que l'apport en tartrazine représente 52% de la DJA chez les jeunes enfants dans les pays de
l’UE (EC, 2001) alors qu’elle représente 0,4 % chez les enfants âgés de 3 à 14 ans selon une
autre étude faite au Brésil (Toledo et al., 1992)
Par contre, en Inde, la dose consommée de la tartrazine dépasse la DJA de 152% chez
les enfants de 1 à 10 ans (Tripathi et al., 2010). Une autre étude réalisée dans la ville de
Hyderabad, au sud de l'Inde a montré que la consommation de ce colorant a dépassé les
limites de la DJA de 104% (Rao et al., 2004). Ce dépassement est aussi trouvé au Kuwait
chez les enfants de 7 ans (Husain et al., 2006; Sawaya et al., 2008).
2.2.1.1.5. Détermination de la présence de la tartrazine dans les aliments
Le niveau d'exposition à la tartrazine et l’excès de la DJA dépendent non seulement de
la fréquence de la consommation des aliments contenant ce colorant, mais aussi de sa quantité
dans ces aliments dont l’excès est généralement lié à un manque de contrôle aux niveaux des
industries alimentaires. Dans l’Union Européenne(UE), la quantité maximale autorisée de
tartrazine dans les aliments est de 500 mg/kg (Scotter and Castle, 2004). L’étude de Amin et
al. (2014) a montré que la teneur en tartrazine était supérieure à la dose maximale permise de
300 mg /kg dans 10 échantillons de yaourts en Côte d’Ivoire. De plus, l'autorité indienne de la
sécurité alimentaire PFA (The Food Safety and Standards Authority of India) autorise
l'utilisation de huit colorants synthétiques dont la tartrazine dans des denrées alimentaires à
une dose de 100 mg/kg ou litre (PFA, 2004). Cependant, cette dose a été dépassée dans 53 %
des aliments comme cela a été montré par Dixit et al. (2011).
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
31
Aux États-Unis, ce contrôle semble être plus stricte, Bastaki et al. (2017) a conclu que
l'utilisation des colorants alimentaires telle qu'elle est actuellement pratiquée est sans risque et
n’entraîne pas une exposition excessive à la population.
Diverses techniques ont été utilisées pour déterminer la dose de la tartrazine dans les
aliments telles que la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) (Alves
et al., 2008), la spectrophotométrie (Badawy et al., 2011), l’électrophorèse capillaire (Süslü et
al., 2007), le dosage par voltamétrie (Ghoreishi et al., 2012), ELISA (Li et al., 2013) ou
encore en utilisant des capteurs potentiométriques (Shawish et al., 2013).
Dans ce sens, l’étude de (Dixit et al., 2011) révèle que la tartrazine est parmi les
colorants les plus utilisés en Inde et qu’elle est présente dans 570 échantillons, principalement
les confitures, les boissons et les bonbons. En Indonésie, les cinq aliments qui contiennent une
dose élevée de la tartrazine sont les nouilles instantanées, les boissons en poudre, gazeuses et
non gazeuses et les biscuits (Anisyah et al., 2011). De plus, selon une étude de (Sawaya et al.,
2008), la dose de la tartrazine dans certains aliments (chips, chocolat, bonbons, boissons,
jelly , chewing-gums) au Kuwait dépassent les doses autorisées en Australie, aux Etats-Unis
et même en Inde.
Vu le nombre croissant des études qui suggèrent le potentiel toxicologique de la
tartrazine, un contrôle strict de sa dose dans les aliments en forte consommation est une tâche
indispensable.
2.2.1.1.6. Toxicité de la tartrazine
2.2.1.1.6.1. Effet du E102 sur le système nerveux
La tartrazine est le colorant le plus fréquemment étudiée en termes d'intolérance
alimentaire, des changements de comportement et de l’hyperactivité chez les enfants (Ward,
1997). Les scientifiques ont découvert que la tartrazine augmentait l'excrétion urinaire de zinc
chez les enfants hyperactifs sachant que cet ion joue un rôle primordial dans le métabolisme
des neurotransmetteurs comme la dopamine ce qui suggère un lien entre la consommation de
la tartrazine et le trouble de déficit de l’attention/ hyperactivité (TDAH) (Ward et al., 1990;
Stevens et al., 2013).
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
32
D’un autre coté, les résultats d'une étude réalisée dans le Royaume-Uni par des
chercheurs du l'Université de Southampton a révélé un lien entre la consommation de
colorants alimentaires synthétiques dont la tartrazine et/ou conservateurs et l’augmentation
des symptômes du TDAH chez les enfants de 3 ans et de 8/9 ans dans la population générale
(McCann et al., 2007). Il est aussi possible que ces colorants alimentaires synthétiques
puissent interagir avec des facteurs génétiques et agissent pour déclencher le désordre
(Kleinman et al., 2011). Suite à cette étude, la Food Standards Agency (FSA) a suggéré que
les parents d'enfants présentant des signes d'hyperactivité pourraient choisir d'éviter de donner
les colorants utilisés dans l'étude dont la tartrazine à leurs enfants (FSA, 2007) . Selon Kamel
and El-lethey (2011), la tartrazine peut induire des effets néfastes liés à l’anxiété et la
dépression chez le rat. En outre, plusieurs études ont trouvé que la tartrazine peut produire des
effets nocifs sur le système nerveux et les paramètres comportementaux (Tanaka, 2006;
Tanaka et al., 2008; Park et al., 2009).
Dans une étude menée par Goldenring et al. (1982), l'acide sulfanilique, le métabolite
majeur de la tartrazine a été administré à des rats post-nataux via une injection
intrapéritonéale pour examiner son impact sur le comportement. Les chercheurs ont observé
une hyperactivité et une altération des performances chez les rats ayant reçu l’acide
sulfanilique.
2.2.1.1.6.2. Effet du E102 sur le système immunitaire
La tartrazine est responsable de réactions allergiques comme l'urticaire, l'asthme, le
purpura et l'eczéma chez les individus allergiques à l'aspirine, le mécanisme immunologique
reste mal connu (Moutinho et al., 2007).
Dans son rapport, le comité de EFSA (2009), a déclaré que les données provenant
d'études animales et humaines n'ont pas démontré de manière convaincante que la tartrazine
est capable d'induire une réponse immunitaire (hypersensibilité) et les réactions indésirables
rapportés chez l'homme après une exposition à la tartrazine semblent être des réactions
d'intolérance. Toutefois, compte tenu des informations disponibles, le comité conclut que la
tartrazine peut induire des réactions d'intolérance chez une minorité de la population, même
au delà de la DJA.
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
33
D’autre part, l’ingestion du E102 provoque une augmentation du nombre de
lymphocytes gastriques chez des rats (Moutinho et al., 2007) ainsi qu'un effet immuno
dépresseur sur la réponse immunitaire humorale chez des souris mâles (Guendouz et al.,
2013). Il a également été démontré que ce colorant pourrait avoir des effets délétères sur la
prolifération des lymphocytes, induisant la mort cellulaire et agissant sur l'ADN des
lymphocytes tout en causant une déficience de la réponse immunitaire (El Golli, 2016).
2.2.1.1.6.3. Effet du E102 sur le système reproductif
Les études qui ont visé l’effet de la tartrazine sur le système reproducteur présentent
aussi une contradiction. Les recherches de Tanaka (2006)et Tanaka et al. (2008) ne montrent
pas un effet adverse de la tartrazine sur la reproduction. A l’inverse, Mehedi et al. (2009), ont
montré que l'administration de la tartrazine diminue le nombre et la motilité des
spermatozoïdes et induit des anomalies du sperme et des dommages au niveau de la structure
du testicule. Cet effet a été confirmé par (Boussada et al., 2017) qui ont montré une
diminution du taux de la testostérone induite par la tartrazine ainsi qu’une réduction de la
densité des spermatozoïdes tout en provoquant des lésions testiculaires ce qui peut contribuer
à l’altération de la fertilité chez le rat.
La tartrazine semble être capable d’initier la mobilisation du zinc des testicules, un
élément essentiel pour la croissance et le fonctionnement normal des spermes
(spermatogenèse). En plus les animaux traités à la tartrazine montrent une architecture
défectueuse des tubes séminifères ce qui prouve l’impact négatif de ce colorant sur la fonction
reproductrice mâle (Visweswaran and Krishnamoorthy, 2012).
Une étude in vitro sur des cellules humaines issues du cancer du sein a montré que le
E102 peut agir comme un xénoestrogène en interagissant avec les récepteurs de l’œstrogène
ce qui favorise une perturbation endocrinienne (Axon et al., 2012).
2.2.1.1.6.4. Effet du E102 sur les tissus et les paramètres biochimiques
En ce qui concerne les paramètres biochimiques, plusieurs études ont mentionné
l’implication de la tartrazine dans l’altération de ces paramètres au niveau de plusieurs
organes. Amin et al. (2010) ont rapporté que le E102 provoque une augmentation significative
de l’activité de l’alanine-aminotransférase (ALT), l’aspartate-aminotransférase (AST) et de la
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
34
phosphatase alcaline (ALP), ainsi que les taux de l'urée, de la créatinine totale et de la sérum
albumine chez des rats ayant reçu de la tartrazine aux doses 10 et 500 mg/kg/jour. De même,
El Golli (2016) a montré une augmentation significative des transaminases dans le plasma des
rats traités à la tartrazine à la dose de 300 mg/kg/jour. Dans une autre étude, et suite à
l’ingestion du E102 pendant 25 jours par des souris Swiss, les taux sériques de triglycérides,
de créatinine et de bilirubine étaient significativement augmentés, tandis que le taux de
cholestérol était diminué (Arefin et al., 2017). Cette altération des paramètres biochimiques
est aussi observée par Sharma et al. (2009), Himri et al. (2011), El-Wahab and Moram (2013),
Mehedi et al. (2013), Saxena and Sharma (2014) et Tawfek et al. (2015).
En effet, la tartrazine affecte les différents paramètres biochimiques, en particulier
ceux liés aux organes vitaux spécialement le foie et les reins ainsi que la modification du
profil lipidique. D’un autre coté, le changement du poids absolu et relatif des organes est un
signe de toxicité. La tartrazine est capable d'augmenter le poids du cœur et des rein des souris,
diminue le poids moyen du foie (Arefin et al., 2017), du thymus et de la rate (Guendouz et al.,
2013). En outre, l’administration du E102 provoque des lésions histologiques sévères au
niveau de plusieurs tissus comme le foie, les reins , les testicules, le cerveau, le thymus, la
rate, le jéjunum et l’estomac (Moutinho et al., 2007; Gao et al., 2011; Himri et al., 2011;
Guendouz et al., 2013; Ghonimi and Elbaz, 2015).
2.2.1.1.6.5. Génotoxicité du E102
Le débat sur l'effet génotoxique de la tartrazine est controversé. En utilisant le tests des
comètes (Comet assay), une technique capable de détecter une grande variété de dommages à
l'ADN et des lésions telles que la rupture de l'ADN simple brin, double brin ainsi que des
dommages au niveaux des bases nucléotidiques (Tice et al., 2000), Sasaki et al. (2002) ont
montré que le E102 consommé à des doses égales à la DJA induit des altérations d’ADN au
niveau du colon tandis que Hassan (2010) a observé le même effet au niveau du foie et les
reins chez les rats. En revanche, selon Poul et al. (2009), la tartrazine n’a pas provoqué des
effets génotoxiques lorsque elle a été administrée deux fois, à 24 heures d’intervalle, par
gavage oral aux souris. Ce colorant azoïque a également un potentiel toxique sur les
leucocytes en liant directement à l’ADN (Mpountoukas et al., 2010; Soares et al., 2015;
Khayyat et al., 2017).
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
35
2.2.1.1.6.6. Cancérogénicité du E102
Plusieurs chercheurs se sont intéressés à l’étude du pouvoir cancérigène de la
tartrazine mais à l’heure actuelle aucune étude n’a montré un tel effet.Soares et al. (2015) ont
trouvé que le E102 provoque des dommages au niveau de l’ADN et que certains d’entre eux
étaient irréparables. Ceci suggère que l’utilisation de la tartrazine pendant une longue période
pourrait avoir un effet cancérigène puisque l’accumulation des erreurs successives d’ADN
peut affecter les gènes liés au contrôle du cycle cellulaire. Selon Raposa et al. (2016), le E102
peut contribuer de manière dose-dépendante à l'activation des voies inflammatoires ce qui
favorise le développement des cancers.
2.2.1.1.6.7. Le E102 et le stress oxydatif
Le stress oxydatif, parfois appelé stress oxydant, se définit comme étant un
déséquilibre de la balance oxydants-antioxydants en faveur des oxydants (Atamer et al.,
2008). Il se développe lorsque les radicaux libres, des molécules oxydantes, sont produits plus
rapidement qu'ils ne peuvent être neutralisés par l'organisme (Rioux, 2009). A l’état
physiologique, le métabolisme de l’oxygène dans les cellules entraine la production d’espèces
réactives de l’oxygène (ERO). Ces derniers participent dans plusieurs fonctions biologiques
(Nordberg and Arnér, 2001). Toutefois, en concentrations élevées, ils deviennent hautement
cytotoxiques en engendrant de sérieuses altérations aux cellules pouvant mener à la mort
cellulaire (Zou et al., 2008).
Plusieurs études ont corrélé la consommation de la tartrazine avec l’induction du stress
oxydatif. Les résultats de l’étude de El Golli (2016) a révélé un important déséquilibre entre
les marqueurs pro- et antioxydants au niveau du sang, reins, foie et la rate chez les rats ayant
reçus de la tartrazine pendant un mois. La tartrazine peut surproduire les ERO et augmenter le
stress oxydatif dans le foie et les reins (Amin et al., 2010; Himri et al., 2011) au niveau de
l’appareil reproducteur mâle (Visweswaran and Krishnamoorthy, 2012; Boussada et al., 2017)
ainsi que le cerveau (Gao et al., 2011).
2.2.1.1.6.8. Effet du E102 sur le système digestif
Même si de nombreuses études ont été menées pour étudier les effets toxiques de la
tartrazine sur la santé, peu d'entre elles ciblent le système digestif. Selon ces études, la
RAPPEL BIBLIOGRAPHIQUE
36
tartrazine peut induire des dommages de l'ADN dans l'estomac et le côlon ainsi que des
modifications dégénératives de la muqueuse gastrique (Sasaki et al., 2002; Ghonimi and
Elbaz, 2015). En Outre, une étude in vitro a révélé que la tartrazine interagit avec des acides
aminés composant la trypsine -une enzyme cruciale dans la digestion- ce qui provoque
l’inhibition de son activité enzymatique (Wang et al., 2012).
MATERIEL ET METHODES
37
3. Matériel et méthodes
3.1. Effet de la tartrazine sur les activités enzymatiques digestives in vivo et in
vitro
3.1.1. Produits et réactifs
Les produits utilisés dans cette partie sont répertoriés dans le tableau 5. Ce tableau
spécifie également la provenance de chacun des produits. En ce qui concerne les appareils de
laboratoire et les logiciels, leur provenance est spécifiée directement dans le texte de
description des méthodes.
3.1.2. Etude in vivo
L’objectif de cette partie est de mesurer l’activité enzymatique des protéases (trypsine
et chymotrypsine), l’amylase et la lipase chez les souris Swiss après une ingestion
subchronique de la tartrazine pour évaluer la toxicité de ce colorant.
3.1.2.1. Modèle animal et conditions d’élevage
Nos expériences sont menées sur des souris Swiss. Ces animaux constitués de deux
sexes ont été acquis auprès de l’Institut Pasteur d’Alger (IPA). Les souris sont mises en
reproduction et élevées dans l’animalerie du Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de
la Sécurité Alimentaire (LPNSA) dans des conditions environnementales contrôlées. La
température est ajustée autour de 20°C. Les souris sont nourries avec une nourriture standard,
correspondant à un aliment pour rongeurs commercialisé par l’ONAB.
3.1.2.2. Protocole expérimental
L’étude porte sur 60 souris de souche Swiss (30 mâles et 30 femelles), âgées de 4
semaines ayant un poids de 14,71±0,11g. Les souris ont été réparties en trois groupes
expérimentaux, comprenant chacun 10 mâles et 10 femelles. Le premier groupe est celui des
témoins. Ses sujets reçoivent de l’eau du robinet sans colorant. Les deux autres groupes ont
reçu de la tartrazine diluée dans l'eau respectivement à 0,005% (faible dose) et à 0,05% (forte
dose).
MATERIEL ET METHODES
38
Les animaux sont placés à raison de dix sujets par cage avec libre accès à l’eau de
boisson (avec ou sans tartrazine) et à la nourriture pendant 13 semaines. Une mesure
quotidienne de la consommation d’aliment (g) et de l’absorption de la solution de tartrazine a
été effectuée en plus d’une pesée hebdomadaire du poids corporel des souris de chaque
groupe et ce afin de suivre leur évolution pondérale.
3.1.2.3. Obtention des échantillons
Au bout des 13 semaines d’expérience, les souris ont été sacrifiées par dislocation
cervicale. Le pancréas de chaque animal a été rapidement excisé, pesé, homogénéisé à l’aide
d’un Potter (avec un piston en téflon) dans une solution de Ringer (contenant en mmol/l :
Na+ : 140, K+ : 5.2, Ca++ :1.2, Cl- :120,HCO-3 : 25,HPO4
- :0.4) et conservé à -20 ºC sous forme
d’aliquotes jusqu'à utilisation. Le pancréas est homogénéisé dans un rapport de 25 mg par ml.
Toutes les opérations sont effectuées à 0°C pour bloquer les activités enzymatiques.
3.1.2.4. Dosage des protéines totales selon la méthode de Lowry et al. (1951)
Cette méthode est basée à la fois sur la réaction de Biuret, dans laquelle les liaisons
peptidiques des protéines réagissent avec le cuivre dans des conditions alcalines pour produire
Cu + et sur la réaction de Folin-Ciocalteu dont le réactif Folin à base de phosphomolybdate et
de phosphotungstate est réduit en bleu hétéropolymolybdène par le complexe cuivre-protéine.
Cette couleur bleue dépend de la teneur en tyrosines et en tryptophanes (Lowry et al., 1951).
Le dosage des protéines totales se fait sur les homogénats des pancréas des souris
témoins et des souris traitées. La lecture se fait au spectrophotomètre (Tecan Group Ltd,
Suisse) par mesure de l’absorbance à la longueur d’onde λ=750 nm. La concentration en
protéines est mesurée par comparaison à une courbe étalon établie avec la sérum albumine
bovine (SAB).
3.1.2.5. Détermination de l’activité enzymatique de la trypsine et la chymotrypsine
La trypsine et la chymotrypsine sont des endopepetidases sécrétées par le pancréas
sous forme de zymogènes et elles sont actives en pH alcalin. Tandis que la trypsine hydrolyse
les liens peptidiques au niveau de la lysine et de l'arginine, la chymotrypsine clive
MATERIEL ET METHODES
39
Tableau 5. Liste des produits utilisés : Etude in vivo et in vitro
Produits Fabricant
Tartrazine
SAB
Chem (Inde)
Sigma-Aldrich (Espagne)
BAPNA Sigma-Aldrich (France)
BTEE Sigma-Aldrich (France)
Amidon soluble
BALB
Scharlau (Espagne)
Sigma-Aldrich (Espagne)
Pancréatine
Lécithine
Sels biliaires
Sigma-Aldrich (Espagne)
Sigma-Aldrich (Espagne)
Sigma-Aldrich (Espagne)
MATERIEL ET METHODES
40
sélectivement les liaisons peptidiques formées par les résidus aromatiques (tyrosine,
phénylalanine et tryptophane) (Hedstrom, 2002). L’activité de la trypsine est mesurée par
l’hydrolyse du substrat L.Benzoyl- Arginine p-nitroAniline (BAPNA) 1 mM dans un tampon
Tris (50 mM trizma, 20 mM CaCl2, pH 8.2) (Faulk et al., 2007). L’hydrolyse du BAPNA
libère la para-nitroaniline jaune. Ce produit de la réaction a un maximum d’absorption pour
=410 nm. Brièvement, 20 µl de chaque échantillon d'homogénat pancréatique sont mis dans
un puits d'une microplaque à 96 puits. Ensuite, 100 µl du tampon Tris contenant la BAPNA
ont été ajoutés rapidement à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. La plaque est
incubé durant 30 minutes à 37 ºC. La production de p-nitroaniline est mesurée à 410 nm en
utilisant un lecteur de plaques (Tecan Group Ltd, Suisse).
L’activité de la trypsine est présentée en unités sachant que 1 unité correspond à la
production de 1 µmol de p-nitroaniline par minute. Pour cela une courbe étalon établie avec la
p-nitroaniline a été utilisée. Pour le dosage de la chymotrypsine, un volume de 1,5 ml de
tampon Tris (80 mM, pH 7,8) contenant 100 mM de CaCl2 est mélangé avec 1,4 ml de
solution BTEE (1,07 mM). Par la suite, 50 µl d'homogénat pancréatique de chaque
échantillon sont ajoutés au réactif réactionnel (Rick, 1976). L’absorbance du mélange a été
déterminée à 256 nm pendant 20 minutes d’incubation à 37 ºC en utilisant un
spectrophotomètre (Evolution 600 Thermoscientific, UK).
L’activité de la chymotrypsine est calculée selon l’équation suivante :
U=106[(∆𝐴256)×(∆t)-1]×(ɛl)-1(Vt×Vs) où :
• U est la quantité d'enzyme qui catalyse l’hydrolyse de 1 µmole de BTEE par minute
• ∆𝐴256 représente l’augmentation de l’absorbance par minute obtenue à partir du taux
linéaire maximum et dépendant de ∆t qui représente le changement dans le temps
• ɛ est le coefficient d'extinction molaire de la BTEE à 256 nm (= à 964 (L/(mol × cm)
• l est le chemin optique de la cuve (=1 cm)
• Vt est le volume total utilisé
• Vs est le volume de l’échantillon
• 106 est un facteur de correction.
MATERIEL ET METHODES
41
3.1.2.6. Détermination de l’activité enzymatique de la lipase
L'activité lipasique a été déterminée selon la méthode BALB-DTNB (Furukawa et al.,
1982). L’homogénat pancréatique (50 µl) a été mélangé avec 1 ml d’acide 5,5′-dithiobis 2-
nitrobenzoique (DTNB) 0,3 mM et 20 µl de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Le
mélange a été incubé à 37 °C pendant 5 minutes. Ensuite, 100 µl d'une solution de BALB (20
mM dimercaproltributyrate et 20 mM de dodécylsulfate de sodium SDS dans l'éthanol) sont
ajoutés et incubés à 37 °C pendant 30 minutes. La réaction est arrêtée en ajoutant 2 ml
d'acétone.
Concomitamment, un échantillon zéro de chaque essai a été préparé comme décrit ci-
dessus mais sans addition de substrat. Les valeurs de l'absorbance à 412 nm ont été
enregistrées à l’aide d’un spectrophotomètre (Evolution 600 Thermoscientific, UK). Une
unité BALB de lipase est définie comme l'activité enzymatique donnant une différence
d'absorbance de 0,001 à 412 nm lorsque 50 µL d'échantillon sont dosés selon les conditions
précédentes. L'activité enzymatique a été exprimée en unités internationales (IUB) comme
décrit par Furukawa et al. (1982).
3.1.2.7. Détermination de l’activité enzymatique de l’amylase
L'activité amylasique est déterminée en se basant sur la libération de maltose à partir
d'amidon soluble selon la méthode de Silva et al. (2001) légèrement modifiée. L'homogénat
de pancréas a été décongelé à température ambiante juste avant la détermination de l'activité
enzymatique. Brièvement, 25 µl d'homogénat pancréatique sont mélangés avec 25 µl de
substrat (1% d'amidon soluble dans un tampon de sodium 20 mM pH = 6,9 contenant 0,6 mM
de NaCl).
Le test est suivi par l'addition de 200 µl de l'acide 3,5-dinitrosalicylique (DNS). La
solution a été incubée à 100 °C pendant 10 minutes. Après refroidissement, 1 ml d'eau
distillée est ajouté. L’absorbance est lue à 550 nm. Une unité d'enzyme correspond à la
quantité d'enzyme qui produit 1 µmol d'équivalent de maltose par minute. Pour cela une
courbe étalon avec des quantités de maltose connues est établie.
Pour tous les dosages, un blanc approprié est utilisé et toutes les activités
enzymatiques sont exprimées en unité par g de pancréas par min.
MATERIEL ET METHODES
42
3.1.3. Etude in vitro
Dans cette partie, l’activité enzymatique de la trypsine et la chymotrypsine a été
mesurée après l’utilisation d’un model de digestion qui imite l’appareil digestif pour mettre en
évidence la relation entre la toxicité probable de la tartrazine et la nature des aliments ingérés.
3.1.3.1. Protocole expérimental
Du riz, du beurre et du lait dégraissé ont été acquis auprès d’un supermarché local. Ces
aliments ont été digérés in vitro sans tartrazine (contrôle), et avec 7,5 mg ou 75 mg de
tartrazine selon la méthode de (Martin et al., 2010). Brièvement, les échantillons alimentaires
(500 mg) avec / sans tartrazine ont été mélangés dans un mortier pendant 2 min à 5 ml de
salive humaine obtenue de chez un volontaire, et à 5 ml d'eau du robinet, simulant le
processus de mastication.
Ensuite, la digestion au niveau de l'estomac a été simulée en ajoutant de l'eau acidifiée
(pH = 2) contenant 0,275 g de pepsine. La solution a été transférée ensuite dans un récipient
thermostaté à 37 ° C (Titrino plus Metrohm 877, Suisse).
Après une heure, la digestion intestinale a été simulée par addition de 5 mM CaCl2,
150 mM de NaCl et 6 ml d'une solution pancréatique (pancréatine (20 mg, 4 × USP), extrait
de bile (633 mg) et phosphatidylcholine (228 mg) dans un tampon de trizma-maléate 50 mM
pH 7,5). Le pH a été ajusté et maintenu à 7,5 avec du 0,5 M NaOH. Au bout de deux heures,
des aliquotes de la suspension de digestion ont été recueillis et stockés à -20 ° C jusqu'à
utilisation.
Les activités enzymatiques de la trypsine et de la chymotrypsine ont été déterminées
en utilisant les méthodes décrites ci-dessus pour les homogénats pancréatiques. Les digestions
ont été réalisées en double.
3.2. Effet de la tartrazine et de son métabolite sur le pancréas exocrine : Etude ex vivo
3.2.1. Produits et réactifs
Les produits et réactifs ainsi que la lignée cellulaire utilisés sont indiqués dans le tableau 6.
MATERIEL ET METHODES
43
3.2.2. Protocole expérimental
Des cellules acinaires isolées à partir du pancréas des souris Swiss et des cellules
AR42J commercialisées ont été utilisées dans cette partie.
3.2.2.1. Mesure microfluorimétrique du calcium libre intracellulaire par
l’imagerie en temps réel « Real time imaging »
L’objectif de cette partie est d’évaluer l’effet de la tartrazine et de l’acide sulfanilique
(AS) sur l’homéostasie calcique sachant que cet ion représente un second messager universel
impliqué dans de nombreuses fonctions cellulaires (Berridge et al., 2003; Petersen, 2005).
Pour cela, une technique de Real imaging a été utilisée.
Les animaux utilisés (souris Swiss agées de 6 semaines) ont été fournis par
l’animalerie de l'Université d'Estrémadure (Cáceres, Espagne). Ils sont manipulés
humainement et sacrifiés conformément au comité de bioéthique institutionnel.
Les cellules acinaires ont été isolées à partir du pancréas selon la méthode de
(Williams, 2010). Brièvement le pancréas est prélevé, lavé avec une solution Na-HEPES
d’isolement, une solution physiologique contenant en mM : 130 NaCl, 4,7 KCl, 1,3 CaCl2, 1
MgCl2, 1,2 KH2PO4, 10 glucose, 10 HEPES, 0,2% (p / v) de SAB et 0,01 % de inhibiteur de
la trypsine (pH = 7,4 ajusté avec 1M de NaOH).
Ensuite, 0,5 ml de solution de collagénase (100 unités dans 0,5 ml de Na-Hepes) est injecté
dans le pancréas pour la dissocier et une incubation de 10 minutes à 37 ºC dans un bain marie
avec agitation a été effectuée. A la fin de l’incubation, le tissu pancréatique est délicatement
coupé en petits morceaux avec un ciseau et le mélange est centrifugé 30xg pendant 5 minutes
à 4 ºC. Le surnageant qui contient la collagénase est éliminé et le tissu pancréatique est
mélangé avec le Na-HEPES d’isolement et pipeté plusieurs fois jusqu'à l’obtention d’un
liquide turbide de préférence ne contenant pas de grands morceaux. En cas ou ces derniers
persistent, la suspension cellulaire est filtrée sur un tamis.
La suspension est centrifugée une autre fois et le culot est mis en suspension dans le
Na-HEPES d’isolement. Des cellules acinaires isolées ainsi que des acini sont obtenus. Elles
sont incubées avec une sonde fluorescente possédant une affinité pour le calcium : (Fura-2)
MATERIEL ET METHODES
44
Tableau 6. Liste des produits utilisés : Etude ex vivo
Produits Fabricant
AR42J
BAPNA
BAPTA
SAB
CCK-8
Tampon de lyse cellulaire
Dexaméthasone
Entérokinase
EGTA
FCCP
TMRM
Acidesulfanilique
Trypsine
Thapsigargine
Inhibiteur de protéase
Fura-2
MitoSOXTMRed
CM-H2DCFDA
Trypsine-EDTA
RPMI
FBS
Pénicilline/Streptomycine
L-Glutamine
Tampon Tris/glycine/SDS (10x)
Tampon Tris/glycine (10x)
Anticorps anti-alfa actine
Anticorps anti SOD2
Tampon de lyse cellulaire
Réactif de BRADFORD
STAB-UEX (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Life Technologies (Invitrogen, Espagne)
Life Technologies (Invitrogen, Espagne)
Life Technologies (Invitrogen, Espagne)
Life Technologies (Invitrogen, Espagne)
HyClone (Fisher Scientific Inc., Espagne)
HyClone (Fisher Scientific Inc., Espagne)
BioWhittaker (Lonza, Basel, Suisse)
BioWhittaker (Lonza, Basel, Suisse)
Bio-Rad (Espagne)
Bio-Rad (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Santa Cruz Biotechnology (Espagne)
Sigma Chemicals Co. (Espagne)
Bio-Rad (Espagne)
MATERIEL ET METHODES
45
sous sa forme ester acétoxyméthylique (Fura-2 AM) à une concentration de 4 µM pendant 40
minutes à 37 ºC et à l’abri de la lumière.
La sonde diffuse à travers la membrane cellulaire et elle est clivée par les estérases
intracellulaires pour générer ensuite la sonde fluorescente. Ensuite, pour éliminer les sondes
restantes à l’extérieur des cellules, une centrifugation pendant 5 minutes à 30 xg a été
effectuée. Le culot est mis en suspension dans un tampon Na-HEPES fraiche dont la
composition en mM est la suivante 140 NaCl, 4,7 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 Hepes, 10
glucose, pH à 7,3, ajusté avec une solution de NaOH (1M).
100 µl de la suspension cellulaire sont déposés sur une lamelle introduite dans une
chambre de perfusion conçue à cet effet. Les variations de la concentration de calcium
intracellulaire ([Ca2+]i) induits par les différentes doses de la tartrazine (0,1mM, 1mM, 5mM,
10 mM) ou de l’acide sulfanilique (AS) (1 µM, 10 µM, 100 µM, 1 mM ) ou encore par la
CCK (control positif) sont mesurés par la technique de Real imaging. Cette technique permet
de quantifier la fluorescence en utilisant un microscope inverse de fluorescence (modèle
Diaphot 200 de NIKON) muni d’un système d’acquisition et d’analyse des images
(Hamamatsu Photonics).
Le Fura-2/AM est excité à deux longueurs d’onde suivantes : 340 nm et 380 nm avec
la lumière ultraviolette d’un monochromateur (Polychrome IV, Photonics) et émets la
fluorescence à 505 nm. Les résultats sont exprimés par le rapport des valeurs de la
fluorescence émise aux deux longueurs d’onde d’excitation.
3.2.2.2. Détermination des changements de [Ca+2] libre sur les cellules AR42J
Les cellules AR42J dérivent initialement d'une tumeur transplantable d'un pancréas de
rat. Elles sont utilisées comme un modèle in vitro pour l’étude du pancréas exocrine grâce à
leurs caractéristiques comme la signalisation calcique et la sécrétion des enzymes digestives
(Christophe, 1994). Dans cette partie du travail, les cellules AR42J ont été cultivées selon la
technique de Gonzalez et al. (2011).
Les cellules ont été maintenues dans un milieu RPMI 1640 supplémenté de 10% de
sérum de veau fœtal (SVF), 2 mM de la L-Glutamine et une association d’anticorps (0,1
MATERIEL ET METHODES
46
mg/ml de streptomycine et 100 UI de pénicilline). Elles sont placées dans un incubateur
thermostaté à 37°C ayant une atmosphère humidifié et contenant 5% de CO2.
Entre chaque renouvellement du milieu de culture ou avant d’être décollées de leur
support, les cellules sont rincées avec le tampon phosphate salin (PBS de l'anglais phosphate
buffered saline) contenant 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04; le
pH est ajusté à 7,4 avec du NaOH 1 M. Lorsque les cellules sont confluentes à 75 à 80 %,
elles sont ensemencées. Afin de faciliter le décollement des cellules de leur support (boites de
pétri), les cellules sont mises en contact pendant deux minutes avec une solution de trypsine-
EDTA. Puis, une centrifugation de 30xg pendant 5 minutes a été effectuée.
Le culot de cellules est repris dans le milieu de culture RPMI 1640 afin de prélever les
cellules en suspension et de nouvelles boites sont préparées. Quarante-huit heures avant
l'utilisation, les cellules sont incubées dans un milieu de culture additionné de 100 nM de
dexaméthasone pour maintenir un phénotype acinaire.
Ensuite, pour Déterminer les changements de [Ca+2] libre, les cellules AR42J ont été
détachées, remises en suspension dans la solution Na-HEPES d’isolement et chargées pendant
40 minutes à température ambiante (23 à 25 ºC ) avec la même sonde fluorescente le Fura-
2/AM utilisé dans la technique de l’imagerie en temps réel.
Les changements des signaux de fluorescence ont été surveillés en plaçant une
aliquote de 2 ml de cellules AR42J dans une cuvette de quartz dans un spectrofluorimètre
(RF-5001-PC; Shimadzu,Kyoto, Japon) relié à un bain marie pour maintenir les cellules à
37°C. Un barreau magnétique a permis d’effectuer une agitation tout au long de
l’enregistrement. Tous les stimuli (control négatif, control positif et les différentes
concentrations d’AS) ont été ajoutés directement aux cellules dans la cuve pour achever la
concentration requise. Les changements de la concentration du calcium intracellulaire
([Ca]i+2) ont été exprimés en ∆Ratio, calculé comme la différence entre les pics du rapport
F340/F380. Les expériences sont réalisées en employant différents lots de cellules.
MATERIEL ET METHODES
47
3.2.2.3. Détermination de l’oxydation
3.2.2.3.1. Détermination de la libération des ERO par spectrofluorimétrie
Dans cette partie les deux types cellulaires ont été utilisés : les cellules acinaires et les
AR42J. Le statut redox des cellules a été déterminé en utilisant deux indicateurs du stress
oxydatif : CM-H2DCFDA et MitoSOXTMRed. La fluorescence a été mesurée selon la
technique de Gonzalez and Salido (2016).
Pour les cellules acinaires isolées à partir du pancréas des souris Swiss, les expériences
ont été réalisées en utilisant les deux indicateurs. Le Diacétate de 5-(et-6) -chlorométhyl-2’,
7’dichlorodihydrofluorescéine (CM-H2DCFDA), un dérivé de H2DCFDA. Ce dernier pénètre
dans la cellule ou il sera transformé par des estérases cellulaires en 2’, 7’-
dichlorodihydrofluorescéine (H2DCF). Les ERO intracellulaires peuvent alors oxyder le
H2DCF (non fluorescent) et le convertir en DCF, qui émet une fluorescence (Ubezio and
Civoli, 1994). Les cellules acinaires sont alors incubées avec le CM-H2DCFDA (10 μM)
pendant 40 min à température ambiante (23-25 ºC).
D’un autre coté, les cellules AR42J détachées et mises en suspension dans le Na-
HEPES ainsi que le reste des cellules acinaires sont incubées avec le MitoSOXTMRed (2,5 μM
) pendant 15 minutes à 37ºC. Cet indicateur est un dérivé cationique du dihydroéthidium,
conçu pour la détection hautement sélective du superoxyde dans les mitochondries des
cellules vivantes. Après le chargement de la sonde, les cellules ont été centrifugées (30 xg),
remises en suspension dans du tampon Na-HEPES frais et utilisées immédiatement.
100 µl de la suspension des cellules acinaires ou AR42J préalablement incubées avec
CM-H2DCFDA ou MitoSOXTMRed sont mises sur un puits d’une plaque ELISA. Ensuite les
différentes concentrations de AS sont ajoutées selon un ordre décroissant (1 mM, 100 µM, 10
µM, 1 µM). Des cellules non traitées avec AS ont été utilisées comme témoin négatif alors
que le contrôle positif s’agit des cellules incubées avec le CCK-8 (1nM) ou le H2O2 sans
cellules à une concentration de 10 µM.
La fluorescence cellulaire pour le CM-H2DCFDA a été déterminée à 530 nm / 590 nm
(excitation/émission). Par ailleurs, l'oxydation de MitoSOXTMRed liée à l'état redox des
cellules était déterminée en mesurant la fluorescence cellulaire à 510 nm / 580 nm (excitation
MATERIEL ET METHODES
48
/émission) en utilisant un spectrofluorimètre ELISA (TecanInfinite M200,Grödig, Autriche)
(Santofimia-Castaño et al., 2015).
En parallèle, le même protocole a été utilisé en absence de calcium extracellulaire et
en présence de l’acide 1,2-bis (o-aminophénoxy) éthane-.N,N,N',N'-tétraacétique (BAPTA)
qui est un chélateur de calcium intracellulaire. Dans ces expériences nous avons utilisé un
tampon Na-HEPES dépourvu de calcium dont la composition est identique à celle du tampon
riche en calcium sauf que le CaCl2 est remplacé par EGTA à 0,5mM.
Les données montrant l'augmentation moyenne de la fluorescence sont exprimées en
pourcentage ± ES. (n) par rapport aux cellules témoins (non stimulées), où n est le nombre
d'expériences indépendantes.
3.2.2.3.2. Visualisation des ERO par microscopie à fluorescence
Afin d'obtenir des images de fluorescence des cellules traitées par le MitoSOXTMRed,
des lamelles contenant des cellules AR42J ont été montées sur une chambre de perfusion
expérimentale et ont été continuellement perfusées avec un tampon HEPES frais. Les stimuli
sont préparés dans ce même tampon et ajoutés directement aux cellules dans la chambre de
perfusion. Les cellules ont été excitées avec la lumière d'une lampe à arc au xénon passée à
travers un monochromateur à grande vitesse (Polychrome IV, Photonics, Hamamatsu, Japon)
à 510 nm. L'émission de la fluorescence (580 nm) a été détectée à l'aide d'une Caméra CMOS
numérique ORCA-flash 4.0 V2 (Hamamatsu Photonics-France, Barcelone, Espagne) et
enregistrée à l'aide du logiciel HCImage (Hamamatsu Corp., Sewickley, PA, États-Unis).
3.2.2.3.3. Détermination des taux de Glutathion
Le glutathion (GSH) est un antioxydant important produit par la plupart des
organismes vivants. Il contrôle le niveau du stress oxydant en agissant à la fois comme
piégeur des ERO et comme cofacteur nécessaire pour l’activité des enzymes antioxydantes
(Nassour, 2015). Lors de l'oxydation, le GSH est transformé en disulfure de glutathion
(GSSG). Les concentrations de GSH et de GSSG sont des indicateurs de la fonctionnalité
cellulaire et du stress oxydatif (Monostori et al., 2009).
MATERIEL ET METHODES
49
Les taux réduits (GSH) et oxydés (GSSG) de glutathion au niveau des cellules AR42J
ont été déterminés en utilisant la méthode de Hissin and Hilf (1976). Après l'application des
stimuli, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, détachées et remises en suspension
avec 1 ml de tampon Tris-HCl 25 mM (pH = 7,6) contenant 1% (p/v) de Triton X-100 et
transférées dans des eppendorfs. Les échantillons étaient placés sur de la glace, soniqués
pendant 10 min et maintenus à -20 ºC pendant 5 min.
Par la suite, les échantillons ont été centrifugés (9 000 ×g, à 4 ºC pendant 30 min), et
les surnageants ont été collectés et placés dans des flacons indépendants. La concentration
totale des protéines dans chaque échantillon a été déterminée selon la méthode de Bradford
(1976), en utilisant la courbe de la SAB. Ensuite, les protéines du surnageant ont été
précipitées par addition de 20% d'acide trichloracétique froid. Les flacons ont ensuite été
centrifugés (10 000 ×g pendant 10 min à 4 ° C) et conservé à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
Au moment d’utilisation, les échantillons (50 μL) ont été incubés avec 1 mg / ml du
réactif fluorescent orthophtalaldéhyde (OPT) dans un tampon basique (pH 8,0) contenant du
Na-phosphate (0,1 M) et EDTA (5 mM). Avant la détermination du GSSG, le N-
éthylmaléimide (40 mM) et la NaOH (1 M, volume pour atteindre pH 12) ont été ajoutés. Le
mélange réactionnel était incubé pendant 45 min à 20 °C.
Ensuite, 200 μL du mélange réactionnel ont été transférés dans les puits dans une
plaque noire à 96 puits. La présence de GSH ou GSSG est déterminé en mesurant la
fluorescence à 350 nm / 420 nm (excitation / émission) en utilisant un spectrofluorimètre. Des
Courbes standard de GSH (3,20-320 μmol / ml) et GSSG (2,5-80 μmol / ml) ont été utilisés
pour la quantification. Pour la normalisation, la teneur en protéines de chaque échantillon a
été utilisée. Les dosages ont été effectués en triplicats. Un milieu réactionnel sans extrait
cellulaire a été utilisé comme un témoin (blanc).
Les valeurs de GSH et GSSG (μmol / mg de protéines) ont été déterminées et le
rapport GSH / GSSG a été calculé. Les données sont présentées comme l'augmentation
moyenne du ratio GSH / GSSG exprimé en pourcentage ± ES (n) par rapport aux cellules
témoins (non stimulées), où n est le nombre d'expériences indépendantes.
MATERIEL ET METHODES
50
3.2.2.3.4. Étude de la superoxyde dismutase mitochondriale par Western blot
Le Western Blot (aussi appelé immunotransfert) est une technique employée pour
analyser des protéines individuelles dans un mélange protéique (par ex. un lysat de cellules).
La technique repose sur trois éléments : la séparation des protéines, leurs transfert et la
révélation en utilisant des anticorps (Mahmood and Yang, 2012).
Dans le cadre du Western blot, le mélange protéique est soumis à une électrophorèse
sur gel dans une matrice porteuse afin de trier les protéines par taille, charge, ou toute autre
différence au sein des bandes individuelles de protéines. Les bandes de protéines séparées
sont ensuite transférées vers une membrane porteuse. Les protéines de cet immunotransfert
peuvent ensuite être utilisées pour être liées à l'anticorps en vue de leurs détermination (C.,
2012).
Le stress oxydatif induit souvent la production des ERO. Parmi ces derniers le radical
superoxyde O2- et le peroxyde d’hydrogène H2O2. La réduction de O2
- en H2O2 se fait par les
superoxydes dismutases (SOD) (Nojima et al., 2015) qui sont des métallo-enzymes se
retrouvant dans l’ensemble du monde du vivant, mis à part dans quelques microorganismes
(Alscher et al., 2002).
Il existe chez l’homme deux SOD qui se distinguent par leur localisation
intracellulaire ainsi que par le cofacteur métallique qu’elles utilisent : la Cu/Zn-SOD (SOD1),
présente dans le cytosol est associée aux ions cuivre et zinc et la MnSOD (SOD2) présente
dans les mitochondries est associée au manganèse (Nassour, 2015). Dans le contexte de
l’étude, l’effet de AS sur le SOD2 mitochondrial a été étudié.
Les cellules AR42J ont été incubées avec les différentes concentrations d’AS pendant
une heure. Par la suite, elles ont été détachées, centrifugées à 1400 xg, lavées avec le PBS et
soniquées dans un tampon de lyse cellulaire contenant 1% d’inhibiteur de protéase et 0,25 %
d’orthovanadate de sodium.
Les protéines des échantillons ont été quantifiées par la méthode de Bradford (1976).
Les protéines dénaturées par la température (70 °C pendant 10 minutes) (20 μg) sont séparées
par SDS-PAGE (10%) et transférées sur des membranes à difluorure de polyvinylidène
MATERIEL ET METHODES
51
(PVDF), et une immunodétection est effectuée en utilisant des anticorps anti-superoxydes
dismutases (SOD2) et anti-Actine.
Les résultats sont exprimés en pourcentage d'expression protéique ± ES (n) comparé à
celui détecté dans les cellules témoins (non stimulées), où n est le nombre d'expériences
indépendantes. Les expériences ont été réalisées en utilisant différents lots de cellules.
3.2.2.4. Effet de l'acide sulfanilique sur la trypsine
Selon les résultats de l’étude in vivo sur les souris Swiss, la tartrazine semble diminuer
l’activité enzymatique de la trypsine et la chymotrypsine. L’objectif ici est de déterminer la
voie par laquelle le E102 peut exercer son effet nocif. La sécrétion de la trypsine a été
mesurée selon une méthode colorimétrique (Tapia et al., 1997).
Des cellules AR42J ont été ensemencées sur une plaque de 24 puits à une densité de
40.000 cellules par puits et sont laissées à croître pendant 72 heures, incubées 48 heures en
présence de dexaméthasone et ensuite elles sont incubées pendant 45 min à 37 ºC avec les
différents stimuli testés en présence de différentes concentrations de CCK.
A la fin de l’incubation, 150 µl de surnageant de chaque puits sont incubés avec 50µl
d’une solution d’entérokinase (4U/ml) et BAPNA (1mg/ml). Le mélange est incubé à 37 ºC
pendant 10 minutes.
La libération de 4-nitroaniline à partir de la BAPNA, liée à la sécrétion de
trypsinogène transformé en trypsine par l’entérokinase, a été surveillée en mesurant
l'absorbance à 405 nm en utilisant un spectrofluorimètre (TecanInfinite M200, Grödig,
Austria). Chaque détermination était effectuée en double. Pour mesurer l’activité de la
trypsine, une gamme étalon avec des concentrations connues de la trypsine est utilisée. Les
résultats sont exprimés en unités de trypsine (UT) sécrétées par les cellules ± ES (n), où n est
le nombre de préparations indépendantes.
3.2.2.5. Détermination du potentiel membranaire mitochondrial
Pour faciliter le transport des métabolites au sein de la membrane interne, la
mitochondrie utilise un gradient électrochimique. Ce gradient appelé potentiel membranaire
MATERIEL ET METHODES
52
mitochondrial (∆ψm) est basé sur un gradient de proton, qui va charger négativement la
matrice mitochondriale et positivement la chambre externe (Lamy, 2009). Il a été suggéré que
le stress oxydatif induit une diminution du ψm (Satoh et al., 1997). C’est pour ceci que ce
potentiel a été mesuré au niveau des cellules AR42J pour évaluer le lien entre le métabolite de
la tartrazine, le stress oxydatif et ce ψm.
A cette fin, le colorant fluorescent tétraméthylrhodamine ester méthylique (TMRM) a
été utilisé selon la technique de González et al. (2003). Les cellules ARJ42 ont été incubées
pendant 30 minutes en présence du TMRM 50 nm à 37 ºC. Ensuite, les cellules ont été
centrifugées (30 ×g), remises en suspension dans le tampon HEPES frais et utilisées
immédiatement. Sur une plaque ELISA, les cellules ont été incubées pendant 15 min en
présence d’AS (1 mM, 100 μM, 10 μM ou 1 μM).
En tant que contrôle positif, différents lots de cellules étaient incubé en présence du
carbonilcyanure p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP) : un agent découplant
mitochondrial. Ce dernier va considérablement dépolariser le ψm. Cette dépolarisation est
reflétée par une diminution de l’intensité de la fluorescence lié au TMRM par rapport à
l'intensité de fluorescence de base (Joshi and Bakowska, 2011).
Les changements de ψm ont été déterminés en mesurant la fluorescence à 543 nm /
605 nm (excitation / émission) en utilisant le même spectrofluorimètre. Les résultats sont
exprimés en pourcentage ± ES (n) par rapport aux cellules témoins (non stimulées)
représentant l’augmentation de la fluorescence où n est le nombre d'expériences
indépendantes.
3.3. Etude statistique
L'analyse statistique des données a été faite à l'aide du logiciel GraphPad Prism
version 5.01 pour Windows (Logiciel GraphPad, San Diego, CA, USA). Les données sont
présentées en moyenne ± ES. Une analyse statistique de variance à sens unique (ANOVA)
suivie d'un test de Tuckey pour l’étude in vivo et in vitro et le test t de student pour l’étude ex
vivo ont été appliquées. Les différences ont été considérées comme statistiquement
significatives à p< 0,05.
RESULTATS
53
4. Résultats
4.1. Effet de la tartrazine sur le gain de poids corporel et la teneur en protéines
Le tableau 7 représente l’effet de la tartrazine sur le gain du poids corporel et la teneur
en protéines totales chez les souris femelles et mâles consommant ce colorant à des doses de
0,005 et 0,05 % en comparaison avec les témoins durant les 13 semaines d’expérimentation.
Aucun effet indésirable sur le gain du poids corporel n'a été observé, bien que ce gain
soit légèrement diminué chez les deux groupes ayant reçu la tartrazine par rapport au groupe
témoin. Néanmoins, les différences ne sont pas statistiquement significatives. Pour la teneur
en protéines totales, aucune différence significative n’est constatée chez les groupes traités
comparés aux témoins.
4.2. Effet de la tartrazine sur la consommation de l’aliment et de l’eau
Le tableau 8 représente le volume de la solution de la tartrazine et la quantité de
l’aliment consommés par les trois groupes expérimentaux durant les 13 semaines
d’expérience. La consommation de l’aliment et du liquide n'était pas significativement
différente chez tous les groupes traités par rapport aux témoins.
4.3. Impact de la tartrazine sur l’activité enzymatique in vivo
L’activité enzymatique de la trypsine est significativement diminuée chez les femelles
et chez les mâles traitées à la dose de 0,05% par rapport aux témoins (p<0,01) dont les valeurs
sont de 1337,12±25,21 vs 1470,08±33,71 U/g de pancréas pour les femelles et 1339,70±31,06
vs 1469,65±16,85 U/g de pancréas pour les mâles soit une diminution respective de 9,05% et
8,85 % (Figure 13).
De même une baisse significative de l'activité de la chymotrypsine est notée chez les
souris à 0,05% de tartrazine (figure 14), dont les valeurs sont de 1000,75 ± 43,35 vs 1312 ±
58,55 U/g de pancréas chez les femelles et 1099,99 ± 18,61 vs 1405±63.54 U/g de pancréas
chez les mâles. Ce qui représente une diminution de 23,77% et 21,74% respectivement.
Cependant, par rapport aux témoins, aucune différence significative de l’activité trypsique ou
chymotrypsique n’est observée chez les souris ayant consommé une faible dose de tartrazine
RESULTATS
54
Tableau 7. Effet de la tartrazine sur le gain du poids corporel et la teneur en protéines
totales chez les souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005%
et 0,05% pendant 13 semaines.
Dose de
Tartrazine (%)
Poids initial
(g)
Poids final
(g)
Gain du poids
(g)
Teneur en protéines
(mg/g Pancréas)
Femelles 0 14,58±0,29 40,51±0,82 25,92±0,96 217,21±6,84
0,005 14,79±0,39 38,63±0,64 23,83±0,79 203,87±6,33
0,05 14,90±0,37 38,40±0,56 23,50±0,43 203,49±9,30
Mâles 0 14,18±0,23 43,27±0,64 29,08±0,79 235,67±7,25
0,005 14,96±0,27 42,32±0,53 27,36±0,53 228,74±10,80
0,05 14,85±0,43 41,22±0,66 26,36±0,62 217,77±13,99
Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) (n=10)
Tableau 8. Effet de la tartrazine sur la consommation de l’aliment et du liquide chez les
souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05%
pendant 13 semaines.
Dose de Tartrazine
(%)
Aliment
(g/souris/jour)
Liquide
(ml/souris/jour)
Tartrazine
(g//souris/jour)
Femelles 0 7,59±0,15 4,69±0,10 0
0,005 7,68±0,25 4,95±0,07 8,06±0,16
0,05 7,71±0,23 5,00±0,08 80,11±0,90
Mâles 0 7,66±0,30 4,94±0,14 0
0,005 7,72±0,15 5,02±0,07 8,07±0,07
0,05 7,75±0,28 5,04±0,08 80,78±0,48
Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) (n=10)
RESULTATS
55
Figure 13. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de la trypsine.
On note une diminution significative de l’activité trypsique pancréatique chez les souris Swiss
consommant 0,05 % de la tartrazine (forte dose) pendant 13 semaines par rapport aux souris
témoins. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES).
** : significativement différent par rapport aux témoins (p<0,01)
RESULTATS
56
Figure 14. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de la chymotrypsine.
On note une diminution significative de l’activité chymotrypsique pancréatique chez les
souris Swiss consommant 0,05 % de la tartrazine (forte dose) pendant 13 semaines par rapport
aux souris témoins. Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards
(X±ES).
** : significativement différent par rapport aux témoins (p<0,01).
RESULTATS
57
(0,005%) aussi bien chez les mâles que chez les femelles. D’un autre coté, il semble que la
tartrazine n’a pas un effet adverse sur l’activité de l’amylase et de la lipase in vivo (tableau 9).
4.4. Impact de la tartrazine sur l’activité enzymatique in vitro
Les résultats de l’effet de la tartrazine sur l’activité de la trypsine et la chymotrypsine
in vitro en utilisant un modèle de digestion sont exprimés dans le tableau 10. Aucune
modification de ces activités n’a été observée.
4.5. Effet de la tartrazine et de l’acide sulfanilique sur la libération du calcium
(étude ex vivo)
En premier lieu, nous avons effectué plusieurs contrôles pour vérifier la mobilisation
du Ca2 + en réponse aux composés connus pour le mobiliser dans les deux types cellulaires
utilisés. A cet effet, différents lots de cellules ont été stimulées avec 1 nM de la CCK-8 ou 1
µM de la thapsigargine (Tps) (figures 15 et 16).
La CCK-8 est un sécrétagogue pancréatique bien connu qui médie ses effets à travers
la mobilisation du Ca2 +(Castillo-Vaquero et al., 2010). Après l'ajout de la CCK-8 aux cellules
acinaires ou AR42J, une augmentation transitoire de [Ca+2]i a été détectée, qui plus tard, est
revenue vers une valeur stable au-dessus du niveau de base (pré-stimulation) (figure 16A).
La Tps est un inhibiteur puissant des Ca2+ATPases du réticulum sarco-endoplasmique
(SERCA). L’inhibition de cette pompe, responsable de la réentrée du calcium dans le RE,
induit une forte augmentation de [Ca2+]i (Thastrup et al., 1990; Peters and Raghavan, 2011).
Ceci est montré dans la figure 16B au niveau des cellules AR42J.
En ce qui concerne les cellules acinaires isolées des souris Swiss, l’augmentation de
[Ca+2]i a été observée suite à la stimulation avec de la tartrazine aux quatre concentrations
utilisées (0,1 mM ; 1 mM ; 5 mM et 10 mM) et aussi la stimulation de ces cellules avec
l’acide sulfanilique (AS) aux concentrations suivantes : 1 µM, 10 µM, 100 µM et 1 mM induit
la même augmentation (figure 17 et 18).
RESULTATS
58
Tableau 9. Effet de la tartrazine sur l’activité enzymatique de l’amylase et de la lipase
chez les souris Swiss témoins et consommant de la tartrazine aux doses de 0,005% et 0,05
pendant 13 semaines.
Dose de tartrazine (%) Activité d’Amylase
U/g pancréas
Activité de Lipase U/g
pancréas
Femelles 0 2392,83±50,21 3385,58±103,96
0,005 2363,60±75,81 3335,42±74,30
0,05 2355,77±25,71 3213,02±81,54
Mâles 0 2458,03±71,05 3413,23±138,22
0,005 2440,30±81,36 3343,41±117,09
0,05 2436,91±48,22 3243,66±55,92
Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) (n=10)
Tableau 10. Effet de la tartrazine aux doses de 7,5mg/kg/jour et 75 mg/kg/jour sur
l’activité des protéases en utilisant un modèle de digestion in vitro.
Dose de tartrazine (mg) Riz Lait Beurre
Activité de la trypsine
(U/ml)
0 0,23±0,00 0,19±0,00 0,23±0,01
7,5 0,23±0,00 0,20±0,00 0,22±0,01
75 0,24±0,01 0,20±0,01 0,23±0,02
Activité de la chymotrypsine
(U/ml)
0 0,24±0,00 0,31±0,02 0,37±0,01
7,5 0,22±0,00 0,31±0,01 0,37±0,01
75 0,21±0,02 0,29±0,01 0,37±0,01
Les valeurs reportées représentent des moyennes et leurs erreurs standards (X±ES) (n=6)
RESULTATS
59
Figure 15. Changements de la [Ca2 +]i dans les cellules acinaires en réponse à la CCK-8.
RESULTATS
60
Figure 16. Les changements de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J en réponse à la CCK-8
et la thapsigargine.
(A) les changements de la fluorescence au cours du temps, liés à la [Ca2 +]i dans des cellules
AR42J chargées en fura-2, stimulées avec 1 nM de CCK-8. (B) les changements de la
fluorescence au cours du temps, liés à la [Ca2 +]i dans des cellules AR42J chargées en fura-2,
stimulées avec 1 μM de thapsigargine (Tps).
Les barres horizontales continues indiquent le moment où la concentration désirée du stimulus
a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 + dans le
milieu extracellulaire. Les enregistrements sont représentatifs de quatre à cinq essais
indépendants.
RESULTATS
61
Figure 17. Effet de la tartrazine sur la [Ca]i+2 dans les cellules acinaires.
Les enregistrements représentent les changements de la fluorescence, liés à [Ca2 +]i dans les
cellules acinaires chargées en fura-2 stimulées avec 0,1 mM (A), 1 mM (B), 5 mM (C) ou 10
mM (D) de tartrazine.
Les barres horizontales continues indiquent le moment où la concentration désirée du stimulus
a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 +dans le
milieu extracellulaire.
Les enregistrements sont représentatifs de quatre à six essais indépendants.
RESULTATS
62
Figure 18. Changements de la [Ca2+]i dans les cellules acinaires en réponse à l'acide
sulfanilique.
Les enregistrements représentent les changements de la fluorescence, liés à la [Ca2 +]i dans les
cellules acinaires chargées en fura-2 stimulées avec 1 µM (A), 10 µM (B), 100 µM (C) ou 1
mM (D) d'acide sulfanilique.
Les barres horizontales continues indiquent le moment où la concentration désirée du stimulus
a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 +dans le
milieu extracellulaire.
Les enregistrements sont représentatifs de sept à neuf essais indépendants.
RESULTATS
63
En outre, les cellules AR42J sont incubées avec différentes concentrations de l’AS (1
μM, 10 μM, 100 μM ou 1 mM) en présence de Ca2+extracellulaire. Ce métabolite de la
tartrazine a conduit à une augmentation progressive de [Ca+2]i (figure 19).
Le niveau de la fluorescence atteint dans les cellules acinaires semble être lié à la dose
de l’acide sulfanilique ajouté mais ce n’est pas le cas en utilisant la tartrazine alors qu’au
niveau des cellules AR42J, ce niveau de fluorescence était similaire en présence de différentes
concentrations d’AS. On suggère donc que l'effet de ce dernier sur la [Ca+2]i n'était pas
toujours dose-dépendant et ça peut différer selon le type cellulaire utilisé.
Dans d'autres expériences, les cellules ont été stimulées avec du Tps (1 μM) après une
incubation préliminaire des cellules avec 1 mM de l’AS. Dans ces conditions, une
augmentation transitoire de [Ca+2]i a été observée mais elle était plus faible par rapport à la
réponse observée lorsque la Tps a été ajoutée seule aux cellules (figure 20). Ces résultats
suggèrent que l’AS provoque une mobilisation du calcium à partir des mêmes réserves
sensibles aux Tps.
4.6. Effet de l’acide sulfanilique sur le statut redox (étude ex vivo)
Nous nous sommes intéressés à étudier la production des espèces réactives de
l’oxygène (ERO) au niveau des cellules acinaires et des cellules AR42J préalablement
incubées avec les différentes concentrations de l’AS (1 mM, 100 μM, 10 μM ou 1 μM) et
chargées en CM-H2DCFDA ou MitoSOXTMRed. Une augmentation de la fluorescence
dérivée des deux sondes a été observée au niveau des deux types cellulaires par rapport aux
cellules non stimulées, reflétant une augmentation de la production des ERO au niveau
cytosolique et mitochondriale (figure 21 et 22).
Pour les cellules acinaires en utilisant le CM-H2DCFDA, les valeurs exprimées en
pourcentage de fluorescence pour les quatre concentrations de l’AS sont respectivement de
123,5±4,47 %; 114,8±2,65 % ; 109,7±2,37% et 111,5±2,35 % vs 100±0,66% (p<0,001) alors
que les valeurs pour la sonde MitoSOXTMRed sont respectivement de 125,01±4,33 %;
118,83±4,11 %; 110,55±2,49 % et 108,65±2,81% vs 100±0,61 % (p<0,001). Pour les cellules
AR42J, nous avons notamment noté une augmentation de la fluorescence en utilisant
l’indicateur MitoSOXTMRed avec les quatre concentrations de l’AS 1 mM, 100 μM, 10 μM et
RESULTATS
64
Figure 19. Changements de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J en réponse à l'acide
sulfanilique.
Les enregistrements représentent les changements de la fluorescence liés à la [Ca2 +]i dans les
cellules AR42J chargées en fura-2 stimulées avec 1 µM (A), 10 µM (B), 100 µM (C) ou 1
mM (D) d'acide sulfanilique.
Les barres horizontales continues indiquent le moment où la concentration désirée du stimulus
a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 +dans le
milieu extracellulaire.
Les enregistrements sont représentatifs de quatre à cinq essais indépendants.
RESULTATS
65
Figure 20. Effet de l'acide sulfanilique sur la mobilisation du calcium provoquée par la
thapsigargine.
Observation des modifications de la [Ca2 +]i dans les cellules AR42J chargées en fura-2 et
stimulées d’abord avec de l'acide sulfanilique 1 mM ensuite avec 1 μM de thapsigargine
(Tps). Les barres horizontales continues indiquent l’instant où la concentration désirée du
stimulus a été appliquée aux cellules. Les expériences ont été réalisées en présence du Ca2 +
dans le milieu extracellulaire.
Les enregistrements sont représentatifs de quatre essais indépendants.
RESULTATS
66
Figure 21. Effet de l'acide sulfanilique sur la génération des ERO dans les cellules
acinaires.
Les cellules acinaires sont exposées aux différents stimulants pendant 1 h. Ensuite, l'effet de
l'acide sulfanilique sur l'oxydation du CM-H2DCFDA(A) et du MitoSOXTMRed (B) a été
étudié. Les résultats expriment l'état oxydatif des cellules traitées par rapport aux cellules non
stimulées. Ils présentent l'augmentation moyenne de la fluorescence exprimée en pourcentage
± ES par rapport aux cellules témoins (non stimulées).
(***, P <0,001 vs cellules non traitées ; n = 6 à 7 essais indépendants).
RESULTATS
67
1 μM par rapport aux cellules témoins non stimulées dont les valeurs sont 117,40±3,62 %;
114,70±3,11 %; 112,52±1,96 % ; 111,15±2,03 % vs 100±1,00 %. Le niveau d'oxydation
obtenu avec 1 mM d'acide sulfanilique était légèrement supérieur à celui observé avec les
autres concentrations bien qu’il soit non statistiquement significatif.
En absence du Ca2+extracellulaire (cellules AR42J incubées en présence de BAPTA en
milieu contenant 0,5 mM EGTA), la production des ERO provoquée par l’AS n’est pas
différente de celle observée en présence du Ca2+. Donc il semble que le stress oxydatif induit
par l’AS n’est pas Ca2+ dépendant (figure 22B). Les valeurs sont de 120,89±4,28 %;
115,70±4,69 % ; 111,14±3,52 % et 108,66±3,84 % vs 100±1,04 % en réponse à la stimulation
avec 1mM, 100 μM, 10 μM et 1 μM d’acide sulfanilique respectivement par rapport aux
cellules non stimulées.
Pour visualiser la production des ERO au niveau des cellules AR42J, des images de
fluorescence ont été prises après une incubation avec 1mM de l’AS. En présence de ce
dernier, une augmentation de la fluorescence a été détectée en corrélation avec une
augmentation de la production des ERO (figure 23).
Une protection contre ces ERO est assurée par une variété de systèmes antioxydants
tels que le glutathion et la SOD. Pour cela, une évaluation de leurs niveaux dans les cellules
AR42J traitées par l’AS a été faite.
Les résultats obtenus montrent que l’AS induit une diminution dose-dépendante du
rapport GSH/GSSG comparé aux cellules témoins (figure 24). Les valeurs obtenues en
utilisant les quatre concentrations de l’AS (1 mM, 100 μM, 10 μM , 1 μM) sont
respectivement de 42,86±7,81 % vs 100±4,78 % (p<0,01) et 56,38±4,19 %; 76,43±5,1 %;
70,88±7,93 % vs 100±4,78 % (p<0,05).
De même, l’étude par Western Blot révèle que le métabolite de la tartrazine induit une
diminution de l’expression de la SOD2 au niveau des cellules AR42J (figure 25). Les valeurs
exprimées en pourcentage de phosphorylation sont de 35,29±11,60% ; 44,73±12,99 % ;
77,88±8,06 % vs 100±0,99 % suite à la stimulation avec les concentrations suivantes de
l’AS : 1 mM, 100 μM, 10 μM respectivement (p<0,001), (p<0,01) et (p<0,05).
RESULTATS
68
Figure 22. Effet de l'acide sulfanilique sur la génération des ERO dans les cellules AR42J
chargées avec l’indicateur redox MitoSOXTMRed.
Les cellules AR42J sont incubées pendant 1 h sans stimulant (contrôle) ou avec différentes
concentrations de l'acide sulfanilique, en présence (A) ou en absence (B) du Ca2 + dans le
milieu extracellulaire. Ensuite, l'effet de l'acide sulfanilique sur l'oxydation de
MitoSOXTMRed a été étudié.
Les résultats expriment l'état oxydatif des cellules traitées par rapport aux cellules non
stimulées. Ils présentent l'augmentation moyenne de la fluorescence exprimée en pourcentage
± ES par rapport aux cellules témoins (non stimulées) (*, P <0,05 ; **, P <0,01 ; ***, P
<0,001 vs cellules non traitées ; †P <0,05 vs CCK-8 en présence du Ca2 + extracellulaire ; n =
6 à 7 essais indépendants).
RESULTATS
69
Figure 23. Images de fluorescence montrant l'effet de l'acide sulfanilique sur la production
des ERO dans les cellules AR42J chargées avec le MitoSOXTMRed.
(A) Image des cellules par microscopie à lumière transmise. (B) Image des cellules par
microscopie à fluorescence avant stimulation avec de l'acide sulfanilique (1 mM). (C) Image
des cellules par microscopie à fluorescence prises après incubation pendant 1 h en présence de
1mM de l’acide sulfanilique. Une augmentation de la fluorescence a été détectée.
RESULTATS
70
Figure 24. Effet de l'acide sulfanilique sur le glutathion.
Les histogrammes montrent l'augmentation moyenne du ratio GSH / GSSG au niveau des
cellules AR42J incubées avec l’acide sulfanilique (1 mM, 100 μM, 10 μM ou 1 μM).
Les résultats sont exprimés en pourcentage ± ES par rapport aux cellules témoins (non
stimulées). Trois préparations cellulaires différentes ont été utilisées (n.s, cellules non
stimulées ; *, P <0,05 ; **, P <0,01).
RESULTATS
71
Figure 25. Effet de l'acide sulfanilique sur l'expression de la superoxyde dismutase
(SOD2).
(A) Les bandes de Western Blot représentent les niveaux d’expression de l’enzyme
mitochondriale antioxidante SOD2 au niveau des cellules AR42J traitées avec l’acide
sulfanilique (1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM). Pour assurer le chargement égal des protéines,
un témoin de charge (α-actine) a été utilisé dans les conditions testées. (B) Le graphe montre
la quantification de la phosphorylation des protéines.
Les valeurs représentent des moyennes ± ES (n=4) exprimées en % de phosphorylation
par rapport aux cellules témoins (non stimulées) (*, p<0,05 ; **, p<0,01 ; ***, P <0,001 par
rapport aux cellules non stimulées).
RESULTATS
72
4.7. Effet de l’acide sulfanilique sur la trypsine (étude ex vivo)
Les cellules AR42J libèrent les enzymes digestives suite à une stimulation par la CCK
(Logsdon, 1986) et leur sécrétion est altérée en cas du stress oxydatif (Gonzalez et al., 2012)
Ainsi, nous nous sommes intéressés à vérifier si l’acide sulfanilique, métabolite de la
tartrazine, exerce un effet sur la sécrétion de la trypsine.
La stimulation des cellules AR42J avec la CCK induit une libération de la trypsine
dépendante de la concentration de cette hormone en atteignant un pic à 10-10M soit 2,60±0,29
unité de trypsine (figure 26A). L’acide sulfanilique (1 mM ou 100 μM) a provoqué une
augmentation de la sécrétion de la trypsine comparée aux cellules témoins non stimulées mais
l’effet dose-dépendant de la CCK-8 sur cette sécrétion était altéré (figure 26B). Les valeurs
sont respectivement de 1,77±0,23 et 2,00±0,36 vs 1,17±0,20 unité de trypsine (p<0,05).
Ensuite, nous avons cherché si l’effet de l’AS sur la sécrétion trypsique est dû ou non
à la production des ERO. Pour cela, les cellules AR42J sont préincubées pendant 5 minutes en
présence de 100 µM de mélatonine. Ce composé a des effets antioxydants dans le pancréas
exocrine (Santofimia-Castaño et al., 2015). En présence de la mélatonine, les cellules sont
stimulées par l’AS en combinaison avec la CCK-8.
Dans ces conditions expérimentales, l’effet de l’AS sur la sécrétion de la trypsine
induite par la CCK-8 a été réduit. En utilisant la concentration 10-10 M de CCK, Les valeurs
comparées avec celles des cellules traitées avec 1mM d’AS sont de 1,70±0,19 vs 2,24±0,21
unité de trypsine (p<0,05).
Nos résultats suggèrent que l'effet de l’AS sur la sécrétion enzymatique induite par la
CCK-8 pourrait être dû à la génération des ERO.
4.8. Effet de l’acide sulfanilique sur le potentiel membranaire mitochondrial
(étude ex vivo)
Outre leur rôle essentiel dans la production d'ATP, les mitochondries agissent
également comme des tampons locaux de calcium pour réguler étroitement la concentration
du Ca 2+ intracellulaire. Pour ce faire, les mitochondries utilisent le potentiel électrochimique
RESULTATS
73
Figure 26. Effet de la CCK-8 et de l'acide sulfanilique sur la sécrétion de la trypsine dans
les cellules AR42J.
(A) Augmentation dose-dépendante de la sécrétion de la trypsine induite par la CCK-8 dans
les cellules AR42J. (B) Effet de l'acide sulfanilique 1 mM (■), acide sulfanilique 100 μM (●)
et de la combinaison de 100 μM de mélatonine plus 1 mM d'acide sulfanilique (□) sur la
sécrétion de la trypsine par la CCK-8 dans les cellules AR42J. Les expériences ont été
réalisées en présence du Ca2 + dans le milieu extracellulaire.
Les données expriment les moyennes ± ES (*, p<0,05 ; **, p<0,01 par rapport aux cellules
non stimulées, n = 4 à 5 essais indépendants).
RESULTATS
74
à travers leurs membranes internes (ΔΨm) pour séquestrer le Ca2+(Au - McKenzie et al.,
2017).Une augmentation de la concentration du calcium mitochondriale devrait conduire à
une dépolarisation du Ψm et reflète des changements dans l’état redox mitochondrial
(González et al., 2003) sachant que les mitochondries représentent la source majeure des ERO
(Circu and Aw, 2010).
C’est pourquoi nous nous sommes intéressés à évaluer l’effet de l’AS sur le potentiel
membranaire mitochondrial pour visualiser la relation entre la [Ca2+]i, le Ψm et la production
des ERO.
Quand les cellules AR42J ont été incubées pendant 15 min en présence de l’AS (1
mM, 100 μM, 10 μM ou 1 μM) nous avons observé une diminution statistiquement
significative de la fluorescence en TMRM dans les cellules traitées avec 1mM d’AS. Cela
reflète une dépolarisation du ψm, en raison de la diffusion du colorant au cytosol (González et
al., 2003). Les valeurs exprimées en pourcentage de fluorescences ont de 92,11±2,27 % vs
100±2,37 % (p<0,05).
Cependant, aucun changement détectable de ψm n'a été noté avec les autres
concentrations. En présence de FCCP (0,5 μM) considéré comme un contrôle positif, une
diminution statistiquement significative de ψm a été détectée dont les valeurs sont de
89,35±3,59 % vs 100±2,37 % (p<0,05) (figure 27).
RESULTATS
75
Figure 27. Effet de l’acide sulfanilique sur le potentiel membranaire mitochondrial (ψm)
Le graphe indique les changements dans le ψm des cellules AR42J chargées avec le TMRM
et incubées en présence d'acide sulfanilique (1 mM, 100 μm, 10 μm ou 1 μm) par rapport aux
cellules non stimulées (n.s.).
Les résultats sont exprimés en moyenne de pourcentage ± ES par rapport aux cellules témoins
(*, p <0,05 vs cellules non stimulées, n = 4 essais indépendants).
DISCUSSION
76
5. Discussion
Les habitudes alimentaires ont évolué tout au long des siècles. Aujourd'hui, les
colorants alimentaires tels que la tartrazine prennent une grande part dans notre alimentation.
En fait, ces colorants sont souvent ajoutés aux denrées alimentaires et aux boissons afin de
fournir, d’intensifier ou de restaurer leurs couleurs pour créer une apparence attrayante
(Schenone et al., 2013). Actuellement, les débats sur la sécurité alimentaire, principalement
l’implication de la tartrazine dans plusieurs pathologies, sont devenus de plus en plus
nombreux.
Ce colorant, répertorié sous le code E102 en Europe, est un colorant azoïque
synthétique utilisé dans plusieurs secteurs. Dans les pays en développement, les gens
l’utilisent principalement comme substitut du safran (Mehedi et al., 2009). Il est également
utilisé dans certains produits cosmétiques et pharmaceutiques (Amine et al 2010). La dose
journalière admissible (DJA) de ce colorant est de 0-10 mg/kg/jour (JECFA, 2016).
Cependant, cette DJA peut largement être dépassée en raison de certaines habitudes
alimentaires.
Plusieurs études ont montré que la tartrazine a des effets immunotoxiques (Moutinho
et al., 2007; Guendouz et al., 2013), génotoxiques (Sasaki et al., 2002; Khayyat et al., 2017)
ainsi que des altérations au niveau du système reproducteur (Mehedi et al., 2009; Axon et al.,
2012). En outre, il a été montré que la tartrazine altère différents paramètres biochimiques, en
particulier ceux liés aux organes vitaux comme le foie et les reins (Sharma et al., 2009; Amin
et al., 2010; Tawfek et al., 2015). Concernant le système digestif, les études existantes
révèlent que la tartrazine peut induire des dommages de l’ADN dans l'estomac et le côlon
ainsi que des modifications dégénératives de la muqueuse gastrique (Sasaki et al., 2002;
Ghonimi and Elbaz, 2015). Selon Wang et al. (2012), il semble que la tartrazine inhibe
l’activité enzymatique de la trypsine et affecte la digestion.
Du fait que le système digestif est la première surface exposée aux xénobiotiques tels
que la tartrazine, il était d’intérêt d’étudier l’impact de ce colorant sur la physiologie du
pancréas exocrine qui occupe une place importante dans le système digestif, principalement
via la sécrétion des enzymes digestives pancréatiques dans le duodénum.
DISCUSSION
77
Dans la première partie de ce travail, on s’est intéressé à évaluer l’effet de la tartrazine
(E102) sur l’activité des enzymes digestives pancréatiques. L'analyse de l'activité des
enzymes digestives a été largement utilisée comme indicateur de l'état et de la fonction du
système digestif (Xu et al., 2003; Jiang et al., 2008; Wang et al., 2012; Arhakis et al., 2013).
Dans notre protocole, les souris Swiss ont reçu deux doses de tartrazine : la première est de
0,005%, équivalente à 8 mg/kg/ jour environ, c’est à dire une dose proche de la DJA établie
par le Comité Conjoint d'Experts sur les Additifs alimentaires (JECFA, 2016) qui est de 10
mg/kg/jour. La deuxième est de 0,05 % du fait qu’il a été constaté que la consommation de ce
colorant alimentaire chez les enfants peut dépasser la DJA (Sawaya et al., 2008; Tripathi et
al., 2010).
En terme de poids corporel, nos résultats ont montré qu’à faible dose, la
consommation de tartrazine n’influe pas significativement sur ce paramètre ; ce qui est en
accord avec l'étude de (Himri et al., 2011). Le même constat est établi lorsque le colorant est
ingéré à dose élevée, concordant avec les données de Tanaka (2006), qui a utilisé une dose de
0,05% (environ 83 mg/kg/jour). Cependant, les études menées au niveau de notre laboratoire
par Mehedi et al. (2009) puis par Guendouz et al. (2013) ont montré une perte de poids
corporel significative chez des souris traitées à la tartrazine. Ces résultats pourraient être liées
aux doses élevées utilisées qui étaient de 0,1 ; 0,45 ; 1 et 2%. La perte de poids corporel est
l'un des indicateurs de toxicité et est généralement liée à la perte d'appétit et à la diminution
de la consommation alimentaire (Ezeuko et al., 2007).
Les résultats de ce travail ont montré aussi que les activités de l'amylase et de la lipase
chez les souris femelles et mâles qui consommaient de la tartrazine aux doses de 0,005% et
0,05% étaient comparables à celles des témoins. En revanche, à forte dose (0,05%), la
tartrazine induit une diminution significative des activités de la trypsine et de la
chymotrypsine, alors qu'aucun changement détectable n'a été noté chez les animaux ayant
consommé le colorant à faible dose (0,005%).
Ces résultats indiquent donc clairement qu’il semble exister un effet notoire de la
tartrazine sur les protéases mais pas sur les enzymes non protéolytiques. Ils indiquent
également que le colorant utilisé à la DJA ne semble pas avoir d’effet sur l’activité des
enzymes pancréatiques étudiées.
DISCUSSION
78
Dans notre travail, l'absence de changements significatifs dans le poids corporel des
souris ayant consommé de la tartrazine à 0,05 % pourrait s'expliquer par le fait qu'une
sécrétion présumée de protéases pancréatiques pourrait être partiellement compensée par les
mécanismes gastriques et de l'intestin grêle, de sorte que la malabsorption des protéines
survient généralement plus tard et elle est moins importante que la malabsorption des lipides
(Keller and Layer, 2014).
L'étude de Buddington and Diamond (1989) a montré que le processus de production
d'enzymes est contrôlé par des mécanismes génétiques et n’est pas induit par le régime
alimentaire. Cependant, selon Vaysse (2005), la sécrétion pancréatique s'adapte aux
changements dans la composition de l'alimentation (glucides, protéines et lipides). Il a été
montré qu’un régime riche en lipides stimule plus la sécrétion pancréatique qu’un régime
protéique (Keller and Layer, 2005; Bartel et al., 2015). Indépendamment de ces observations,
dans notre étude, tous les groupes ont été nourris avec un régime ayant la même composition.
Ce qui laisse penser que la diminution des activités des protéases que nous avons observée
n’est pas en lien avec la composition du régime alimentaire consommé par les animaux.
Dans le pancréas, les protéines sont synthétisées et transférées dans le réticulum
endoplasmique rugueux des cellules acineuses. Elles sont ensuite transportées dans l'appareil
de Golgi où elles subissent des modifications post-traductionnelles et sont triées. Les
zymogènes pancréatiques peuvent être exportés sous l'influence d'agents stimulants (voie
régulée), ou peuvent être libérés en permanence (voie constitutive) (Vaysse, 2005).
En ce qui concerne la tartrazine, ce colorant est transformé en acide sulfanilique (AS)
après avoir été métabolisée par la microflore gastro-intestinale (Moutinho et al., 2007;
Demirkol et al., 2012). Plusieurs études ont révélé que le groupe sulfonique interagit avec les
résidus d'acides aminés chargés positivement des protéines, principalement par des forces
électrostatiques, ce qui peut modifier la structure de la protéine (Aehle, 2007; Ang and
Elimelech, 2007; Nilsson et al., 2009; Wang et al., 2012; Al-Shabib et al., 2018).
Du fait que les études sur la physiologie digestive aussi bien chez l’homme que chez
l’animal sont éthiquement et techniquement difficiles, il était important pour les scientifiques
de pouvoir développer et appliquer des modèles de digestion in vitro qui miment et reflètent
les conditions et les processus physiologiques qui se produisent in vivo. Actuellement, ces
DISCUSSION
79
modèles de digestion sont largement utilisés pour étudier les changements structurels, la
biodisponibilité ainsi que la digestibilité des aliments (Hur et al., 2011).
Pour ce qui est de l’étude in vitro dans notre travail à l’aide d’un modèle de digestion,
aucun changement d’activité enzymatique de la trypsine ou de la chymotrypsine n'a été noté,
avec les deux doses de la tartrazine (7,5 et 75 mg) utilisées. Selon Hur et al. (2011), les
résultats des modèles de digestion in vitro sont souvent différents de ceux obtenus avec des
modèles in vivo en raison des difficultés à simuler avec précision les événements
physicochimiques et physiologiques très complexes qui se produisent dans les voies
digestives animales et humaines. En effet, les modèles de digestion gastro-intestinale
présentent des avantages et des inconvénients. Ménard and Dupont (2014) ont conclu que le
recours à des modèles in vivo, animaux ou humains, demeure la meilleure approche pour
étudier la digestion. De plus, la réponse individuelle varie non seulement en fonction de la
dose, de l'âge, du sexe, de l'état nutritionnel et des facteurs génétiques, mais aussi en fonction
de l'exposition à long terme à de faibles doses (Sasaki et al., 2002).
Par conséquent, l'impact négatif de la tartrazine sur les enzymes in vitro pourrait
s'expliquer par la complexité du système digestif animal et par la durée de l'exposition (13
semaines) in vivo. Un autre facteur important pourrait être l'absence de la microflore gastro-
intestinale dans ce modèle de digestion in vitro qui, par conséquent, se traduit par l’absence de
toute production d'amines aromatiques.
Il est admis que l'ingestion de certains contaminants est susceptible d'affecter l'activité
des enzymes qui peuvent conduire ensuite à l’apparition de certaines pathologies dans le corps
humain (Wang et al., 2012). En ce qui concerne le système digestif, Sasaki et al. (2002) ont
montré que la tartrazine (à la dose de 10 mg/ kg / jour) provoque des lésions de l'ADN au
niveau des organes gastro-intestinaux. L'étude de Himri et al. (2011) suggère une réponse
inflammatoire due à l'absorption de l'acide sulfanilique caractérisée par l’augmentation du
nombre de leucocytes.
Dans une étude menée par Goldenring et al. (1982), l'acide sulfanilique, métabolite
majeur de la tartrazine, issu du métabolisme de la flore intestinale a été administré à des rats
postnataux via une injection intrapéritonéale pour examiner son impact sur le comportement.
DISCUSSION
80
Ces chercheurs ont observé une hyperactivité et une altération des performances chez les
animaux traités à l’acide sulfanilique.
Sur la base des travaux précédemment cités et de nos études réalisées in vivo et in
vitro, il apparait bien que l’action de la tartrazine sur les protéases pancréatiques s’effectue à
travers son métabolite majeur. Ce qui conforte l’hypothèse de Onyema et al. (2006), selon
lesquels les métabolites des xénobiotiques deviennent parfois plus toxiques que les substances
initiales dont elles sont issues.
Sachant que les trois grandes phases de la sécrétion des protéines par le pancréas
exocrine sont: la synthèse des enzymes digestives, leur transport intracellulaire et la sécrétion
de zymogènes induite par le sécrétagogue (Otsuki and Williams, 1982), on peut donc suggérer
que le E102 et/ou l’acide sulfanilique (AS) pourraient exercer leurs effets toxiques au cours
de l’une de ces phases. Partant donc des ces données, et dans le but d’établir les mécanismes
mis en jeu dans l’altération du système digestif, il était intéressant d’essayer d’identifier les
voies de signalisation intracellulaires qui pouvaient être affectées par ces deux composants.
Pour cela, nous avons procédé à une étude ex vivo sur des cellules acinaires isolées du
pancréas des souris Swiss et sur des cellules AR42J issus d’un carcinome pancréatique du rat.
On sait que la fonction du pancréas exocrine est contrôlée principalement par les
signaux du calcium (Petersen, 2014). Mais il est connu également qu’une augmentation
prolongée des niveaux du Ca2+ peut nuire à la physiologie du pancréas par l’induction de
lésions pancréatiques à l’origine de plusieurs pathologies (Petersen, 2008; Petersen, 2009;
Gerasimenko et al., 2017).
Nos résultats ont montré que la tartrazine ainsi que l’AS provoquent une augmentation
généralement dose-dépendante de la concentration du Ca2+libre intracellulaire. Ceci suggère
que le E102 et son métabolite pourraient potentiellement endommager la glande (Petersen,
2008).
Compte tenu du rôle primordial du Ca2+ dans différents processus physiologiques, la
dérégulation du signal calcique peut être une caractéristique de certains états pathologiques
(Missiaen et al., 2000; Roderick and Cook, 2008; Parkash and Asotra, 2010). En effet, le
calcium a un rôle accélérateur dans la conversion du trypsinogène en trypsine alors qu'un taux
DISCUSSION
81
élevé de calcium dans le suc pancréatique pourrait être à l'origine de la formation de calculs
responsables de l'obstruction des voies pancréatiques. Tout ceci pourrait être à l'origine de
l'autodigestion du pancréas (Sara, 2016). De plus, cette élévation anormale provoque une
activation prématurée des enzymes intracellulaires, un dysfonctionnement mitochondrial, une
altération de l’autophagie, vacuolisation et nécrose. Ces anomalies contribuent au
développement de la pancréatite aigüe (Wen et al., 2016).
D’autre part, le stress oxydatif qui correspond à un déséquilibre entre la génération des
espèces réactives de l’oxygène (ERO) et les défenses antioxydantes de la cellule, en faveur
des premières, peut contribuer à une multitude de maladies dans lesquelles une surproduction
des ERO engendre un dysfonctionnement cellulaire (Haleng et al., 2007; Migdal and Serres,
2011).
En effet, plusieurs études ont corrélé l’action de la tartrazine avec l’induction du stress
oxydatif. En particulier, il a été montré que ce colorant alimentaire peut altérer le statut redox
en produisant des ERO et en diminuant l’activité des enzymes antioxydantes au niveau du
système reproducteur (Visweswaran and Krishnamoorthy, 2012; Boussada et al., 2017), des
reins et du foie (Amin et al., 2010; El Golli, 2016) et du cerveau (Gao et al., 2011; Cemek et
al., 2014). De même, la production excessive des ERO a été signalée comme étant un
contributeur majeur des pathologies affectant le pancréas exocrine (Bhardwaj and Yadav,
2013).
Dans notre travail, nous avons montré que l’acide sulfanilique induit la production des
ERO dans les cellules acinaires et dans les mitochondries des cellules AR42J. En fait, il est
bien connu que les mitochondries représentent la principale source des ERO dans la cellule et
que leur production joue un rôle fondamental dans les pathologies pancréatiques (Granados et
al., 2004; Gerasimenko and Gerasimenko, 2012).
Nos résultats sont en accord avec ceux deMorales et al. (2004) et Bansal et al. (2005)
qui montrent que les métabolites de la tartrazine peuvent générer des ERO favorisant ainsi la
peroxydation lipidique et inhibant les enzymes antioxydantes, accélérant ainsi le stress
oxydatif et endommageant la plupart des composants cellulaires.
La relation entre la génération des ERO et l’excès en Ca2 + est très étroite et il est
DISCUSSION
82
difficile d’évaluer lequel conduit à l’autre sachant que des niveaux élevés de [Ca2+]i
conduisent à la production des ERO et un excès de cette dernière induit une surproduction en
Ca2 +(Gonzalez et al., 2012).
Fait intéressant, nos résultats indiquent que l'effet de l'acide sulfanilique sur la
production des ERO ne semblait pas dépendre de la mobilisation du Ca2+. Ceci nous laisse
supposer que le dérivé de la tartrazine pourrait altérer la physiologie mitochondriale,
conduisant à la production des ERO qui, à leur tour, pourrait entraîner une augmentation de
[Ca2+]i.
D’autre part, il a été montré que la génération des ERO dans un organisme est corrélée
à la diminution des niveaux d'enzymes antioxydantes favorisant ainsi le stress oxydatif (El-
Tohamy, 2012). C’est pourquoi, on s’est intéressé à évaluer l’effet de AS sur le système du
glutathion (GSH) et sur les taux de la superoxydase dismutase (SOD2).
Nos résultats montrent que l’incubation des cellules AR42J avec l’acide sulfanilique
provoque une diminution dose-dépendante du ratio glutathion réduit/glutathion oxydé
(GSH/GSSH) ainsi qu’une diminution d’expression de la SOD2.
En fait, le système de glutathion est impliqué dans la désintoxication des ERO
produites par les xénobiotiques. Une diminution de la teneur de GSH ainsi qu’une
augmentation permanente du ratio [GSSG/GSH] constitue un stress oxydant et est considéré
comme un signe pathologique commun lors des troubles affectant les tissus et les organes de
l’organisme (Dugo et al., 2011). A son tour, la SOD2 mitochondriale protège les cellules
contre les effets délétères des ERO. Par conséquent, sa déficience est responsable de plusieurs
pathologies (Nojima et al., 2015). En effet, la suppression du gène responsable de la
production de la superoxyde dismutase chez des souris a été associé à un décès prématuré dû
à un manque de défense contre les radicaux libres (Baba and McGrath, 2008).
La SOD2 est une métalloprotéine qui représente une des premières lignes de défense
contre le stress oxydant. Elle assure l’élimination de l’anion superoxyde O2-par une réaction
de dismutation, en le transformant en peroxyde d’hydrogène H2O2 et en oxygène (Haleng et
al., 2007). Cependant, cette enzyme peut être inhibée par un taux élevée des H2O2 (Grzelak et
al., 2000).
DISCUSSION
83
Les résultats de l’étude du GSH et de la SOD2 confirment les observations
précédentes lors de la détermination des ERO et indiquent que le métabolite de la tartrazine
affecte le système de défense antioxydant, favorisant ainsi un état de stress oxydatif et altère
probablement la mitochondrie.
Pour vérifier une probable altération de cet organite, nous avons déterminé le potentiel
membranaire mitochondriale (ψm). Ce dernier est nécessaire pour maintenir la fonction
physiologique de la chaine respiratoire pour générer de l’ATP (Joshi and Bakowska, 2011). Il
a été montré qu’une diminution de ψm est liée à une augmentation du niveau des ERO (Satoh
et al., 1997). De plus, les changements dans l'état redox mitochondrial et du ψm peuvent
conduire à des dommages cellulaires (Kuznetsov et al., 2011). D’ailleurs, le
dysfonctionnement mitochondrial et le stress oxydatif sont impliqués dans la
physiopathologie de nombreuses maladies (Joshi and Bakowska, 2011). Dans ce sens, une
diminution du ψm entraine un dysfonctionnement de la mitochondrie qui va activer la voie
apoptotique intrinsèque (Lamy, 2009).
Nous avons observé une diminution du ψm dans les cellules AR42J incubées avec la
concentration la plus élevée d'acide sulfanilique, soit 1 mM. Notre résultat concorde avec les
données précédemment citées confortant alors l’existence d’une relation entre l'atteinte
mitochondriale et le stress oxydatif. De plus, Siraki et al. (2002) ont constaté que l'incubation
des hépatocytes avec des amines aromatiques entraînent une diminution du potentiel de la
membrane mitochondriale avant que la cytotoxicité ne se produise .
En effet, nos résultats suggèrent que l'acide sulfanilique induit la production des ERO
dans les mitochondries et altère les défenses antioxydantes des cellules favorisant les
conditions du stress oxydatif qui pourrait endommager la fonction cellulaire.
En ce qui concerne la fonction cellulaire, nous avons observé une altération de la
sécrétion de la trypsine dans les cellules AR42J stimulées par la cholécystokinine (CCK) en
présence d’acide sulfanilique. Ceci confirme les résultats obtenus in vivo en utilisant la
tartrazine. Selon Sherwood et al. (2007), un désordre dans la sécrétion du trypsinogène est une
étape précoce dans le développement de la pancréatite aigüe.
Nous avons également montré que l’effet toxique du métabolite de la tartrazine sur la
DISCUSSION
84
trypsine a été diminué en présence de la mélatonine. Cette dernière est considérée comme un
puissant antioxydant qui peut protéger les cellules en piégeant les ERO, elle présente aussi des
effets anti-inflammatoires (Korkmaz et al., 2009).
En fait, il a été précédemment montré que l’utilisation des antioxydants protège
potentiellement le pancréas contre les dommages induits par les ERO (Sevillano et al., 2003).
De même, concernant l’effet antioxydatif, Santofimia-Castaño et al. (2013) et Santofimia-
Castaño et al. (2014) ont montré que l'indoleamine possède des effets protecteurs sur les
cellules acineuses pancréatiques.
Tous les composants cellulaires, y compris les lipides, les protéines, les acides
nucléiques et les sucres sont des cibles potentielles du stress oxydatif (Visweswaran and
Krishnamoorthy, 2012). Les enzymes digestives alors ne font pas exception. Nos observations
suggèrent donc que l'effet de l'acide sulfanilique sur la sécrétion de la trypsine pourrait être dû
à la génération des ERO.
CONCLUSION
85
6. Conclusion
La coloration est un facteur important, parfois même décisif, dans le choix d'un
aliment. Ainsi, les colorants alimentaires sont d’avantage utilisés par intérêt économique que
par nécessité technique ou technologique. La tartrazine (E102) étudiée dans le cadre de ce
travail, est un colorant largement utilisé dans l’industrie alimentaire et notamment dans la
cuisine algérienne.
L’évaluation de la toxicité de la tartrazine a fait l’objet de nombreuses études menées
aussi bien sur l’animal que chez l’homme, en plus de travaux réalisés in vitro. Cependant,
l'impact de l’ingestion de la tartrazine sur les activités biologiques et les processus
physiologiques telle que la digestion n'est pas clairement établi, et les conclusions peuvent
différer d'une étude à l'autre.
Ce travail a donc eu pour objectif l’évaluation de la toxicité de la tartrazine sur un
aspect particulier de la fonction digestive à savoir l’activité enzymatique de la trypsine, de la
chymotrypsine, de l’amylase et de la lipase.
Nous avons dans un premier temps vérifié si l’ingestion de la tartrazine à la DJA est
vraiment sans effets néfastes. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à
étudier l’effet du métabolite majeur de la tartrazine qui est l’acide sulfanilique sur les
fonctions du pancréas exocrine compte tenu du rôle majeur de cette glande dans le processus
de la digestion. Il s’agissait, en fait, d’essayer de d’étudier la voie par laquelle ce colorant peut
affecter le bon fonctionnement de la digestion.
Nos résultats ont montré dans cette étude que la consommation par les souris Swiss de
la tartrazine à la dose de 0,05% durant 13 semaines diminue significativement l’activité de la
trypsine et de la chymotrypsine. Contrairement à cela, les résultats de l’étude in vitro en
utilisant un modèle de digestion ont montré que la tartrazine n’as pas d’effet sur l’activité de
ces deux enzymes protéolytiques. Ce résultat suggère en fait que ce colorant exerce son
pouvoir toxique via son métabolite. Une absorption intestinale adéquate des nutriments est
tributaire d’une production conséquente en enzymes pancréatiques pour permettre une activité
enzymatique optimal dans la lumière du duodénum.
CONCLUSION
86
Les données de l’étude ex vivo sur les cellules acinaires et sur les cellules AR42J
indiquent que la tartrazine affecte la signalisation calcique. En fait, une augmentation de la
concentration du calcium intracellulaire est un signal précoce important par lequel les
sécrétagogues physiologiques provoquent la libération des enzymes digestives par les cellules
acineuses pancréatiques. Une altération de la sécrétion conduit à l’activation intracellulaire
des enzymes digestives qui à son tour pourrait initier l’autodigestion de la glande et les tissus
environnants en favorisant les maladies inflammatoires (Fernández-Sánchez et al., 2009;
Tapia et al., 2010).
Nos résultats montrent que l’acide sulfanilique (AS), le métabolite majeur de la
tartrazine, altère la physiologie de la mitochondrie et affecte son potentiel membranaire. Ce
composant semble notamment être très nocif pour les cellules car il induit un stress oxydatif
dose-dépendant dans les deux modèles cellulaires utilisés (cellules acinaires et cellules
AR42J) tout en surproduisant les espèces réactives de l’oxygène (ERO) et en diminuant le
niveau de défense antioxydante assurée par le système du glutathion et de la superoxyde
dismutase dans les cellules AR42J. De plus, l’acide sulfanilique provoque une altération de la
sécrétion de la trypsine qui semble être due à un excès des ERO mis en évidence par
l’utilisation d’un antioxydant (la mélatonine) qui diminue l’effet toxique de l’AS.
Les protéines ont de nombreuses fonctions dans le corps. Elles peuvent être utilisées
comme source d’énergie, entrer dans la structure des différentes parties du corps, constituer
des hormones, des enzymes etc. Ainsi, toute carence dans la digestion de ces protéines peut
affecter le bon fonctionnement de l'organisme. Nos résultats ont clairement montré que
l’ingestion subchronique de la tartrazine diminue significativement l’activité protéolytique des
enzymes pancréatique ce qui confirme que ce colorant est réellement nocif pour la bonne
santé.
Bien que les résultats de ce travail montrent que la dose de 0,005 %, une dose très
proche de la DJA, n’as pas un effet adverse sur les enzymes pancréatiques étudiées, il est
néanmoins important qu’une enquête nutritionnelle soit menée auprès de la population
algérienne pour évaluer la consommation quotidienne de la tartrazine. Une priorité doit être
plus particulièrement accordée aux enfants, catégorie très vulnérable, en raison d’une part de
leur poids corporel relativement diminué et d’autre part, en rapport à leur consommation
CONCLUSION
87
élevée en additifs alimentaires (Anisyah et al., 2011). Ainsi, l’altération du processus de
croissance peut être plus sévère chez les enfants.
En conclusion, la présente étude montre clairement que la tartrazine ainsi que son
métabolite, l’acide sulfanilique, peut significativement affecter la fonction du pancréas
exocrine et rendre cet organe susceptible à des pathologies ce qui altère les processus de la
digestion.
En perspectives, en vue de protéger la population des effets nocifs de ce colorant
alimentaire synthétique, la curcumine (grâce à son pouvoir antioxydant puissant) est utilisée
comme un additif alimentaire prometteur pour réduire le stress oxydatif causé par la tartrazine
(El-Desoky et al., 2017) donc une étude comparative en utilisant les deux colorants semble
être de grand intérêt .
Les résultats obtenus ouvrent sur d’autres perspectives notamment d’évaluer l’effet de
la tartrazine et de son métabolite sur d’autres enzymes digestives tels que la pepsine gastrique,
l’élastase, les nucléases, les carboxypeptidases…etc. D’autre part, on peut également
envisager l’étude de l’effet de la tartrazine et de son métabolite, l’acide sulfanilique, sur
l’absorption intestinale in vivo sur des souris Swiss et ex vivo en utilisant les cellules Caco-2
pour bien comprendre l’effet de ce colorant alimentaire sur la fonction digestive.
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Contents lists available at ScienceDirect
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journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchemtox
Sulfanilic acid increases intracellular free-calcium concentration, inducesreactive oxygen species production and impairs trypsin secretion inpancreatic AR42J cells
Fatma Zohra Ameura,b, Nabila Mehedib, Omar Kherouab, Djamel Saïdib, Gines M. Salidoa,Antonio Gonzaleza,∗
a Institute of Molecular Pathology Biomarkers, University of Extremadura, Caceres, Spainb Laboratoire de Physiologie de la Nutrition et de Sécurité Alimentaire - Université d'Oran1, Ahmed BenBella, Algeria
A R T I C L E I N F O
Keywords:AR42J cellsCalciumPancreasROSSulfanilic acidTrypsin secretion
A B S T R A C T
We studied the effects of the tartrazine-metabolite sulfanilic acid on the physiology of pancreatic AR42J cells.Sulfanilic acid (1 μM-1 mM) induced a slow and progressive increase in intracellular free-calcium concentrationthat reached a plateau. The effect of sulfanilic acid was not concentration-dependent. Stimulation of cells withthapsigargin (1 μM) after treatment with sulfanilic acid (1mM) induced a smaller Ca2+ response compared withthat obtained with thapsigargin alone. Sulfanilic acid induced a concentration-dependent production of reactiveoxygen species; however, this effect was not Ca2+-dependent. Depolarization of mitochondrial membrane po-tential was observed at the concentration of 1mM sulfanilic acid. In the presence of the compound a decrease inthe GSH/GSSG ratio was observed. A decrease in the expression of superoxide dismutase 2 was noted. Finally,stimulation of cells with CCK-8 led to a concentration-dependent increase of trypsin secretion that was impairedby pretreatment of cells with sulfanilic acid. Preincubation of cells with the antioxidant melatonin (100 μM)reduced the effect of sulfanilic acid on trypsin secretion. We conclude that sulfanilic acid might induce oxidativestress, which could alter Ca2+ signaling and enzyme secretion in pancreatic AR42J cells. This creates a situationpotentially leading to damage of the exocrine pancreas.
1. Introduction
The compound E102 or FD&C Yellow #5, known as tartrazine(PubChem CID: 164825), is a synthetic lemon yellow azo dye used as afood coloring mainly in developing countries as a substitute for saffron(Mehedi et al., 2009). It is also used in some of non-food products suchas soaps and cosmetics; also some medical preparations contain tar-trazine such as vitamin complexes, antiacids, medicinal capsules andcertain prescription drugs (Amin et al., 2010). An acceptable daily in-take (ADI) of 0–7.5mg/kg b.w. was established by Joint FAO/WHOExpert Committee on Food Additives (Wilson and Terry, 1964) andrevised to be 0–10mg/kg b.w. in 2016 (WHO, 2016) while a standardnorm of 300mg per kg of tartrazine in dairy products is permitted.However, the ADI of this compound may be exceeded in part due to
food habits (Amin et al., 2010).The debate about tartrazine is controversial but most of the studies
show a relation between its consumption and health disorders. After theoral ingestion of tartrazine, it can be reduced to free aromatic amines.Sulfanilic acid is the mainly metabolite that results from this reductionat the N=N azo link, which occurs mainly via the gastrointestinal (GI)flora (Elhkim et al., 2007; Moutinho et al., 2007) and possibly bymammalian azo reductase in the intestinal wall or in the liver (deAragão Umbuzeiro et al., 2005). According to Onyema et al. (2006), thebyproducts of such metabolism sometimes become more toxic than theinitial substance. Its consumption can lead to activation of the in-flammatory cascade, impairment of intestinal permeability allowinglarge antigenic molecules to be absorbed, and could lead to cross-re-activities, autoimmunity, and even neurobehavioral disorders (Vojdani
https://doi.org/10.1016/j.fct.2018.07.001Received 22 March 2018; Received in revised form 9 June 2018; Accepted 1 July 2018
∗ Corresponding author. Institute of Molecular Pathology Biomarkers, University of Extremadura, Avenida Universidad s/n, E-10003, Caceres, Spain.E-mail address: [email protected] (A. Gonzalez).
Abbreviations: BAPNA, Nα-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydrochloride; Dimethyl BAPTA/AM, 1,2-bis(2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl) ester; CCK-8, cholecystokinin octapeptide; [Ca2+]i, intracellular free Ca2+ concentration; CM-H2DCFDA, 5-(and-6)-chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluoresceindiacetate, acetyl ester; EGTA, ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'N´-tetraacetic acid; ER, endoplasmic reticulum; GSSG, oxidized glutathione; GSH, reduced glutathione; FCCP,carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone; Fura-2/AM, fura-2 acetoxymethyl ester; H2O2, hydrogen peroxide; ROS, reactive oxygen species; SA, sulfanilic acid; SERCA,sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase; SOD2, superoxide dismutase 2; TMRM, tetramethylrhodamine methyl ester; Tps, thapsigargin
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Available online 03 July 20180278-6915/ © 2018 Elsevier Ltd. All rights reserved.
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and Vojdani, 2015). A possible link exists between consumption of ar-tificial food coloring, including tartrazine and/or preservatives, andincreased symptoms of attention-deficit hyperactivity disorder amongchildren (McCann et al., 2007). Additional research supports neurotoxicand reproductive effects (Axon et al., 2012; Kamel and El-Lethey, 2011;Park et al., 2009; Tanaka, 2006; Tanaka et al., 2008).
Even though many studies have been carried out to investigate thetoxic effects of tartrazine and its derivatives on health, few ones targetthe digestive system. According to existing studies, tartrazine may in-duce DNA damage in the stomach and colon as well as degenerativechanges in stomach mucosa (Sasaki et al., 2002). However, studies onthe effects of this food-dye and of its derivative sulfanilic acid on theexocrine pancreas are currently lacking. In the present study, we aimedto investigate the effects of the tartrazine derivative compound sulfa-nilic acid on rat pancreatic AR42J cells. Here we show that sulfanilic
acid exerts deleterious actions on cellular physiology, which might bebased on the induction of oxidative stress and the impairment of en-zyme secretion.
2. Material and methods
2.1. Chemicals
Pancreatic AR42J cells were obtained from the Service of AppliedTechniques to Bioscience from the University of Extremadura (STAB-UEx, Badajoz, Spain). Nα-Benzoyl-DL-arginine 4-nitroanilide hydro-chloride (BAPNA), 1,2-bis(2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl) ester (dimethylBAPTA/AM), bovine serum albumin, (Tyr[SO3H]27) cholecystokininfragment 26–33 amide (CCK-8), cell lysis reagent for cell lysis andprotein solubilization, reduced glutathione, dexamethasone, en-terokinase, ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N'N´-tetraaceticacid (EGTA), carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone(FCCP), N-ethylmaleimide, tetramethylrhodamine methyl ester(TMRM), sulfanilic acid, oxidized glutathione, o-Phthalaldehyde, pro-tease inhibitor cocktail (Complete, EDTA-free), Tween®-20, thapsi-gargin and trypsin were obtained from Sigma Chemicals Co. (Madrid,Spain). Fura-2 acetoxylmethyl ester (fura-2/AM), MitoSOX™ Red, andtrypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (trypsin-EDTA) were pur-chased from Life Technologies (Invitrogen, Barcelona, Spain). RPMI1640 medium and fetal bovine serum (FBS) were purchased fromHyClone (Fisher Scientific Inc., Madrid, Spain). Penicillin/streptomycinand L-glutamine were obtained from BioWhittaker (Lonza, Basel,Switzerland). Bradford reagent, Tris/glycine/SDS buffer (10× ) andTris/glycine buffer (10× ) were from Bio-Rad (Madrid, Spain).SignalFire™ ECL Reagent was obtained from Cell Signaling Technology(C-Viral, Madrid, Spain). Anti-alpha-actin antibody was purchased fromSigma Chemicals Co. (Madrid, Spain). Antibody against superoxidedismutase 2 was purchased from Santa Cruz Biotechnology (QuimigenS.L., Madrid, Spain). Goat anti-mouse IgG HRP-conjugate was pur-chased Thermo Fisher Sci. (Fisher Scientific Inc., Madrid, Spain). Allother reagents were of analytical grade.
2.2. Preparation of cell cultures
AR42J cells (passages 8–18) were cultured following previouslydescribed methods (Gonzalez et al., 2011). Briefly, cells were culturedin a RPMI 1640 medium supplemented with 2mM L-glutamine, 10%FBS and an association of antibiotics (0.1 mg/mL streptomycin, 100 IUpenicillin). Cells were maintained in a cell incubator at 37 °C under ahumidified condition of 95% air and 5% CO2. Cells were seeded in cellculture plates (10 cm diameter) at a density of approximately 106 cells/mL or on glass coverslips (≈30000 cells) placed in independent dishes(35mm diameter), and were allowed to grow until confluence wasreached. Forty-eight hours prior to use, cells were incubated in culturemedium supplemented with 100 nM dexamethasone and then the cellswere used for the experiments. In order to increase the number of cellsavailable for the experiments, and to keep a cell population to be usedin other studies, the cells were detached by incubation with Hanks'Balanced Salt Solution containing Trypsin-EDTA and reseeded.
2.3. Determination of changes in intracellular free-calcium concentration
The fluorescent ratiometric Ca2+ indicator fura-2 was employed tomonitor the changes in [Ca2+]c (Santofimia-Castaño et al., 2014a).Fura-2-derived fluorescence closely report changes in [Ca2+]c(Grynkiewicz et al., 1985).
For this purpose, cells were detached and resuspended in aNa–HEPES buffer 1 containing: 130mM NaCl, 4.7mM KCl, 1.3 mMCaCl2, 1 mM MgCl2, 1.2mM KH2PO4, 10mM glucose, 10 mM HEPES,0.2% (w/v) bovine serum albumin and 0.01 trypsin inhibitor (pH=7.4
Fig. 1. Changes in [Ca2+]c in AR42J cells in response to CCK-8 andthapsigargin. (A) Time-courses of changes in fluorescence, related to [Ca2+]c,in fura-2-loaded AR42J cells stimulated with 1 nM CCK-8. (B) The trace shows arepresentative time-course of changes in fluorescence in fura-2-loaded AR42Jcells stimulated with 1 μM thapsigargin (Tps). The horizontal continuous barsindicate the time during which the desired concentration of stimulus was ap-plied to the cells. The experiments were performed in the presence of Ca2+ inthe extracellular medium. Traces are representative of four to five such in-dependent experiments.
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adjusted with NaOH). Thereafter, cells were incubated in the presenceof fura-2/AM (4 μM) at room temperature (23–25 °C) for 40min. Oncefinished the incubation with the dye the cell suspension was centrifuged(30× g), the supernatant was discarded and the pellet was resuspendedwith a Na-HEPES buffer 2 containing: 140mM NaCl, 4.7mM KCl, 1 mM
CaCl2, 1.1 mMMgCl2, 10mM Hepes, 10mM glucose (pH adjusted to 7.4with NaOH).
Changes in fluorescence signals were monitored by placing 2mLaliquots of dye-loaded cells into a quartz cuvette in a fluorescencespectrofluorimeter (RF-5001-PC; Shimadzu, Kyoto, Japan). Cells werestirred continuously and maintained at 37 °C. Fluorescence light at 340and 380 nm were employed to alternatively excite the cells, andfluorescence emission was measured at 505 nm. All stimuli were dis-solved in the extracellular Na-HEPES buffer 2, and were added directlyto the cells to yield the final concentration required. Results are ex-pressed as the ratio of fluorescence emitted at both excitation wave-lengths, previously normalized to the basal (resting) fluorescence (n)(where n is the number of independent experiments). The experimentswere carried out employing different batches of cells.
2.4. Determination of reactive oxygen species production
Determination of reactive oxygen species (ROS) generation wasperformed using protocols routinely applied in our lab. Cells were de-tached, resuspended in Na-HEPES buffer 1 and incubated in the pre-sence of MitoSOX™ Red (2.5 μM) for 15min. at 37 °C as previously de-scribed (Santofimia-Castaño et al., 2015). Following loading of cellswith the dye, cells were centrifuged (30× g), resuspended in Na-HEPESbuffer 2 and used immediately. Oxidation of the dye, related to theredox state of cells, was determined by measuring cellular fluorescenceat 510 nm/580 nm (excitation/emission) using an ELISA spectro-fluorimeter (Tecan Infinite M200, Grödig, Austria).
In experiments in which Ca2+-free conditions were used, cells wereloaded with BAPTA by incubating the cells in the presence of 10 μM
Fig. 2. Changes in [Ca2+]c in AR42J cells in response to sulfanilic acid. The traces represent the changes in fluorescence, related to [Ca2+]c, in fura-2-loadedAR42J cells stimulated with 1 μM (A), 10 μM (B), 100 μM (C) or 1mM (D) sulfanilic acid. The horizontal continuous bars indicate the time during which the desiredconcentration of sulfanilic acid was applied to the cells. The experiments were performed in the presence of Ca2+ in the extracellular medium. Traces are re-presentative of six to eight such independent experiments.
Fig. 3. Effect of sulfanilic acind on thapsigargin-evoked calcium mobili-zation. Time-course of changes in [Ca2+]c in fura-2-loaded AR42J cells sti-mulated with 1mM sulfanilic acid and further application of 1 μM thapsigargin(Tps). The horizontal continuous bars indicate the time during which the de-sired concentration of stimulus was applied to the cells. The experiments wereperformed in the presence of Ca2+ in the extracellular medium. Traces arerepresentative of four such independent experiments.
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BAPTA/AM during 40min at room temperature. Additionally, Ca2+
was omitted from the extracellular solution and 0.5mM EGTA wasadded. Results are shown as the mean increase of fluorescence ex-pressed in percentage ± SEM (n) with respect to control (non-stimu-lated) cells, where n is the number of independent experiments.
In order to obtain fluorescence images of MitoSOX RedTM-loadedcells, individual coverslips with dye-loaded cells were mounted on anexperimental perfusion chamber, and placed on the stage of an epi-fluorescence inverted microscope (Nikon Diaphot T200, Melville, NY,USA). The cells were continuously superfused with a control Na-HEPESbuffer containing (in mM): 140 NaCl, 4.7 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10Hepes, 10 glucose (pH adjusted to 7.4). Cells were excited with light
from a xenon arc lamp passed through a high-speed monochromator(Polychrome IV, Photonics, Hamamatsu, Japan) at 510 nm.Fluorescence emission (580 nm) was detected using an ORCA Flash 4.0V2 digital CMOS camera (Hamamatsu Photonics-France, Barcelona,Spain) and recorded using HCImage software (Hamamatsu Corp.,Sewickley, PA, USA). Stimuli were dissolved in the extracellular Na-HEPES buffer, and applied directly to the cells in the perfusionchamber. Three different culture preparations were employed in thestudies.
2.5. Determination of mitochondrial membrane potential
Changes in mitochondrial membrane potential (ψm) were recordedusing the dye TMRM as described previously. AR42J cells were in-cubated during 30min in the presence of 50 nm TMRM at 37 °C. Adecrease in TMRM fluorescence reflects depolarization of ψm, becauseof diffusion of the dye to the cytosol (González et al., 2003). No TMRMwas added to the medium after the initial loading period. Followingloading of cells with the dye, cells were centrifuged (30× g), re-suspended in Na-HEPES buffer 2 and used immediately. Changes in ψmwere determined by measuring cellular fluorescence at 543 nm/605 nm(excitation/emission) using an ELISA spectrofluorimeter (Tecan InfiniteM200, Grödig, Austria). Results are given as the mean increase offluorescence expressed in percentage ± SEM (n) with respect to con-trol (non-stimulated) cells, where n is the number of independent ex-periments.
2.6. Determination of glutathione
Reduced (GSH) and oxidized (GSSG) levels of glutathione weredetermined using the method of Hissin and Hilf (1976). After applica-tion of stimuli, cells were washed twice with PBS, detached and re-suspended with 1mL of 25mM Tris-HCl buffer (pH=7.6) containing1% (w/v) Triton X-100 and transferred to Eppendorf vials. The sampleswere placed on ice, sonicated for 10min and kept at −20 °C during5min. Subsequently, the samples were centrifuged (9000× g, at 4 °Cfor 30min), and the supernatants were collected and placed in in-dependent vials. The total protein concentration in each sample wasdetermined following Bradford's method (1976), using bovine serumalbumin as standard. Next, proteins in the supernatant were pre-cipitated by addition of 20% cold trichloroacetic acid. The vials werethen centrifuged (10,000× g for 10min at 4 °C) and kept at −80 °C forlater determination of GSH and GSSG. On the moment of use, samples(50 μL) were incubated with 1mg/mL of the fluorescent reagent ortho-phthalaldehyde (OPT) in a basic (pH 8.0) buffer containing Na-phos-phate (0.1M) and EDTA (5mM). Previous to the determination ofGSSG, N-ethylmaleimide (40mM) and NaOH (1M; volume to reach pH12) were added. The reaction mixture was incubated during 45min at20 °C. Afterwards, 200 μL of the reaction mixture were transferred tothe wells in a black 96 well plate. The presence of GSH or GSSG wasdetermined by measuring fluorescence at 350 nm/420 nm (excitation/emission) using a spectrofluorimeter (Tecan Infinite M200, Grödig,Austria). Standard curves of GSH (3.20–320 μmol/mL) and GSSG(2.5–80 μmol/mL) were used for quantification. For normalization, theprotein content of each sample was used. The assays were performed intriplicate. A reaction medium without cell extract was employed ascontrol (blank) sample.
GSH and GSSG values (μmol/mg of proteins) were determined andthe ratio GSH/GSSG was calculated. Data are shown as the mean in-crease in GSH/GSSG ratio expressed in percentage ± SEM (n) withrespect to control (non-stimulated) cells, where n is the number of in-dependent experiments.
2.7. Western blotting studies
Cells were incubated with stimuli. Thereafter, cells were detached,
Fig. 4. Effect of sulfanilic acid on reactive oxygen species generation inAR42J cells loaded with the redox-sensitive dye MitoSOXTM Red. AR42Jcells were incubated during 1 h with no stimulus (control) or with differentconcentrations of sulfanilic acid, in the presence (A) or in the absence (B) ofCa2+ in the extracellular medium. Then the effect of sulfanilic acid onMitoSOX™ Red oxidation was studied. Results report the oxidative state oftreated cells compared with that of control (non-stimulated) cells, and arepresented as the mean increase of fluorescence expressed in percentage ± SEMwith respect to control (non-stimulated) cells (*, P < 0.05; **, P < 0.01 vsnon-treated cells; ***, P < 0.001 vs non-treated cells; †, P < 0.05 vs CCK-8 inthe presence of extracellular Ca2+; n= six to seven independent experiments).
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centrifuged, washed with a standard phosphate-buffered saline (PBS:137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4; pH ad-justed to 7.4) and sonicated in lysis buffer. For quantification of theprotein content of samples Bradford's method was employed (Bradford,1976). Protein lysates (20 μg/lane) were fractionated by SDS-PAGEusing 10% polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose mem-branes. The membranes were incubated with the specific primary andthe corresponding IgG-HRP conjugated secondary antibody. Results areexpressed as percentage of protein expression ± SEM (n) comparedwith that detected in control (non-stimulated) cells, where n is thenumber of independent experiments. The experiments were carried outemploying different batches of cells, harvested on different days.
2.8. Determination of trypsin secretion
Trypsin secretion was monitored employing previously describedmethods (Tapia et al., 1997) with some modifications. AR42J cells wereseeded onto 24 well plates at a density of 40.000 cells per well and wereallowed to grow for 72 h. Once the cells had been differentiated byincubation in the presence of dexamethasone the cells were incubatedduring 45min at 37 °C with the different stimuli assayed. For the de-tection of trypsin secretion to the supernatant in each well the followingprocedure was used: 150 μL of the supernatant were incubated with50 μL of a solution containing enterokinase from porcine intestine (4units/mL) and BAPNA (1mg/mL). The mixture was then incubated at37 °C during 10min. In the presence of enterokinase the inactiveproenzyme trypsinogen, that will have been secreted by AR42J cells, isconverted to the active enzyme trypsin, and also autocatalytically bythe action of trypsin formed. BAPNA is used as a chromogenic substrate,which will liberate 4-nitroaniline in the presence of trypsin. The releaseof 4-nitroaniline, related to trypsin secretion, was monitored by mea-suring absorbance at 405 nm employing the ELISA spectrofluorimetermentioned above. Each determination (secretion point) was performedin duplicate. The increases in optical density were linearly related withunits of trypsin. Trypsin secretion was calculated employing a calibra-tion curve with known trypsin concentrations. Results are expressed asunits of trypsin (UT) secreted by the cells ± SEM (n), were n is thenumber of independent preparations.
2.9. Statistical analysis
Statistical analysis was performed by one-way analysis of variance(ANOVA) followed by Tukey post hoc test, and only p values < 0.05
Fig. 5. Fluorescence images showing the effect of sulfanilic acid on reactive oxygen species generation in AR42J cells loaded with the redox-sensitive dyeMitoSOXTM Red. Coverslips with dye-loaded cells were mounted on an experimental perfusion chamber and placed on the stage of an epifluorescence invertedmicroscope, as described in Material and methods section. (A) Transmitted light image of cells. (B) Fluorescence image of cells before treatment with sulfanilic acid(1mM). (C) Fluorescence image of the cells taken after incubation during 1 h in the presence of 1mM sulfanilic acid. An increase in fluorescence was detected. Theimages are representative of three independent preparations.
Fig. 6. Effect of sulfanilic acid on mitochondrial membrane potential.AR42J cells were loaded with the mitochondria-specific voltage-sensitive dyeTMRM. The cells were then incubated during 15 min. in the presence of sul-fanilic acid (1 mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM). As a control, different batches ofcells were incubated in the presence of the mitochondrial uncoupler FCCP(0.5 μM). Results show the changes in ψm of treated cells compared with non-stimulated (n.e.) cells, and are presented as the mean increase of fluorescenceexpressed in percentage ± SEM with respect to non-stimulated cells (*,P < 0.05 vs non-stimulated cells; n= four independent experiments).
Fig. 7. Effect of sulfanilic acid on glutathione. AR42J were incubated duringone hour in the presence of sulfanilic acid (1 mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM), andthe effect on glutathione was analyzed. The bars show the mean increase inGSH/GSSG ratio expressed in percentage ± SEM with respect to control (non-stimulated) cells. Three different cellular preparations were used (n.e., non-stimulated cells; *, P < 0.05; **, P < 0.01).
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were considered statistically significant. For individual comparisonsand statistics between individual treatments, we employed Student's t-test, and only p values < 0.05 were considered statistically significant.
3. Results
3.1. Effect of sulfanilic acid on intracellular free-calcium concentration
First, we performed several controls to check Ca2+ mobilization inresponse to compounds known to mobilize Ca2+ in this cell type. Forthis purpose, different batches of cells were stimulated with 1 nM CCK-8or 1 μM thapsigargin (Fig. 1A and B). CCK-8 is a well-known pancreaticsecretagogue that mediates its effects through Ca2+ mobilization (DelCastillo-Vaquero et al., 2010). Following addition of CCK-8 to the cellsa transient increase in [Ca2+]c was detected, which later returned to-wards a stable value over the basal (prestimulation) level, as it has beenpreviously shown. Thapsigargin, in turn, is a potent selective sarcoen-doplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) inhibitor, and increases[Ca2+]c due to depletion of functional Ca2+ stores (Nielsen et al.,1995). When thapsigargin was added to the cells, a transient increase in
[Ca2+]c was noted that then decreased towards a stable level over thebasal.
Next, we incubated AR42J cells with different concentrations ofsulfanilic acid (1 μM, 10 μM, 100 μM or 1mM) in the presence of ex-tracellular Ca2+. The compound led to a progressive increase in[Ca2+]c that reached a plateau over the resting (prestimulation) level.Because the level of fluorescence achieved was similar in the presenceof the different concentrations of sulfanilic acid tested, we can assumethat the effect of the compound on [Ca2+]c was not concentration de-pendent (Fig. 2).
In other set of experiments, cells were stimulated with Tps (1 μM)following prior incubation of cells with 1mM SA. Under these condi-tions, sulfanilic acid induced a progressive increase in [Ca2+]c thattowards a plateau over the prestimulation level. Addition of Tps to thecells in the presence of SA further induced a transient increase in[Ca2+]c, which was smaller compared with the response observed whenTps was added to the cells alone (Fig. 3). These results suggest thatsulfanilic acid evokes mobilization of [Ca2+]c from Tps-sensitive stores.
3.2. Effect of sulfanilic acid on reactive oxygen species production
It has been shown that the synthetic dye tartrazine induces oxida-tive damage and hepatotoxicity (El-Desoky et al., 2017). It is also wellknown that mitochondria serve as the major intracellular source of ROS(Granados et al., 2004). We were interested in checking whether tar-trazine derivative compound sulfanilic acid induced any effect on ROSproduction in our cellular model. For this purpose, different batches ofAR42J cells were loaded with MitoSOX™ Red, a mitochondrial ROSindicator. When the cells were incubated during one hour in the pre-sence of sulfanilic acid (1mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM) we observed anincrease in the dye-derived fluorescence, compared with non-stimu-lated cells, reflecting an increase in ROS production. The level of oxi-dation achieved with 1mM sulfanilic acid was slightly higher than thatobserved with the other concentrations of the compound used, althoughthe differences were not statistically significant. In another set of ex-periments cells were incubated in the presence of 1 nM CCK-8, whichalso induced an increase in fluorescence (Fig. 4A).
In order to check whether ROS generation in response to sulfanilicacid was dependent on Ca2+, we performed a series of experiments inwhich AR42J cells were previously loaded with the intracellular Ca2+
chelator dimethyl BAPTA, and challenged with sulfanilic acid in theabsence of extracellular Ca2+ (medium containing 0.5mM EGTA).Under these conditions ROS production evoked by sulfanilic acid didnot differ from that observed in the presence of Ca2+. However, ROSproduction in response to 1 nM CCK-8 was diminished compared withthe response noted in the presence of Ca2+ (Fig. 4B). These resultssuggest that sulfanilic acid-induced ROS production may not be Ca2+-dependent.
In separate sets of experiments individual coverslips with MitoSOXRedTM-loaded cells were mounted on an experimental perfusionchamber, and placed on the stage of an epifluorescence inverted mi-croscope, as described in Materials and methods section. For thesedeterminations we chose the concentration of 1mM sulfanilic acid,because it was the concentration that had evoked the highest ROSgeneration. The cells were incubated with the compound during onehour and fluorescence images of the cells were obtained. In the pre-sence of 1mM sulfanilic acid an increase in fluorescence was detected,which is consistent with an increase in ROS production (Fig. 5).
3.3. Effect of sulfanilic acid of mitochondrial membrane potential
It has been suggested that oxidative stress induces a decrease of ψm(Satoh et al., 1997). In order to analyze whether sulfanilic acid induceschanges in ψm, we performed a series of experiments in which AR42Jcells were loaded with the mitochondria-specific voltage-sensitive dye
Fig. 8. Effect of sulfanilic acid on the expression of superoxide dismutase.(A) Representative blot showing the effect of sulfanilic acid (SA; 1 mM, 100 μM,10 μM or 1 μM) on the level of the mitochondrial antioxidant enzyme SOD2,evaluated with a specific antibody, in AR42J cells. To ensure equal loading ofproteins, the levels of α-actin were employed as controls under the testedconditions. Cells were incubated during 1 h in the absence (n.e.) or in thepresence of the desired concentration of sulfanilic acid. (B) The graph shows thequantification of protein phosphorylation. The experiments shown are re-presentative of three others. Values are the mean ± S.E.M. of normalizedvalues expressed as % of phosphorylation in control (non-stimulated) cells (*,P < 0.05; **, P < 0.01 vs non-stimulated cells).
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TMRM. The cells were then incubated during 15min. in the presence ofsulfanilic acid (1mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM). We observed a statis-tically significant decrease in ψm in cells treated with 1mM sulfanilicacid. However, no detectable changes in ψm were noted when the cellswere incubated with the other concentrations of sulfanilic acid. As acontrol, different batches of cells were incubated in the presence of themitochondrial uncoupler FCCP (Gonzalez et al., 2003). In the presenceof FCCP (0.5 μM) a statistically significant decrease in ψm was detected(Fig. 6).
3.4. Effect of sulfanilic acid on glutathione levels
The glutathione system includes reduced (GSH) and oxidized(GSSG) forms of glutathione. Glutathione is a critical antioxidant de-fense against oxidative stress (Garcia-Gimenez et al., 2017). Becausesulfanilic acid induced ROS production, we were interested in testingthe effect of the compound on the glutathione system. For this purpose,different batches of cells were incubated during one hour in the pre-sence of different concentrations of sulfanilic acid (1mM, 100 μM,10 μM or 1 μM), and the effect on the levels of GSH and GSSG wasstudied. Sulfanilic acid induced a concentration-dependent decrease inGSH/GSSG ratio, compared with that noted in non-treated (control)cells (Fig. 7). These results show that sulfanilic acid induces changes inthe oxidative state of AR42J cells.
3.5. Effect of sulfanilic acid on superoxide dismutase 2 expression
Superoxide dismutase (SOD) metabolizes superoxide radicals tomolecular oxygen and hydrogen peroxide (Nojima et al., 2015). Mi-tochondrial SOD2 plays a critical role in protecting cells from oxidativestress and cytotoxicity (Fukui and Zhu, 2010). Because we had observedthat sulfanilic acid induces generation of ROS in the mitochondria itwas of interest to analyze the effect of the compound on the expressionof this enzyme.
For this purpose, AR42J cells were incubated for one hour in thepresence of 1mM, 100 μM, 10 μM or 1 μM of sulfanilic acid. Incubationof cells in the presence of compound resulted in a concentration-de-pendent decrease in the expression of SOD2 (Fig. 8).
3.6. Effect of sulfanilic acid on trypsin secretion
AR42J release digestive enzymes following stimulation with cho-lecystokinin (Logsdon, 1986), and secretion is impaired under oxidativestress conditions (Gonzalez et al., 2012). Thus, we were interested inanalyzing whether sulfanilic acid exerts any effect on enzyme secretion,in a search for deleterious actions of the compound on the secretoryprocesses. In this work we analyzed the secretion of the protease en-zyme trypsin in response to CCK-8 and we also tested the two higherconcentrations of sulfanilic acid, alone or in combination with CCK-8.
Fig. 9. Effect of CCK-8 and sulfanilic acid on trypsin secretion in AR42J cells. (A) Concentration-dependent increase in trypsin secretion evoked by CCK-8 inAR42J cells. (B) Effect of sulfanilic acid 1mM (■), sulfanilic acid 100 μM (●) and of the combination of 100 μM melatonin plus 1mM sulfanilic acid (□) on CCK-8-evoked trypsin secretion in AR42J cells. The experiments were performed in the presence of Ca2+ in the extracellular medium. Data show the units of trypsin secretedto the extracellular medium expressed as the mean ± SEM (*, P < 0.05; **, P < 0.01 vs non-stimulated cells; n= four to five independent experiments).
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Stimulation of pancreatic AR42J cells with CCK-8 (45min incuba-tion) induced a concentration-dependent release of trypsin, reaching amaximum at 10−10 M (Fig. 9A). Incubation of cells for 45min withsulfanilic acid alone (1mM or 100 μM) evoked an increase in trypsinsecretion, compared with non-stimulated (control) cells (Fig. 9B; fullsquares and full circles for 1mM and 100 μM sulfanilic acid respec-tively). When AR42J cells were incubated with CCK-8 in the presence ofsulfanilic acid (1mM or 100 μM) the concentration-dependent effect ofCCK-8 on trypsin secretion was impaired (Fig. 9B).
Because we had observed that sulfanilic acid induced ROS genera-tion, we tested whether the effect of the compound on trypsin secretionwas due to the production of ROS. In this set of experiments AR42J cellswere preincubated for 5min in the presence of 100 μM melatonin, acompound with known antioxidant effects in the exocrine pancreas(Santofimia-Castaño et al., 2015). In the presence of melatonin cellswere then challenged with 1mM sulfanilic acid in combination withCCK-8. Under these experimental conditions the effect of sulfanilic acidon CCK-induced trypsin secretion was reduced (Fig. 9B, open squares).In addition, trypsin secretion was lower in the presence of melatonin,compared with the effect of CCK-8 alone. Our results suggest that theeffect of sulfanilic acid on enzyme secretion evoked by CCK-8 might bedue to ROS generation.
4. Discussion
Colour is one of the most influential factors in the acceptance offood and in eating behavior, and it has been shown to dramaticallyaffect people's perception of a variety of different foods and drinks(Radder and Le Roux, 2005; Zampini et al., 2007). The annual world-wide production of dyes is approximately 800.000 tones and about 50%of these are azo dyes (Szygula et al., 2008). Food dyes are often addedto foodstuffs and drinks in order to supply, intensify or restore theircolour to create the desired coloured appearance (Schenone et al.,2013). However, its consumption may lead to health damage.
Tartrazine is a food-dye worldwide employed. Once in the body it istransformed into its derivative sulfanilic acid. Different studies havereported immunotoxic (Moutinho et al., 2007; Guendouz et al., 2013)and genotoxic effects of this food dye (Khayyat et al., 2017; Sasakiet al., 2002), as well as alterations of the reproductive system (Axonet al., 2012; Mehedi et al., 2009). Furthermore, tartrazine and its me-tabolite sulfanilic acid adversely affect and alter different biochemicalparameters, especially those related to vital organs like liver and kidney(Amin et al., 2010; Sharma et al., 2009; Tawfek et al., 2015). Being thedigestive system a major site of contact of dyes present in food, it was ofinterest to study its action on the physiology of the exocrine pancreas.
The exocrine pancreas is a gland whose secretion participates in thedigestion of food in the intestine. The function of the gland is majorlycontrolled by Ca2+ signals (Petersen, 2014). Moreover, sustained in-creases in the levels of Ca2+ may impair pancreatic physiology andhave been related with diseases affecting the gland (Gerasimenko et al.,2018; Petersen, 2009). In the present work we have shown that sulfa-nilic acid evoked a concentration-dependent increase in [Ca2+]c thatreached an elevated value over the basal. Because sustained elevationsof [Ca2+]c have been related with damage to the pancreas (Petersen,2008), the tartrazine-derivative might potentially damage the gland.
It is well-established that oxidative stress is a factor that contributesto a range of diseases in which an inadequate cytoprotective responseconverts ROS into contributors of cellular dysfunction. The availableresearch points towards oxidative stress as a major cause of the perni-cious actions of tartrazine and its derivatives (Axon et al., 2012; Bhattet al., 2018; Cemek et al., 2014; Visweswaran and Krishnamoorthy,2012). Excessive ROS production has been signaled as a major con-tributor to the diseases affecting the exocrine pancreas (Bhardwaj andYadav, 2013). Here we have shown that sulfanilic acid induces ROSgeneration in the mitochondria. It is well known that mitochondriarepresent the major source of ROS within the cell (Granados et al.,
2004). Moreover, mitochondrial production of ROS plays a funda-mental role in pancreatic pathology (Gerasimenko and Gerasimenko,2012). Interestingly, the effect of sulfanilic acid on ROS productionseemed not to depend on Ca2+ mobilization. This lets us hypothesizethat the tartrazine-derivative might impair mitochondrial physiology,leading to ROS generation which, in turn, might lead to an increase in[Ca2+]c.
Glutathione is a critical antioxidant defense against oxidative stress.The glutathione system is responsible for the detoxification of ROSproduced by xenobiotics. Therefore, depletion of GSH leads to exacer-bation of damage by oxidative stress. A common pathological hallmarkin disorders affecting different tissues and organs in the body is theincrease in oxidative stress and the failure of antioxidant systems, suchas the decrease in the GSH content (Garcia-Gimenez et al., 2017). Herewe show that incubation of cells with sulfanilic acid decreased theavailability of reduced glutathione. Our observations support thecreation of a potential oxidative stress condition in the presence ofsulfanilic acid.
One way that aerobic biological systems counteract the generationof ROS is with SOD proteins, which metabolize superoxide radicals tomolecular oxygen and hydrogen peroxide or scavenge oxygen radicalsproduced by the extensive oxidation-reduction and electron-transportreactions that occur in mitochondria. Mitochondrial SOD is biologicallysignificant to aerobic cells. Its role in protecting the cells against thedeleterious effects of ROS is of major relevance. Therefore, impairmentof this enzyme is of relevance under oxidative stress conditions (Nojimaet al., 2015). Here we show that the expression of SOD2 decreased afterincubation of cells with sulfanilic acid. Our observations support aprobable impairment of mitochondria in the presence of sulfanilic acid.
Mitochondria fulfill a number of essential cellular functions. Theirprimary role is generation of ATP through oxidative phosphorylation.However, as mentioned above, mitochondria are also the major sourceof ROS production. It has been shown that a decrease of ψm is linkedwith an increase in the level of ROS (Satoh et al., 1997). Moreover,changes in mitochondrial redox state and ψm can lead to cell damage(Kuznetsov et al., 2011). We observed a decrease in ψm in cells in-cubated with the highest concentration of sulfanilic acid tested. Ourobservations are in agreement with previously reported data that sup-port a relationship of mitochondrial impairment with oxidative stress.Altogether, our results suggest that sulfanilic acid induces ROS pro-duction in the mitochondria and impairs the antioxidant defenses of thecell. This leads to oxidative stress conditions that might compromisecell function.
We further observed an impairment of trypsin secretion evoked byCCK-8 in the presence of sulfanilic acid. Former studies have proposedthat aberrant secretion of trypsinogen is an important early step in thedevelopment of acute pancreatitis (Sherwood et al., 2007). Our resultssupport a potential harmful action of sulfanilic acid on pancreaticfunction due to its effect on CCK-8-induced enzyme secretion. We havealso shown that the effect of the tartrazine-derivative was decreased bypretreatment with the antioxidant melatonin. In fact, it has been pre-viously shown that treatment with antioxidants potentially protects thepancreas against ROS-induced damage (Sevillano et al., 2003). In thisline, previous studies in our lab showed protective actions of the in-doleamine on pancreatic acinar cells (Santofimia-Castaño et al., 2013,2014b). Our observations thus suggest that the effect of sulfanilic acidon trypsin secretion might be due to the generation of ROS, and supportthe above mentioned effects of the compound on the cellular anti-oxidant system.
5. Conclusion
Our results show that sulfanilic acid exerts deleterious actions onpancreatic AR42J cells, which involve ROS generation in the mi-tochondria and a consequent impairment of antioxidant defenses.Generation of ROS can lead to the release of stored Ca2+ in the ER and
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its accumulation in the cytosol. Moreover, treatment of cells with sul-fanilic acid evoked an impairment of trypsin secretion. Altogether, theactions of sulfanilic acid on cell physiology might create a situationpotentially prone to the development of illness in the exocrine pancreas.
Conflicts of interest
The authors declare that there is no conflict of interest.
Acknowledgments
Funding for this study was partly provided by Junta deExtremadura-FEDER (IB16006) and Ministerio de Economía yCompetitividad (BFU 2016–79259-R; UNEX13-1E-1608). The fundingsource(s) had no role in study design, in the collection, analysis andinterpretation of data, in the writing of the report, nor in the decision tosubmit the paper for publication. The authors would like to thank Mrs.Mercedes Gomez and Ana María Moreno for their valuable technicalassistance.
Transparency document
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Résumé
Le but de notre travail est d’évaluer l’effet de la tartrazine et de son
métabolite sur la fonction exocrine du pancréas à travers une étude in
vivo sur des souris Swiss, une étude in vitro à l’aide d’un modèle de
digestion et une étude ex vivo sur des cellules acinaires murines et sur des
cellules AR42J de carcinome pancréatique de rat. Les résultats obtenus
montrent que :- L’ingestion subchronique de la tartrazine chez les souris
Swiss à une dose de 0,05 % pendant 13 semaines provoque une diminution
de l’activité enzymatique de la trypsine et de la chymotrypsine. - Aucune
modification de l’activité enzymatique de la trypsine ou de la chymotrypsine
n’a été observée lorsqu’on utilise un modèle de digestion. - La tartrazine
ainsi que son métabolite, l’acide sulfanilique, peuvent altérer
significativement l’homéostasie calcique au niveau des cellules acinaires et
AR42J. - L’acide sulfanilique induit un stress oxydatif au niveau des cellules
acinaires et des cellules AR42J pancréatiques en générant des espèces
réactives de l’oxygène (ERO). - L’acide sulfanilique diminue le niveau de
défense antioxydante assurée par le système du glutathion et de la
superoxyde dismutase, affecte le potentiel membranaire mitochondrial et
altère la sécrétion de la trypsine par les cellules AR42J. En conclusion, la
tartrazine et son métabolite l’acide sulfanilique semblent affecter
significativement l’activité du pancréas exocrine en favorisant le
développement d’effets délétères au niveau de cet organe. Le
dysfonctionnement de cette glande peut évidemment être à l’origine de
troubles digestifs.
Mots clés :
Tartrazine; Acide sulfanilique; Pancréas exocrine; Calcium; ERO; AR42J;
Trypsine; Chymotrypsine; Amylase; Lipase.