Université d'Oran Es-Sénia
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Biologie
Thèse
En vue de l'obtention du diplome de
DOCTORAT
En Microbiologie Alimentaire Et Industrielle
Présentée par
GUETARNI Hassina
Thème Effets antibactériens des bactéries lactiques isolées à partir des laits
crus Algériens sur la croissance de Helicobacter pylori
Soutenue publiquement le 05/12/ 2013 Membres du jury:
Pr.CHEKROUN Abdallah……………….Président, Université d'Oran Es-Sénia
Pr.AOUES Abdelkader………………Examinateur, Université d'Oran Es-Sénia
Pr.SLIMANI Miloud………………………….Examinateur, Université de Saida
Dr.CHERIGUENE Abdrrahim………..Examinateur, Université de Mostaganem
Dr.BEKKADA Ahmed…..……..Examinateur, Centre Universitaire de Relizane
Pr.BENSOLTANE Ahmed……..Directeur de thèse, Université d'Oran Es-Sénia
-Année Universitaire: 2012-2013-
Je dédie ce travail à
Mes chers parents
Et
Mes chers frères
Que Allah les garde et les protège
Guetarni H.
REMERCIEMENTS
Mes premiers remerciements s’adressent au Pr. BENSOLTANE Ahmed, mon
directeur de thèse, pour son soutien, ses aides précieuses, ses conseils et ses encouragements
continuels durant la période de préparation de cette thèse.
J'adresse un grand remerciement aux messieurs les membres de jury, qui ont accepté
d'évaluer ma thèse de doctorat:Président Pr. CHEKROUN Abdallah (Université d'Oran Es-
Sénia) et Examinateurs: Pr.AOUES Abdelkader (Université d'Oran Es-Sénia), Pr.
SLIMANI Miloud (Université Saida), Dr.CHERIGUENE Abdrrahim(Université de
Mostaganem) et Dr.BEKKADA Ahmed(Centre Universitaire de Relizane).
Je remercie le ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique
qui m'a fourni tous les moyens nécessaires pour réaliser ce travail.
Je remercie aussi le Recteur de l'Université Khemis Miliana: le Pr. BEZINA
Mohamed et le Doyen de la faculté des Sciences de la nature et de la vie et des sciences de
la terre: Dr. MOKABLI Aissa, qui m'ont aidé beaucoup afin de réaliser ce travail et m'ont
fourni des stages à courte durée.
Une partie de ce travail a été réalisée au niveau de laboratoire de bactériologie de
l'hôpital Cochin, Paris, dont je remercie le chef de service le Pr. POYART Claire, pour son
acceptation de faire cette partie au niveau de ce laboratoire.
Je remercie également Dr. RAYMOND Josette, pour son invitation au niveau de
laboratoire de bactériologie de l'hôpital Cochin, et avoir mis à ma disposition l'équipement
nécessaire pour isoler et caractériser des souches de H.pylori par la PCR en temps réel.
Je remercie aussi toute l'équipe de ce laboratoire, en particulier: la secrétaire
ESSOMEE MOUNE Agnès, pour son bon accueil au niveau de ce laboratoire et le
technicien CZARNA Nicolas, pour ses aides précieuses durant la période de mon stage.
J'adresse un sincère remerciement au Pr. MEGRAUD Francis pour son invitation
à des stages à courte durée que je l'aie fait durant les années 2009 et 2010 dans le centre
national de références des Campylobacters et des Helicobacters de Bordeaux.
L'étude anatomopathologique et cytologique des biopsies gastriques a été faite au
niveau de laboratoire d'analyses anatomopathologiques et cytologiques de l'hôpital de
Médéa, dont je remercie Docteur BENAYAD, pour me permettre réalisée cette partie.
L'isolement et la caractérisation des souches de H.pylori a été effectué grâce aux
aides du Dr. DJEBAILLI Mustapha, gastrœntérologue à Chlef, dont je le remercie
infiniment car il m'a autorisé d'assister des séances de l'endoscopie digestive haute et m'a
prélevé des biopsies gastriques des patients pour réaliser mon travail.
Enfin, Je salue et je remercie toutes les personnes qui m'ont aidé, sans citer leur nom.
TABLE DES MATIERES
Résumé Abstract
لخصالم Liste des publications et communications……………………………………………………i Liste des abréviations…………………………………………………………………………ii Liste des tableaux……………………………………………………………………………..iv Liste des figures………………………………………………………………………………..v
Chapitre I:
I 1. 2. 3.
II. 1. 2. 3. 4. 5.
5.1. 5.2.
6. 7.
7.1. 7.2.
8. 8.1
8.1.1. 8.1.1.1. 8.1.1.2. 8.1.1.3.
8.1.2. 8.1.2.1. 8.1.2.2.
8.1.2. 8.1.2.1. 8.1.2.2. 8.1.2.3. 8.1.2.4. 8.1.2.5.
9. 9.1. 9.2. 9.3. 9.4. 10.
10.1.
Introduction Revue bibliographique Rappel anatomique et histologique Estomac Epithélium gastrique Renouvellement tissulaire épithélial Helicobacter pylori Historique Classification Caractères morphologiques et biochimiques Réservoir Mode de transmission Transmission oro-orale Transmission féco-orale Prévalence Physiopathologie de l’infection à H. pylori Phase aiguë Phase chronique Facteurs de virulence de H.pylori Inflammation et lésions tissulaires Cytotoxine vacuolisante VacA Génétique Structure Effets physiopathologiques Ilot de pathogénicité cag et la protéine CagA Activités biologiques Inflammation Adaptation à l'environnement gastrique Flagelles et le chimiotactisme Uréase Réponse à l'acidité Lipopolysaccharide Adhésines H.pylori et pathologies associées Gastrite Ulcére gastro-duodénal Lymphome gastrique Cancer gastrique Diagnostic de l'infection à H.pylori Méthodes invasives
4 4 5 7 10 10 11 11 12 12 12 13 13 14 14 14 14 15 15 15 16 17 19 20 21 22 22 23 25 25 26 27 27 28 29 29 31 31
10.1.1. 10.1.2. 10.1.3. 10.1.4. 10.1.5.
10.2. 10.2.1. 10.2.2. 10.2.3.
11. 11.1. 11.2. 11.3. 11.4.
11.4.1. 11.4.2. 11.4.3.
III 1. 2. 3.
3.1. 3.2.
3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.2.6. 3.2.7.
4. 4.1. 4.2.
5. 5.1.
5.1.1. 5.1.2.
5.2. 6. 7.
7.1. 7.2.
8. 8.1.
8.1.1. 8.1.2. 8.1.3. 8.1.4. 8.1.5. 8.1.6.
8.2.
Endoscopie digestive haute Tests rapides à l'uréase (TRU) Culture Examen histologique Amplification génique PCR Méthodes non invasives Détection antigénique dans les selles Recherche des anticorps sériques Test respiratoire à l'urée marquée Traitement anti-H.pylori Monothérapies Bithérapies Trithérapies Facteurs d’échecs d’éradication Mauvaise observance du traitement Résistance aux antibiotiques Autres facteurs d’échec d’éradication Bactéries lactiques Généralités sur les bactéries lactiques Origine des bactéries lactiques Taxonomie et diversité et taxonomie Taxonomie des bactéries lactiques Diversité des bactéries lactiques Genre Lactobacillus Genre Lactococcus Genre Streptococcus Genre Enterococcus Genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella Genres Pediococcus et Tetragenococcus Genre Bifidobacterium Habitat Présence de bactéries lactiques à l'état libre dans l'environnement Présence de bactéries lactiques en association avec un hôte Métabolisme fermentaire Métabolisme des sucres Voie homofermentaire ou EMP Voie héterofermentaire ou PPC( pentose phosphocétolase) Métabolisme de l'azote Besoins nutritionnels Devenir des bactéries lactiques ingérées Elimination des bactéries lactiques ingérées Suivies des bactéries lactiques dans la lumière intestinales Critères de sélection de bactéries lactiques comme probiotiques Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques Résistance à l'acidité gastrique Résistance aux sels biliaires Adhésion aux cellules épithéliales Production de substances antimicrobiennes Résistance aux antibiotiques Critères technologiques Effets des probiotiques sur la santé
31 31 31 32 32 32 32 32 32 33 33 33 34 35 35 35 35 36 36 36 36 36 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41 42 42 42 42 44 45 45 45 46 46 47 47 47 47 48 48 49 49
8.2.1. 8.2.2. 8.2.3. 8.2.4. 8.2.5. 8.2.6.
III 1. 2.
2.1. 2.1.1. 2.1.2.
2.2. 2.3. 2.4.
3. 4.
4.1. 4.2. 4.3. 4.4.
5. 6.
Chapitre II: I. II 1.
1.1. 1.2. 1.3.
1.3.1. 1.3.2. 1.3.3.
1.3.3.1. 1.3.3.2.
1.3.3.2.1. 1.3.3.2.2. 1.3.3.2.3.
1.4. 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5.
2. 2.1. 2.2.
2.2.1. 2.2.1.1. 2.2.1.2.
2.2.2.
Amélioration de la digestion de lactose Réduction du taux de cholestérol Cancérogenèse Réduction du risque de diarrhée Effets sur le système immunitaire Infection par Helicobacter pylori Bactériocines Définition des bactériocines Classification des bactériocines Classe I: les lantibiotiques Type A Type B Classe II: peptides non modifiés Classe III: protéines Classe IV: bactériocines complexe Intérêt des bactériocines Domaines d’applications des bactériocines Typage bactérien Domaine alimentaire Domaines de la médecine humaine et vétérinaire Domaine agricole Mode d'utilisation des bactériocines Mode d'action des bactériocines Matériel et Méthodes Lieu de travail Etude microbiologique Isolement et caractérisation de Helicobacter pylori Prélèvement des biopsies gastriques Test rapide à l'uréase Ensemencement et caractérisation de Helicobacter pylori Broyage des biopsies Coloration de Gram des biopsies gastriques Ensemencement des biopsies gastriques pour la recherche de Helicobacter pylori Culture Identification de H.pylori Examen macroscopique Examen microscopique Identification des caractères biochimiques PCR en temps réel ou PCR quantitative Principe Extraction de l'ADN sur automate NucliSens easyMAG Préparation de Master mix Préparation de mix Amplification de l'ADN Isolement et caractérisation des bactéries lactiques Origine et prélèvement des échantillons du lait Analyses du lait cru Tests préliminaires pH Réduction du bleu de méthylène Analyses microbiologiques
50 50 51 51 51 52 53 53 54 54 55 55 55 58 58 58 59 59 59 60 61 62 62 63 63 65 65 65 65 65 65 66 66 66 66 67 67 67 67 67 68 69 69 69 73 73 73 73 73 73 74
2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3.
2.3. 2.4. 2.5.
2.5.1. 2.5.2. 2.5.3. 2.5.4. 2.5.5.
2.5.5.1. 2.5.5.2. 2.5.5.3. 2.5.5.4.
2.5.6. 2.5.7.
III. 1. 2.
2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5.
2.5.1. 2.5.2.
2.6. IV 1.
1.1. 1.2. 1.3.
2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6.
3. 3.1. 3.2.
3.2.1. 3.2.2. 3.2.3.
3.3. 3.4. 3.5. 3.6.
Chapitre II:
Diluant Préparation de l'inoculum Dénombrement des microorganismes Isolement des bactéries lactiques Identification phénotypique Identification biochimique et physiologique Test de la catalase Test de l'oxydase Type fermentaire Croissance en milieux hostiles Identification au niveau de l'espèce et sous espèce par les galeries Api20 Strep Préparation de la galerie Préparation de l'inoculum Inoculation de la galerie Lecture Test d'hémolyse Pouvoir acidifiant Examen anatomopathologique et cytologique des biopsies gastriques Fixation des biopsies gastriques Etapes d'un examen ACP Macroscopie Déshydratation Inclusion Microtomie Coloration des lames Coloration à HE Coloration Giemsa Long Montage des lames Etude de l'activité antibactérienne Interaction des bactéries lactiques avec les souches d'H.pylori in vitro Préparation des précultures des souches d'Helicobacter pylori Préparation des précultures des souches de bactéries lactiques Antagonisme Détermination de l'activité bactériocinogénique Préparation de l'extrait bactériocinique Elimination de l'effet des acides organiques et de peroxyde d'hydrogène Effet de l'extrait bactériocinogénique sur H.pylori en milieu liquide Influence du pH sur l'activité des bactériocines Influence de la température sur la stabilité des bactériocines Influence des enzymes sur la stabilité des bactériocines Etude de l'activité antibactérienne in vivo Préparation des souris Analyses microbiologiques des selles de souris Prélèvement des selles Analyses bactériologiques Identification Recherche de Helicobacter pylori dans l'estomac de souris Infection des souris par Helicobacter pylori Traitement des souris infectées par Helicobacter pylori Détection bactérienne Résultats
74 74 74 83 84 85 85 86 86 86 86 87 87 87 87 90 90 91 91 92 92 92 92 94 94 94 94 94 96 96 96 96 96 99 99 99 99 100 100 100 101 101 101 101 102 103 103 103 104 104 106
I. 1.
1.1. 1.2.
1.3.
1.4
2.
2.1. 2.1.1. 2.1.2.
2.1.2.1. 2.1.2.2. 2.1.2.3. 2.1.2.4.
2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3.
II III 1. 2.
2.1. 2.2. 2.3.
3.
Etude microbiologique Isolement et caractérisation de Helicobacter pylori Test rapide à l'uréase Ensemencement des biopsies gastriques pour la recherche d'Helicobacter pylori Observation microscopique des frottis réalisés à partir des biopsies
gastriques Quantification de Helicobacter pylori dans des biopsies gastriques par la PCR temps réel Isolement et caractérisation des bactéries lactiques Analyses du lait cru Tests préliminaires Analyses microbiologiques Dénombrement des germes mésophiles totaux Dénombrement des coliformes fécaux Dénombrement des Clostridium sulfito- réducteurs Dénombrement de streptocoques fécaux et Straphylococcus aureus Isolement des bactéries lactiques Identification phénotypique Identification biochimique et physiologique Pouvoir acidifiant Examen anatomo-pathologique et cytologique des biopsies gastriques Etude de l'activité antibactérienne Interaction des bactéries lactiques avec les souches d’H.pylori in vitro Détermination de l’activité bactériocinogénique Elimination de l’effet des acides organiques et de peroxyde d’hydrogène Effet de l'extrait bactériocinogénique sur H.pylori en milieu liquide Influence du pH, température et enzymes sur les bactériocines Etude de l'activité antibactérienne in vivo Discussion Conclusion Références bibliographiques Annexes Publications Perspectives
106 106 106 107 108 109 113 113 113 114 116 118 119 120 120 120 123 128 131 137 137 142 142 144 145 150 157 182 184
RESUME
L'objectif de ce travail est de chercher des souches de bactéries lactiques qui
pourraient inhiber in vitro et in vivo la croissance d’Helicobacter pylori impliquée dans la
pathologie gastroduodénale. Pour cela, deux souches de Helicobacter pylori (Hp1 et Hp3)
sensibles à la clarithromycine, ont été isolées des biopsies prélevées par endoscopie digestive
haute par culture sur gélose au sang et caractériser par PCR en temps réel. Ces souches ont
provoqué des gastrites aigue et chronique déterminer par un examen anatomopathologique et
cytologique. 30 souches de bactéries lactiques du genre Lactococcus et Enterococcus ont été
isolées à partir des échantillons des laits crus de chèvre, vache, brebis et chamelle prélevés de
différentes régions de l'Algérie. Des interactions ont été réalisées entre des bactéries lactiques
isolées, les deux souches d’Helicobacter pylori et d'autres souches de références (TN2GF4,
J99, 26695, HPAG1) et clinique (HSA3068). La meilleure zone d'inhibition a été constatée
avec la souche TN2GF4 en présence d’Enterococcus faecium (B13) isolée du lait de chèvre
de Miliana (Zi=20mm). La recherche de la substance antagoniste a été réalisée suivant la
méthode de diffusion sur gélose et dans le bouillon après élimination de l'effet des acides
organiques (neutralisation du milieu à pH 6,5) et le peroxyde d'hydrogène (ajout du catalase).
Les substances inhibitrices produites par la souche d'Enterococcus faecium (B13) perdent
leur activité après traitement par la trypsine et la pepsine, mais retiennent cette activité
antibactérienne après traitement thermique pendant 30 minutes à 60oC, 80oC pendant 10
minutes et 100oC pendant 5 minutes. Cette protéine est stable à pH acide et basique. In vivo,
l'administration orale de la souche Enterococcus faecium (B13) réduit le nombre de H pylori
dans l’estomac des souris Balb/c prés d'un log soit 43%.
Mots clés: Lait cru, bactéries lactiques, Helicobacter pylori, PCR en temps réel,
bactériocines, inhibition, in vitro, in vivo.
ABSTRACT
The aim of this study is to find strains of lactic acid bacteria that could inhibit in
vitro and in vivo growth of Helicobacter pylori involved in gastroduodenal pathology. For
that, two strains of Helicobacter pylori (Hp1 and Hp3) sensitive to clarithromycin were
isolated from biopsies by upper gastrointestinal endoscopy after culture on blood agar and
characterized by real-time PCR. These strains have caused acute and chronic gastritis
determined by anatomic pathology and cytology examine. 30 strains of lactic acid bacteria of
Lactococcus and Enterococcus were isolated from samples of milks: raw, goat, cow, sheep
and camel, collected from different regions of Algeria. Interactions were conducted between
lactic acid bacteria isolated, the two strains of Helicobacter pylori and other references
(TN2GF4, J99, 26695, HPAG1) and clinical (HSA3068) strains. The best zone of inhibition
was observed with TN2GF4 strain in the presence of Enterococcus faecium (B13) isolated
from goat milk of Miliana (Zi = 20mm). The search for the antagonist effect was performed
according to agar and broth diffusion method after removing the effect of organic acids
(neutralization of the medium at pH 6.5) and hydrogen peroxide (addition of catalase).
Inhibitory substances produced by Enterococcus faecium (B13) lose their activity after
treatment with trypsin and pepsin, but retain the antibacterial activity after heat treatment for
30 minutes at 60oC, 10 minutes at 80oC and 5 minutes at 100oC. This substance is stable in
acidic and basic pH. In vivo, oral administration of Enterococcus faecium (B13) reduces the
number of H. pylori in the stomach of Balb / c mice near a log or 43%.
Key words: Raw milk, lactic acid bacteria, Helicobacter pylori, real-time PCR, bacteriocins,
inhibition, in vitro, in vivo.
الملخص
ذا العمل هو ع االهدف من ه ا حمض الالآتيك التي يمكن أن تمن ة لبحث عن سالالت بكتيري و جرثوم . نم
Helicobacter pylori ،ذا ام به اس 30للقي ن أجن ك م ض الالآتي ا حم ن بكتيري الالت م و Enterococcus س
Lactococcus ر الماعز، البقر واألغنام وحليب اإلبل التي تم جمعها منحليب المعزولة من عينات . مختلف أنحاء الجزائ
د لحساسة Hp3 وHelicobacetr pylori Hp1ساللتين من م عزل كالريثروميسين ق ا ت التنظير من ه خزعات تؤخذ ب
ى وي عل ه دم الحصان الهضمي العل ذه السالالت تسبب . PCR en temps réelصنفت ب ووسط زرع مضاف الي ه
ة أجريت التفاعالت بين بكتيريا حمض الالآتيك .والخلوية التهاب المعدة الحاد والمزمن تحددها دراسة الباثولوجية المعزول
ادة (TN2GF4, J99, 26695, HPAG1) مراجع وسالالت أخرى Helicobacter pyloriين وسالالت وعي
.(HSA3068) يط أفضل وحظ تثب ع ساللة ل ة من Enterococcus faecium (B13)بوجود TN2GF4 م المعزول
ب الماعز ة لحلي م 20(مليان ثلل).م ادة بح أثير عن الم ى ت د القضاء عل رق بع ار وم ي أج رها ف ة نش ب طريق وهر عق الج
ا ). الكاتالز إضافة(وفوق أآسيد الهيدروجين ) 6.5في درجة الحموضة الوسط ييد تح( األحماض المواد المثبطة التي تنتجه
ذا النشاط المضاد تفقد نشاطها Enterococcus faecium (B13)ساللة د ه بعد العالج مع التربسين وبيبسن، ولكن عق
ائق 5و 80oC في دقائق oC 60 ،10 في دقيقة 30بالحرارة لمدة للبكتيريا بعد المعالجة ذا . oC 100 في دق روتين ه الب
Enterococcus faecium (B13)عن طريق الفم من ساللة استهالك. مستقر في درجة الحموضة الحمضية واألساسية
.في المائة 43لوغاريتم واحد أو بمعدل Balb/c في معدة فئران H.pylori ، خفضت عدد
، Helicobacetr pylori ،PCR en temps réel، الآتيكلا الحليب الخام، بكتيريا حمض: الكلمات الرئيسية المجراه في,المختبر باآتيريوسين،تثبيط، في
Liste des publications et des communications
A. Publications internationales: 1. GUETARNI H., BENSOLTANE A., AICHOUR D., BENABDALLAH Z., KHOUATRIA I.R.
& KHOUATRIA N.K., 2012: In vitro and in vivo Activity of Lactococci Strains against
Helicobacter pylori. OnLine Journal of Biological Sciences. 12 (2): 38-43.
2. GUETARNI H., BENSAID A., & BENSOLTANE A., 2012: analysis of lactic acid responsible
for inhibition in-vitro of Helicobacter pylori by high performance chromatography (HPLC).
Journal of Biotechnology Letters. 3(1): 34-36.
3. GUETARNI Hassina and BENSOLTANE Ahmed, 2013: Isolation and Characterization of
Helicobacetr pylori strains from gastric biopsies of Algerian patients. OnLine Journal of
Biological Sciences. 13(2): 46-54.
B. Communications nationales:
Orales:
1. GUETARNI H. 2007: Effet, in vitro, de certaines bactéries lactiques sur Escherichia coli et
Salmonella typhi. Séminaire nationale: Université de Chlef, filière lait et produits laitiers.
2. GUETARNI H. & LAISSAOUI A., 2013: Alimentation de l'étudiant. Journée scientifique"rein et
prévention". SAPM & Université de Khemis Miliana.
Affichées:
1. LAISSAOUI A., ALLEM R., GUETARNI H., & MADANI M, 2013: Relation entre l’indice
de masse corporelle et l’adiposité. Journée scientifique"Rein et prévention". SAPM &
Université de Khemis Miliana
2. LAISSAOUI A., ALLEM R., GUETARNI H., & OUKACI F/Z, 2013: Impact du syndrome
métabolique sur le développement du diabète type 2 et de l’hypertension artérielle. Journée
scientifique"Rein et prévention". SAPM & Université de Khemis Miliana
i
LISTE DES ABREVIATIONS
µm: Micro mètre ADH : Arginine Dihydrolase AlpA: Adhesin-like Protein A AlpB: Adhesin-like Protein B AMD: Amidon Api : Analytic prophylactic index ARA: Arabinose B: Bifidobacterium BabA: Blood group antigen binding Adhesin BGT: Bouillon Glucose Tamponné C: Crypte CagA: Cytotoxin-associated gene A CagPAI: Cytotoxin-associated gene Pathogenicity Island CE: Cellule Endocrine Ch: Chorion CLO test®: Campylobacter-Like Organism test CM: Cellule à Mucus CMSD: Cellule Muqueuse Superficielle Détachée D : Dextrogyre DO : Densité Optique E.f : Enterococcus faecium ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EMP: Embden Meyerhof Parnas ESC: Esculine FC: Fibre Collagène FR: Fibre Réticulaire G.désoxy: Gélose désoxycholate GLU : Glucose GLYG: Glycogène h : Heure H.pylori: Helicobacter pylori Hem: Hémolyse HIP : Hippurate HUT test®: H.pylori Urea Tube test INRA: Institut National des Recherches Agronomiques INU: Inuline L : Leuvogyre LAC: Lactose LAP: Leucine aminopeptidase Lb: Lactobacillus Lc: Lactococcus LDC : Lysine Décarboxylase Lg: Lumière Glandulaire LPS: Lipopolysaccharide MALT: Mucosae Associated Lymphoid Tissue
ii
MAN: Mannitol MAN: Mannose min: Minute mL: Millilitre mm: Millimètre MRS: Man Rogosa Sharp Muc5ac: Mucin 5, subtypes A and C Muc6: Mucin 6 NaCl : Chlorure de sodium NIN:Ninhydrine nm : Nanomètre ODC : Ornithine Décarboxylase OMP: Outer Membrane Protein ONPG : Ortho-Nitro-Phényl-β-D- Galactopyranoside P: Polynucléaire PAL: Phosphatase Alcaline Pc: Pediococcus PCA: Plate Count Agar PCR : Polymerase Chain Reaction PEP: Phosphoénolpyruvate pH: Potentiel Hydrogène Pi: Phosphate inorganique PN: Polynucléaire Neutrophile PPC: Pentose Phosphocétolase PYRA: Pyrrolidonyl Arylamidase RAF: Raffinose RIB: Ribose SAC : Saccharose Sc: Streptococcus SFM: Serum-Free Medium SOD: Super Oxyde Dismutase SOR: Sorbitol T4SS: Type IV Secretion Systems TFF1: Trefoil Factor 1 TNF: Tumor Necrosis Factor TRE: Tréhalose TRU : Test Rapide à l’Uréase TSA: Trypticase Soja Agar TSI : Triple Sugar Iron UFC: Unité Formant Colonie URE : Urée VacA: Vacuolation Cytotoxin Vf: Viande foie Vp: Voges proskauer Zi: Zone d’inhibition α GAL: α Galactosidase β GAL: β Galactosidase β GUR: β Glucuronidase
iii
LISTE DES TABLEAUX
Page Tableau I :
Tableau II :
Tableau III :
Tableau IV :
Tableau V:
Tableau VI:
Tableau VII:
Tableau VIII:
Tableau IX:
Tableau X:
Tableau XI:
Tableau XII:
Tableau XIII:
Tableau XIV:
Tableau XV:
Pourcentage de quelques bactéries d’origine alimentaire dans l’intestin
grêle humain
Exemples de souches probiotiques dans des produits
Sexe et l'âge d'un échantillon de patients.
Tableau d’identification par galerie api 20 Strep
Souches de Helicobacter pylori
Résultats de la détection qualitative
Tm, Aire, L et l de chaque pic.
Résultats des tests de pH et la réductase des échantillons du lait cru
Résultats des analyses microbiologiques des échantillons du lait cru
Nombre moyen de colonies dénombrées (UFC/mL) dans chaque type
de lait.
Caractères physiologiques des souches de bactéries lactiques
Résultats de l'identification des bactéries lactiques obtenus par Api20
strep et le test d'hémolyse.
Résultats de l'identification des espèces de bactéries lactiques
Cytologie des coupes histologiques des biopsies gastriques.
Diamètres des zones d'inhibition (mm) des bactéries lactiques vis-à-vis
des souches d' H.pylori
46
52
65
88
97
111
112
115
117
121
125
126
127
132
138
iv
LISTE DES FIGURES
Page Fig. 1 : Fig. 2 : Fig. 3 : Fig. 4 : Fig. 5 : Fig. 6 : Fig. 7 : Fig. 8 : Fig. 9 : Fig. 10: Fig. 11: Fig. 12: Fig. 13: Fig. 14: Fig. 15: Fig. 16: Fig. 17: Fig. 18: Fig. 19: Fig. 20: Fig. 21: Fig. 22: Fig. 23: Fig. 24: Fig. 25: Fig. 26: Fig. 27: Fig. 28: Fig. 29: Fig. 30: Fig.31: Fig.32: Fig.33: Fig.34: Fig.35:
Anatomie de l’estomac Muqueuse et glandes de l'estomac Des mécanismes majeurs de régénération et restitution épithéliales La génération des différents types cellulaires à partir des cellules souches dans les glandes gastriques antrale et fundique Schéma représentatif du gène VacA Schéma représentant les différentes activités de la protéine VacA de H. pylori sur les cellules épithéliales de la barrière gastrique Représentation schématique de l'îlot de pathogénicité cag (PAI) Rôle de l'îlot cag et de la protéine CagA Structure de l'appareil flagellaire de H.pylori Structure de l'uréase de H.pylori, A: structure tertiaire; B: assemblage dodécamérique Schéma du lipopolysaccharide de H. pylori Pathologies gastriques associées à l'infection par Helicobacter pylori Evolution de l’infection à H.pylori vers les maladies gastriques en fonction de l'âge Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et des genres associés, obtenu par analyse des ARNr 16S Transport et métabolisme du lactose et du galactose chez les bactéries lactiques Schéma du système protéolytique de Lactococcus lactis Lieu de réalisation de la partie expérimentale Etapes de l'extraction d'ADN dans NucliSens easyMAG® (technologie de Boom) Le thermocycleur LightCycler ® 2.0 Génération de la fluorescence par mécanisme FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert) Les phases d'une courbe d'amplification d'ADN par PCR en temps réel Dénombrement des germes mésophiles aérobies totaux sur gélose PCA Recherche des streptocoques fécaux dans le lait cru (test de présemption et de confirmation Dénombrement des coliformes fécaux du lait cru sur gélose désoxycholate Dénombrement de Staphylococcus aureus du lait cru sur gélose chapman Dénombrement de Clostridium- sulfito réducteurs du lait cru sur gélose viande-foie Isolement et caractérisation des bactéries lactiques sur gélose M17 Préparation d'une galerie Api20 strep. Etapes d'un examen ACP (Anatomie Cytologique et Pathologique) Etapes de la coloration à Hématoxyline éosine Interaction des bactéries lactiques avec les souches de Helicobacter pylori in vitro. Etapes de détection d’H.pylori après dissection des souris. Test rapide à l'uréase Aspect des colonies de Helicobacter pylori sur gélose maison après incubation à 37oC pendant 7jours et sous atmosphère microaérophile. Aspect des cellules de Helicobacter pylori après culture sur gélose maison
05 07 08 09 17 19 20 21 23 24 27 28 30 37 43 44 64 68 70 72 72 78 79 80 81 82 84 89 93 95 98 105 106 107 108
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Fig.36: Fig.37: Fig.38: Fig.39: Fig.40: Fig.41: Fig.42: Fig.43: Fig.44: Fig.45: Fig.46: Fig.47: Fig.48: Fig.49: Fig.50: Fig.51: Fig.52: Fig.53: Fig.54: Fig.55:
sous microscope optique après coloration de Gram (10X100) Observation microscopique d'un frottis préparé à partir d'une biopsie gastrique et coloré par la méthode de Gram (10X100). Courbes d'amplification qui exprime la quantité d'amplicons produits (Fluorescence (640/530) émise en fonction du nombre de cycles: témoin positif (détecte la présence des souches Wildtype) (courbe bleu), témoin négatif (H2O) (courbe vert clair), biopsie 1(courbe rouge), biopsie 2 (courbe noir), biopsie 3(courbe rose), et biopsie 4 (courbe en vert foncé)). Analyse des courbes de fusion: Fluorescence (640/530) émise en fonction de la température: témoin positif (courbe bleu), témoin négatif (courbe vert clair), biopsie 1(courbe rouge), biopsie 2 (courbe noir), biopsie 3(courbe rose), et biopsie 4 (courbe vert foncé). Les courbes de fusion : dérivées primaires donnant les Tm afin de déterminer les souches wildtype et mutantes. La courbe de fusion des souches d'H.pylori Wildtype de la biopsie 1 (courbe rouge) (Tm = 64,48) et la biopsie 3 (courbe rose) (Tm= 63,913). Résultats de dénombrement des Germes aérobies mésophiles totaux (GAMT) dans les échantillons du lait cru. Résultats de dénombrement des coliformes fécaux (CLF) dans les échantillons du lait cru. Résultats de dénombrement des Clostridium sulfito-réducteurs (CSD) dans les échantillons du lait cru. Aspect des bactéries lactiques sur gélose M17:A: Enterococcus, B: Lactococcus Observation des bactéries lactiques genre Lactococcus sous microscope optique après coloration de Gram (10X100). Observation des bactéries lactiques genre Enterococcus sous microscope optique après coloration de Gram (10X100). Répartition des souches de bactéries lactiques selon l'espèce dans les échantillons du lait cru. Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus lactis subsp. lactis. Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus lactis subsp cremoris. Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Enterococcus faecium. Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus garvieae. Gastrite aigue type B oedimateuse (présence des vaisseaux sanguins) (grande flèche), infection légère à H.pylori+: arcs, bâtonnets (flèche rouge) dans la lumière glandulaire: A: HE, B:Giemsa Gastrite chronique avec atrophie glandulaire modérée (grande flèche), infection modérée à H.pylori++: arcs, bâtonnets et coccis (flèche rouge) dans la lumière glandulaire de la muqueuse gastrique: A:HE, B:Giemsa L Gastrite aigue type B oedimateuse (présence des vaisseaux sanguins) (grande flèche), infection légère à H.pylori+: arcs et bâtonnets (flèche rouge) dans la lumière glandulaire et au contact de l'épithélium gastrique (flèche rose): A: HE, B:Giemsa L Observation microscopique d'une glande pylorique à 1000 après coloration A:HE et B: Giemsa lent Activité antibactérienne des souches de Lactococcus et Enterococcus vis-à-
108 110 112 113 116 118 120 121 122 122 124 129 129 130 130 133 134 135 136 140
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Fig.56: Fig.57: Fig.58: Fig.59: Fig.60: Fig.61: Fig.62: Fig.63: Fig.64: Fig.65: Fig.66: Fig.67:
vis des souches d'Helicobacter pylori par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B: J99, C: 26695 et D: HSA3068. Activité antibactérienne des souches de Lactococcus et Enterococcus vis-à-vis des souches de Helicobacter pylori par la méthode de diffusion sur gélose:A: HPAG1, B: Hp1, C:Hp3. Effet de l'extrait cellulaire (EC) et la fraction extracellulaire (FEC) de Enterococcus faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose:A:TN2GF4, B: J99, C:HSA3068, D: 26695. Nombre de colonies de Helicobacter pylori obtenus après culture sur gélose Brucella. Effet de pH(4 et 8) sur l’activité bactériocinogénique de Enterococcus faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose:A:TN2GF4, B: J99, C:HSA3086, D: 26695. Effet du traitement thermique (60°C pendant 30min, 80°C pendant 10min et 100°C pendant 5min) de la fraction extracellulaire (FEC) de E.faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B:J99, C: 26695, D: HSA3086. Effet des enzymes (Pepsine, Trypsine et α- Amylase) sur la fraction extracellulaire de E.faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B: J99, C: HSA3086, D: 26695. Les microorganismes présents chez des souris Balb/C (lot témoin) Aspect d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris après coloration de Gram (10X100). Aspect d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris infectée après coloration de Gram (10X100). Aspect des colonies de Helicobacter pylori isolée sur gélose au sang d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris infectée après incubation à 37oC pendant 5jours sous atmosphère microaérophile. Nombre de colonies d’H pylori après traitement par Enterococcus faecium (J21 et J30). Culture de Enterococcus faecium à partir des selles des souris traité
141 143 145 147 148 149 151 152 153 154 155 156
vii
INTRODUCTION
Introduction
INTRODUCTION
L’infection à H. pylori est universellement répandue mais elle est plus élevée dans
les pays en voie de développement, dont 78 % en Algérie (Joutei et al. 2010). Cette bactérie
vient en tête des facteurs déclencheurs du cancer de l’estomac, qui vient en deuxième
position des cancers les plus répandus en Algérie. On estime que 8 personnes sur 10, en
Algérie, sont porteurs de la bactérie Helicobacter pylori, soit 90 % de la population. Le
cancer de l’estomac est plus répandu chez les personnes âgées de 50 à 60 ans dont les
hommes sont les plus touchés par cette pathologie. Les prévisions de l’Institut National de
Santé Publique font état de 45000 nouveaux cas de cancer par an, soit 120 cas pour 100.000
habitants, tandis que celui du cancer de l’appareil digestif est de 20 cas pour 100000
habitants (4000 cas/an) (Santé-Mag, 2013).
Helicobacter pylori est la seule bactérie connue capable de résister aux conditions
extrêmement acides de l’estomac humain et d’infecter la paroi de cet organe en provoquant
la maladie ulcéreuse gastroduodénale. Elle correspond à une destruction localisée de la
muqueuse gastrique ou duodénale résultant d'un déséquilibre entre des facteurs d'agression
(sécrétion acide, Helicobacter pylori et médicaments) et de défense-réparation (barrière
mucus-bicarbonates, prolifération épithéliale, flux sanguin muqueux, sécrétion de
prostaglandines). Le mécanisme physiopathologique qui aboutit à la formation de l'ulcère
est complexe, et fait intervenir de nombreux médiateurs de l'inflammation, et des facteurs
environnementaux sur un terrain génétique particulier (Bouarioua et al. 2007).
L'éradication de H. pylori est difficile car les antibiotiques utilisés doivent parvenir
dans le mucus gastrique et y atteindre une concentration bactéricide malgré le milieu acide
qui diminue leur activité. En outre, H. pylori a une capacité élevée de variation génomique,
responsable de l'émergence fréquente de résistances sous la pression de sélection des
antibiotiques. Ces contraintes expliquent que les traitements d'éradication doivent associer
deux antibiotiques et un traitement antisécrétoire à forte posologie pour élever le pH
intragastrique (Conférence de consensus, 1999).
1
Introduction
L’utilisation des antibiotiques pour le traitement de l’infection à H pylori n’étant
pas toujours efficace, et a de nombreux effets secondaires y compris la stimulation de la
résistance des agents pathogènes. C’est pour cela que l’application alternative de probiotique
est mise en place (Felley et Michetti , 2003).
Au cours des dernières années, les maladies humaines et les bactéries probiotiques,
sont devenues des domaines interdépendants. Les probiotiques ont été recommandés comme
agents biothérapeutiques alternatives contre les infections gastro-intestinales. Ils ont des
applications à valeur commerciale, plusieurs formes sont disponibles: gélules ou dans des
produits alimentaires fonctionnels tels que le yaourt, jus de fruits fermentés et les saucisses.
Les bactéries probiotiques ont été documentés comme étant efficace dans les applications
biothérapeutiques contre les agents pathogènes gastro-intestinaux. Cette alternative
application thérapeutique de probiotiques pour protéger contre les infections gastro-
intestinales peut être d'une grande importance pour l'usage médicinal dans l'avenir
(Thirabunyanon , 2011).
Les bactéries lactiques, font partie des bactéries probiotiques, sont utilisées depuis
des siècles pour la fermentation et bioconservation des aliments, cependant le développement
de nouvelles technologies de biologie moléculaire ouvre une perspective d’utilisation de ces
bactéries comme agents biothérapeutiques (Heymann et Heulevin ,2006). Ces microorganismes produisent de nombreux métabolites aux propriétés
antimicrobiennes tels que les acides organiques, le peroxyde d'hydrogène et les bactériocines
(Dortu et Thonart, 2009). Ces peptides présentent un intérêt dans la capacité d'inhiber la
croissance des germes pathogènes (Delves-Broughton, 1990). Les effets bénéfiques
potentiels des bactéries lactiques suscitent un intérêt croissant, certains sont maintenant bien
établis tels que l’amélioration de la digestion du lactose et le traitement des désordres
diarrhéiques (Draouault et Corthier ,2001).
2
Introduction
Dans ce contexte que s'inscrit notre étude dont les objectifs sont les suivants:
1. Isolement des souches de H.pylori à partir des biopsies gastriques;
2. Caractérisation phénotypique, biochimique et moléculaire des souches d'H.pylori isolées;
3. Isolement et caractérisation des souches de bactéries lactiques à activité
bactériocinogénique à partir du lait cru de vache, chèvre, brebis et chamelle;
4. Examen anatomopathologique et cytologique des biopsies gastriques prélevées par
endoscopie digestive haute;
5. Recherche des espèces des bactéries lactiques à activité antibactérienne in vitro vis-à-vis
Helicobacter pylori et caractérisation des bactériocines extraites à partir de la bactérie
lactique qui a montré un pouvoir inhibiteur important in vitro;
6. Déterminer l'effet probiotique in vivo.
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REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
Revue bibliographique
I. Rappel anatomique et histologique:
1. Estomac:
L’estomac est un segment dilaté du tube digestif en forme de poche, situé entre
l’oesophage et le duodenum. Chez l’adulte, il mesure 20 cm de long et se trouve en rapport
avec le foie, la rate, le pancréas, le diaphragme et les intestins. L’estomac permet d’assurer
une partie de la digestion par des fonctions mécaniques et chimiques. Il présente deux
sphincters : le sphincter oesophagien situe au niveau du cardia permettant la jonction avec
l’oesophage et le sphincter pylorique situe au niveau du pylore permettant la sortie vers le
duodenum (Figure 1) (Sherwood, 2006). Il présente deux courbures: la petite courbure est
courte, siège sur la face postérieure de l’estomac, et elle est la continuation vers le bas de la
paroi postérieure de l’oesophage. Juste avant le sphincter pylorique, elle s’incurve vers la
droite et le haut pour réaliser la forme de J. Là où l’oesophage rejoint l’estomac, la région
antérieure forme un angle aigu vers le haut puis s’incurve vers le bas, formant la grande
courbure, qui se dirige ensuite vers le sphincter pylorique. Grace à sa musculature, l’estomac
malaxe les aliments et les transforme en substance semi-fluide constituée d’aliments
partiellement digérés, d’eau, de diverses enzymes de digestion et d’acide chlorhydrique
(HCl), le chyme. Celui-ci est éjecté dans le duodenum par relachement du pylore. Le pylore
a pour fonction essentielle la formation d’un reservoir assurant la continence gastrique.
L’estomac est composé de 3 régions : le fundus, le corps et l’antre qui se distinguent par une
composition cellulaire et fonctionnelle différentes (Helander, 1981).
Sur le plan histologique, la paroi interne de l’estomac est constituée de différentes
couches :
La muqueuse : c’est la première couche en contact avec le bol alimentaire. Elle est
constituée par l’épithélium et la lamina propria ainsi que d’une fine couche de muscle lisse la
séparant de la sous-muqueuse. Elle est recouverte de mucus.
La sous-muqueuse : constituée d’une couche de tissu conjonctif fibreux et vascularisé
assurant l’irrigation des cellules gastriques.
La couche musculaire: constituée de 3 couches de fibres:
- La couche musculaire oblique interne est responsable du mouvement de brassage
mécanique des aliments. Cette couche est specifique à l’estomac et n’est présentée dans
aucun autre organe du système digestif. La paroi musculaire interne de l’antre est plus
épaisse que celle du fundus assurant des contractions plus forcées.
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Revue bibliographique
- La couche musculaire circulaire qui est également plus forte au niveau de l’antre. Cette
couche est concentrique à l’axe longitudinal de l’estomac.
- La couche musculaire longitudinale externe
La sereuse : elle est composée de plusieurs couches de tissu conjonctif en continuite avec le
péritoine qui recouvre la totalité de la paroi externe de l’estomac.
Fig. 1: Anatomie de l’estomac (Sherwood, 2006; Kierszenbaum, 2006).
2. Epithélium gastrique:
Les glandes gastriques sont identifiées en fonction de leur localisation et sont
enchassées dans l’épithélium cylindrique sous forme d’invaginations tubulaires ou cryptes
gastriques. Les unités antrales et fundiques sont trés différentes sur le plan histologique. Les
glandes fundiques constituent entre 70% et 80% du total des glandes présentes dans
l’estomac et sont les plus complexes. Elles comprennent 5 types majeurs de cellules
épithéliales matures (Figure 2) : les cellules à mucus (ou mucocytes), les cellules pariétales,
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Revue bibliographique
les cellules principales, les cellules endocrines et les cellules regéneratrices. Les glandes
pyloriques, situées au niveau du pylore, ne présentent que 15% des glandes gastriques et sont
essentiellement constituées de cellules endocrines, de cellules à mucus et de cellules
regénratrices.
Cellules à mucus (ou mucocytes) : ces cellules sécretent un mucus riche en glycoprotéines :
les mucines. Le mucus joue un rôle dans la lubrification et la protection de la muqueuse
contre l’autodigestion en formant un film protecteur neutralisant l’acidité et empechant la
pepsine d’entrer en contact direct avec la paroi gastrique (Allen and Flemstrom, 2005). Les
mucines joueraient egalement un rôle dans la défense antimicrobienne contre le pathogène
gastrique Helicobacter pylori (Kawakubo et al. 2004; Fukuda et al. 2006).
Cellules pariétales: qui produisent du HCl nécessaire à la conversion du pepsinogène en
pepsine, à l’absorption du fer et à maintenir l’environnement gastrique suffisamment acide
pour assurer la dénaturation et digestion des protéines issues de l’alimentation. Le HCl limite
également le developpement de microorganismes au niveau gastrique et joue un rôle dans
l’équilibre des populations cellulaires. Les cellules pariétales produisent également une
protéine particulière : le facteur intrinséque, qui se lie sous forme de complexe à la vitamine
B12 et qui est indispensable à son absorption intestinale (Sherwood, 2006).
Cellules principales: qui secrètent deux molécules nécessaires à la digestion gastrique, le
pepsinogène, précurseur de la pepsine et une lipase gastrique. Le pepsinogène est une
proenzyme denuée d’activité protéolytique et convertie en pepsine en présence d’acide. La
pepsine est une protéase digestive assurant la dégradation des protéines en acides aminès
(Dunn, 2001). La lipase est impliquée dans la dégradation des lipides en acides gras
(Canaan et al. 1999).
Cellules endocrines: principalement situées au niveau de l’antre, responsables de la
sécrétion de gastrine, d’histamine, de somatostatine ainsi que d’autres hormones qui
régulent les différents processus associés à la digestion (Sherwood, 2006).
Cellules regénératrices (ou cellules souches): présentes au niveau des glandes antrales et
fundiques, sont impliquées dans les processus de réparation tissulaire, de regénération et
auto-renouvellement de l’épithélium gastrique. Certains peptides et neuropeptides gastriques,
en plus de leur rôle régulateur des fonctions gastriques, possèdent des propriétes de facteurs
de croissance et interviennent dans le processus de renouvellement des cellules épithéliales.
C’est le cas de la gastrine qui possède un effet prolifératif et de la somatostatine qui
possède un effet antiproliferatif (Sherwood, 2006).
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Revue bibliographique
Fig. 2: Muqueuse et glandes de l'estomac (Hoffman, 2008).
3. Renouvellement tissulaire épithélial :
L’épithélium gastrique assure plusieurs fonctions physiologiques lui permettant de
maintenir son intégrité fonctionnelle : la production de mucus et de peptides antimicrobiens,
la régulation des reponses immunitaires et inflammatoires, la regénération (auto-
renouvellement) et la réparation tissulaire. Le maintien de l’intégrite tissulaire épithéliale est
assuré par deux processus complémentaires (Figure 3) :
La regénération continue: qui se fait via la prolifération et la différenciation des cellules
souches progénitrices. Ce processus est responsable de l’auto-renouvellement de la
muqueuse épithéliale et dure tout au long de la vie adulte. La regénération tissulaire à partir
des cellules souches somatiques multipotentes est un mécanisme proéminant au niveau des
muqueuses épithéliales (Alison et al. 2006; Blanpain et al. 2007). La différenciation des
cellules souches progénitrices peut être dérégulée suite à certaines infections chroniques
entrainant éventuellement des transformations néoplasiques malignes et des tumeurs.
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Revue bibliographique
La réparation tissulaire (restitution): qui permet la restitution rapide des lesions
superficielles de la muqueuse. La re-épithélialisation se fait par migration des cellules
avoisinantes vers le site de la lésion. Ce processus commence quelques minutes aprés la
lésion (Silen and Ito, 1985; Hoffmann, 2005). L’auto-renouvellement tissulaire de
l’épithélium gastrique (antre et fundus) se fait par la prolifération et la différenciation de
cellules souches somatiques multipotentes adultes présentes dans une zone germinative
(isthme) à l’interieur de chaque glande gastrique (Gordon and Hermiston, 1994; Karam,
1999). Les cellules souches somatiques multipotentes sont entourées par les fibroblastes
subépithéliaux auxquels elles adhèrent fortement (Figure 4) (Powell et al. 1999; Powell et
al. 2005; Andoh et al. 2007). Les fibroblastes subépithéliaux secrètent une multitude de
facteurs de croissance en particulier le Hepatocyte Growth Factor (HGF), le transforming
growth factor β1 (TGF-β1) ainsi que des protéines morphogénetiques osseuses, des
métalloprotéinases matricielles (MMPs), des inhibiteurs de métalloprotéinases (TIMPs) et du
collagène de types I, III et IV (Wagner, 2007; Hoffmann, 2008)
Fig. 3: Deux mécanismes majeurs de regénération et restitution épithéliales (Hoffman,
2008).
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Revue bibliographique
La division des cellules souches peut être symétrique permettant la génération de
deux cellules-filles souches ou asymétrique permettant de générer une cellule souche et une
cellule plus différenciée (Morrison and Kimble, 2006). A partir de l’isthme, les cellules
souches somatiques migrent d’une manière bidirectionnelle pour se différencier via des
mécanismes de maturation assez complexes en mucocytes, en cellules pariétales, principales
ou endocrines (Kierszenbaum, 2006; Quante and Wang , 2009)
Fig. 4: La génération des différents types cellulaires dans les glandes gastriques antrale et
fundique (Hoffmann, 2008)
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Revue bibliographique
I. Helicobacter pylori:
1. Historique :
En 1875 des scientifiques allemands constatèrent la présence d’une bactérie
hélicoïdale dans des estomacs humains. Ils abandonnèrent les recherches car ils n’arrivèrent
pas à la cultiver. Il fallut attendre jusqu’à 1982 pour que deux chercheurs australiens J.Robin
Warren et Barry J Marshall au cours des recherches consistant aient pu isoler et cultiver des
organismes à partir d’estomacs humains (Kidd et Modlin, 1998).
Ils pensèrent à réaliser les cultures de biopsies gastriques sur gélose chocolat en
atmosphère microaérophile. Un temps d’incubation de 2 à 3 jours ne leur permit tout d’abord
pas d’obtenir de culture. En avril 1982, des milieux de culture avaient été oubliés dans
l'étuve, la culture s'avéra positive au bout de 5 jours, indiquant la nécessité d'un temps de
culture plus long pour isoler la bactérie. Elle fut alors assimilée au genre Campylobacter sur
la base de sa morphologie spiralée et de la présence de flagelles engainés. Dans leur
publication originelle, R.Warren et B. Marshall postulèrent que la plupart des ulcères
gastriques étaient causés par cette bactérie, et non par le stress ou la nourriture épicée,
comme on le pensait auparavant. Cette découverte leur valut le prix Nobel en 2005 de
physiologie et de médecine.
La communauté médicale tarda à reconnaître la responsabilité de cette bactérie dans
la genèse des ulcères gastro-duodénaux, pensant qu'aucune bactérie ne pouvait survivre dans
l'environnement acide de l'estomac. Il a fallu que B. Marshall absorbe une culture de
H.pylori et développe une gastrite qu’il traita avec des antibiotiques, pour convaincre la
communauté médicale. Coghlan et al. (1987) puis Marshall et al. (1988) confirmèrent
l’importance de l’éradication de la bactérie pour prévenir les récidives d’ulcère.
En 1994, l' Institut Nationale de la Santé affirmait que la plupart des ulcères
gastriques récurrents étaient causés par H. pylori et recommandait l’adjonction
d’antibiotiques. En effet, avant que ne soit reconnu le rôle de H. pylori, les ulcères gastriques
étaient traités par des antiacides qui n’évitaient pas les rechutes. Le subsalicylate de bismuth
était largement utilisé mais bien que vraisemblablement bactéricide, il fut abandonné en
raison de sa toxicité neurologique. En 1994, H. pylori a été classée parmi les agents
carcinogènes de classe I par l’Organisation Mondiale de la Santé. Elle fut initialement
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Revue bibliographique
nommée Campylobacter pyloridis, puis Campylobacter pylori (après correction
grammaticale latine). Sur la base de la séquence de l’acide ribonucléique (ARN) 16S, de la
composition en acide gras et de la morphologie des flagelles, cette bactérie a été renommée
en 1989 Helicobacter pylori, représentant ainsi le chef de file d’un nouveau genre bactérien
Helicobacter (Goodwin et al. 1989).
2. Classification :
Le genre Helicobacter tire son nom de la forme hélicoïdale, et le nom pylori vient
du latin« pylorus »faisant référence à l’ouverture circulaire pylore (Dominique, 2008). Ce
genre appartient à la famille des Helicobacteriaceae (Campylobacterales, division epsilon de
la classe des Proteobacteria), comprenant aussi les genres Flexispira, Sulfuricurvum,
Sulfurimonas, Thiovulum et Wolinella (Euzéby, 2008).
En 2008, le genre Helicobacter regroupe 31 espèces différentes ayant un statut dans
la nomenclature bactérienne, mais de nombreuses autres espèces n'ont pas encore été
validement publiées où sont placées dans la catégorie Candidatus : "Helicobacter colifelis",
"Helicobacter muricola", "Helicobacter suncus", "Helicobacter westmeadii", "Helicobacter
winghamensis", "Candidatus Helicobacter bovis", "Candidatus Helicobacter heilmannii",
"Helicobacter-like organisms" (Euzéby, 2008).
D'autres espèces d'Helicobacter constituées d’espèces entéro-hépatiques sont
retrouvées dans le tractus intestinal et le foie des mammifères et des oiseaux. Elles peuvent
occasionner des inflammations ou des affections malignes chez des individus présentant un
déficit immunitaire. Les principales espèces retrouvées chez l’homme sont : H. canadensis,
H. canis, H. cinaedi, H. fennelliae, H.pullorum, H. rappini et H. winghamensis (Jay et
Schauer, 2001, Laharie et al. 2009).
3. Caractères morphologiques et biochimiques :
H. pylori est une bactérie pathogène, ne colonise que la muqueuse gastrique et
n’infecte pas le duodénum s’il n’y pas de métaplasie gastrique. Elle est du genre
Helicobacter et sa définition se résume en trois mots : helico (du grec hélikoïde, qui veut dire
spiralée); bacter (bâtonnet) ; pylori (désigne le pylore). Ce qui donne un bâtonnet spiralé du
pylore (Bigard, 2004).
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Revue bibliographique
H.pylori apparaît comme une bactérie mobile, incurvée ou spiralée, à Gram négatif,
de 2 à 4 µm de longueur et de 0.5 à 1 µm de largeur (Denis et al. 2007). Toutes les souches
de H.pylori ne réduisent pas les nitrates, mais produisent une oxydase, une catalase, une
uréase très active, une phosphatase alcaline, une gamma-glutamyl transférase, une leucine
aminopeptidase et une ADNase (Matysiak, 1998 ; Skoulobris et al. 2000). La culture de
H.pylori requiert une atmosphère humide et microaérophile (5-6% O2, 8-10% CO2, 80-85%
N2). C’est une bactérie exigeante, nécessitant la présence de 5 à 10% du sang (mouton ou
cheval) ainsi que de compléments vitaminiques (Vincent et Leclerc, 1991; Skoulobris et al.
2000).
4. Réservoir :
Le seul réservoir identifié est la muqueuse gastrique, y compris dans ses
localisations ectopiques comme l’œsophage ou le diverticule de Meckel. En dehors de
l’estomac, H. pylori a pu exceptionnellement être isolée par culture des selles, de la salive et
de la plaque dentaire. L’eau et l’alimentation pourraient être des réservoirs occasionnels
puisqu’ une survie de la bactérie a pu être obtenue après contamination artificielle de ces
milieux (Vincent et Leclerc, 1991 ; Megraud et Broutet, 2000).
5. Mode de transmission :
5.1. Transmission oro-orale:
L’infection gastrique à H pylori s’accompagne d’une excrétion dans le milieu
extérieur de bactéries conservant leur viabilité. L’hypothèse de la contamination à partir de la
salive s’appuie sur plusieurs arguments : c’est le mode prédominant de transmission des
Helicobacters chez l’animal et chez l’homme, le visage de l’enfant en contact étroit avec
celui des adultes qui l’entourent, est hautement exposé à leurs projections salivaires
(Giacomo, 1994). Des cas de coïnfection mère-enfant (même souche hébergée par les deux)
ont été décrits, ainsi qu’un risque accru d’infection lorsque la mère mastique préalablement
les aliments, qu’elle va donner à son enfant (Vincent, 1994). La mise en évidence de
H. pylori au niveau de la plaque dentaire et la détection du génome bactérien dans la salive,
sont aussi en faveur d’une transmission oro-orale (Remot et al. 1994).
12
Revue bibliographique
5.2. Transmission féco-orale:
L’isolement de H pylori dans des selles de sujets africains, oriente plutôt vers une
transmission de type féco-orale (Remot et al. 1994). La transmission féco-orale se fait par
exposition particulière de l’enfant, qui porte facilement ses doigts à la bouche après la
manipulation d’objets souillés (Vincent, 1994).
6. Prévalence:
L’infection à H.pylori est l’infection bacterienne la plus répandue dans le monde
(50 % de la population) mais il existe de grandes disparites géographiques. En effet, sa
prevalence est > 90 % en Asie, Amerique latine et pays en voie de developpement, de 50 à
70 % en Europe de l’Est et de 30 % environ dans les pays occidentaux (Biomnis, 2012).
De très nombreuses études épidémiologiques ont été effectuées sur des populations
asymptomatiques. Ces différents travaux, ont tous permis de démontrer le caractère
ubiquitaire de l’infection à H. pylori, mais la prévalence varie en fonction du pays, l’âge,
l’origine éthnique, des conditions socio-économiques, la promiscuité et l’hygiène (Faucher,
1994 ; Sobhani, 2004).
Dans les pays développés, 22% de la population est infectée à l’âge de 20 ans et
66% à l’âge de 60 ans (Malaty, 2007). L’incidence de l’infection est nettement inférieure
durant l’enfance puisque seulement 10% des enfants de 10 ans sont atteints (Gasbarrini et
al. 1995). Dans les pays en voie de développement, l’incidence de l’infection est supérieure
durant l’enfance puisque 70% à 80% des enfants de 10 ans sont atteints (Adler-Shohet et al.
1996 ; Guisset et al. 1997).
Dans une étude menée entre 2003 et 2004, les chercheurs de CHU de Hussein-Dey
ont dévoilé une extrême fréquence de l’infection chronique par H.pylori dans la population
générale. Sur un échantillon de 400 enfants et de 431 adultes, il a été retrouvé une prévalence
moyenne de 37% chez l’enfant (56% à 16 ans) et de 86% chez l’adulte (96% pour les adultes
de plus de 50 ans). Selon les conclusions de ces travaux, en Algérie la séroprévalence est très
élevée, acquise très tôt dans l’enfance (Guechi, 2008).
13
Revue bibliographique
7. Physiopathologie de l’infection à H. pylori:
7.1. Phase aiguë :
Elle apparaît après ingestion, pénétration et déplacement de H.pylori dans le mucus
grâce aux flagelles. L’activité uréasique de H.pylori permet sa survie en milieu acide en
alcalinisant le milieu ambiant grâce à la production d'ammoniac. 20% des bactéries adhèrent
aux cellules épithéliales par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques. H. pylori provoque une
diminution de la couche de mucus, fragilisant ainsi la muqueuse et lèse l'épithélium en
produisant des cytotoxines ou des enzymes protéolytiques induisant l'altération des jonctions
intercellulaires. Cette phase est caractérisée par une inflammation aiguë avec présence de
polynucléaires. L'IL-8 sécrétée par les cellules épithéliales en réponse à l'infection par
H.pylori permet le recrutement des polynucléaires neutrophiles qui, en phagocytant les
bactéries, vont libérer des substances toxiques entretenant les lésions. Cette phase est de
courte durée. L'infection aiguë s'accompagne d'une séroconversion avec la présence très
transitoire d'IgM, suivie d'une réponse IgG qui perdure alors tout le temps de l'infection
(Skouloubris et Labigne, 1999; Sobhani et al. 2000; Lamarque et al. 2003).
7.2. Phase chronique:
En absence d'éradication, une phase chronique survient. Elle est caractérisée par une
inflammation chronique active et une réponse immunitaire spécifique. Les polynucléaires
persistent mais l'infiltrat inflammatoire est alors plutôt constitué de cellules mononucléées :
macrophages et lymphocytes T. La présence de follicules lymphoïdes est fréquente et plus
importante chez l'enfant. La stimulation immunitaire, qui entretient la réaction de la
muqueuse, semble dûe à la libération par H.pylori de nombreux facteurs immunogènes
(Skouloubris et Labigne, 1999; Sobhani et al. 2000; Lamarque et al. 2003).
8. Facteurs de virulence de H.pylori:
H. pylori est particulièrement bien adapté à la colonisation de la muqueuse gastrique
grâce à de nombreux facteurs bactériens tels qu’une uréase et des flagelles. D’autres facteurs
sont responsables d’une inflammation locale au site de colonisation tels que le
lipopolysaccharide (LPS), des adhésines, un appareil de sécrétion de type IV (T4SS) et une
cytotoxine VacA. L’intervention de ces différents facteurs bactériens amène à
l’affaiblissement de la barrière épithéliale et à des lésions gastriques apparentes lors de
14
Revue bibliographique
l’observation par endoscopie de l’estomac. H. pylori entraîne l’apparition de gastrites qui
peuvent être chroniques et asymptomatiques ou évoluer vers des pathologies plus graves.
8.1. Inflammation et lésions tissulaires:
8.1.1. Cytotoxine vacuolisante VacA:
VacA est un facteur de virulence majeur chez H. pylori. La protéine VacA a la
particularité d’être une cytotoxine multifonctionnelle, incluant entre autres une vacuolisation
cellulaire, la formation de canaux membranaires, la perturbation des fonctions
endosomales/lysosomales, l’apoptose et un effet immunosuppresseur. La capacité de la
toxine à former des pores anioniques est une caractéristique importante de son mécanisme
d’action (Isomoto et al. 2010).
8.1.1.1. Génétique:
Bien que toutes les souches de H. pylori n’aient pas toutes une activité cytotoxique,
elles possèdent toutes le gène vacA codant pour une cytotoxine vacuolisante VacA. Le gène
vacA est sujet à un polymorphisme au niveau de (Rhead et al. 2007):
- la région « s » codant pour la séquence signal de la protéine (allèle s1 fonctionnel,
subdivisé en s1a, s1b, s1c et l’allèle non fonctionnel s2),
- la région « i » (allèles i1 et i2),
- la région « m » située au milieu du gène (allèles m1 et m2 subdivisés en m2a et m2b)
Les souches s1/m1 sont i1, s2/m2 sont i2 et s1/m2 peuvent être i1 ou i2 (Rhead et
al. 2007; Basso et al. 2008), les souches de type s1/i1/m1-ou-m2 induisent en général un
haut niveau de vacuolization tandis que les souches s1/i2/m2 induisent peu de vacuolisation,
et les souches s2/i2-ou-i1/m1- ou-m2 sont dépourvues d’effet cytotoxique (Rhead et al.
2007).
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Revue bibliographique
8.1.1.2. Structure:
Le gène vacA code pour une protéine précurseur de 140 kDa qui est maturée en une
toxine d'environ 88 kDa après les clivages suivants (Figure 5) (Cover et Blaser, 1992;
Schmitt et Haas, 1994):
- lors de sa traversée de la membrane interne via le système de sécrétion de type II
(Sec-dépendant), une séquence signal de 33 acides aminés en N-terminal est clivée,
- lors de sa traversée de la membrane externe, la partie C-terminale de 33 kDa de la
protéine reste attachée à la membrane externe permettant l'export et la sécrétion de la
toxine mature par un mécanisme de type auto-transport,
- la protéine mature peut subir un clivage au niveau d'une boucle sensible à la
protéolyse entre le fragment N-terminal de 33 kDa (p33) et le fragment C terminal de
55 kDa (p55), les deux fragments restant physiquement associés.
Le domaine p33 présente une activité de formation de pores nécessaire pour la
vacuolisation (Busler et al. 2006), tandis que le domaine p55 est responsable de la liaison à
la cellule cible (Reyrat et al. 1999). La toxine est libérée dans le milieu extracellulaire ou
peut être retenue à la surface bactérienne (Telford et al. 1994).
Les monomères de VacA peuvent s'agencer en une structure de plus de 900 kDa
dite "en fleur", de 6 à 7 pétales constitués chacun par l'association des deux polypeptides de
33 et 55 kDa (monomère de 88 kDa) (Lupetti et al. 1996; Reyrat et al. 1999). La forme
oligomérique de VacA présente une faible activité sauf lorsqu'elle est exposée à pH acide ou
alcalin, pH auxquels la protéine se monomérise (Cover et al. 1997). La toxine de H. pylori
possède donc des propriétés remarquables qui pourraient lui permettre d'optimiser dans le
milieu gastrique son action délétère vis-à-vis de l'épithélium.
16
Revue bibliographique
Fig. 5: Schéma représentatif du gène VacA (Kim et Blank, 2012)
8.1.1.3. Effets physiopathologiques:
Vacuolisation des cellules eucaryotes:
Il a été observé que des surnageants de culture de H. pylori étaient capables
d’induire in vitro la formation de larges vacuoles intracellulaires dans des cellules, activité
qui a été attribuée ultérieurement à la protéine VacA (Figure6) (Leunk et al. 1988).
L’utilisation de la protéine purifiée et activée par l’acidité permet d’induire la vacuolisation
en présence de bases faibles, telle que le chlorure d’ammonium (Cover et Blaser, 1992).
VacA est capable d’agir dans la cellule eucaryote sous forme d’oligomères ou de
monomères. L’administration intragastrique chez la souris d’une dose massive de la protéine
VacA purifiée permet d’observer des dommages de la muqueuse gastrique ainsi qu’une
inflammation (Cover et Blanke, 2005).
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Revue bibliographique
La toxine VacA forme des pores dans des bi-couches lipidiques et sur des
membranes plasmiques: des monomères de VacA, activés à pH acide et insérés dans une bi-
couche lipidique, se réassocient au niveau membranaire pour former un pore hexamérique
impliqué dans un transport d'anions (Iwamoto et al. 1999; Szabo et al. 1999).
Après endocytose des pores de surface, ils sont traités au niveau des compartiments
endosomaux tardifs, qui subissent un gonflement osmotique pour devenir de larges vacuoles
(Papini et al. 1994). Les vacuoles induites par VacA portent les marqueurs des endosomes
tardifs et des lysosomes et ne sont pas létales pour les cellules. Cependant, la protéine VacA
engendre des dégâts au niveau du compartiment endosomal tardif (Cover et Blanke, 2005):
– dégradation du facteur de croissance épidermique (EGF pour epidermal growth
factor).
– inhibition de la maturation de la procathepsine D.
– inhibition de la présentation d’antigènes.
Induction de l’apoptose:
La protéine VacA engendre d’autres phénomènes cytotoxiques tels que l’induction
de l’apoptose. Lorsque des cellules en culture sont traitées avec la protéine VacA purifiée, il
a été observé une réduction du potentiel transmembranaire mitochondrial et la libération de
cytochrome c (Kimura et al. 1999; Willhite et al. 2003; Willhite et Blanke, 2004). Ces
deux effets sont caractéristiques d’un affaiblissement de la perméabilité membranaire
mitochondriale et suggèrent l’initiation d’une mort cellulaire.
Action immunosuppressive:
Elle est suggérée par :
- une altération dans la maturation du phagosome, mais la survie de H. pylori ne
semble pas modifiée que le gène vacA soit exprimé ou non (Zheng et Jones, 2003).
- une altération de la capacité à présenter les antigènes par les lymphocytes B
(Molinari et al. 1998).
- une inhibition de la prolifération et de la maturation des lymphocytes T (Gebert et al.
2003; Sundrud et al. 2004; Torres et al. 2007) et B (Torres et al.2007).
18
Revue bibliographique
Fig. 6: Schéma représentant les différentes activités de la protéine VacA de H. pylori sur les
cellules épithéliales de la barrière gastrique (Chaput et Boneca, 2006)
8.1.2. Ilot de pathogénicité cag et la protéine CagA:
Les souches de H. pylori ont été classées en deux catégories: celles qui possèdent un
îlot de pathogénicité cag (cag PAI) complet et fonctionnel et celles qui en sont totalement ou
partiellement dépourvues (Figure 7) (Covacci et al. 1999).
Le cag PAI est une région génomique de 40 kb contenant une trentaine de gènes. Le
cag PAI est inséré dans le gène chromosomique glr codant la glutamate racémase et présente
les caractéristiques d'un îlot de pathogénicité (Censini et al. 1996):
- une grande taille (environ 40 kb, 31 gènes putatifs),
- contenu en GC de 35 % différent de celui du reste du génome (39 %),
- la présence de séquences répétées de 31 paires de base aux extrémités,
- une presence variable de séquences d’insertion,
- des homologues à certains facteurs de virulence,
- une instabilité génétique. 19
Revue bibliographique
Fig. 7: Représentation schématique de l'îlot de pathogénicité cag (PAI) (Occhialini et
Megraud, 2002).
8.1.2.1. Activités biologiques:
Le T4SS (appareil de sécrétion de type IV) de H. pylori, en contact étroit avec les
cellules épithéliales est impliqué dans plusieurs processus majeurs (Figure 8):
- un phénomène d’élongation cellulaire également appelé phénotype colibri, de par les
extensions cellulaires que l’on peut observer lors d’une infection de cellules épithéliales in
vitro avec une souche de H. pylori, résultat d’une augmentation de la mobilité et de
l’élongation cellulaire;
- une activité pro-inflammatoire, pro-apoptotique et mitogène,
- une perturbation des jonctions serrées et adhérentielles, et de la polarité cellulaire (Backert
et Selbach, 2008).
20
Revue bibliographique
8.1.2.2. Inflammation:
H. pylori induit une infection chronique de la muqueuse gastrique qui conduit à un
état inflammatoire chronique. Le cag PAI induit la synthèse par les cellules épithéliales
gastriques d’IL8, une puissante cytokine pro-inflammatoire. H. pylori induit chez l’homme
une forte réponse immunitaire cellulaire et humorale. La réponse humorale semble inefficace
pour entraîner une guérison de l’infection (Ferrero et al. 1998).
En revanche, la réponse cellulaire joue un rôle majeur dans l’élimination de H.
pylori et dans la pathogenèse chez l’animal. La réponse cellulaire prédominante chez
l’homme induite par H. pylori est une réponse de type Th1 et est associée à la libération de
cytokines pro-inflammatoires (Interferon-gamma (IFN-γ), IL12, IL18, TNFalpha) ainsi qu’à
une activation des macrophages (D'Elios et al. 1997; Ernst et Gold, 2000), contribuant aux
dommages tissulaires. D’autres cytokines jouent également un rôle important, l’IL17, l’IL21
et l’IL23 dans le fin équilibre entre protection et lésions cellulaires liées à H.pylori (Luzza et
al. 2000; Amedei et al. 2006; Cooper, 2009).
Fig. 8: Rôle de l'îlot cag et de la protéine CagA (Megraud, 2008). 21
Revue bibliographique
8.1.2. Adaptation à l’environnement gastrique:
Les cellules épithéliales gastriques secrètent le mucus qui forme une couche épaisse
de protection (100 µm) pour la muqueuse gastrique vis-à-vis de l'acidité gastrique. Il est
produit par les cellules cardiales, pyloriques et fundiques. Lors de son entrée dans l’estomac,
H. pylori est confronté à l’acidité extrême de la lumière gastrique qu’il fuit rapidement à
l’aide de puissants flagelles, vers le mucus. L’analyse du transcriptome à pH acide montre
une augmentation de l’expression de certains gènes impliqués dans la mobilité et le
chimiotactisme (Bury-Mone et al. 2004). Le pH à la surface de la barrière est de 1.5 alors
qu'il est de 7 en zone profonde au contact des cellules. Ce gradient de pH permettrait à la
bactérie de s’orienter dans la couche de mucus et d’atteindre son site de colonization
(Schreiber et al. 2004).
La répartition de H. pylori dans l'habitat gastrique est la suivante: une infime
proportion des bactéries se situe dans la lumière, 20 % à la surface de l'épithélium et environ
80 % dans le mucus dans une zone d’acidité modérée (pH 4.5-6) (Schreiber et al.1999;
Schreiber et al. 2000).
8.1.2.1. Flagelles et le chimiotactisme:
La mobilité de H. pylori est un facteur indispensable à la colonisation de la
muqueuse gastrique par la bactérie (Figure 9). Des mutants aflagellés de H. pylori trouvés
chez des porcelets sont incapables de persister dans la muqueuse gastrique mais génèrent une
réponse immunitaire témoignant de leur survie transitoire dans l'estomac (Eaton et al. 1992).
H. pylori possède 5 à 7 flagelles polaires engainés de 3 µm de long et une
morphologie spiralée qui lui permettent, lors de son ingestion, d'abréger son séjour dans le
suc gastrique, de pénétrer dans la couche de mucus et de s'y mouvoir. La mobilité de H.
pylori dans le mucus gastrique est assurée par la machinerie flagellaire dont la fonctionnalité
requiert l'expression d'une quarantaine de gènes identifiés dans le génome de H. pylori
(Tomb et al. 1997).
L'appareil flagellaire se décompose en trois éléments:
- Un corps basal qui sert d'ancrage à la membrane bactérienne et porte les constituants
du moteur flagellaire et certains éléments de chimiotactisme,
22
Revue bibliographique
- Le crochet (constitué par la polymérisation de la protéine FlgE) qui relie le corps
basal aux filaments flagellaires,
- Les filaments flagellaires de H. pylori sont constitués par la polymérisation de deux
sous-unités d'environ 53 kDa : la flagelline majeure FlaA (codée par flaA) et la
flagelline mineure FlaB (codée par flaB), retrouvées uniquement à la base du filament
(Kostrzynska et al. 1991).
L’analyse du transcriptome à pH acide montre une augmentation de l’expression de
certains gènes impliqués dans la mobilité et le chimiotactisme (Merrell et al.2003; Wen et
al. 2003; Bury-Mone et al. 2004), suggérant la nécessité pour la bactérie de fuir rapidement
l’acidité extrême pour un environnement plus favorable.
Fig. 9: Structure de l'appareil flagellaire de H.pylori (Lertsethtakarn et al. 2011)
8.1.2.2. Uréase:
H. pylori exprime une métalloenzyme à nickel de localisation cytoplasmique,
l’uréase, produite en quantité abondante (6 à 10 % des protéines totales) (Figure 10). Elle
hydrolyse l'urée présente dans l'environnement gastrique en permettant la production
d'ammoniac et de dioxyde de carbone. L’ammoniac produit par l’uréase capte un proton pour
former l’ammonium, ce qui permet à la bactérie de maintenir son pH intracellulaire proche
23
Revue bibliographique
de la neutralité. La production d’ammonium participerait également à l’endommagement de
la barrière épithéliale gastrique afin de récupérer des nutriments et des ions essentiels (Smoot
et al. 1990).
L'uréase est codée par un opéron bicistronique comprenant les gènes de structures
de l'apoenzyme (ureA et ureB) et cinq gènes (ureIEFGH) dont les produits participent à
l'activation de l'apoenzyme par incorporation des ions nickel. Des données de
cristallographie montrent que l'uréase de H. pylori forme un complexe dodécamérique
[(UreAUreB)3]4 contenant 12 sous-unités catalytiques (UreB) fixant chacune 2 ions de
nickel (24 ions/molécule) et formant un complexe sphérique extrêmement compact,
conférant à l'enzyme une résistance à l'acidité (Ha et al. 2001).
Une des caractéristiques uniques de l'opéron uréasique de H. pylori est liée à la
présence du gène ureI codant une protéine membranaire qui forme au niveau de la membrane
cytoplasmique un pore à urée qui s'ouvre à pH acide permettant le transport efficace de l'urée
et donc une adaptation rapide à un environnement acide (Weeks et al. 2000). L'uréase et la
protéine ureI sont essentiels pour la colonisation de la muqueuse gastrique de différents
modèles animaux (Bury-Mone et al. 2001; Mollenhauer-Rektorschek et al. 2002).
Fig. 10: Structure de l'uréase de H.pylori, A: structure tertiaire; B: assemblage
dodécamérique (Ha et al. 2001).
B A
24
Revue bibliographique
8.1.2.3. Réponse à l’acidité:
L’influence du pH acide sur la transcription des gènes a été étudiée en détail par des
analyses de transcriptome (Merrell et al. 2003; Wen et al. 2003; Pflock et al. 2006). La
réponse à l’acidité est caractérisée par la mise en oeuvre de mécanismes de protection (De
Reuse et Bereswill, 2007):
- augmentation de l’expression de certains gènes impliqués dans la mobilité et le
chimiotactisme,
- maintien de son pH intracellulaire par l’augmentation de la transcription de gènes
codant pour des enzymes générant l’ammoniac, l’uréase (UreA) et les amidases
aliphatiques (AmiE et AmiF),
- diminution de la transcription de gènes codant pour des protéines transmembranaires
telles que des transporteurs, perméases ou des protéines de la membrane externe
(OMP pour « outer membrane protein ») entraînant une diminution des influx
transmembranaires (protons, ions sodiques),
- protection contre l’accumulation d’ions métalliques, principalement le nickel et le fer
(à pH acide, leur solubilité est augmentée. L’expression des protéines impliquées dans
le stockage est augmentée et l’expression des protéines impliquées dans l’import de
nickel, NixA, et du fer, FecA, est diminuée),
- augmentation de l’expression de la protéine VacA et de l’adhésine SabA à pH neutre,
ce qui optimiserait leurs actions à proximité de la cellule gastrique.
Par rapport à d’autres bactéries, H. pylori possède un nombre restreint de
régulateurs transcriptionnels (Tomb et al. 1997; Alm et al. 1999). Au moins, trois
régulateurs transcriptionnels ont été identifiés comme impliqués dans la réponse adaptative à
l’acidité : NikR, Fur et ArsRS (De Reuse et Bereswill, 2007). Ces protéines agissant sur des
catégories fonctionnelles de gènes très diverses. Les protéines NikR et Fur sont deux
métallorégulateurs sensibles respectivement à la concentration intracellulaire en nickel et en
fer.
8.1.2.4. Lipopolysaccharide:
Le LPS est un constituant de la paroi qui est ancré dans la membrane externe par sa
partie lipidique, appelée lipide A. A ce lipide est greffé une partie centrale courte composée
de sucres. Cette partie centrale fait elle-même le lien entre le lipide A et de longues chaînes
25
Revue bibliographique
glucosidiques formant l’antigène O. Il a été observé que jusqu’à 85 % des souches de H.
pylori sont porteuses d’antigènes Lewis qui correspondent à l’antigène O (Simoons-Smit et
al. 1996; Wirth et al. 1996).
Une particularité unique est la présence au niveau de l'antigène O de motifs
antigéniques de type Lewis, Lex, Ley dans 80 à 90 % des souches ou plus rarement Lea, Leb,
Lec ou Lex-sialylé. Les antigènes Lewis sont normalement présents des cellules épithéliales
de la muqueuse gastrique. La synthèse des antigènes Lewis est sous la dépendance de trois
fucosyl-transférases, FutA, FutB et FutC, leur expression peut-être modulé par un
mécanisme de variation de phase, créant une population microbienne avec des profils de
glycosylation du LPS très divers. De fait, il a été proposé que le LPS de H. pylori puisse
jouer un rôle dans l’échappement de la bactérie au système immunitaire (Figure 11) (Moran
et Prendergast, 2001).
Il a été constaté que le LPS de H. pylori est peu immunogène, car les patients
infectés par la bactérie ne presentent pas ou très peu d’anticorps dirigés contre ce constituant.
De plus, le lipide A de H. pylori montre une composition en acide gras inhabituelle (Moran
et al. 1997).
8.1.2.5. Adhésines:
H. pylori a de nombreux moyens d’adhésion à la muqueuse gastrique, ce qui la
protégé du péristaltisme et de la desquamation de la muqueuse gastrique. Au regard des sept
genomes séquencés (Thiberge et al. 2010), 46 OMPs ont été prédites. Cette catégorie de
OMPs regroupe plusieurs adhésines dont un petit nombre a été caractérisé : AlpA, AlpB,
BabA, BabB, HopZ, HopQ, SabA. Les adhésines BabA (blood group antigen-binding
adhesin) et SabA (sialic acid-binding adhesin) lient respectivement, les antigènes Lewis du
type b (Leb) et les antigènes Lewis portant un acide sialique (sialyl-Lex).
Une augmentation de sialyl-Lex était corrélée à une persistance de la colonisation
de l’estomac de jeunes souris infectées de façon précoce (Yang et al. 2008). Le locus sabA a
une expression soumise à une variation de phase. Ce système permet à la bactérie d’échapper
à la réponse immunitaire de l’hôte, expliquant sa persistance et son adaptation à l’hôte
(Goodwin et al. 2008).
26
Revue bibliographique
Fig.11: Schéma du lipopolysaccharide de H. pylori(Chaput et Boneca, 2006)
9. H pylori et pathologie associées :
Suite à une infection par H. pylori, les principales étapes (nommées « cascade de
Correa ») d'un processus de cancérisation sont: la gastrite chronique active, l'atrophie
gastrique, la métaplasie intestinale, la dysplasie et le cancer gastrique (Figures 12 et 13)
(Correa, 1995 ; Kuipers, 1999; Peek et Blaser, 2002).
9.1. Gastrite :
L’H pylori demeurant à la surface de l’épithélium gastrique, déclenche une réaction
inflammatoire caractérisée par une infiltration de lymphocytes, de plasmocytes et de
macrophages. En effet, la bactérie en interaction avec la cellule épithéliale entraîne la
production d’interleukines, celles-ci provoquent le recrutement des polynucléaires. De plus
l’H.pylori activerait directement ou par le biais d’une endotoxine, le macrophage qui induit à
son tour la production de nombreuses cytokines et le T. N .F (Tumor Necrosis Factor). Ces
différentes réactions déclenchées par la colonisation de l’estomac par l’H pylori, aboutissent
à la gastrite (De Dorwin, 1994 ; Dobrilla et Benvutti, 1995).
27
Revue bibliographique
L’évolution de la gastrite à H pylori est influencée par de nombreux facteurs, la
variabilité de la localisation lésionnelle et la sévérité de l’inflammation expliquent la
diversité des conséquences lésionnelles (atrophie, métaplasie) ou fonctionnelles (anomalie de
la sécrétion acide), ainsi que la diversité des pathologies: ulcère gastrique ou duodénal,
lymphome et adénocarcinome gastrique (Amrani et Allouch, 1995).
9.2. Ulcère gastro-duodénale :
C’est une maladie plurifactorielle où H pylori occupe une place prépondérante
puisqu’il est associé dans 90% des cas à un ulcère duodénal et dans 70% à un ulcère
gastrique (CNHIM, 2001). La maladie ulcéreuse gastroduodénale résulte d’un déséquilibre
entre les facteurs d’agression et les facteurs de défense au niveau de la muqueuse. Il est
généralement admis que dans l’ulcère duodénal le facteur dominant est l’agression
chlorhydro-peptique alors que dans l’ulcère gastrique c’est l’altération de la muqueuse
gastrique (Pascal et Christiane, 2007). L’infection chronique par H pylori s’accompagne
d’une augmentation modérée de la gastrine basale. En plus, il existe chez les patients infectés
et porteurs d’un ulcère duodénal une diminution de la sécrétion des bicarbonates, ce qui
concourt à l’acidification du duodénum (Sobhani, 1994).
Fig. 12: Pathologies gastriques associées à l'infection par Helicobacter pylori (Sobhani,
2003)
8
28
Revue bibliographique
9.3. Lymphome gastrique :
L’H. pylori entraîne une prolifération lympho-épithéliale de la muqueuse gastrique,
celle-ci étant normalement dépourvue de follicule lymphoïde et évoque la phase d’initiation
du lymphome gastrique de type M.A.L.T (Mucosae Associated Lymphoid Tissue) à cellule B
de bas grade de malignité (Faik et Raiss, 1998). La cytologie normale de l’estomac est
dépourvue de tissu lymphoïde associé aux muqueuses. Tous les lymphomes primitifs gastro-
intestinaux sont issus du MALT digestif. Parmi ceux-ci, le lymphome gastrique de type
MALT est le plus fréquent : Il représente 3 % des tumeurs malignes gastriques (Zucca et al,
1988). Il s’agit d’une prolifération lymphomateuse de l’épithélium et du chorion de type
monoclonal. Ondistingue 2 types cliniques:
- Lymphome à grandes cellules (haut grade) caractérisé par une tumeur volumineuse et
ulcérée.
- Lymphome à petites cellules (bas grade) caractérisé par une réaction inflammatoire
lymphoplasmocytaire, une formation de nodules lymphoïdes et la prolifération d’un clone
cellulaire. Ce sont des lymphomes de faible degré de malignité, d'évolution indolente,
généralement localisés et pouvant se transformer en lymphome de haut degré de malignité
lorsqu'apparaît un ou plusieurs contingents de grandes cellules.
Le pronostic du lymphome gastrique du MALT à faible degré de malignité a été
sensiblement amélioré depuis la découverte de l’implication de H. pylori en 1991
(Wotherspoon et al, 1991). En effet, une éradication précoce fait régresser le processus
tumoral (Wotherspoon et al, 1993). Elle est sans effet sur les formes à haut degré de
malignité résultant de l’acquisition d’altérations génétiques supplémentaires.
9.4. Cancer gastrique :
L’infection à H. pylori provoque une gastrite qui, après plusieurs années d’évolution
chronique, peut aboutir dans certains cas au cancer. H. pylori semble altérer les propriétés
physiques et chimiques du mucus gastrique, le rendant plus sensible aux facteurs
carcinogènes. Un régime alimentaire riche en sel et pauvre en acide ascorbique de l’hôte
influence le processus carcinogène. La hausse du pH favoriserait ainsi une prolifération de la
flore bactérienne intestinale douée d’une activité nitrate réductase, qui métabolise les nitrates
en produisant de la nitrosamine, substance cancérigène. Une muqueuse de type intestinal
remplace progressivement la muqueuse gastrique, c’est la métaplasie gastrique. Le cancer
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Revue bibliographique
qui va ainsi se développer est plutôt de type intestinal : c’est la forme la plus fréquente des
cancers gastriques (Sobhani, 2004). Selon leur localisation, on distingue 2 types
d’adenocarninomes gastrique :
- L’adénocarcinome du cardia se développe indépendamment de l’infection par H. pylori et
serait favorisé par le reflux gastro oesophagien. Son incidence reste stable ou en légère
augmentation.
- L’adénocarcinome de l’estomac distal lié à la gastrite atrophique induite par H. pylori. Son
incidence diminue nettement. Le cancer de type intestinal, de loin la forme la plus fréquente,
est associé à des lésions de métaplasie intestinale sur la muqueuse adjacente à la tumeur,
contrairement au cancer de type diffus (forme plus rare de cancer gastrique).
Fig. 13: Evolution de l’infection à H pylori vers les maladies gastriques en fonction de l'âge
(Mégraud, 2003).
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Revue bibliographique
10. Diagnostic de l’infection à H pylori :
Les techniques de diagnostic d’une infection à H pylori comprennent les méthodes
microbiologiques, anatomopathologiques, immunologiques, et celles basées sur la mise en
évidence de l’activité uréasique bactérienne. Ces méthodes sont soit invasives nécessitant
une endoscopie avec biopsie, soit non invasives (Korwin et Lozniewski, 2000).
10.1. Méthodes invasives :
10.1.1. Endoscopie digestive haute: Elle consiste à prélever des fragments biopsiques de
la muqueuse antrale ou fundique et à rechercher les bactéries dans ces prélèvements
(ANAES, 2001).
10.1.2. Tests rapides à l’uréase (TRU): Ces tests consistent à mettre en évidence
l’activité uréasique de H. pylori en déposant la biopsie gastrique dans un milieu liquide (tests
« maison », CU test®), semi-solide (CLO test®, HUT test®, etc.) ou sur une membrane
(Pyloritek®) contenant de l’urée et un indicateur de pH. En présence de H. pylori, la
dégradation de l’urée en ammoniaque provoque l’alcalinisation du milieu et donc le
changement de couleur de l’indicateur de pH (Korwin et Lozniewski, 2000). Ce test a une
sensibilité de 80% et une spécificité de 95% (Lamarque, 2000). La sensibilité du TRU est
diminuée en cas de faible densité bactérienne intra gastrique (inférieur à 1000 et 10000
bactéries) ce qui explique qu’il ne peut être utilisé pour le contrôle d’éradication d’H pylori
(Monteiro et Megraud, 1999).
10.1.3. Culture : C’est la méthode de diagnostic la plus spécifique. Elle est la technique de
référence pour affirmer la présence de H. pylori. La culture de cette bactérie à partir des
biopsies gastriques exige un acheminement rapide vers un laboratoire de bactériologie
(moins de 24h) dans un milieu de transport adapté (Biagi, 2002). La culture est réalisée en
pratique courante sur des milieux solides non sélectifs et sélectifs contenant des antibiotiques
pour inhiber les bactéries de la flore buccale. Ces milieux sont incubés à 37 °C 3 à 7 jours,
même jusqu’à 12 jours en atmosphère microaérophile (Korwin et Lozniewski, 2000).
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Revue bibliographique
10.1.4. Examen histologique : Le prélèvement biopsique se fait dans la région antrale à 2
/3 cm du pylore au cours d’une fibroscopie. Les biopsies sont immédiatement fixées dans le
liquide de Bouin ou du formol (Faik, 2000) et colorés par HE (hématoxyline-éosine), le
Giemsa modifiée, le warthin-starry et le cresyl violet. L’examen histologique des biopsies
permet de détecter H.pylori à la surface de la muqueuse gastrique et de typer la gastrite à H
pylori (Stanghellini et Barbara, 2001).
10.1.5. Amplification génique PCR : L’amplification génique par la Polymerase Chain
Reaction (PCR) permet la détection de séquences d’ADN spécifiques de H. pylori dans des
prélèvements gastriques (biopsies, suc, mucus) ou autres (salive, plaque dentaire, selles)
(Korwin et Lozniewski, 2000).Cette méthode est connue pour sa rapidité, sa sensibilité et sa
possibilité de mettre en évidence toutes les formes de H pylori, y compris les formes
coccoїdes non cultivables ou les bactéries mortes (Razafimahefa et al. 2012).
10.2. Méthodes non invasives :
10.2.1. Détection antigénique dans les selles : Un test ELISA appelé Premier Platinum
HpSA (Meridian Diagnostics) a été développé. Il utilise des anticorps polyclonaux anti-Hp
adsorbés sur les cupules d’une microplaque afin de capturer les antigènes de Hp présents
dans un échantillon de selles diluées (Vaira et al. 1999).
10.2.2. Recherche des anticorps sériques : La réponse humorale à l’infection par H.
pylori est caractérisée par la production d’anticorps spécifiques (principalement
immunoglobulines (IgG, IgA, IgM), qui peuvent être détectés dans le sang, le plus souvent
par des méthodes ELISA (Korwin et Lozniewski, 2000).
D’autres techniques que l’ELISA peuvent être utilisées, telle que la technique d’immuno-
blot, l’agglutination par test au latex et la réaction de dot-blot sur papier filtre (Dominique et
De korwin, 2003).
10.2.3. Test respiratoire à l’urée marquée: Cette méthode consiste à mettre en évidence
l’activité uréasique de la bactérie en faisant ingérer au patient de l’urée marquée au 13C. Dans
l’estomac en présence de l'uréase il se produit de bicarbonates et d'ammonium. Sous
l’influence de l’acidité gastrique, les bicarbonates sont transformés en gaz carbonique
absorbé puis transporté aux poumons et expiré (SFED, 2003). La détection du 13CO2 dans
l’air expiré est réalisée par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse,
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Revue bibliographique
par spectrométrie laser ou infrarouge (Korwin et Lozniewski, 2000). Le patient doit être à
jeun, et absorber une solution d’acide citrique (Helikit®) ou de jus d’orange (Helicobacter
test infai®) avec l’urée marquée au 13C principalement afin de retarder la vidange gastrique
et allonger les temps de contact entre l’uréase bactérienne et l’urée 13C (Biomnis, 2008).
11. Traitement anti-Helicobacter pylori:
11.1. Monothérapies:
Les monothérapies proposées comme premier model thérapeutique, testant des
molécules auxquels Helicobacter pylori était sensible in vitro, telles que: amoxicilline;
tétracycline; nitro-imédazolé, clarithromycine et des sels de bismuth (Cayla, 1998).
En fait, malgré la sensibilité de Helicobacter pylori aux nombreux composés in
vitro, avec des concentrations minimales d'inhibition (CMI) inférieures à 1 mg/L, ces
différentes monothérapies sont inéfficases in vivo, un taux d'éradication de Helicobacter
pylori est obtenu de 20 à 40 %. Il est probable que les conditions d'action de ces molécules in
vivo soient profondement modifiées par la localisation de cette bactérie au sein de la couche
du mucus, entourée par un milieu acide formant ainsi une niche écologique protégée d'accés
difficile (Cayla, 1998).
11.2. Bithérapies:
La difficulté rencontré dans l'éradication de la bactérie par de simples
monothérapies et dans la moindre d'éfficacité des antibiotiques en milieu acide oriente les
shémas thérapeutiques vers l'utilisation des combinaisons thérapeutiques de deux
médicaments associant antisécrétoire et antibiotique. Parmi celles-ci, deux ont été
principalemnt testées:
- IPP+ amoxicilline;
- IPP+ clarithromycine.
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Revue bibliographique
D'après les différentes combinaisons étudiées, le schéma optimal obtenu ossociant
un ihibiteur de la pompe à proton à double dose en une prise unique, et la clarithromycine
500 mg (2 fois par jour pendant 2 semaines) (Cayla, 1998). Cependant les effets secondaires
(40%) ainsi que l'efficacité modeste ont limité son utilisation (Olson et al. 1995).
Notant aussi que l'association de la ranitidine-bismuth citrate (RBC) et
monoantibiotique a permis d'obtenir des taux d'éradication relativement comparables à ceux
des bithérapies IPP-antibiotique (Lamouliatte, 1997).
Les bithérapies associant un antisécrétoire et un antibiotique ne permettaient
d'obtenir que des taux d'éradication maximum autour de 60%, paraissent donc nettement
insuffisante pour être utilisées en première intention.
11.3. Trithérapies:
La Conférence de Consensus, (1995) avait recommandé une trithérapie d'une
durée de 7 jours associant un IPP à double dose et deux antibiotiques : IPP-amoxicilline-
clarithromycine ou IPP-métronidazole-clarithromycine. Un troisième schéma associant IPP-
amoxicilline-métronidazole avait été proposé en alternative, en cas d'intolérance ou de forte
prévalence de résistance à la clarithromycine. Les taux d'éradication espérés sur la base des
résultats publiés étaient supérieurs à 90 %. L'association IPP-amoxicilline-clarithromycine
pendant 7 jours est la trithérapie la plus utilisée en France. Les taux d'éradication avec ce
schéma sont de 56 à 84 % en France. Ils sont inférieurs à ceux observés en Europe du Nord
et aux Etats-Unis (82 à 88 %). La même discordance est observée avec l'association IPP-
clarithromycine-métronidazole puisque le taux d'éradication avec ce schéma est de 61 à 70 %
en France et de 61 à 95 % dans les études internationales. L'association IPP-amoxicilline-
métronidazole donne des résultats inférieurs aux autres associations. Ces résultats conduisent
à s'interroger sur les raisons des résultats globalement inférieurs à ceux espérés, sur les
divergences entre les taux d'éradication observés en France et dans les autres pays, et sur les
modifications éventuelles des schémas thérapeutiques qui pourraient être proposées pour
améliorer les résultats.
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Revue bibliographique
11.4. Facteurs d’échecs d’éradication:
Les principales causes d'échec de traitement sont la résistance aux antibiotiques et la
non observance du traitement.
11.4.1. Mauvaise observance du traitement:
Reliée à la lourdeur des thérapies et aux effets secondaires des antibiotiques, la
mauvaise observance semble être une importante cause d’échec de traitement. Graham et al.
(1992) avaient démontré que le taux d’éradication était de 96% pour les patients ayant pris
plus de 60% des médicaments prescrits et 69% pour les patients qui étaient moins assidus.
11.4.2. Résistance aux antibiotiques:
Des cas de résistance de H. pylori ont été décrits pour tous les antibiotiques
proposés pour l’éradication (Vakil et Mégraud, 2007). Le taux de résistance aux
antibiotiques est beaucoup plus élevé en cas d’échec d’éradication (Duck et al. 2004 ;
Koletzko et al. 2006; Agudo el al. 2010) et est proportionnel au nombre de tentatives
infructueuses (Miendje Deyi et al. 2011).
La résistance aux antibiotiques conduit à un échec d’éradication global de 55 à
70% pour la clarithromycine et de 25 à 37% pour le métronidazole (Van der Wouden et al.
1999; Dore et al. 2000; Fischs et al. 2004; Mégraud, 2004). La résistance aux
fluoroquinolones a été associée à une diminution de 66,7% du taux d'éradication (Nishizawa
et al, 2009).
11.4.3. Autres facteurs d’échec d’éradication :
• Durée du traitement (Malfertheiner et al. 2007).
• Tabagisme: le fait de fumer pourrait réduire de moitié l’efficacité d’un traitement
d’éradication (Camargo et al. 2007).
• Nature et posologie des antibiotiques: les autres macrolides sont moins efficaces que
clarithromycine (Calabrese et al. 2000 ; Laurent et al. 2001)
• Age des patients: les données sont fort variables. On note généralement plus de
difficultés d’éradication chez les patients de moins de 50 ans.
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Revue bibliographique
II. Bactéries lactiques
1. Généralités sur les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques sont décrites pour la première fois par Orla Jenson au début
de vingtième siècle. Elles sont des microorganismes utiles à l’homme lui participant à
l’élaboration de nombreux produits alimentaires fermentés. Elles jouent plusieurs rôles
relatifs aux caractéristiques organoleptiques, nutritionnelles et sanitaires de l’aliment (Pilet
et al. 1998). Elles sont considérées comme non pathogènes et se voient attribuer le
qualificatif anglo-saxon d’organismes GRAS (GENERALLY REGARDED AS SAFE)
(Drouault et Corthier, 2001).
Les bactéries lactiques sont des bactéries immobiles et non sporulantes, à Gram
positif qui peuvent avoir des formes en bâtonnets ou en coques. Leur ADN présente un
pourcentage de G + C compris entre 30 et 60% (Stiles et Holzapfel, 1997).
2. Origine des bactéries lactiques:
Les bactéries lactiques ont été retrouvées dans des sédiments datant de 2,75
milliards d’années bien avant l’apparition d’oxygène dans l’atmosphère, ce qui pourrait
expliquer leur caractère anaérobie. De plus, des études sur la phylogénie bactérienne
mentionnent leur apparition avant celle des cyanobactéries (Quiberoni et al. 2001).
3. Taxonomie et diversité:
3.1. Taxonomie des bactéries lactiques:
Depuis la description du Bacterium lactis (actuellement Lactococcus lactis), la
taxonomie des bactéries lactiques est en évolution permanente. Le nombre de nouvelles
espèces a augmenté énormément au cours de ces dix dernières années. Les réorganisations
effectuées ont contribué à fusionner des espèces en une seule, ou identifier une espèce
comme un nouveau genre (Pot, 2008). La classification des bactéries lactiques peut se faire
selon des critères phylogénétiques par l’utilisation des méthodes moléculaires. Cependant, la
caractérisation phénotypique /biochimique classique demeure pratique dans l’identification
préliminaire des microorganismes. Certaines caractéristiques phénotypiques sont utilisées
pour identifier les espèces à l'intérieur des genres comme la capacité à : fermenter les
hydrates de carbone, tolérer différentes concentrations en bile, produire des polysaccharides
extracellulaires, exiger des facteurs de croissance, produire de l’acétoïne et synthétiser
certaines enzymes. La composition en G+C de l’ADN et la composition en acides gras, sont
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Revue bibliographique
également d'autres critères qui peuvent être étudiés pour l'identification des espèces lactiques
(Vandamme, 1996 ; Stiles et Holzopfel, 1997 ; Ho et al. 2007).
La morphologie est considérée comme la caractéristique clé pour décrire et
classifier les genres des bactéries lactiques. De ce fait, les bactéries lactiques peuvent être
divisées arbitrairement en bacilles et coques. Le genre Weissella, récemment décrit, est le
seul genre qui comporte à la fois des bacilles et des coques (Collins et al. 1993 ). A ce
groupe de bactéries lactiques, appartient plusieurs genres comme Aerococcus,
Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Stiles et
Holzapfel, 1997 ; Pot, 2008). Le genre Bifidobacterium est actuellement considéré par
plusieurs auteurs comme genre de bactéries lactiques, bien qu’il se distingue par un
pourcentage en G+C de 55%, largement supérieur à celui des autres genres et par une voie
métabolique de fermentation des sucres particulière. Les études phylogénétiques basées sur
l’analyse des séquences des ARN ribosomiques ont confirmé l’appartenance de ces différents
genres à un même groupe qui inclut également Propionibacterium (Figure14) (Stiles et
Holzopfel, 1997 ; Pilet et al. 2005).
Fig. 14 : Arbre phylogénétique des principaux genres de bactéries lactiques et des genres
associés, obtenu par analyse des ARNr 16S (Stiles et Holzapfel, 1997).
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Revue bibliographique
3.2. Diversité des bactéries lactiques:
3.2.1. Genre Lactobacillus:
Le Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae, il
contient de nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactique intervenant dans
de nombreuses industries ou qui sont rencontrées comme contaminants. Il s’agit de bacilles
longs et fins, parfois incurvés, souvent groupés en chaînes, immobiles, asporulés, dépourvus
de la catalase et se développent à un optimum de température situé entre 30 et 40°C. Les
lactobacilles ont des exigences nutritionnelles très complexes en acides aminés, en vitamines,
en acides gras, en nucléotides, en glucides et en minéraux (Khalid et Marth, 1990 ; Leclerc
et al. 1994).
Le genre Lactobacillus a été subdivisé par Orla-Jensen en trois groupes et cette
classification est encore utilisée en milieu industriel (Tamime, 2002 ; Guiraud et Rosec,
2004) :
Groupe I « Thermobacterium » : comprend les lactobacilles homofermentaires thermophiles
qui se développent à 45°C mais pas à 15°C. Les espèces les plus fréquentes dans le lait et
produits laitiers sont Lb. helveticus, Lb. delbrueckii, Lb. acidophilus.
Groupe II « Streptobacterium » : regroupe les lactobacilles homofermentaires mésophiles et
peuvent être occasionnellement hétérofermentaires en fonction du substrat. Les espèces les
plus fréquentes dans l’alimentation sont Lb. casei, Lb. curvatus, Lb. sake et Lb. plantarum.
Groupe III « Betabacterium » : ce sont des lactobacilles hétérofermentaires. Il comporte les
espèces Lb. fermentum, Lb. brevis et Lb. sanfransisco.
3.2.2. Genre Lactococcus:
Le genre Lactococcus (streptocoque du groupe N) représente les streptocoques dits
« lactiques », car ils sont associés à de nombreuses fermentations alimentaires et ne
possèdent aucun caractère pathogène. Les produits végétaux constituent leur réservoir
principal, mais ils sont largement présents dans le lait et les produits laitiers (Pilet et al.
2005). Les lactocoques se présentent sous forme de coques en paire ou en chaînes de
longueur variable. Ce sont des bactéries anaérobies facultatives homofermentaires ne
produisant que de l’acide lactique L(+), seul Lactococcus lactis subsp. lactis biovar.
diacetylactis produit le diacétyle. Leur température optimale de croissance est proche de
30°C, capable de se développer à 10°C mais pas à 45°C. Quelques espèces produisent des
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Revue bibliographique
exopolysaccharides et des bactériocines. Elles sont capables de se développer à 3% de bleu
de méthylène et d’hydrolyser l’arginine (Tamime, 2002). Actuellement, le genre
Lactococcus comprend cinq espèces, Lactococcus lactis est l’espèce la plus connue avec ses
trois sous-espèces : Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris et Lc. lactis
subsp.hordniae (Pot et al. 1996 ; Pot, 2008).
3.2.3. Genre Streptococcus:
Le genre Streptococcus est généralement divisé en trois groupes : pyogène (la plus
part des espèces pathogènes et hémolytiques), oral (tel que St. salivarius, St. bovis) et les
autres streptocoques (Scheilfer, 1987). La seule espèce de streptocoques utilisée en
technologie alimentaire est Streptococcus thermophilus qui a été inclue dans le groupe des «
autres streptocoques », mais ensuite transféré au groupe des streptocoques oraux à cause de
leur degré d’homologie avec l’ADN de Streptococcus salivarius (Stiles et Holzapfel, 1997).
Streptococcus thermophilus se différencie par son habitat (lait et produits laitiers) et son
caractère non pathogène. La résistance à la température, la capacité de croitre à 52°C et le
nombre limité des hydrates de carbones permettent de distinguer St. thermophilus de la
plupart des autres streptocoques (Haddie, 1986 ; Pilet et al. 2005).
3.2.4. Genre Enterococcus:
Les entérocoques sont des coques homofermentaires, généralement différenciés par
la fermentation de l’arabinose, ils croissent entre 10°C et 45°C, leur aptitude à croitre en
présence de 6,5% de NaCl, et à pH 9 (Tamime, 2002 ; Ho et al. 2007).
3.2.5. Genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella:
Ils ressemblent les coques lenticulaires en paires ou en chainettes mésophiles, qui
possèdent un caractère hétérofermentaire marqué, avec production d’acide lactique (isomère
D), de CO2 et d’éthanol. Les caractéristiques telles que l’hydrolyse de l’esculine, la
formation de dextrane, les conditions de croissance, la capacité à croître à différents pH et
température, l’assimilation de citrate et/ou malate permettent la différenciation entre les
genres Leuconostoc et Weissella (Pilet et al. 1998 ; Ho et al. 2007).
Actuellement, le genre Leuconostoc comprend quatorze espèces, ils sont également
anaérobies facultatifs et exigeants au point de vue nutritionnel et leur croissance est toujours
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Revue bibliographique
lente. Le développement des leuconostoc entraîne souvent l’apparition d’une viscosité dans
le milieu grâce à la production des exopolysaccharides. Les leuconostoc principalement Ln.
mesenteroides ssp.cremoris et Ln. lactis sont utilisés en association avec les lactocoques dans
l’industrie laitière pour produire en plus de l’acide lactique et le CO2, des substances
aromatiques telles que le diacétyle et l’acétoïne à partir des citrates du lait (Hassan et
Frank, 2001 ; Guiraud, 2003 ; Ogier et al. 2008). Une espèce Leuconostoc oenos isolée de
vins a été classée dans un nouveau genre, Oenococcus oeni et certaines espèces de
lactobacilles hétérofermentaires ont été groupées avec Leuconostoc paramesenteroides dans
le nouveau genre Weissella (Stiles et Holzapfel, 1997).
3.2.6. Genres Pediococcus et Tetragenococcus:
Les Pediococcus sont des coques homofermentaires dont la particularité est le
regroupement en tétrade. Ils sont mésophiles, le plus souvent incapable d’utiliser le lactose,
et leur développement nécessite la présence de divers facteurs de croissance. Certaines
espèces se distinguent par leur capacité à se développer à des teneurs en sels très élevées,
comme Pediococcus halophilus, renommé Tetragenococcus halophilus et Tetragenococcus
muriaticus qui tolère jusqu’à 18% de NaCl (Pilet et al. 2005). Les espèces de
Tetragenococcus ont un rôle crucial dans la fabrication des produits alimentaires à
concentration élevée en sel comme les sauces de soja, alors que les pediocoques sont parfois
utilisés comme levains lactiques pour les charcuteries (Guiraud et Rosec, 2004 ;
Tosukhowong et al. 2005).
3.2.7. Genre Bifidobacterium:
Le genre Bifidobacterium est considéré comme faisant partie du groupe des bactéries
lactiques grâce à la similarité de ses propriétés physiologiques et biochimiques et à sa
présence dans le même habitat écologique, tel que le tube gastro-intestinal. Ces
microorganismes sont phylogénétiquement sans rapport avec ces dernières. Ils sont
davantage liés au phylum Actinobacteria (anciennement Actinomycètes) des bactéries Gram
positif dont l’ADN est à haut pourcentage de G +C. Les bifidobactéries se caractérisent par
leur forme très irrégulière souvent en forme V mais pouvant être coccoïdes, la présence d'une
enzyme, la fructose-6-phosphate phosphocétolase, celle-ci leur permet de fermenter les
hexoses en produisant de l'acide acétique et de l'acide lactique. Leur température de
croissance varie de 36°C à 43°C (Axelsson et al. 2004 ; Pilet et al. 2005 ; Ho et al. 2007).
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Revue bibliographique
4. Habitat:
Les bactéries lactiques sont présentes à l’état libre dans l’environnement ou vivent
en association avec un hôte, tel que l’Homme ou l’animal, dans un écosystème bactérien
comme le tractus gastro-intestinal ou génital des mammifères (Klein et al. 1998).
4.1. Présence des bactéries à l’état libre dans l’environnement:
Dans l’environnement, les bactéries lactiques sont souvent retrouvées dans le lait et
ses dérivés (lait fermenté, fromages, …). Les différentes espèces de
Lactobacillus,Lactococcus lactis (Lc. lactis) et/ ou Lc. garvieae, les plus rencontrées dans le
lait et le fromage, sont communément utilisées comme ferments (« starter culture ») par
l’industrie agroalimentaire pour la production de produits laitiers. Aussi, les bactéries
lactiques sont à l’origine de la fermentation utilisée pour la préparation de boissons à partir
de plantes (boza, cidre, …). Parmi elles, on distingue des espèces appartenant aux genres
Lactobacillus et Leuconostoc (Gálvez et al. 2011). Acidotolérantes, les bactéries lactiques
sont capables de survivre dans des milieux très acides en raison de leur production d’acide
lactique (Gálvez et al. 2011).
4.2. Présence des bactéries lactiques en association avec un hôte:
Les bactéries lactiques peuvent vivre en symbiose entre elles et avec un hôte. Le
tractus gastrointestinal des mammifères est colonisé par des bactéries lactiques telles que
Bifidobacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, et Weisseilla. Par ailleurs, l’appareil génital
chez la femme est principalement colonisé par des bactéries lactiques, telles que
Lactobacillus, auxquelles il apporte des nutriments comme le glycogène. En acidifiant le
milieu, ces bactéries apportent une protection contre des pathogènes responsables
d’infections vaginales comme Trichomonas vaginalis (Björkroth et Holzapfel, 2006, Ruiz
et al. 2009).
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Revue bibliographique
5. Métabolisme fermentaire:
5.1. Métabolisme des sucres:
Les bactéries lactiques utilisent principalement l’une des deux voies majeures du
métabolisme des sucres (Figure 15) (De Roissart et Luquet, 1994) :
5.1.1. Voie homofermentaire ou EMP :
Ils convertissent presque quantativement le glucose en acide lactique (90 à 95%).
Une des enzymes clé de la glycolyse est le fructose 1-6 diphosphate aldolase, cette enzyme
est présente dans toutes les espèces homofermentaires (Streptocoque, Enterocoque,
Lactocoque, Pediocoque et Lactobacille). C’est une enzyme qui transforme le fructose
biphosphate en triose phosphate. Les bactéries homolactiques contiennent habituellement
une forte concentration en fructose diphosphate (FDP). Cette molécule importante pour la
régulation sert d’activateur de la synthèse des enzymes terminales de la voie glycolytique
(pyruvate kinase et lactate déshydrogénase). En dehors du glucose, les bactéries
homolactiques ont la capacité de fermenter d’autres mono ou disaccharides. Ces molécules
pénètrent dans la cellule par l’intermédiaire de système phosphotransférase ou sous forme
libre par l’intermédiaire d’un système perméase mais la voie de l’EMP est la voie principale
de dégradation des dérivés phosphoryles.
Glucose + 2Pi + 2ADP 2Lactate + 2ATP.
5.1.2. Voie hétérofermentaire ou PPC (pentose phosphocétolase) :
Les bactéries lactiques appartenant à cette classe sont les leuconostocs et certains
lactobacilles. Elles sont également dépourvues d’un système phosphotransférase PEP pour le
glucose. Avec ces bactéries le glucose est accumulé par l’intermédiaire d’un transport actif
puis est phosphorylé par une glucokinase ATP dépendante. Le glucose 6p est transformé en
acide 6p gluconique puis décarboxylé en 5p avec libération de CO2. Ce pentose phosphate
est métabolisé en triose phosphate et en acétyl-P. Enfin l’acétyl-P est réduit en éthanol et le
triose phosphate est métabolisé en acide lactique par les dernières réactions de la voie EMP:
Glucose + Pi + ADP Lactate + ATP + CO2 + éthanol.
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Revue bibliographique
43
Revue bibliographique
5.2. Métabolisme azoté:
De fait de leurs nombreuses auxotrophies pour les acides aminés, la croissance des
bactéries lactiques repose sur leur système protéolytique. Ces systèmes comportent des
protéases intracellulaires, des systèmes de transport spécifiques pour les peptides et une
multitude de peptidases intracellulaires. Les systèmes protéiques des lactocoques et des
lactobacilles sont remarquablement similaires, en ce qui concerne leurs composants et leurs
modes d’action (Law et Haandrikman, 1997 ; Savijoki et al. 2006). Les études du système
protéolytique ont été menées essentiellement pour le genre Lactococcus et ont permis
l’établissement d’un modèle de la protéolyse en trois étapes (Figure 16): la première étape
fait intervenir une protéase ancrée à la surface bactérienne, appelée protéase de paroi (ou
PrtP). Les peptides sont pris en charge par deux systèmes de transport des oligopeptides
(Opp et Opt) pour traverser l’enveloppe bactérienne. Des di et tripeptides peuvent aussi être
transportés par deux autres systèmes (DtpT et Opt). Les acides aminés sont transportés par
des systèmes de transport spécifiques. Enfin, dans le cytoplasme bactérien un éventail de
peptidases concourent à achever l’hydrolyse des peptides en acides aminés (Savijoki et al.
2006 ; Atlan et al. 2008 ; Picon et al. 2010). Le catabolisme des acides aminés est une voie
majeure de formation de molécules aromatiques (alcool, aldéhydes, acides organiques, …),
comme il peut être une source d’énergie pour certaines bactéries lactiques en cas de
limitation en nutriments (Williams et al. 2001).
Fig. 16 : Schéma du système protéolytique de Lactococcus lactis (Atlan et al. 2008).
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Revue bibliographique
6. Besoins nutritionnels :
Les bactéries lactiques ont une faible aptitude biosynthétique et sont en principe
incapables d’assimiler directement les principaux précurseurs de leur environnement. Elles
requirent non seulement des substrats complexes carbonés, azotés mais aussi des facteurs de
croissance comme les vitamines et les oligoéléments dont le rôle des coenzymes est plus
important (Lenoir et al. 1992).
→ Vitamines : jouent un rôle primordial dans le métabolisme cellulaire. Les bactéries
lactiques sont incapables de synthétiser des vitamines d’où l’importance d’un apport exogène
en vitamines au milieu de culture (Desmazaud et De Roissart, 1994).
→ Ions : ont une fonction de cofacteur pour de nombreuses enzymes, en effet le fer est un
élément important puisqu’il y a des affinités pour un grand nombre de molécules chelatrices.
Il augmente la croissance et la production d’acide lactique pour les lactocoques ainsi le
calcium et magnésium exercent un effet crucial dans le métabolisme énergétique, le sodium
exerce un effet sélectif sur différentes espèces des bactéries lactiques (Boyaval, 1989).
7. Devenir des bactéries lactiques ingérées :
L’étude de la survie des bactéries lactiques dans le tractus gastro-intestinal est
importante pour une meilleure connaissance du devenir des bactéries lactiques ingérées avec
l’aliment et une meilleure compréhension de l’action des probiotiques chez l’homme et
l’animal. Il est probable que pour exercer un effet probiotique significatif, les bactéries
doivent arriver vivantes et en nombre suffisant dans l’intestin (Drouault et Corthier, 2001).
Deux techniques peuvent être utilisées : la collection des selles et l’intubation intestinale
(Marteau et al. 1992 ; Rambaud et al. 1993).
7.1. Elimination des bactéries lactiques ingérées :
Les bactéries ingérées sont généralement excrétées dans les selles pendant quelques
jours après leur ingestion à la même vitesse qu’un marqueur de transit (Bouhnik et al. 1992).
Le pourcentage de survie des bactéries dans les selles après consommation varie de 1à 5%
excepté pour Bifidobacterium et Lb.plantarum atteignent environ 25 à 30% de survie par
contre la survie dans les selles des bactéries lactiques du yaourt Sc.thermophilus et
Lb.bulgaricus est très faible avec des quantités inférieurs au seuil de détection (Drouault et
Corthier, 2001).
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Revue bibliographique
7.2. Survies des bactéries lactiques dans la lumière intestinale :
L’intubation intestinale est la meilleure technique pour obtenir des échantillons
humains ou animaux à partir des différents segments du tractus gastro-intestinal dont laquelle
on détermine non seulement les concentrations en bactéries mais également leur débit dans
un compartiment bien précis du tractus digestif, à ce jour un petit nombre de bactéries
lactiques ont été étudiés leur survie dans l’intestin grêle (Tableau I).
Tableau I: Pourcentage de quelques bactéries d’origine alimentaire dans l’intestin grêle
humain
Bactéries lactiques Taux de survie Site de
récupération
Source
Lb.plantarum
NCIMB 8826
Lb.fermentum kld
Lc.lactis mg 1363
7
0.5
1
Iléon
Iléon
Iléon
Vesa et al. 2000
B.bifidum
Lb.acidophilus
Bifidobacterium sp
37.5
1.5
23.5
Iléon
Iléon
Iléon
Marteau et al. 1992
Lb.bulgaricus
Sc.thermophilus
> 1
> 1
Duodénum
Duodénum
Pochart et al. 1989
8. Critères de sélection des bactéries lactiques comme probiotiques :
Les probiotiques sont généralement définis en tant que microorganismes vivants
exerçant une action bénéfique sur la santé de l’hôte qui les ingère en améliorant l’équilibre
de la flore intestinale (Fuller, 1989). Les probiotiques doivent répondre à certains exigences
avant d’être à même de produire un effet bénéfique :
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Revue bibliographique
8.1. Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques:
Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l’espèce ou la
souche microbienne. Il est nécessaire de connaître le genre et l’espèce de la souche utilisée
car les effets probiotiques sont spécifiques à la souche microbienne. La non pathogénicité
des souches est un critère très important, les souches ayant le statut GRAS (Generally
Regarded As Safe) sont d'ailleurs à favoriser. Toutefois, le critère de viabilité ou de survie
demeure essentiel dans la sélection des probiotiques qui doivent parvenir vivantes au site de
leur action, à savoir l’intestin, et donc résister aux différents mécanismes de défense de
l’hôte. Les bactéries étant administrées par voie orale, il faut qu’elles franchissent les
obstacles majeurs du transit digestif : le pH acide, les sels biliaires, les enzymes
pancréatiques…etc (Percival, 1997 ; Lamoureux, 2000 ; Millette et al. 2008).
8.1.1. Résistance à l'acidité gastrique:
La survie des bactéries dans le suc gastrique dépend de leur capacité à tolérer les
bas pH. Le temps de passage peut être d’une heure à quatre heures selon l'individu et son
régime. Par conséquent, quelques auteurs proposent que les souches probiotiques doivent
résister à un pH de 2.5 dans un milieu de culture pendant quatre heures (Ammor et Mayo,
2007).
8.1.2. Résistance aux sels biliaires:
Dans l'intestin grêle, la tolérance aux sels biliaires est un facteur important qui
contribue à la survie des probiotiques. Les bactéries qui survivent aux conditions acides de
l'estomac doivent alors faireface à l’action détergente des sels biliaires libérés dans le
duodénum après ingestion des repas gras. Les bactéries peuvent réduire l’effet émulsifiant
des sels biliaires en les hydrolysant avec des hydrolases, de ce fait diminuant leur solubilité
(Ammor et Mayo, 2007 ; Gu et al. 2008).
8.1.3. Adhésion aux cellules épithéliales:
La capacité d’adhésion à la couche intestinale est un critère de sélection
recommandé pour le choix des probiotiques, parce que c'est une condition pour la
colonisation des entrailles. L'adhérence constitue le premier mécanisme de défense contre
l’invasion des bactéries pathogènes. Elle est basée sur la réalisation d’un ensemble de tests in
vitro puis in vivo en utilisant des cellules d’origine animale et/ou humaine (Palomares et al.
2007 ; Reyes-Gavilan et al. 2011). 47
Revue bibliographique
En plus du pouvoir d’adhésion aux cellules épithéliales de l'intestin, les probiotiques
peuvent se fixer au mucus qui recouvre les enthérocytes ou aux divers microorganismes que
l'on retrouve dans le tractus gastro-intestinal (Lamoureux, 2000).
8.1.4. Production de substances antimicrobiennes:
Les bactéries lactiques synthétisent des molécules à action
bactéricide/bactériostatique comme les acides organiques, le peroxyde d’hydrogène, le
dioxyde de carbone, le diacétyle et les bactériocines. Ces mécanismes antimicrobiens ont été
exploités pour améliorer la préservation des aliments (Titiek et al. 1996 ; Labioui et al.
2005).
8.1.5. Résistance aux antibiotiques:
Les bactéries lactiques sont naturellement résistantes à beaucoup d’antibiotiques
grâce à leur structure et physiologie. Les travaux de Temmerman et al. (2003) ont montré
que 68.4% des probiotiques isolés ont une résistance à un antibiotique ou plus. Des souches
de Lactobacillus ont été trouvées résistantes à la kanamycine (81%), à la tétracycline
(29.5%), à l’érythromycine (12%) et au chloramphénicol (8.5%). 38% des isolats de
Enterococcus faecium ont été trouvés résistants à la vanomycine.
Dans la pluspart des cas la résistance n’est pas transmissible, cependant, il est
possible que le plasmide codant pour la résistance aux antibiotiques soit transféré à d’autre
espèces et genre. C'est une raison significative pour choisir des souches manquantes du
potentiel de transfert de résistance (Denohue, 2004).
Les autorités européennes ont récemment conclu que quelques bactéries utilisées
pour la production d’aliment pourraient poser un risque à la santé humaine et animale en
raison d'héberger des souches avec les gènes de résistance transmissibles. Par conséquent,
avant de lancer une culture probiotique, il est important de vérifier que les souches
bactériennes impliquées ne comportent pas de gènes transmissibles de résistance aux
antibiotiques (Ammor et Mayo, 2007).
48
Revue bibliographique
8.1.6. Critères technologiques:
En plus de l’innocuité et des propriétés fonctionnelles, des critères technologiques
sont également pris en considération dans la sélection des souches probiotiques. Selon
Saarela et al. (2000), ces critères sont :
- Bonnes propriétés sensorielles ;
- Résistance aux phages;
- Viabilité durant le traitement technologique ;
- Stabilité dans le produit et durant le stockage.
8.2. Effets des probiotiques sur la santé:
Les probiotiques sont des microorganismes vivants, qui lorsqu'ils sont ingérés en
quantité suffisante, exercent un effet bénéfique sur la santé de l'hôte (FAO/OMS, 2001).
Consommés depuis des centaines d’années, les produits laitiers ont toujours été considérés
comme source de santé et de longévité, dans le Caucase et au Moyen-Orient. Ce n’est qu’à
partir du XXe siècle, qu’Elie Metchnikoff évoqua une éventuelle relation entre la longévité
de certaines populations et leur consommation de grandes quantités de lait fermenté. Plus
tard, il isola deux espèces bactériennes Streptococcus salivarius subsp. thermophilus et Lb.
delbrueckii subsp. bulgaricus auxquelles il attribua les bienfaits de « longue vie ». Ce n’est
qu’en 1954, que le terme « probiotique » a été pour la première fois introduit dans la
littérature par Ferdinand Vergin. Les produits à base de laits fermentés sont considérés
depuis de nombreuses années comme bénéfiques pour la santé humaine. Certaines espèces
bactériennes ont le pouvoir d’améliorer la valeur nutritionnelle des aliments et les conditions
générales de santé de l’homme en prévenant et en contrôlant les infections intestinales et
diverses maladies comme le cancer, l’intolérance au lactose, la constipation,etc…(Gournier-
Château et al. 1994). De nombreux microorganismes sont considérés comme probiotiques,
parmi eux des bactéries lactiques telles que Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium
breve,Bifidobacterium longum, Lb. acidophilus, Lb. bulgaricus, Lb. casei, et Streptococcus
thermophilus (Str. thermophilus). Lb. bulgaricus et Str. thermophilus sont les premières
souches bactériennes qui ont été utilisées pour la fabrication de yaourt (Tableau II).
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Revue bibliographique
D’autre part, des levures comme S.boulardii et S. cerevisiae, communément
utilisées dans la fabrication du pain, de la bière et du kéfir, sont également reconnues pour
leurs propriétés probiotiques. S. boulardii a été isolée pour la première fois à partir de fruits
de litchis et de mangoustans par le scientifique Français Henri Boulard en 1923. Il a été
démontré, plus tard, que S. boulardii permet la restauration de la flore du gros intestin après
des diarrhées causées par Vibrio cholerae (Dias et al. 1995).
8.2.1. Amélioration de la digestion de lactose:
Il est bien établi que le yaourt a des effets positifs sur le mal digestion du lactose
dans le cas de déficiences primaires et secondaire en lactase (Drouault et Corthier, 2001).
Ce disaccharide, présent exclusivement dans le lait et ses dérivés. Chez les personnes
souffrant d’intolérance au lactose, un déclin de la production de cette enzyme est observé au-
delà de la petite enfance. La deuxième cause d’intolérance (intolérance secondaire) est
représentée par les maladies dont la conséquence est une réduction de la surface de
digestion-absorption intestinale ou une accélération du transit jéjunal, comme les résections
intestinales, les gastro-entérites, la maladie cœliaque ou les gastrectomies. Plusieurs études
ont montré que le β-galactosidase participe à la digestion du lactose dans l’intestin (Marteau
et al. 1990; Marteau et al. 2001). Il a été démontré que les bactéries qui survivaient dans
l’intestin gardent une activité métabolique suffisante pour hydrolyser le lactose (Drouault et
al. 1999), et que celles dont la membrane est facilement lyser par des acides biliaires
libéraient leur lactase dans l’intestin (Marteau et al. 1990).
8.2.2. Réduction du taux de cholestérol :
Plusieurs études ont montré que la consommation de yaourt ou de lait fermenté
contenant des probiotiques entraîne une diminution du taux de cholestérol dans le sang, et
par conséquent la réduction des risques d’hypercholestérolémie responsable des maladies
coronariens (Dilmi Bouras, 2006). Modler et al. (1990) ont montré que les bactéries
lactiques produisant de l’hydroxyméthylglutarate, qui inhibe l’enzyme
l’hydroxyméthylglutaryl-réductase intervenant dans la synthèse du cholestérol.
L’administration de laits fermentés contenant une grande quantité de Bifidobacterium
(109UFC/g) à des patients ayant un taux de cholestérol élevé permet de diminuer la quantité
de cholestérol de 3à 1,5g/l (Gournier- Château et al. 1994).
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Revue bibliographique
8.2.3. Cancérogenèse:
D'après Rowland et al. (1998); Naito et al. (2007): La flore colique pourrait être
impliquée dans la cancérogenèse. Cet effet serait médité par des enzymes bactériennes qui
activent des procarcinogènes en carcinogènes. Des expériences menées avec des modèles
animaux et chez l’homme ont montré que plusieurs bactéries probiotiques pouvaient
diminuer les taux d’enzymes responsables de l’activation de certaines procarcinogénes tels
que la β- glucuronidase, la β-galactosidase, l’azoréductase, ou encore la nitroréductase.
8.2.4. Réduction du risque de diarrhée:
Les souches probiotiques Lb. acidophilus et Lb. casei, qu'on retrouve entre autres
dans le lait fermenté Bio-K+®, ont fait l'objet d'études montrant leur efficacité contre la
diarrhée associée à la prise d'antibiotiques en milieu hospitalier (Kelleher et al. 2002;
Penner et al. 2005a). Plusieurs types des diarrhées sont dus à des infections microbiennes.
Des effets protecteurs de souches probiotiques contre certaines infections intestinales ont été
observés sur des modèles animaux. Les mécanismes potentiellement impliqués incluent la
production d’acide, de peroxyde d’hydrogène, d’autres substances antimicrobiennes telles
que les bactériocines, la compétition pour de nutriments ou des récepteurs d’adhésion, des
actions antitoxines et de la stimulation du système immunitaire (Gill, 2003). Plusieurs
études randomisées contrôlées sur l’homme ont montré l’efficacité des souches probiotiques
pour prévenir ou atténuer les perturbations digestives liées à la prise d’antibiotiques
(Gremonini et al. 2002 ; Fooks and Gibson, 2002 ; Hickson et al. 2007).
8.2.5. Effets sur le système immunitaire :
Des études ont montré que l'ajout des probiotiques compact certaines effets de
l’affaiblissement du système immunitaire et en particulier renforce l’activité des cellules
naturelles (Gill et al. 2001). En outre, l’interaction d’adhésion des probiotiques à la surface
mucosale facilité le contact avec le médiateur local du tissu lymphoïde. L’association de ce
dernier à l’intestin déclenche l’immunisation de tout le système et la stabilisation de la
fonction barrière du mucus (Salminen et Salminen, 1997). Ce système fonctionne en
provoquant une augmentation de la production des IgA, IgG, IgM, cytokines anti-
inflammatoires, interleukines et interférones (Attouri et Lemonier, 1997).
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Revue bibliographique
8.2.6. Infection par Helicobacter pylori:
Selon Reid et al. (2003b), Helicobacter pylori est une bactérie impliquée dans la
survenue et les récidives des gastrites et ulcères gastro-duodénaux. Des travaux réalisés in
vitro et in vivo indiquent que les bactéries lactiques peuvent inhiber la croissance de
Helicobacter pylori et diminuer l’activité uréasique nécessaire pour que l’agent pathogène
reste dans le milieu acide de l’estomac (FAO/OMS, 2001).
Tableau II: Exemples de souches probiotiques dans des produits (WGO, 2008).
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III. Bactériocines
1. Définition des bactériocines:
Les bactériocines sont définies comme des molécules sécrétées par les bactéries, de
nature protéique ou peptidiques et douées d'une activité antagoniste vis-à-vis des souches
phylogénétiquement proches des souches productrices. Leur synthèse par voie ribosomique,
les différencie des antibiotiques de nature peptidique provenant de l'assemblage enzymatique
d'acides aminés libres (Cenatiempo et al. 1996). Deux grands groupes de bactériocines
peuvent être distingués avec, d'une part, les bactériocines produites par des bactéries à Gram
négatif, et d'autre part, celles produites par les bactéries à Gram positif et notamment les
bactériocines de bactéries lactiques.
La découverte des bactériocines remonte à 1925 quand GRATIA appela "colicines"
des substances antibactériennes sécrétées par E. coli. Des substances semblables sécrétées
par des bactéries à Gram positif ont été découvertes. Elles ont été appelées « bactériocines ».
II a été rapporté pour la première fois par Rogers en 1928, qu'une substance antimicrobienne
produite par Lactococcus lactis subsp. lactis avait une activité inhibitrice sur Lactobacillus
delbruckii subsp. bulgaricus.
La nature protéique de cette substance a été identifiée par Hirch en 1951 qui
l'appela nisine. "n" désigne les streptocoques de groupe N selon la classification de
Lancefield (1993) "is" est l'abréviation de « Inhibitory Substances » et "ine" désigne une
bactériocine (De Vuyst et Vandamme ,1994).
La production d'une bactériocine peut être considérée comme une façon d'éliminer
des bactéries envahissantes qui font compétition à la bactérie productrice pour les nutriments.
Le spectre d'activité d'une bactériocine se définit comme étant la diversité des bactéries
sensibles à l'action bactéricide ou bactériostatique du peptide. On a d'abord attribué aux
bactériocines un spectre d'activité limité aux bactéries taxinomiquement proches de la
bactérie productrice. Certaines bactériocines possèdent un large spectre d'activité qui inclut
des bactéries éloignées au point de vue phylogénétique (Lachance, 2000). Des critères ont
été établis pour définir les bactériocines :
53
Revue bibliographique
• Ce sont des protéines ayant une activité bactéricide et pas seulement
bactériostatique ;
• Elles ont des sites de liaisons spécifiques dans la membrane des bactéries cibles ;
• Leur synthèse est associée à la synthèse d'une protéine d'immunité qui évite de
provoquer la mort de la cellule excrétrice (Troupel, 2009).
2. Classification des bactériocines:
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont réparties en quatre
classes reposant sur les structures et les mécanismes d’action (Klaenhammer, 1993). Cette
classification a été modifiée actuellement par l’ajout de sous-classes (Nes et al. 1996 ; Diep
et al. 1996) :
2.1. Classe I : Les lantibiotiques :
Les lantibiotiques sont des petits peptides de taille inférieure à 5 kDa, stables à la
chaleur (Dortu et Thonart, 2009) ; hydrophobes qui agissent au niveau de la membrane et
contiennent des acides aminés non usuels (Klaenhammer ,1993).
La structure des lantibiotiques varie essentiellement en fonction de la localisation de
ponts établis entre les acides aminés modifiés ce qui permet de distinguer les types A
(lantibiotiques linéaires) et B (lantibiotiques globulaires) (Moriss et al. 2005).
Les lantibiotiques sont des peptides antimicrobiens synthétisés par voie ribosomique
et subissant des modifications post-traductionnelles importantes. Ils se distinguent des autres
bactériocines, par la présence de résidus lanthionine et 3’-méthyllanthionine. La lanthionine
et la 3’-méthyllanthionine, résultent respectivement de la formation d’un pont thioéther entre
une cystéine libre et un acide aminé déshydraté, la didéhydroalanine (Dha) et la 2, 3-
didéhydrobutyrine (Dhb). La Dha et la Dhb sont respectivement formées par déshydratation
de la sérine et de la thréonine.
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Revue bibliographique
2.1.1. Type A:
Le type A rassemble les lantibiotiques linéaires et cationiques structurés en hélice
alpha-amphiphile et de masse moléculaire < 4 kDa. Ces peptides présentent des similitudes
d’arrangement de leurs ponts « lantionine ». Ces bactériocines sont synthétisées par les
genres Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, et également par des Bacillus. Les
bactériocines les plus étudiés de cette classe sont la nisine produite par Lc lactis,
l’épidermine produite par Staphylococcus epidermis et la subtiline produite par Bacillus
subtilis (Mc Auliffe et al. 2001). Les lantibiotiques de type A puissent être subdivisés en
deux sous groupes (I et II) en fonction des parties Leaders des peptides (Moriss et al. 2005):
Type A I : Le leader peptide est hydrophile, possède une grande proportion d’acides aminés
chargés avec une région très conservé et a une nette charge négative ou légèrement positive
(ex : nisine A).
Type A II: Le leader peptide est chargé négativement (ex : lacticine 481)
2.1.2. Type B:
Molécules globulaires de masse moléculaire varie de 1.8 à 2.1 kDa (ex :
mersacidine) (Chen et Hoover, 2003), plus rigides que les peptides de type A et ayant une
charge globalement nulle ou négative. Ces molécules agissant en inhibant certaines enzymes
comme celles intervenant dans la biosynthèse de la paroi cellulaire. Cette sous-classe de
lantibiotiques regroupe les duramicines et leurs variants naturelles (l’ancovinine et la
cinnamycine), la mersacidine, l’actagardine et la mutacine A (Moriss et al. 2005).
2.2. Classe II: Peptides non modifiés :
Ce Sont des peptides de taille inférieure à 10 kDa, stables à la chaleur, ne contenant
pas d’acides aminés modifiés (Dortu et Thonart, 2009). Elle correspond à une plus grande
variété de structures, ce qui nécessite la création de plusieurs sous groupes (Chen et Hoover,
2003).
55
Revue bibliographique
La classe II forme un groupe relativement hétérogène de peptides de masses
moléculaires < 10 kDa. Contrairement aux lantibiotiques, les bactériocines de classe II ne
présentent pas de modifications post-traductionnelles. La classe II peut être subdivisée en:
Sous-classe IIa : Bactériocines anti-listeria « pediocin-like » (ex : pédiocinePA-Les
bactériocines de classe IIa sont aussi communément appelées bactériocines « pediocin-like »
en référence à la pédiocine, une des premières bactériocines de la classe Iia caractérisées.
Ces bactériocines sont produites, pour la plupart, par des bactéries lactiques et représentent le
groupe de bactériocines de classe II le mieux étudié (Fimland et al. 2005; Drider et al.
2006).
Les bactériocines de classe IIa ont suscité beaucoup d’intérêt en raison de leur
production par des bactéries isolées de l’alimentation et ce, combiné à une activité
antimicrobienne dirigée contre des pathogènes majeurs responsables d’infections, tels que
Li.monocytogenes. De façon générale, les bactériocines « pediocin-like » présentent un
spectre d’activité étroit limité aux bactéries à Gram positif. Depuis la découverte de
nombreuses bactériocines pendant les années 90, telles que la curvacine A (Tichaczek et al.
1993) sakacine A (Axelsson et Holck, 1995), la leucocine A (Hastings et al. 1991), la
mésentéricine Y105 (Héchard et al. 1992; Fleury et al. 1996), la pédiocine PA-
1(Henderson et al. 1992) et la sakacine P (Tichaczek et al. 1994; Hühne et al. 1996), de
nombreuses nouvelles bactériocines ont été découvertes et sont régulièrement découvertes,
comme la mundticine L (Feng et al. 2009) et l’avicine A (Birri et al. 2010). Les
bactériocines de classe IIa sont des peptides antimicrobiens cationiques et partiellement
amphipathiques et/ ou hydrophobes de masse moléculaire inférieure à 5500 Da. Elles sont
constituées de 37 à 49 acides aminés.
Sous-classe IIb :
Les bactériocines, communément appelées « two-peptides », sont formées de deux
peptides différents, α et β, dont l’activité antimicrobienne optimale nécessite la présence des
deux peptides complémentaires, le plus souvent en quantité équimolaire (Garneau et al.
2002; Nissen-Meyer et al. 2009).
56
Revue bibliographique
Dans certains cas, ces peptides peuvent être actifs individuellement comme c’est le
cas de la lactacine F (Allison et al. 1994) et des plantaricines EF et JK(Anderssen et al.
1998). Depuis l’identification de la lactococcine G chez Lb. lactis (Nissen-Meyer et al.
1992), environ 15 bactériocines de la même classe ont été isolées et caractérisées. Ces
bactériocines possèdent une taille très variable allant de 25 résidus (plantaricine J, PlnJ) à 62
résidus (thermophiline A, ThmA). Comme les autres bactériocines de classe II, les
bactériocines de classe IIb possèdent un spectre d’activité incluant de nombreux genres de
bactéries à Gram positif pathogènes telles que Bacillus, Clostridium, Listeria,
Staphylococcus et Streptococcus ou commensales comme Lactobacillus, Lactococcus et
Pediococcus (Garneau et al. 2002).
Toutes les bactériocines de classe IIb agissent en perméabilisant la membrane
cytoplasmique de la bactérie cible, provoquant des mouvements d’influx et d’efflux d’ions
et de petites molécules et conduisant à la mort de la bactérie. Les bactériocines de classe IIb
sont actives à faible concentration contrairement à d’autres bactériocines (Oppegård et al.
2007b).
Sous-classe IIc :
Les bactériocines circulaires se carctérisent par la présence d’un cycle liant d’une
façon covalente leurs extrémités N- et C-terminales. La structure circulaire est responsable de
la protection de ces bactériocines à l’égard de la protéolyse, en raison de l’absence de site de
clivage aux exopeptidases (Maqueda et al. 2008), et joue un rôle important dans
l’augmentation de l’activité antimicrobienne dûe à une stabilité accrue de la molécule. Par
ailleurs, le terme circulaire a été associé à ces bactériocines pour les distinguer des peptides
cycliques comme les polymixines, la cyclosporine A et la gramicidine S synthétisées par la
voie des peptide-synthétases appellées NRPS (nonribosomal peptides synthetase) (Koglin et
Walsh, 2009). Les bactériocines circulaires agissent par la perméabilisation de la membrane
cytoplasmique et la perturbation de la force protomotrice membranaire de la bactérie cible
aboutissant à la mort cellulaire.
57
Revue bibliographique
Huit bactériocines circulaires ont été caractérisées à ce jour, parmi lesquelles cinq
sont produites par des bactéries lactiques (carnocycline A, gasséricine A/ reutéricine 6,
entérocine AS-48, lactocycline Q, ubérolysine), tandis que la butyrivibriocine AR10 et la
circularine A sont produites respectivement par Clostridium beijerinckii (Cl. beijerinckii) et
Butyrivibrio fibrisolvens (By. fibrisolvens) (Kawulka et al. 2003).
La structure circulaire ainsi que l’oligomérisation confèrent à ces bactériocines une
activité biologique décuplée en apportant une stabilité thermodynamique et une intégrité à
leur structure protéique ainsi qu’une protection contre des protéases (Maqueda et al. 2008).
2.3. Classe III: protéines :
Ces protéines de taille supérieure à 30 kDa sont sensibles à la chaleur. La structure
et le mode d’action de ces bactériocines diffèrent complètement des autres bactériocines
produites par les bactéries lactiques. Cette classe ne contient que quatre bactériocines (Nilsen
et al. 2003 ; Papagianmi, 2003 ; Nigutova et al. 2007).
- l’helveticin J produite par Lactobacillus helveticus A.
- l’enterolysin A produite par Enterococcus faecium.
- la zoocin A produite par Spreptococcus zooepidemicus.
- la millericin B produite par Streptococcus milleri.
2.4. Classe IV: bactériocines complexes :
Les bactériocines de classe IV étaient définies comme des protéines associées à une
composante non protéique, lipidiques et/ou oligosaccharidiques, nécessaire à leur activités
biologiques la plantaricines S, par exemple possède une activité antibactérienne sensible à
des enzymes lipolytiques et glycolytiques (Jiménez-Diaz et al. 1993).
3. Intérêts des bactériocines:
Dans leur grande majorité, les bactériocines peptidiques de bactéries lactiques sont
thermorésistantes (120°C pendant 10 minutes), stables dans des zones de pH de 3 à 8 et
sensibles à l’action d’enzymes protéolytiques. De plus, contrairement à certains autres
peptides antimicrobiens d’invertébrés et vertébrés, elles ne montrent pas d’activité
hémolytique vis- à-vis des cellules eucaryotes (Nes et Holo, 2000).
58
Revue bibliographique
Parmi les applications réelles ou envisagées pour les bactériocines de bactéries
lactiques, on peut citer l’utilisation de ferments producteurs de bactériocines dans l’industrie
laitière (Cleveland et al. 2001). La fixation des bactériocines sur des polymères pour
l’emballage d’aliments pourrait aussi être un mode de conservation des aliments (Sebti et al.
2002).
Différentes bactériocines trouvent des applications dans les domaines, médicaux et
vétérinaires. Par exemple, la nisine a fait l’objet d’un brevet (Blackburn et Projan, 1994)
quant à son utilisation dans la prévention et le traitement d’ulcère causé par Helicobacter
pylori .Elle est, de plus, connue pour être un agent thérapeutique potentiel des mastites
bovines, et est déjà utilisée comme agent prophylactique. Différentes études ont été réalisées
sur l’utilisation de la nisine en solution buccale. Elle a démontré une action préventive contre
la plaque dentaire et les inflammations gingivales chez le chien (Howell et al. 1993).
4. Domaines d’applications des bactériocines:
4.1. Typage bactérien:
Le pouvoir des bactériocines à inhiber certaines souches de la même espèce
productrice et parfois des souches des autres espèces a été largement utilisé pour
l’identification d’espèces de différents genres bactériens. La plupart des méthodes sont
basées sur l’inhibition d’une souche dite indicatrice ou sensible aux bactériocines. Cette
méthode a été utilisée avec succès pour certaines bactéries Gram-négatif, telles que
Pseudomonas aeruginosa (Pitt et Gaston, 1995). L’utilisation des bactériocines a permis
aussi à Merino et al. 2000 de différencier les souches de Shigella.
4.2. Domaine alimentaire:
L’utilisation des bactériocines dans le domaine alimentaire est avantageuse non
seulement à cause de leur large spectre d’activité, mais aussi parce qu’elles sont non
toxiques, facilement dégradables par les enzymes digestives et ne compromettent pas la prise
des médicaments (Ryan et al. 1998). Du fait qu’elles sont des substances naturelles, l’emploi
des bactériocines permettrait d’avoir des produits plus sains et réduirait l’utilisation des
agents chimiques de conservation (Harlander, 1993 ; Galvarez et al. 2007). Ces dernières
années, l’application des bactériocines dans la technologie a gagné une grande attention. En
effet, plusieurs bactériocines montrent des effets synergiques ou addititionnels lorsqu’elles
sont utilisées en combinaison avec d’autres agents antimicrobiens, incluant des conservateurs
59
Revue bibliographique
chimiques, des composés phénoliques naturels (Grande et al. 2007), et même d’autres
protéines antimicrobiennes. L’utilisation combinée de bactériocines différentes, peut être
aussi une approche attirante pour éviter le développement de souches résistantes (Galvarez
et al. 2007).
La combinaison de bactériocines avec des traitements physiques, comme le
traitement à haute pression ou dans un champ électrique, offre une conservation plus efficace
des produits alimentaires, fournissant ainsi une barrière complémentaire aux formes les plus
résistantes comme les endospores bactériennes (Galvarez et al. 2007).
La nisine est utilisée comme additif dans les aliments en conserves, notamment dans
les produits laitiers, les soupes et les poudings à base de céréales (Eckner et al. 1992). Par
ailleurs, Rayman et al. 1981 ont démontré que l’interaction synergique entre la nisine et les
nitrites contre les spores de Clostridium botilinum permettrait de réduire l’emploi de ces
substances cancérigènes. A ce jour, plus de 45 pays ont approuvé l’utilisation de la nisine
comme agent de conservation, ce qui fait de la nisine la bactériocine la plus utilisée à travers
le monde (Riley et Wertz, 2002). Tout comme la nisine, l’utilisation de la pédiocine dans la
conservation des viandes, des salades et du fromage a été brevetée en Europe (Chen et al.
1997a).
4.3. Domaines de la médecine humaine et vétérinaire:
L’utilisation des bactériocines n’est pas restreinte au domaine alimentaire, plusieurs
études ont démontré que l’utilisation répandue des antibiotiques pour traiter et prévenir les
infections, engendrait de sérieux problèmes de toxicité et de résistance. Par leurs
caractéristiques mentionnées précédemment, les bactériocines ont été énormément
appréciées comme étant des agents de thérapie naturelle, alternative aux antibiotiques,
puisque l’effet inhibiteur des bactériocines pourrait réduire les effets nocifs engendrés par
l’antibiothérapie. Quelques lantibiotiques sont utilisables dans les applications médicales
pour l’espèce humaine et animale. L’épidermine produite par Staphylococcus epidermidis est
active contre Propionibacterium acnes, qui cause l’acné (Allgaier et al. 1986).
60
Revue bibliographique
Ce lantibiotique est utilisé dans la thérapie pour remplacer l’usage habituel de
l’érythromycine et de la vitamine A. Cette application montre plusieurs avantages tels que
l’absence de résistance aux lantibiotiques et leur faible coût de production par rapport aux
antibiotiques. La nisine, quant à elle, peut être utilisée dans le traitement des ulcères
gastriques vu sa stabilité aux pHs acides et son activité contre Helicobacter pylori (De Vuyst
et Vandamme, 1993). Trois autres bactériocines produites par Lactobacillus johnsonii LA1,
Lactobacillus casei YIT 9029 et Lactobacillus amylovorus DCE 471 montrent une activité
inhibitrice contre l’agent pathogène gastrique humain Helicobacter pylori qui cause des
ulcères gastriques (Avonts et De Vuyst, 2001).
Cinnamycine produite par différentes souches de Streptomyces spp est impliqué
dans l’immunité humaine (prolifération des leucocytes) et la régulation de la pression du
sang avec l’intervention de phospholipase A2 et l’enzyme de conservation de l’angiotensine.
De plus, ce groupe peut être impliqué aussi dans la protection contre le virus Herpes simplex
(Marki et Franson, 1986). Une « bacteriocin-like inhbitory substance » (BLIS) anti –
Streptococcus pyogenes produite par Streptococcus salivarius est appliquée dans la
préservation de la pharyngite streptococcique (Tagg, 2004).
4.4. Domaine agricole:
La protection des plantes contre les microorganismes phytopathogènes ainsi que la
préservation des semences, sont les objets de l’exploitation des bactériocines en agriculture.
Dans ce cas, les substances antibactériennes et substances antifongiques seront associées afin
de lutter contre les ravageurs phytopathogènes (Paik et al. 1997).
5. Mode d’utilisation des bactériocines:
Les bactériocines peuvent être utilisées dans les aliments selon trois procédés:
‐ inoculation de la souche productrice de bactériocine dans le produit : si la bactérie
lactique est naturellement présente dans le produit alors dans ce cas elle se développe
normalement et produit la substance inhibitrice au cours de sa phase exponentielle de
croissance. Si au contraire, il faut implanter la souche productrice, le succès de
l’opération dépend de la capacité de la souche à se développer et à produire la
bactériocine dans un environnement nouveau. Les conditions de culture (température,
pH, aw, exigences nutritionnelles dans l’aliment) peuvent ne pas convenir au
développement du microorganisme souhaité.
61
Revue bibliographique
- utilisation d’une préparation semi-purifiée de bactériocine : le plus souvent, il s’agit du
milieu de culture fermenté débarrassé des cellules bactériennes ;
- utilisation de la bactériocine pure : dans ce cas, la bactériocine n’est pas accompagnée de
substances nuisibles au procédé de fabrication ou à l’obtention du produit souhaité
(ASEPT,1999).
6. Mode d’action des bactériocines:
Le mode d’action le plus connu et le plus répondu chez les bactériocines des
bactéries lactiques implique une action visant la fonction de la barrière de la membrane, mais
il existe des exceptions à ce mode général. Les bactériocines de classe II représentent le cas
typique de bactériocine agissant sur la membrane cytoplasmique des cellules sensibles par la
formation des petits pores membranaires (Chatterjee et al. 2005). Deux modes d'action des
bactériocines ont été étudiés:
a. Les molécules de bactériocine se fixe à la surface de la membrane et quand la
concentration locale est élevée, l’orientation de la molécule change et elles sont
insérées dans la membrane causant la déstabilisation de la structure de la bicouche et
la formation des pores. ceci résulte en un flux d’ions, d’acides aminés et d’ATP vers
l’extérieur de la cellule, avec comme conséquence la mort de la cellule par annulation
de toute les réactions énergie dépendantes a concentrations proches de la concentration
minimale inhibitrice. Les bactériocines tuent les bactéries beaucoup plus rapidement
que les antibiotiques conventionnels (Chatterjee et al. 2005).
b. Certaines lantibiotiques comme par exemple la nisine un mode d’action double : d’une
part elles s’attachant au lipide II, le principal transporteur des unités de peptidoglycane
du cytoplasme à la paroi cellulaire ce que empêche la synthèse correcte de la paroi
cellulaire, causant la mort de la cellule ; d’autre part elles utilisent le lipide II comme
point d’ancrage pour initie le processus d’insertion dans la membrane et la formation
des pores provoquant la mort rapide de la cellule. Les bactériocines à deux peptides,
comme par exemple la lactacine 3147, peuvent avoir cette activité double partagée
entre les deux peptides (Brotz et al. 1998 ; Breukink et al. 1999 ; Weidmann et al.
2001).
62
PARTIE EXPERIMENTALE
MATERIEL & METHODES
Matériel & Méthodes
I. Lieu de travail:
Le présent travail a été soutenu par le Laboratoire Biotoxicologie Expérimentale,
Biodépollution et Phytoremédiation et le Laboratoire de Microbiologie Alimentaire et
Industrielle de l'Université Es-Senia, d'Oran. Les parties de ce travail ont été réalisées au
niveau de:
1. Laboratoire de bactériologie de l'hôpital Cochin, Paris:
a. Isolement et identification phénotypique et biochimique des souches
d'H.pylori à partir des biopsies gastriques prélevées par endoscopie digestive
haute au niveau d'une clinique dirigée par le gastroentérologue Mustapha
DJEBAILI à Chlef;
b. Caractérisation dans les biopsies gastriques des souches d'H.pylori et
détermination de leur sensibilité au clarithromycine par PCR en temps réel.
2. Centre national de référence des Campylobacters et des Helicobacters de Bordeaux:
- Caractérisation par PCR des îlots de pathogénicité CagA et VacA des souches de
H.pylori.
3. L'Université de Khemis Miliana:
a. Isolement et caractérisation des bactéries lactiques à partir des échantillons du
lait cru de vache, chèvre, brebis et chamelle;
b. Etude in vitro de l'effet antibactérien des bactéries lactiques vis-à-vis des
souches de H.pylori et caractérisation des bactériocines responsables de
l'inhibition;
c. Etude in vivo de l'effet antibactérien de la bactérie lactique qui a donné un net
effet inhibiteur in vitro.
4. Laboratoire de l'anatomie pathologique et de cytologie de l'hôpital Mohammed
Boudiaf de Médéa:
a. Préparation des coupes histologiques à partir des biopsies gastriques prélevées
par endoscopie digestive haute;
b. Coloration des coupes à Hématoxyline éosine;
c. Coloration des coupes par Giemsa Lent.
63
64
Matériel & Méthodes
II. Etude microbiologique:
1. Isolement et caractérisation de Helicobacter pylori:
1.1 Prélèvement des biopsies gastriques:
Des patients (n=100) ayant subi une endoscopie digestive haute afin de prélever des
biopsies gastriques de l'antre, au niveau de la clinique dirigée par le gastroentérologue
DJEBAILLI Mustapha à Chlef dont l'âge et le sexe d'un échantillon de patients sont
présentés dans le Tableau III. Un fragment biopsique est mis dans le bouillon urée-indole
pour détecter la présence de l'uréase et un fragment dans le formol à 4% pour l'examen
anatomo-pathologique et cytologique. Pour l'isolement de H.pylori deux fragments sont mis
dans de l'eau physiologique.
Tableau III: Sexe et l'âge d'un échantillon de patients.
Patient 1 2 3 4 5 6
Sexe Homme Homme Femme Femme Femme Femme
Age (ans) 19 43 64 35 62 59
1.2. Test rapide à l'uréase:
Un fragment est mis dans un tube contenant de l’urée indole pour détecter l’activité
uréasique qui montre la présence de la bactérie dans la biopsie (Cassel-Beraud et al. 1996).
Le résultat positif est interprété par le changement de la couleur de l’urée- indole de l’orange
au rose ou rouge après incubation à 37oC pendant 24h.
1.3. Ensemencement et caractérisation de Helicobacter pylori:
Cette partie a pour but d’isoler et caractériser des souches de Helicobacter pylori,
responsable de la maladie ulcéreuse à partir des biopsies gastriques. Les étapes de
l'ensemencement des souches de H.pylori ont été mentionnées par la Société française de
microbiologie, (2010).
1.3.1. Broyage des biopsies :
Le broyage permet la dispersion des bactéries et leur libération des cellules à
mucus, dont 3 microtubes PCR de 1,5mL sont étiquetés : un est rempli par 0,25 mL du
broyat, un est vide (pour la PCR) et l'autre contient le reste du broyat. Ensuite 1mL de 65
Matériel & Méthodes
bouillon viande foie glucosé (Bio-Rad) est mis dans le broyeur (Wheaton ou Kontes) et les
biopsies sont broyées. Il faut contenir une solution homogène, sans amas cellulaires. Ceci
afin d'accroître les chances de culture et d'éviter l'obstruction des embouts lors de l'étape de
l'extraction d'ADN.
1.3.2. Coloration de Gram des biopsies gastriques:
La coloration de Gram est un test essentiel et obligatoire réalisé au sein du
laboratoire de microbiologie. C’est une étape préliminaire utilisée pour différencier les
bactéries Gram positif des bactéries Gram négatif. Les biopsies sont étalées en frottis sur une
lame en verre (s'assurer que du mucus a bien été déposé sur la lame) et colorées par la
méthode de Gram dans un automate Slaide Stainer-Cytocentrifuge(Wescor). La technologie
par pulvérisation de Wescor permet un gain de temps, une standardisation et garantit la
fiabilité des résultats. Cette méthode permet de mettre en évidence H.pylori à la surface de
l'épithélium de la muqueuse des biopsies gastriques.
1.3.3. Ensemencement des biopsies gastriques pour la recherche d'Helicobacter pylori:
1.3.3.1. Culture :
Deux types de gélose ont été utilisées : gélose pylori(Biomérieux, France) et gélose
maison (Annexe) pour la culture de Helicobacter pylori, dont 4 gouttes de broyat sont
déposées à la surface des deux géloses. Ensuite, les géloses sont mises dans le sachet Genbag
anaer (Biomérieux, France) (deux boites de Pétri par sachet) en présence d'un sachet
générateur d'atmosphère microaérophile (Genbag microaer, Biomérieux). D'après Zine-
Charaf, (2007) H.pylori est microaérophile; elle a besoin d'oxygène en pourcentage
nettement moins élevé que dans l'air pour vivre et se développer (soit 3 à 5% d'oxygène). En
notant sur le sachet Genbag la date d'ouverture du sachet (7 jours après la date
d'ensemencement). Enfin, le sachet est mis à incuber dans l'étuve à 37oC (Telewig CCH01-
009-00-R05-291-333).
1.3.3.2. Identification de H.pylori :
D'après Cassel-Béraud et al. (1996), l’identification d’H. pylori a été basée sur ses
caractères morphologiques, son examen microscopique et sur ses caractères biochimiques
essentiels : uréase très intense, présence d’une oxydase et d’une catalase.
66
Matériel & Méthodes
1.3.3.2.1. Examen macroscopique:
Après culture sur milieu gélosé additionné au sang, des petites colonies rondes,
bombées et luisantes apparaissent exprimant la croissance de Helicobacter pylori sur ce
milieu.
1.3.3.2.2. Examen microscopique :
Un frottis est préparé à partir des colonies suspectes, en fixant sur une plaque
chauffante une goutte de la suspension bactérienne déposé sur une lame en verre; ensuite on
colore par la méthode de Gram dans l'automate Slaide Stainer-Cytocentrifuge(Wescor).
L'observation à l'immersion au microscope optique montre des bactéries plus grosses et plus
droites que sur le frottis de l’examen direct.
1.3.3.2.3. Identification des caractères biochimiques :
Oxydase: À l'aide d'une pipette Pasteur, prélever des colonies et les déposer sur un disque
oxydase imprégné d'eau. Un virage coloré rapide au violet indique une réaction positive.
Catalase: Pour détecter la présence de cet enzyme, on dépose une goutte d'eau oxygénée à
30 volumes sur une lame. A l'aide d'une pipette Pasteur, quelques colonies sont prélevées et
déposées dans la goutte d'eau oxygénée. L'apparition des bulles indique une réaction
positive.
Uréase: À l'aide d'une pipette Pasteur, quelques colonies sont prélevées et déposées dans une
goutte de milieu urée-indole. Un virage coloré rapide au rose fuchsia indique une réaction
positive.
1.4. PCR temps réel ou PCR Quantitative:
1.4.1. Principe:
La PCR quantitative en temps réel repose sur la possibilité de suivre au cours du
temps le processus de PCR à l’aide de la fluorescence. Les données de fluorescence sont
collectées à chaque cycle de la PCR et représentent la quantité de produits amplifiés à cet
instant (Elyse, 2002). Dans notre travail, on utilise la PCR en temps réel pour détecter à la
fois H. pylori dans les biopsies gastriques et sa sensibilité à la clarithromycine. Cet
antibiotique fait en effet partie du traitement de première de l'infection à H. pylori et le
succès du traitement est en partie dépendant de la sensibilité de la bactérie. Selon Ménard et
al. (2002) la résistance de la clarithromycine, la principale cause de l'échec du traitement
Helicobacter pylori, est attribuée à des mutations ponctuelles dans la région
peptidyltransférase de codage dans le domaine V de l'ARNr 23S.
67
Matériel & Méthodes
1.4.2. Extraction de l'AND sur automate NucliSens easyMAG®:
Pour l'extraction de l'ADN de H.pylori à partir des broyats des biopsies gastriques,
on utilise un automate NucliSens easyMAG® (00982, Biomérieux, France). L’appareil
NucliSens easyMAG® procède à l’extraction des acides nucléiques en provenance
d’échantillons biologiques. La méthode d’extraction des acides nucléiques, basée sur la
technologie de Boom utilise des particules de silice magnétique. La silice, composé chimique
de dioxyde de silicium, est capable de fixer les acides nucléiques. Cette propriété est
importante pour le bon fonctionnement de cette plateforme automatisée. Selon les
instructions du fabricant, l'automate va distribuer le tampon de lyse (ref. 280134, NucliSens
easyMAG®) dans les cupules (navettes). Après, sous une hôte laminaire, les navettes
(cupules) sont remplies avec 0,25 mL de broyat déjà mis dans un microtube (homogénéiser à
l'aide de pipette stérile). L'extraction de l'ADN est lancer pendant 40 min, dont après 10 min
au minimum de la lyse, 50 µL de silice Magnétique (MagSIL)(ref.280133, Biomérieux) a été
distribué et homogénéisé à l'aide d'une pipette multicanaux (Biohit). L'extraction se fait en
trois étapes (Figure 18):
A. Après la lyse des échantillons, tous les acides nucléiques sont capturés par les particules
de silice magnétique.
B. Le système d’aimantation de NucliSens easyMAG® permet le lavage dynamique puis la
fixation de la silice magnétique, pour purifier les acides nucléiques. Ensuite 110 µl de
solution d’élution sont ajoutée. L'étape de chauffage à 60oC libère les acides nucléiques fixés
sur la silice.
C. Lors de l'étape finale, la silice magnétique est séparée de l'éluat par le système
d’aimantation.
Fig.18: Etapes de l'extraction d'ADN dans NucliSens easyMAG® (technologie de Boom)
(Guide d'utilisateur, Roche).
68
Matériel & Méthodes
1.4.3. Préparation de Master Mix:
Pour la préparation de Master Mix, on pipette 10 µL du tube contenant LightCycler
Fast-Start Enzyme dans le tube de LightCycler FastStart Reaction Mix SYBR Green I. Le
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I obtenu (Roche Diagnostics-Applied
Science) contient Fast Start Taq DNA polymérase, tampon de réaction, colorant de Syber
Green et mélange de DNTP.
1.4.4. Préparation de Mix:
Dans une boite Light Cycler Centrifuge Adapters 1909312(Roche, Germany) on
place des tubes spéciales pour la préparation de Mix. On utilise pour sa préparation des
amorces sens HPYS (41-6018-3/4 ;Eurofins mwg/Operon), 5'-AGG-TTA-AGA-GGA-TGC-
GTC-AGT-C-3', nucléotides 1931-1952) et anti-sens HPYAS (41-6018-4/4; Eurofins
mwg/Operon), 5'-CGC-ATG-ATA-TTC-CCA-TTA-GCA-GT-3', nucléotides 2197- 2175).
Le produit amplifié a été détecté avec deux sondes: la sonde de détection HP-LCR (41-
6018-1/4 ;Eurofins mwg/operon), marqué en 5' avec LC-Red 640 et phosphorylée en 3' ( 5'-
GGC-AAG-ACG-GAA-AGA-CC-3', nucléotides 2504 à 2520), et la sonde d'ancrage HP-
FLU (24-66592/2; Eurofins mwg/Operon ) marqué à la fluorescéine en 3' (24-66592/2, 5'-
TGT-AGT-GGA-GGT-GAA-AAT-TCC-TCC-TAC-CC-3'; nucléotides 2473-2501).
Pour chaque échantillon à étudier, le mix doit contenir 8,4 µL de H2O, 1µL de
HPY-S(10µM), 1µL de HP-LCR(10µM), 1µL de HP-FLU(10µM), 1µL de HPY-AS(10µM),
2 µL de master mix et 1,6 de MgCl2 (25 mM). Dans ce type de PCR on utilise deux témoins
positifs: Quinet pour détecter les souches Wildtype et Alves pour les souches ayant une
mutation A2143G, et du H2O pour le contrôle négatif. Après on ajoute 4µL d'ADN extrait à
16 µL de Mix préparé, et la PCR se lance.
1.4.5. Amplification de l'ADN:
Avant de procéder à l'amplification de l'ADN, les microtubes préalablement
préparés sont centrifugés afin d'éliminer toutes bulles d'air. Les microtubes sont mis dans le
thermocycleur Light Cycler 2,0(Roche, Germany). Les appareils de la version Light-Cycler
2.0 contient Jusqu'à 32 tubes capillaires, en verre, d'une contenance de 20 µl, sont
69
Matériel & Méthodes
portés sur un "carrousel" (Figure 19), tournant dans une chambre obscure de forme
circulaire. Les paliers de température sont effectués par le biais d'un courant d'air chaud.
L'appareil est capable d'élever ou de baisser sa température de chambre de 20°C par
seconde. Il y a une lampe d'excitation diffusant une lumière de 530 nm, 640 nm et 710 nm de
longueur d'onde et un intégrateur capable de récupérer le signal correspondant à la lumière
d'émission de la fluorescence générée à 5 longueurs d'onde différentes. Ensuite le logiciel
permet de faire de la quantification de façon absolue ou de façon relative (Guide
d'utilisateur, Roche). Dans notre travail la fluorescence a été mesurée dans le domaine
530/640nm.
Les étapes de base de la détection de l'ADN au cours de PCR en temps réel sur le
système LightCycler sont les suivantes: une préincubation à 95oC/10min consiste à une
1. Le LightCycler ® consiste en une chambre cylindrique où l'air, ce qui n'a pratiquement pas de masse, est chauffée par un serpentin de chauffage. Le PCR se produit dans des capillaires en verre qui peut contenir un volume allant jusqu'à 20 pi. Cette grande surface par rapport au volume permet des cycles très rapides. 2. L'unité de détection se compose d'une source lumineuse LED bleue et trois voies de détection qui mesurent la lumière émise à trois longueurs d'onde différentes (530 nm, 640 nm et 710 nm).
Fig.19: Le thermocycleur LightCycler ® 2.0 (Roche Diagnostics GmbH, Germany)
70
Matériel & Méthodes
activation de l'ADN polymérase FastStart et dénaturation de l'ADN double brins (50cycles
avec un taux de température de transition 20 ° C / s). Elle s’effectue à une température de
95°C pendant 0 S, dite température de dénaturation. À cette température, l’ADN matriciel est
dénaturé dont les liaisons hydrogène ne peuvent pas se maintenir à cette température et les
ADN doubles brins se dénaturent en ADN simple brin (ADN monocaténaires).
La deuxième période s’effectue à une température de 60°C pendant 10s dite
température d’hybridation des amorces. Pour l'hybridation, les deux sondes utilisées dans ce
travail vont augmenter la spécificité. Une des sondes (HP-FLU) porte à son extrémité 3’ une
fluorescéine qui émet une lumière verte lorsqu’elle est excitée par l’appareil. Son spectre
d’émission recouvre le spectre d’excitation d’un fluorophore accepteur situé à l’extrémité 5’
de la seconde sonde (HP-LCR), marqué en 5' avec LC-Red 640 et phosphorylée en 3'. Celle-
ci est bloquée en 3’ pour éviter toute extension à partir de son extrémité. L’excitation du fluo
donneur (la fluorescéine) est transmise par FRET (Fluorescence Resonnance Energy
Transfert) au fluo accepteur qui émet une lumière rouge. Les deux sondes vont s’hybridées «
tête-bêche » sur leur séquence cible au cours de l’étape d'hybridation. Les sondes
d’hybridation présentent des spécificités élevées. Puisqu’elles ne sont pas hydrolysées durant
la PCR, la fluorescence est réversible et va permettre de générer des courbes de fusion. La
diminution de la température permet aux liaisons hydrogène de se reformer et donc aux brins
complémentaires de s’hybrider (Figure 20).
La troisième période s’effectue à une température de 72°C pendant 17s, dite
température d’élongation. À cette température, la FastStart polymérase Taq ADN se lie aux
ADN monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant les dNTP présents dans
le mélange réactionnel. Après amplification une étape de fusion a été réalisée: dénaturation à
95 ° C pendant 0 s, refroidissement à 45 ° C pendant 30 s (avec une vitesse de transition de
température de 20 ° C / s), et une augmentation lente de la température à 85 ° C à une vitesse
de 0,1 ° C / s, avec acquisition continue de déclin de fluorescence.
Les courbes d'amplification d'ADN contiennent trois phases:
- Phase d'initiation (bruit de fond) : dans cette phase la quantité de fragment amplifié est
insuffisante pour générer un signal fluorescent supérieur au bruit de fond.
- Phase exponentielle : La quantité de fragment amplifié génère un signal fluorescent
supérieur au seuil de détection de l’appareil, puis le nombre de produits amplifiés double à
71
Matériel & Méthodes
chaque cycle. Plus il y a de matrice à amplifier au départ de la réaction PCR, moins élevé
sera le nombre de cycle requis pour atteindre un point où le signal d’émission de
fluorescence sera statistiquement et significativement plus élevé que le bruit de fond. Ce
point est défini comme étant le cycle seuil (Threshold cycle, Ct ou Cp) et apparaîtra toujours
au cours de la phase exponentielle d’amplification. La valeur du Ct peut être traduite en un
résultat quantitatif
- Phase de plateau (ou de saturation) : certains composants de la réaction deviennent
limitants. Le système ne permet plus une amplification exponentielle (figure 21).
Fig. 20: génération de la fluorescence par le mécanisme FRET (Fluorescence Resonnance Energy Transfert) (Cartron, 2013)
Fig. 21: Le suivi en temps réel d’une réaction PCR. La cinétique de la réaction PCR met en jeu en trois
phases : une phase d’initiation, une phase exponentielle et une phase plateau (Tse et Capeau, 2003)
72
Matériel & Méthodes
2. Isolement et caractérisation des bactéries lactiques :
2.1. Origine et prélèvement des échantillons de laits:
Des échantillons de laits crus ont été prélevés en mois de Février de l'an 2010, des
différentes espèces caprines (Arabia), bovines (vaches laitières de race Pie-noire et Brebis) et
camelines (Camelus dromedaries), de trois régions de l'Algérie: Ain Defla (Ain Defla
Commune et Miliana), Biskra et Tamanrasset.
Le prélèvement du lait a été fait le matin au moment de la traite manuelle. Pour
chaque échantillon, 100 à 150 mL de lait étaient recueillis de la mamelle de l'animal après
avoir bien lavé le pis et éliminé les 2 ou 3 premiers jets de lait. Les échantillons de lait sont
conservés à + 4 °C dans des flacons stériles en verre et transportés à l’obscurité jusqu’au
laboratoire durant les cinq heures qui précèdent les analyses.
2.2. Analyses du lait cru:
2.2.1. Tests préliminaires:
2.2.1.1. pH:
Le pH du lait cru donne une première idée sur le stade d’évolution du lait et sur la
nature des germes que nous pouvons éventuellement y rencontrer. Le pH est mesuré à 20°C à
l’aide d’un pH-mètre (HANNA), en plongeant une électrode dans un bêcher contenant 100
mL du lait. La valeur de pH est lue directement sur l'appareil (Sboui et al. 2009).
2.2.1.2. Réduction du bleu de méthylène:
Le test de la réductase au bleu de méthylène représente une méthode indirecte
simple pour surveiller la charge microbienne du lait cru (Guiraud, 2003). Il s’agit de mettre
dans des tubes à essai stériles l’échantillon du lait cru, ajouter de bleu de méthylène à (1%),
mélanger, et incuber à 37° C. La durée de sa décoloration permet de quantifier
approximativement la population microbienne du lait et par conséquent d’estimer sa qualité
microbiologique (Berrens et Luquet, 1987):
- Si la durée de la décoloration est supérieure à 5h, l'échantillon est de
bonne qualité microbiologique (100000 à 200000 germe/mL);
73
Matériel & Méthodes
- La qualité microbiologique du lait est de bonne à passable (200000 à 2
millions germes/mL), si la durée de la décoloration du bleu de méthylène
s'estime entre 2 et 4h;
- Si le lait décolore le bleu de méthylène dans moins de deux heures, il
contient une charge microbienne allant de 2 à 10 millions de germes/mL.
Sa qualité est inssufisante.
2.2.2. Analyses microbiologiques (Beerens et Luquet, 1987):
2.2.2.1. Diluant:
La nature de diluant est importante. Il faut choisir un liquide assurant une parfaite
dispersion des bactéries et qui ne soit pas inhibiteur pour elles. Dans ce travail, nous avons
utilisé la solution de tryptone–sel (TSE), dont sa préparation consiste de dissoudre 1g de
Tryptone (Difco) et 8,5 g de chlorure de calcium dans 1000 mL d'eau distillée. Après
dissolution, le pH est ajusté à 7,0. On répartit en flacons ou en tubes et on autoclave à 121 oC.
2.2.2.2. Préparation de l’inoculum:
Le lait cru a été dans une première étape homogénéisé et dilué pour obtenir la prise
d’essai destinée a être inoculée dans les différents milieux de culture. En raison de la grande
variabilité des bactéries et de leur nombre, un dénombrement nécessite des dilutions de la
prise d'essai. La dilution du lait nécessite de préparer une suspension mère à partir de
laquelle les dilutions seront ensuite préparées. La suspension mère du lait est une suspension
obtenue après qu’un volume de 1mL du lait ait été mélangé avec une quantité neuf fois égale
de diluant. La suspension ainsi préparée est appelée suspension mère et constitue une
première dilution. Les dilutions décimales sont des suspensions obtenues en mélangeant un
volume de 1mL de la suspension mère ainsi préparée et homogénéisée avec un volume neuf
fois égal de diluant, et en répétant cette opération sur chaque dilution ainsi préparée, jusqu’à
obtention d’une gamme de dilutions décimales appropriée pour l'inoculation des milieux de
culture.
2.2.2.3. Dénombrement des microorganismes:
Les analyses microbiologiques ont été commencées immédiatement après la
préparation des dilutions. Deux groupes de microorganismes ont été recherchés:
74
Matériel & Méthodes
- Les germes potentiellement pathogènes pour le consommateur : les anaérobies sulfito-
réducteurs et Staphylococcus aureus.
- Les germes tests d’hygiène générale :
• Des germes capables d’altérer la qualité marchande de l’aliment : Il s’agit habituellement
du dénombrement des micro-organismes aérobies mésophiles totaux.
• Les témoins de contamination fécale : l’analyse de la flore fécale permet de refléter que le
lait n'est pas traité dans des conditions normales d’hygiène. Toutefois les coliformes fécaux
thermotolérants et les streptocoques fécaux sont recherchés.
Dénombrement des germes mésophiles aérobies totaux (GMAT):
Afin d’apprécier la pollution microbienne du produit et de prévoir son altération
probable, il est important de compter les germes mésophiles totaux présents. Ce
dénombrement se fait en général à 30◦C. Cette méthode consiste à (Figure 22):
- Transférer en double 1mL des dilutions décimales dans des boites de Pétri stériles;
- Dans chaque boite de Pétri, 15 mL de la gélose PCA (Gélose pour dénombrement) (Plate
Count Agar) (Institut Pasteur d'Algérie) a été coulée;
- L’inoculum a été soigneusement mélangé au milieu de culture qui a été laissé pour se
solidifier en posant les boites de Pétri sur une surface horizontale;
- Après solidification complète, 4mL d’une gélose blanche a été coulé à la surface du milieu
ensemencé;
- Après solidification de la nouvelle couche, les boites ainsi préparées sont retournées et
incubées à l’étuve réglée à 30◦C pendant 72 heures;
- Retenir pour le comptage, les boites de Pétri contenant un nombre de colonies compris
entre 10 et 300. Calculer le nombre de microorganismes par mL de lait à l'aide de la formule
suivante:
Nombre/mL =
Dénombrement des coliformes fécaux:
Le dénombrement des coliformes fécaux permet la mise en évidence d'une
population fécale et donc la possibilité d'une contamination par les entérobactéries
Nombre total de colonies comptées
Volume ensemencé de l'échantillon
75
Matériel & Méthodes
pathogènes. Pour cela, on prélève deux fois 1mL de chaque dilution décimale et on les
transfère dans deux boites de Pétri stériles. Dans chaque boite 15mL de la Gélose
désoxycholaté à 1‰ (Institut Pasteur d'Algérie) refroidie à 45◦C ont été coulés. L’inoculum a
été soigneusement mélangé au milieu de culture qui a été laissé pour se solidifier en posant
les boites de Pétri sur une surface horizontale. Après solidification complète, 5mL d’une
gélose blanche a été coulé à la surface du milieu ensemencé. Les boites seront incubées à 44°C,
pendant 24 à 48 h. Après la période d’incubation, les colonies caractéristiques (colonies
violacées d’un diamètre supérieur ou égal à 0,5mm et parfois entourées d'une zone rougeâtre
due à la précipitation de la bile) ont été comptées (Figure 23).
Recherche des streptocoques fécaux:
Les streptocoques du groupe D sont constamment rencontrés dans les matières
fécales et ont naturellement été choisie comme témoin de contamination fécale dans certains
aliments crus. Leur recherche utilise un milieu de présomption de Roth (Institut Pasteur
d'Algérie) et un autre de confirmation de l'Eva Litsky (Institut Pasteur d'Algérie) en cas
d'obtention d'un résultat positif dans le premier test (Figure 24).
A. Test de présomption:
- Préparer une série de tubes contenant le milieu sélectif de Rothe à raison de trois tubes par
dilution.
- A partir des dilutions décimales 10-1 à 10-3, porter aseptiquement 1 mL dans chacun des
trois tubes correspondant à une dilution donnée. Bien mélanger le milieu et l’inoculum.
- Incuber à 37°C pendant 24 à 48 heures.
- Les tubes présentant un trouble microbien sont considérés comme positifs.
B. Test de confirmation:
- Chaque tube de Rothe trouvé positif lors du test de présomption fera l’objet
d’un repiquage à l’aide d’une öse bouclée dans un tube de milieu Eva Lytski.
- Bien mélanger le milieu et l’inoculum.
- Incuber à 37°C pendant 24 h.
- L’apparition d’un trouble homogène et d’une pastille violette au fond des tubes signe la
présence de streptocoques fécaux.
76
Matériel & Méthodes
Dénombrement de Clostridium sulfito- réducteurs :
Le but de cette recherche est de dénombrer les Clostridium sulfito-réducteurs
capables de produire des toxines et de sporuler et survivre au cours des processus de
conservation des aliments (Figure 25):
- Au moment de l'emploi faire fondre un flacon de la gélose Viande Foie, la refroidir
dans un bain d'eau à 45◦C puis ajouter une ampoule d'Alun de Fer et une ampoule de
sulfite de sodium.
- Les tubes contenant les dilutions décimales seront soumis d'abord à un chauffage à
80◦C pendant 8 à 10minutes, puis un refroidissement immédiat sous l'eau de robinet
pour but d'éliminer les formes végétatives et garder uniquement les formes sporulées;
- A partir de ces dilutions, porter aseptiquement 1mL de chaque dilution en double
dans deux tubes à essai, puis ajouter environ 15mL de la gélose Viande Foie (Institut
Pasteur d'Algérie) prête à l'emploi, dans chaque tube;
- Après solidification, ces tubes seront incubés à 37◦C pendant 48h;
- La première lecture doit se faire à 16h, car d'une part les colonies de Clostridium
sulfito-réducteurs sont envahissantes et on se trouverait en face d'un tube
complètement noir auquel cas l'interprétation devient impossible et l'analyse est
refaite;
- Il faut absolument repérer toutes colonies noires ayant poussé en masse et d'un
diamètre supérieur à 0,5mm;
Dans le cas ou il n'y a pas de colonies caractéristiques, réincuber les tubes et
effectuer une deuxième lecture au bout de 24h à 48h.
Dénombrement de Staphylococcus aureus:
Ce type de recherche permet de savoir si le produit présent un risque pour la santé
du consommateur, car les Staphylococcus aureus sont producteurs d'une entérotoxine de
nature protéique. Un enrichissement et une revivification ont été réalisés par introduction de
1mL des dilutions décimales dans 9 mL de l’eau peptonnée et incubation à 37oC pendant 1
heure. Un mL de l’échantillon ainsi préparé a été transféré dans deux boites de Pétri stériles.
Dans chaque boite de Pétri 15 mL de la gélose Chapman (Institut Pasteur d'Algérie) refroidie
à 45oC a été coulée. L’inoculum a été soigneusement mélangé au milieu de culture qui a été
laissé pour se solidifier en posant les boites de Pétri 77
Matériel & Méthodes
sur une surface horizontale. Après solidification, les boites ainsi préparées sont
retournées et incubées à l’étuve réglée à 37oC pendant 24 à 48 heures. Après la période
d’incubation, les colonies caractéristiques (colonies noires, convexes, brillantes d’un
diamètre compris entre 0,5mm et 2mm, avec un lisère blanc opaque, entoure d’une auréole
claire) ont été comptées (Figure 26).
Fig. 22: Dénombrement des germes mésophiles aérobies totaux sur gélose PCA.
Incubation à 30 oC/72 h
PCA PCA PCA
1 mL 1 mL
1 mL 1 mL 1 mL
1 mL
Lait cru
9 ml TSE 10-1 10-2 10-3
78
Matériel & Méthodes
Fig. 23: Recherche des streptocoques fécaux dans le lait cru (test de présemption et de
confirmation).
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL 1 mL 1 mL
Lait cru
9 ml TSE
Rothe
Incubation à 37 oC/ 24 à 48h
Resultat négatif Resultat positif
Eva Litsky
Incubation à 37 oC/ 24 h
10-210-1 10-3
79
Matériel & Méthodes
Fig. 24: Dénombrement des coliformes fécaux du lait cru sur gélose désoxycholate.
1 mL
1 mL 1 mL 1 mL
1 mL 1 mL
G.désoxy.à 1‰ G.désoxy.à 1‰
G.désoxy.à 1‰ G.désoxy.à 1‰
G.désoxy.à 1‰
G.désoxy.à 1‰
Incubation à 37oC/24 à 48h
Incubation à 44oC/24 à 48h
Lait cru
9 mL TSE
9 mL TSE 10-310-210-1
80
Matériel & Méthodes
Fig. 25: Dénombrement de Staphylococcus aureus du lait cru sur gélose chapman.
Lait cru
9 mL TSE
1 mL
1 mL 1 mL
10-210-1 10-39 mL TSE
9 mL Eau
peptonnée
1 mL 1 mL 1 mL
Incubation à 37 oC/ 1 h
Chapman Chapman Chapman
1 mL 1 mL 1 mL
Incubation à 37 oC/ 24 à 48 h
81
Matériel & Méthodes
Fig.26 : Dénombrement de Clostridium- sulfito réducteurs du lait cru sur gélose viande-foie.
Lait cru
9 mL TSE
1 mL
1 mL 1 mL
10-2 10-39 mL TSE
Chauffage à 80◦C pendant 8 à 10minutes
Refroidissement
1 mL 1 mL 1 mL
Vf Vf Vf
Incubation à 37◦C/ 48h
10-1
82
Matériel & Méthodes
2.3. Isolement des bactéries lactiques:
Les genres étudiés sont mis en évidence sur le milieu M17 commercial (Institut
Pasteur d'Algérie), milieu complexe et riche, a été utilisé pour la plupart des précultures et
cultures (Terzaghi and Sandine, 1975). Afin d'éviter tout problème de précipitation du
sucre au cours de la stérilisation, le milieu M17 est reconstitué, stérilisé, puis une solution
stérile de lactose (200 g.L-1) rajoutée avant la culture. Dans cette étude, le milieu M17 est
employé pour la recherche surtout des souches de Lactococcus et Enterococcus.
A partir de chaque type de lait, des dilutions décimales jusqu'à 10-6 sont réalisées :
- Repartir stérilement 9mL de diluant dans une série de tubes ;
- Agiter la solution mère pour assurer une répartition homogène des micro- organismes;
- Prélever 1mL de la suspension de bactéries lactiques et transférer dans le tube n° 1 ; on
obtient ainsi la dilution 10-1 ;
- Après agitation, prélever 1mL de la dilution 10-1 et transférer dans le tube n° 2 pour obtenir
la dilution 10-2 et ainsi de suite jusqu'à l’obtention de différentes dilutions (10-3, 10- 4,10-5,
10-6).
A partir de la dernière dilution, des boites de Pétri contenant de la gélose M17 sont
ensemencées en surface par les dilutions 10-4, 10-5 et 10-6. L'incubation des boites de Pétri se
fait à 30 °C et à 45°C pendant 24h à 48h. Le nombre de colonies par souches est évalué en
UFC (unité formant colonie) par millilitre d’échantillon de lait analysé. Une colonie bien
distincte a été prélevée aseptiquement et mise dans le bouillon M17 et incubée à 37°C
pendant 24h. Plusieurs repiquages ont été faits pour obtenir une souche pure. Les souches
pures ont été conservées dans le bouillon M17 et mises au congélateur à –20°C en attendant
leur identification (Figure 27). 83
Matériel & Méthodes
Fig.27: Isolement et caractérisation des bactéries lactiques sur gélose M17.
10-410-3 10-5 10-610-210-1
1 mL
M17 M17 M17
Lait cru
9 mL TSE
9 mL TSE
1 mL 1 mL 1 mL
M17 M17 M17
Incubation à 30 ◦C/ 72h
Incubation à 45 ◦C/ 72h
5 mL M17
M17 Identification:
- Catalase - Oxydase - Type fermentaire - Pouvoir acidifiant - Croissance en milieux
hostiles: NaCl, température et pH
- Api 20 Strep
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
84
Matériel & Méthodes
2.4. Identification phénotypique:
Afin de déterminer les caractères culturaux des bactéries lactiques isolées (couleur,
disposition, forme et aspect), les colonies obtenues sont observées à la loupe binoculaire.
L'examen de la forme unitaire des cellules ainsi que leur mode d'enchaînement est effectué
au microscope optique (ZEISS) après fixation d'un frottis et la coloration de Gram, qui ce fait
en 3 étapes (OIV, 2013):
- Dans un premier temps, les cellules sont colorées avec du violet de gentiane pendant deux
minutes. Ce colorant présente des affinités avec les composants du cytoplasme ; par
conséquent les cellules se colorent en bleu-violet quelle que soit le type de paroi. Après
rinçage à l’eau déminéralisée, une solution d’iode-ioduree (lugol) est étalée sur les cellules
pour fixer la couleur. Après 30 secondes, les cellules sont à nouveau rincées à l’eau
déminéralisée.
- Dans un deuxième temps, une décoloration est réalisée par rinçage avec de l’éthanol à 95%
(15 s). Les bactéries à Gram négatif sont décolorées car leur paroi laisse passer l’alcool et
permet le rinçage du violet de gentiane. Au contraire, la paroi riche en peptidoglycanes des
bactéries à Gram positif ne laissent pas passer l’alcool et par conséquent, ces cellules ne sont
pas décolorées : le cytoplasme des bactéries à Gram positif reste violet.
- Pour terminer, une recoloration à la fuschine est réalisée (10 s). Cette étape permet de
recolorer les cellules en rouge. La teinte bleu-violet des cellules à Gram positif n’est pas
affectée par la couleur rouge de la fuschine car le spectre du violet de gentiane absorbe dans
le même domaine de longueur d’onde que la fuschine. Les bactéries à Gram négatif seront,
quant à elles, colorées en rouge et pourront être observées au microscope optique.
2.5. Identification biochimique et physiologique:
2.5.1. Test de la catalase:
La catalase est une enzyme produite en abondance par les bactéries ayant un
métabolisme respiratoire qui détruit le peroxyde d’hydrogène et libère de l’oxygène (Vézina
et Lacroix, 2000).
Cette activité a été réalisée selon le protocole expérimental décrit par Prescott et al.
(2003). La technique consiste à prélever une partie de colonie et à l’émulsionner dans une
goutte d’eau oxygénée (30V). Le dégagement de bulles de gaz signifie qu’il y’a production
de la catalase.
85
Matériel & Méthodes
2.5.2. Test de l’oxydase:
Le test de l’oxydase est basé sur la production bactérienne d’une enzyme oxydase
intracellulaire en présence d’oxygène atmosphérique et de cytochrome C (Vézina et
Lacroix, 2000).
Pour déterminer l'activité oxydase une colonie prélevée est mise dans une goutte de
réactif oxydase (Biomérieux, France). Le développement d'une couleur violette signifie que
le test est positif et que l'isolat possède l'enzyme oxydase (Kovacs et al. 1995).
2.5.3. Type fermentaire:
Ce test permet de classer les bactéries lactiques en homo ou hétéro-fermentaire. Les
souches sont cultivées dans des tubes contenant de bouillon nutritif avec addition de glucose
liquide, plus une cloche de Durham. Après, recouvrir les tubes avec l’huile de vaseline puis
incuber à 37°C pendant 48 heures. La présence ou l’absence du gaz dans la cloche indique le
type fermentaire (Coppola et al. 1997).
2.5.4. Croissance en milieux hostiles:
a. En présence de NaCl: Le bouillon M17 est additionné de 2 %, 4% et 6.5 % de NaCl puis
reparti en tubes et ensemencé par les bactéries lactiques (Badis et al. 2005). La présence de
trouble indique une croissance bactérienne.
b. pH 4 ,5 et 6,5: Le pH du milieu M17 est ajusté à 4,5 et 6 ,5 à l’aide d’une solution de
HCl puis le milieu est ensemencé par les différentes souches et incubé à 37°C pendant 2 à
3 jours (Badis et al. 2005). La présence de trouble indique une croissance bactérienne.
c. Thermorésistance : Les tubes contenant le bouillon M17 sont ensemencés par les
bactéries lactiques et incubés à 65oC pendant 30 minutes puis refroidis et incubés à 37oC
pendant 24h (Guiraud, 2003). La présence de trouble indique une croissance bactérienne.
2.5.5. Identification au niveau de l'espèce ou sous espèce par les galeries Api20 Strep:
Les bactéries lactiques isolées sont identifiées au niveau de l'espèce ou de sous
espèce en établissant leurs profiles fermentaires à l'aide du microsystème d'identification Api
20 Strep (Biomérieux, France). Api 20 Strep est un système standardisé associant 20 tests
biochimiques qui présentent un grand pouvoir discriminant. Il permet de faire un diagnostic
de groupe ou d'espèce pour la plupart des streptocoques et entérocoques (Figure 28).
86
Matériel & Méthodes
La galerie Api 20 comporte 20 microtubes contenant des substrats sous forme
déshydratée. Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstitue les
milieux. Les réactions produites pendant la période d’incubation se traduisent par des virages
colorés spontanés ou révélés par l’addition de réactifs. La lecture de ces réactions se fait à
l’aide du tableau de lecture, en comparant aussi les profiles obtenus avec les données de la
littérature (Biomérieux, France).
2.5.5.1. Préparation de la galerie:
La préparation de la galerie consiste à répartir de l’eau dans les alvéoles de boite
d’incubation pour créer une atmosphère humide. Ensuite, on dépose stérilement la galerie
dans la boite d’incubation.
2.5.5.2. Préparation de l’inoculum :
Une suspension bactérienne très dense : opacité supérieure à 4 de McFarland, est
préparée dans une ampoule de Suspension Medium ou dans un tube d’eau distillée stérile.
2.5.5.3. Inoculation de galerie :
Dans la première moitié de la galerie (tests VP à ADH) répartit la suspension
bactérienne en évitant la formation de bulles:
-Pour les tests VP à LAP environ 100µl dans chaque cupule.
-Pour le test ADH remplir uniquement le tube.
Dans la deuxième moitié de la galerie (tests RIB à GLYG), on met 0,5mL dans une
ampoule Api20 Strep Medium. Ensuite, cette suspension est repartit dans les tubes
uniquement. Une huile de paraffine est mise dans les cupules d’ADH à GLYG. Après, la
boite d’incubation est fermée et incubée à 37°C pendant 24heures. La lecture de la galerie
doit se faire en se référant au tableau de lecture (Tableau IV).
2.5.5.4. Lecture:
Après 4 heures d'incubation, on ajoute les réactifs :
-test VP: 1goutte de VP1 et VP2;
-test HIP: 2 gouttes de NIN;
- tests PYRA, αGAL,βGUR, βGAL, PAL, LAP: 1goutte de ZYM A et ZYMB.
On attend 10 minutes avant de lire toutes les réactions en se référant au Tableau de
Lecture. 87
Matériel & Méthodes
Tableau IV: Tableau d’identification par galerie api 20 Strep(BioMérieux, France).
88
Matériel & Méthodes
Fig. 28: Préparation d'une galerie Api20 strep(Guide d'utilisateur, Biomérieux).
89
Matériel & Méthodes
2.5.6. Test d'hémolyse:
Ce test constitue le 21ème test de la galerie Api20 strep. Il permet de terminer si la
bactérie a un pouvoir hémolytique dans un milieu gélose additionné au sang par la présence
d'une enzyme hémolytique. Dans cette partie, une gélose nutritive fondue est additionnée au
sang de cheval après refroidissement. Des boites de Pétri ont été coulées par la gélose et
solidifiées sur paillasse. Une goutte de bouillon contenant la culture de la bactérie lactique a
été ensemencée par strie sur la surface de la gélose au sang.
Après incubation à 37oC pendant 24h, l'hémolyse des érythrocytes du sang de
cheval s'exprime par la présence d'un halo d'hémolyse autour des colonies.
2.5.7. Pouvoir acidifiant :
La mesure de l’activité acidifiante consiste à suivre d’une part l’évolution du pH des
différentes cultures en fonction du temps et d’autre part à doser simultanément l’acidité
totale par la soude. On commence par la préparation de lait écrémé à 10% dans des flacons
de capacité 250mL. Après stérilisation et refroidissement à la température d’ensemencement,
chaque flacon est ensemencé par une culture lactique (V/ 100V). Après incubation à 37°C, à
un intervalle du temps 2h, 6h et 24h; 10mL du lait est prélevé puis titrer par la soude Dornic
(N/9) en présence de 5 gouttes de phénolphtaléine, jusqu’au virage de la couleur au rose pâle
persistant au moins 10 secondes (Larpent, 1997).
L’acidité est déterminée par la formule :
Acidité (°D) = V NaOH x 10
Où :
V NaOH: Volume de NaOH utilisé pour titrer l’acide lactique contenu dans les 10mL de lait.
La mesure de pH est faite directement par le pH-mètre, en plongeant l’électrode
dans le volume du lait. Le pH a été déterminé à chaque fois qu’on procède au dosage de
l’acide lactique.
90
Matériel & Méthodes
III. Examen anatomo-pathologique et cytologique des biopsies gastriques :
1. Fixation des biopsies gastriques:
Pour détecter H.pylori une biopsie gastrique prélevée des patients par endoscopie
digestive haute est mise dans le formol à 4% pour l'examen anatomo-pathologique et
cytologique.
Le but de la fixation est de conserver et immobiliser les structures des constituants
tissulaires/cellulaires. En effet, le prélèvement des tissus provoque leur mort: les cellules
déversent leurs enzymes, ce qui provoque une autodigestion du tissu. La fixation prévient
l’autolyse cellulaire (Lullmann-Rauch, 2008).
De plus, à l'air ambiant, les prélèvements peuvent être contaminés par des bactéries,
ce qui entraîne une putréfaction des tissus post-mortem. Le principe de la fixation repose sur
le fait que le formol réagit avec les groupements aminés des protéines. Elle permet à la
technique histologique et les colorations ultérieures (Lullmann-Rauch, 2008).
L’anatomie pathologique officiellement dénommée anatomie et cytologie
pathologiques (ACP) ou Pathologie, est une spécialité médicale indispensable dans la chaîne
des soins. Elle est axée sur le diagnostic des lésions à partir de leur aspect morphologique.
C'est un examen diagnostique, basé sur l’observation morphologique, notamment au
microscope (AFAQAP, 2009).
Elle s’appuie sur des bases fondamentales d’anatomie normale, d’histologie et de
cytologie pour identifier des anomalies morphologiques macroscopiques et microscopiques
et sur des techniques d’histochimie, d’immunologie, de cytogénétique et de biologie
moléculaire pour identifier des anomalies moléculaires dans les cellules ou les tissus
(AFAQAP, 2009).
91
Matériel & Méthodes
2. Etapes d'un examen ACP:
2.1. Macroscopie:
Sous hotte d'influx laminaire (Gelaire, Biohazard), les biopsies sont décrites,
mesurées, étudiés en totalité (incluant total) et mises dans des cassettes. La technique
consiste à préparer les biopsies, à les traiter et à les rendre observables au microscope par
création de préparations colorées sur des lames de verre (Figure 29) (AFAQAP, 2009).
2.2. Déshydratation :
Cette étape consiste à préparer les tissus à l'inclusion en paraffine. Elle est réalisée
dans un automate type Leica (Tp/1020). L’intérêt de la déshydratation est d’éliminer le
fixateur. On passe les tissus dans des bains de formol pendant 1h et d'alcool de degré
croissant (50°/1h, 60°/1h, 70°/1h, 80°/1h, 96°/1h30, 96°/1h30). L'alcool est ensuite remplacé
par un solvant miscible à la paraffine : il s'agit de xylène (deux bains de xylène pendant
1h30). Enfin, trois bains de paraffine sont réalisés pendant 1h30.
Ces substances éliminent l’éthanol. Au fur et à mesure de leur infiltration par le
solvant, les tissus ont tendance à s'éclaircir : cette étape est donc parfois appelée
éclaircissement ou clarification (Lullmann-Rauch, 2008).
2.3. Inclusion :
Une fois totalement imprégné, le tissu est placé dans de la paraffine fondue (portée
à 56/58°C); la chaleur provoque l'évaporation du solvant et sa dissolution dans la paraffine:
les espaces ainsi libérés sont remplis par la paraffine. Puis la paraffine est placée dans de
petits moules, à température ambiante, ce qui provoque son durcissement et donc la
rigidification des biopsies. On procède alors au démoulage : on obtient des biopsies inclus
dans un bloc de paraffine (Lullmann-Rauch, 2008).
92
Matériel & Méthodes
Fig. 29: Etapes d'un examen ACP (Anatomie Cytologique et Pathologique) (AFAQAP,
2009)
Fixation des biopsies gastriques dans 4% du formol
Macroscopie
Déshydratation (Leica Tp/1020).
Inclusion (paraffine fondue)
Microtomie (Leica RM 2125 RTS)
Coloration des lames (HE, Giemsa L)
Montage des lames
Observation sous microscope optique
93
Matériel & Méthodes
2.4. Microtomie:
On isole ensuite des coupes dans le bloc de paraffine. On utilise pour cela un
microtome type Leica (RM 2125 RTS), qui fait avancer le bloc sur un rasoir : le bloc avance
d'environ 2 à 3 µm à chaque fois (les coupes mesurent environ 5 µm). L'ensemble des
tranches va former un ruban dans lequel on retrouve des coupes sériées des biopsies. Les
rubans sont déposés sur des lames contenant de l'eau distillée. Ces lames vont été séchées sur
une plaque chauffante pendant 1h, et étuvées après à 80oC pendant 10mn afin d'éliminer la
paraffine (Lullmann-Rauch, 2008).
2.5. Coloration des lames :
2.5.1. Coloration à HE:
C'est une coloration alliant une laque nucléaire (Hématoxyline basique) et un
colorant cytoplasmique (Erythrosine acide). Pour que l'on puisse utiliser une coloration, la
paraffine doit être éliminée. On procède donc au déparaffinage dans un automate Sakura
(Japan), qui consiste à passer les lames dans trois bains de xylène (2min) afin de dissoudre la
paraffine. Ensuite, on procède à la coloration qui consiste à faire passer les lames dans des
bains d'alcool, de colorants, d'HCl et d'eau (Figure 30).
2.5.2. Coloration Giemsa Long:
C'est une coloration de Giemsa peu différenciée afin de mieux visualiser
Helicobacter pylori(coloration en bleu foncé). Les lames sont déparaffinées et rincées à l'eau
distillée. Ensuite, elles sont colorées par le Giemsa lent dilué à 20 % dans l'eau distillée à pH
7 pendant 1 h à température du laboratoire. Après rinçage à l'eau distillée (pH7), on procède
à un passage dans 3 bains successifs d'alcool à concentration croissante pendant 1 à 2
minutes/bain et dans un bain de xylène (Zine-Charaf, 2007).
2.6. Montage des lames:
Les lames sont montées pour préserver les colorations. Les lames sont déshydratées
grâce à des bains en xylène. Ensuite, des lamelles de verre sont colées par-dessus (grâce à
des résines synthétiques) afin de préserver les préparations. Les lames ainsi montées peuvent
être conservées pendant plusieurs dizaines voire plusieurs centaines d'années (Lullmann-
Rauch, 2008). 94
Matériel & Méthodes
Xylène Xylène Xylène
Alcool 96o
Alcool 96o
Alcool 96o
2mn 2mn 2mn
3mn 3mn 3mn
Eau distillée 3mn
Hématoxyline de Harris
Eosine orange G
Eau courante
HCl
Alcool 96o
Carbonate de lithium
Eau distillée
6mn
3mn
30s
3mn
3mn
3mn
12mn
Eau courante 3mn
Alcool 96o Alcool 96o
Xylène Xylène Xylène
2mn 2mn 2mn
3mn 3mn
Fig. 30: Etapes de la coloration à Hématoxyline éosine 95
Matériel & Méthodes
IV. Etude de l'activité antibactérienne:
1. Interaction des bactéries lactiques avec les souches d’H.pylori in vitro:
1.1. Préparation des précultures des souches d'Helicobacter pylori:
Les souches pathogènes utilisées dans ce travail sont des souches d'H.pylori
proviennent du centre national de référence des Campylobacters et des Helicobacters de
Bordeaux, transportées dans le milieu BIO-RAD (souches de référence : 26695 ; J99 ;
TN2GF4 et HPAG1, souche clinique : HSA3068) (Tableau V) et les souches d'H.pylori
isolées sur gélose pylori et maison au niveau de laboratoire de bactériologie de l'hôpital
Cochin. Une portion de ces milieux a été dispersée dans quelques millilitres de bouillon
Brucella (Annexe). Ensuite, on ensemence la gélose Brucella additionnée à 10% du sang de
cheval par une goutte de ce bouillon. On incube à 37oC pendant 03 jours et sous atmosphère
microaérophile. Après 03 jours d'incubation, les colonies translucides de couleur grisâtre
seront identifiées en vérifiant:le Gram; l'activité oxydase; l'activité catalase et l'uréase. Pour
étudier l'effet antibactérien des bactéries lactiques, les souches H.pylori repiquées sont
ensemencées dans 5mL de bouillon Brucella et incubées à 37oC pendant 24h et sous
atmosphère microaérophile.
1.2. Préparation des précultures des souches de bactéries lactiques:
Pour déterminer le pouvoir antibactérien, les souches de bactéries lactiques isolées
et purifiées sont ensemencées dans 05 mL de bouillon M17 et incubées à 37oC pendant 24h.
1.3. Antagonisme:
Les bactéries lactiques sont douées des propriétés antibactériennes qui dépendent de
plusieurs critères: le pH, le milieu de croissance et la production de substances
antibactériennes comme les bactériocines, les acides organique et le peroxyde d'hydrogène
(Huttunen et al. 1995). Notre travail s'intéresse sur l'étude du pouvoir antibactérien des
précultures des bactéries lactiques testées suivant la méthode de disques (Tadess et al.
2004). Les boites de Pétri contenant milieu Muller Hinton (Institut Pasteur d'Algérie), sont
inoculées par un mL de précultures d’H.pylori (107 CFU/ mL). Après un séchage de 30
minutes à 37°C, des disques de 6mm de diamètre imprégnés par 50µl de bouillon des
bactéries lactiques, sont déposés à la surface de la gélose, avec trois
96
Matériel & Méthodes
répétitions pour chaque souche de bactérie lactique. Les boites de Pétri ainsi préparées sont
préincubées dans des conditions réfrigérées pendant 2 à 4 heures à 4°C afin de permettre la
diffusion de l’agent inhibiteur qui sera suivie par l’incubation pendant 24 heures à 37°C
(Figure 31). La lecture se fait par la mesure du diamètre en mm des zones d’inhibition
formées autour des disques (Zi). Une inhibition est considérée positive, si le diamètre est
supérieur à 2mm (Thompson et al. 1996). La mesure du diamètre de Zi est effectuée selon la
formule suivante: Zi en (mm)= diamètre de la zone d’inhibition obtenue (mm)- diamètre de
disque (6mm).
Tableau V: souches de Helicobacter pylori
Souches 26695 J99 TN2GF4 HPAG1 HSA3068
Etest - Metronidasol - Amoxicyline - Clarithromycine
S S S
S R R
S R R
S S S
S S S
Disc ATB - Rifampicine - Tetracycline - Levofloxacyne
S S S
S S S
S S R
S S S
S S S
Alleles ATCC700824 ATCC700392 / / /
pathologies Ulcère Gastrite Ulcère Gastrite Chronique Atrophique
/
Infection souris Non Oui ? ? ?
CagPAI + + + + /
CagA3’ + + + + /
TPM P1+ P1+ P1- P1+ /
CagE + + + + /
CagI + + + + /
VirD4/VirB11 + + + + /
Vac slmLil slmLil slmLil slmLil /
BabA BabA2 BabA1 BabA2 BabA2 /
Ice A2 A1 A1A2 A1 /
SabA off off / / /
PMID / / / 2,00E+07 /
S: sensible, R: résistant, /: non réalisée , ?: incertaine , +: présence 97
Matériel & Méthodes
Fig.31: interaction des bactéries lactiques avec les souches de Helicobacter pylori in vitro.
Incubation à 37 oC/24h
5mL Brucella
5 mL M17
1 mL
Hp BL
Disques stériles
imbibés par 50
µl de BL
MH
Séchage à 37 oC/30 min
Incubation à 2-4 oC/4h
Incubation à 37 oC/24h
Lecture
98
Matériel & Méthodes
2. Détermination de l’activité bactériocinogénique 2.1. Préparation de l’extrait bactériocinique :
Un volume de 100 mL de préculture de bactérie lactique qui a donné la meilleure
zone d’inhibition est centrifugé pendant 20 minutes à 10 000 tours / min et à +4°C. Le
surnageant, représentant la fraction extracellulaire est filtré sur une membrane de l’acétate de
cellulose (0,45µm) puis conservé à+4°C, le culot est lavé deux fois avec de l’eau distillée,
séché puis additionné de méthanol selon un rapport de volume de 2/3. Le Méthanol est utilisé
pour l’extraction éventuelle de la bactériocine. Le mélange est centrifugé pendant 20 minutes
à 10 000 tours / min et à +4°C. Le surnageant obtenue est l'extrait cellulaire. L'effet
inhibiteur du surnageant (fraction extracellulaire) et culot (extrait cellulaire) vis-à-vis les
souches d’H .pylori a été déterminé par la méthode de diffusion sur gélose et avec trois
répétitions (Labioui et al. 2005).
2.2. Elimination de l’effet des acides organiques et de peroxyde d’hydrogène :
Les bactéries lactiques peuvent produire des substances inhibitrices différentes des
bactériocines. Pour éliminer l’effet des acides organiques, notamment des acides lactique et
acétique, le surnageant a été neutralisé à pH 6,5 par une solution de NaOH (0,1 N). Afin
d’éliminer le peroxyde d’hydrogène accumulé dans le milieu de culture, le surnageant a aussi
été traité par une catalase (5mg/1mL, Institut pasteur d’Algérie) à 30°C pendant 2h avant de
procéder au test d’inhibition (Elmoualdi et al. 2008). L’inhibition a été réalisée sur le
surnageant (fraction extracellulaire) et sur le culot (extrait cellulaire) avec les souches d’H
.pylori suivant la méthode de diffusion sur gélose et avec trois répétitions.
2.3. Effet de l'extrait bactériocinogénique sur H.pylori en milieu liquide:
Cette partie s'intéresse à étudier l'effet de l'extrait bactériocinogénique de la bactérie
lactique qui a montré un net effet inhibiteur de H.pylori sur milieu gélosé. Le surnageant a
été neutralisé à pH 6,5 par une solution de NaOH (0,1 N) et traité par une catalase
(5mg/1mL, Institut pasteur d’Algérie) à 30°C pendant 2h afin d'éliminer les acides
organiques et H2O2 présentent dans le milieu. Pour réaliser le test d'inhibition en milieu
liquide, on a suivi le protocole établi par Lin et al. (2011) et Guetarni et al. (2012), dont
250 µL du surnageant de la bactérie lactique a été ensemencé avec 250µL de 99
Matériel & Méthodes
préculture de H.pylori (107 CFU /mL) et incubé à 37oC pendant 126h. Après chaque 18h, une
culture de Helicobacter pylori a été faite sur gélose Brucella additionné à 10% du sang de
cheval et incubé à 37 oC sous atmosphère microaérophile. Le dénombrement des colonies de
Helicobacter pylori a été fait sur gélose au sang.
2.4. Influence du pH sur l'activité des bactériocines:
La stabilité de la substance antagoniste aux pH acide et basique a été étudiée en
ajustant le pH du surnageant aux valeurs désirées (pH4 et pH8) par l’ajout de tampons
préparés à ces valeurs et à double concentration. Ensuite l’activité inhibitrice du surnageant
vis-à-vis les souches d’H.pylori est testée par la méthode de diffusion sur gélose
(Achemchem et al. 2004).
2.5. Influence de la température sur la stabilité des bactériocines:
Pour la détermination de la thermostabilité des substances inhibitrices, en traitant le
surnageant de la bactérie lactique à 60oC pendant 30 minutes, à 80oC pendant 10 minutes et à
100oC pendant 05 minutes. Après refroidissement, l’activité de la bactériocine est testée par
la méthode de diffusion sur gélose (Achemchem et al. 2004).
2.6. Influence des enzymes sur la stabilité des bactériocines:
La nature de la bactériocine est déterminée sous l’action des enzymes suivantes :
Pepsine (Merck 2000UI/g), Trypsine (Merck from bovine pancreas 40 UI/mg) et α amylase
(Merck 20 à 160 UI/g) (Achemchem et al. 2004). L'alpha-amylase brise les liens α (1-4)
glycosidiques à l'intérieur des chaînes de l'amylose et de l'amylopectine pour ultimement
donner des molécules de maltose. La pepsine est une endoprotéase qui hydrolyse les liaisons
peptidiques dans lesquelles un acide aminé aromatique (Tyr, Trp, Phe) engage sa fonction
amine. La trypsine est une endoprotéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans
lesquelles un acide aminé basique (Lys ou Arg) engage sa fonction acide (Garrett et
Grisham, 2000). Le surnageant, doté d’activité inhibitrice, de la bactérie productrice est
additionné de la pepsine, de la trypsine et de l’ α amylase à une concentration final de 1
mg/mL. Le mélange est incubé à 37oC pendant 2h. L’activité de la bactériocine est testée par
la méthode de diffusion sur gélose (Achemchem et al. 2004).
100
Matériel & Méthodes
3. Etude de l'activité antibactérienne in vivo:
La bactérie lactique qui a donné une meilleure zone d'inhibition in vitro fait l'objet
d'une étude in vivo pour déterminer son effet probiotique sur Helicobacter pylori.
3.1. Préparation des souris:
Des souris Balb/c, holoxéniques, femelles âgées de deux mois provenant de l'institut
Pasteur d'Algérie sont logées dans des cages en bois bien aérées mesurant 9177 cm3. Les
souris sont nourries avec des grains de blé deux fois par jour et ont eu de l’eau à volonté.
L’hygiène des souris consiste à changer la litière (sciure de bois) deux fois par semaine ainsi
les abreuvoirs doit être nettoyer quotidiennement.
Ces souris sont reparties en 3 lots:
Lot 1 : c'est un lot témoin contenant 12 souris holoxéniques qui n'ont subit aucun
traitement;
Lot 2 : un lot de 12 souris infectées par la souche H.pylori qui a montré la grande
sensibilité vers les bactéries lactiques étudiées.
Lot 3 : un lot de 12 souris infectées par H.pylori et traité par la bactérie lactique qui a
engendré l'inhibition de ce pathogène.
3.2. Analyse microbiologique des selles de souris:
Les souris holoxéniques hébergent dans leur tractus digestif un microbiote inconnu
par l’expérimentateur, alors des analyses des selles sont faites pour déterminer le moins des
germes occupés par l’intestin (surtout les bactéries pathogènes) et contrôler la présence
surtout de la bactérie lactique à étudier (Doumandji et Neche, 2008).
3.2.1. Prélèvement des selles:
L’analyse des selles est effectuée pour la moitié du groupe témoin. Les selles sont
prélevées avant administration de bactérie lactique ou de H pylori. Les selles fraîches sont
recueillies dans des pots stériles en plastique.
101
Matériel & Méthodes
3.2.2. Analyses bactériologique: Les germes recherchés sont :
E. coli : des boites de Pétri contenant la gélose désoxycholate sont ensemencées en surface
par l’écouvillon, puis incuber à 44°C pendant 24h.
Salmonella : à partir des échantillons des selles, porter aseptiquement 1mL dans un tube
contenant 9 mL de bouillon d’enrichissement (Sélénite cystéine), puis incuber à 37°C
pendant 24h. Seront présumés positifs, les tubes ayant un trouble microbien. Les tubes
positifs feront l’objet d’une confirmation par isolement sur gélose Héktoen. Les boites seront
incubées à 37°C pendant 24h.
Shigella : à partir des échantillons des selles on ensemence en surface les boites de Pétri
contenant de la gélose Héktoen, puis incuber à 37°C pendant 24h.
Staphylococcus :
- Enrichissement sur milieu de Giolitti Cantonii
On ajoute 15 mL d’une solution de tellurite de potassium dans un flacon contenant le milieu
de Giolitti Cantonii. Le milieu est alors prêt à l’emploi.
A partir des selles porter aseptiquement 1 mL dans un tube à vis stérile. Ajouter par la suite
environ 5 mL du milieu d’enrichissement, puis incuber à 37°C pendant 24h.
Seront présumés positifs, les tubes ayant virés au noir.
-Isolement sur gélose Chapman
Des boites de Pétri contenant milieu Chapman seront ensemencées à partir des tubes positifs,
puis incubées à 37°C pendant 24h à 48h.
Streptococcus : couler les boites de Pétri avec la gélose Columbia au sang, puis ensemencer
en surface et incuber à 37°C pendant 24h.
Enterococcus : à partir des échantillons des selles, ensemencer les boites de Pétri contenant
la gélose M17. Ensuite incuber à 37°C pendant 48h.
Lactobacilles : à partir des échantillons des selles ensemencer en surface par l’écouvillon, les
boites de Pétri contenant la gélose MRS. Ensuite incuber à 37°C pendant 48h.
Lactococcus : à partir des échantillons des selles ensemencer en surface par l’écouvillon, les
boites de Pétri contenant la gélose M17. Ensuite incuber à 37°C pendant 48h.
Clostridium : à partir des échantillons des selles, porter aseptiquement 1mL dans un tube à
vis stérile. Ce tube serait soumis à un chauffage à 80°C pendant 10 minutes, puis à un 102
Matériel & Méthodes
refroidissement immédiat sous l’eau de robinet, dans le but d’éliminer les formes végétatives
et de garder uniquement les formes sporulées. Après on ajoute 15 mL de gélose viande foie
additionnée à l’alun de fer et sulfite de sodium. Pour créer l’atmosphère anaérobie on prend
un coton stérile et on met dans l’alcool puis on allume le coton dans l’ouverture de tube.
Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes. Puis incuber à 37°C pendant 24h.
Levures et moisissures : à partir des échantillons des selles ensemencer en surface les boites
de Pétri contenant la gélose Sabouraud. Ensuite incuber à 22°C pendant 5 jours.
3.2.3. Identification:
L'identification des bactéries isolées a été faite par des galeries biochimiques
contenant les milieux (Institut Pasteur d'Algérie) et les tests suivants: Catalase, Oxydase,
Citrate-Simmons, Mannitol-mobilité, TSI (Triple Sugar Iron), LDC (Lysine décarboxylase),
ODC (Ornithine décarboxylase), ADH (Arginine déshydrogénase), ONPG (Ortho-Nitro-
Phenyl-Galactopyranozide) et Urée-indole.
3.3. Recherche de Helicobacter pylori dans l'estomac de souris:
L’euthanasie d'une souris est réalisée par inhalation du formol. L’estomac est
prélevé dans des conditions d’asepsies maximales sous hotte à flux laminaire puis ouvert
dans le sens longitudinal. Un fragment biopsique a été prélevé du pylore et broyé dans 1 mL
de bouillon Brucella. Deux dilutions successives au 1/10ème et au 1/100ème sont effectuées
puis 100 µl de chaque suspension est étalée sur gélose Brucella additionnée de 10% du sang
de cheval et incubé à 37oC pendant 3 à 5 jours et sous une atmosphère microaérophile
(Figure 32).
3.4. Infection des souris par H. pylori :
Les souris des lots 2 et 3 ont été inoculées par voie orale d’une suspension d’H
pylori préparée à partir d’une culture fraîche, incubée à 37 oC pendant 24h et sous une
atmosphère microaérophile. La dose infectante de H.pylori a été déterminée par une lecture
réalisée à l'aide de spectromètre UV/visible (λ= 590nm), dont la quantité à inoculer est fixée
à 0,5 mL (109 CFU/mL≈0.6DO). Selon Sgouras et al. (2004), H.pylori est administrée trois
fois pendant une semaine, avec un intervalle de 2 jours entre les inoculations à l’aide d’une
sonde de gavage reliée à une seringue 103
Matériel & Méthodes
3.5. Traitement des souris infectées par H.pylori :
Après trois semaines post infection, un groupe de souris infecté par H.pylori (6
souris) est traité pendant sept jours avec 1mL de lait ensemencé avec 107 CFU/mL≈0.1 DO
de la bactérie lactique qui a donné un net effet inhibiteur in vitro (Coconnier et al. 1998).
3.6. Détection bactérienne :
Dans les 3ème et 4ème semaines, six souris des lots 2 et 3 et une souris du lot témoin
ont été tuées et aseptiquement disséqués. L’estomac de chaque souris a été enlevé et la
présence de H pylori a été détectée après un dénombrement effectué sur une culture d’une
biopsie gastrique, par la coloration de Gram, test à l’urée, test de catalase et de l’oxydase.
Ainsi que les selles des souris traitées ont été recueillies et analysées pour déterminer la
présence de la bactérie lactique administrée par voie orale (Sgouras et al. 2004).
Test à l’urée : un fragment de biopsie gastrique est mis dans un tube contenant de l’urée
indole et incuber à 37°C pendant 18h à 24h, le résultat positif est interprété par le
changement de couleur de l’orange au rose.
Coloration de Gram: un fragment de biopsie gastrique est écrasé à l’aide de deux lames en
fixant à la flamme ; ensuite coloré par la méthode de Gram.
Isolement sur gélose :
- A partir de la partie terminale de l’estomac (pylore) prélever un fragment gastrique et
écraser dans 2 mL de bouillon BGT pour permettre la dispersion des bactéries.
-Prendre 1mL de broyat et mettre dans 9 mL d’eau physiologique. Réaliser des
dilutions décimales successives jusqu’à 10-2;
-A partir de la dernière dilution ensemencer 1mL dans une boite de Pétri contenant
gélose Columbia additionnée à 10% de sang de cheval.
-Incuber à 37°C pendant 3 à 5 jours sous une atmosphère microaérophile.
L’espèce Helicobacter pylori est déterminée par la coloration de Gram, test à
l’urée, de l’oxydase et de la catalase.
104
Matériel & Méthodes
Dissection des souris
Coupure de l’estomac
Culture sur gélose Columbia au sang Test à l’uréase
Coloration de Gram d'une biopsie gastrique
Fig. 32 : Etapes de détection d’H.pylori après dissection des souris. 105
RESULTATS
Résultats
I. Eude microbiologique: 1. Isolement et caractérisation de Helicobacter pylori:
1.1. Test rapide à l'uréase:
Le test à l’uréase est basé sur la production abondante d’uréase par H .pylori .
des biopsies gastriques prélevées par endoscopie digestive haute sont mises dans un
milieu contenant l’urée. Les résultats montrent un virage au rose du mileu contenant les
biopsies gastriques(Figure 33).
Fig. 33: Test rapide à l'uréase
1.2. Ensemencement des biopsies gastriques pour la recherche d'Helicobacter pylori:
Des broyats des biopsies prélevées d'un échantillon de patients sont ensemencés
sur deux milieux : gélose pylo et gélose maison. Après 7 jours d’incubation à 37oC sous
une atmosphère microaérophile, de fines colonies, transparentes à grisâtres et luisantes,
apparaissent dans les boites contenant la gélose maison ; ces caractères culturaux
correspondent à Helicobacter pylori. Les colonies sont étalées sur la gélose maison et
remise à incuber afin d'obtenir une nappe bactérienne sur la gélose (Figure 34).
106
Résultats
Cette gélose est constituée à base de milieu Müller Hinton et deux antibiotiques:
Amphotéricine et Vancomycine. La croissance de H.pylori indique que la gélose de
Müller Hinton constitue un milieu de base pour la fabrication de gélose au sang. La
croissance de H.pylori montre que ce milieu contient les éléments nécessaires pour sa
prolifération. Ainsi l'ajout du sang de cheval au milieu Müller Hinton est appropriée pour
cultiver cette bactérie.
L'examen microscopique d'un frottis préparé à partir des colonies suspectes en
fixant la goutte de la suspension bactérienne à la flamme; ensuite le frottis est coloré par la
méthode de Gram a permis d'observer des cellules fines de couleur rose prouvant leur
appartenance aux Gram négatif. Ces cellules prennent beaucoup plus la forme de bacille.
Ce sont les caractères morphologiques des cellules H.pylori sous microscope optique
(Figure 35). Deux souches de H.pylori isolées sur gélose Maison, ont montré la présence
d'une uréase très active, une oxydase et une catalase.
Fig. 34: Aspect des colonies de Helicobacter pylori sur gélose maison après incubation à 37oC
pendant 7jours et sous atmosphère microaérophile.
107
Résultats
Fig.35: Aspect de cellules de Helicobacter pylori après culture sur gélose maison sous
microscope optique après coloration de Gram (10X100)
1.3. Observation microscopique des frottis réalisés à partir des biopsies gastriques:
Des frottis réalisés à partir des biopsies gastriques sont colorés par la méthode de
Gram dans un appareil de Slaide Stainer-Cytocentrifuge (Wescor). L'observation
microscopique à l'immersion montre la présence des bactéries incurvées à Gram négatif
dans les biopsies gastriques. Ces bactéries sont Helicobacter pylori (Figure 36).
Fig. 36: Observation microscopique d'un frottis préparé à partir d'une biopsie gastrique et
coloré par la méthode de Gram (10X100).
Helicobacter pylori
108
Résultats
1.4. Quantification de Helicobacter pylori dans des biopsies gastriques par la PCR en
temps réel:
Afin de rechercher H.pylori dans les biopsies gastriques et de déterminer sa
sensibilité au clarithromycine, une PCR en temps réel a été réalisée. Cette PCR repose sur
la possibilité de suivre au cours du temps le processus de PCR à l’aide de la fluorescence.
Les données de fluorescence à chaque cycle de la PCR sont collectées et exprimées par
des courbes à l'aide du logiciel Light Cycler Software Version 4.0.5.415 (Roche).
Les étapes de base de la détection de l'ADN au cours de PCR en temps réel sur le
système LightCycler consiste à une dénaturation de l'ADN double brins (50cycles avec
une température de transition 20 ° C / s). Elle s’effectue à une température de 95°C
pendant 0 S, dite température de dénaturation. La deuxième période s’effectue à une
température de 60°C pendant 10 s dite température d’hybridation des amorces.
La troisième période s’effectue pendant 17s à 72°C, dite température
d’élongation. À cette température, la FastStart polymérase Taq ADN se lie aux ADN
monocaténaires amorcés et catalyse la réplication en utilisant les dNTP présents dans le
mélange réactionnel. Après amplification de l'ADN une étape de fusion a été réalisée, elle
consiste à : une dénaturation à 95 ° C pendant 0 s, un refroidissement à 45 ° C pendant 30
s (avec une température de transition de 20 ° C / s), et enfin une montée lente de la
température à 85 ° C à une vitesse de 0,1 ° C / s, avec acquisition continue de déclin de
fluorescence.
La figure 37 montre des courbes d'amplification d'ADN, ces courbes expriment
la fluorescence émise en fonction du nombre de cycles, dont on obtient trois courbes
d'amplification (courbe en bleu pour le témoin positif utilisé pour déterminer la présence
des souches d'H.pylori sensibles au clarithromycine "Wildtype"), courbe en rouge indique
la présence d'H.pylori dans la biopsie 1 et courbe en rose indique aussi la présence de
H.pylori dans la biopsie 3). Nous avons remarqué la présence de trois phases pour chaque
courbe d'amplification:
- une phase où la quantité du fragment amplifié est insuffisante pour générer un signal
fluorescent, c'est la phase de bruit de fond.
109
Résultats
- une phase dont un signal fluorescent a été détecté. Ce signale exprime une phase
exponentiel. Au début de la réaction PCR il y a plus de matrice à amplifier pour cela nous
avons enregistré un nombre faible de cycles pour atteindre un point où le signal
d’émission de fluorescence sera plus élevé que le bruit de fond. Ce point est le cycle seuil
(Threshold cycle, Ct ou Cp). La détection qualitative à 640 nm montre que le témoin
positif donne un nombre de cycle (CP) égale à 35,67, les biopsies 1 et 3 leur CP varie de
39,29 et 38, 95, respectivement (Tableau VI).
- une troisième phase a été constatée dans les courbes d'amplification d'ADN est exprimée
par une diminution du nombre de certains composants de la réaction, c'est la phase
plateau.
Fig. 37: Courbes d'amplification qui exprime la quantité d'amplicons produits (Fluorescence
(640/530) émise en fonction du nombre de cycles: témoin positif (détecte la présence des souches
Wildtype) (courbe bleu), témoin négatif (H2O) (courbe vert clair), biopsie 1(courbe rouge),
biopsie 2 (courbe noir), biopsie 3(courbe rose), et biopsie 4 (courbe vert foncé)).
1: phase initiale 2: phase exponentielle 3: phase plateau
110
Résultats
Tableau VI: Résultats de la détection qualitative
Position Nom Type Résultats
CP Score
1 Témoin
positif
Contrôle
Positif
35,67 5,00
2 Témoin
négatif
Contrôle
Négatif
-2,91
3 Biopsie 1 inconnu 39,29 5,00
4 Biopsie 2 inconnu -5,00
5 Biopsie 3 inconnu 38,95 5,00
6 Biopsie 4 inconnu -3,99
Pour prouver que le seul produit désiré a été amplifié par PCR, on effectue une
analyse des courbes de fusion (Figure 38 et 39). Chaque pic de fusion représente une
température caractéristique (Tm) d'un produit d'ADN. Les facteurs les plus importants qui
déterminent le Tm d'ADN double brin sont la longueur de GC contenu dans ce fragment.
Selon le tableau VII, le témoin positif utilisé dans cette étude donne un Tm égale à 55,96.
Par comparaison avec les Tm des courbes d'amplification d'ADN des souches
d'H.pylori, la biopsie 1 donne un Tm égale à 64,48 et la biopsie 3 un Tm égale à 63,91.
On conclus que les souches de H.pylori sont sensibles au clarithromycine. Les résultats
obtenus montrent la présence de H.pylori dans deux biopsies gastriques prélevés des
patients. Ce ci exprime la possibilité de traiter H.pylori par la clarithromycine qui
représente un intérêt clinique dans le traitement de H.pylori .
111
Résultats
Tableau VII: Tm, Aire, L et l de chaque pic.
Position Nom de l'échantillon Pic
Tm Aire Largeur Longueur
1 Témoin positif 55,96 0,32 1,40 0,07
2 Témoin négatif
3 Biopsie 1 64,48 0,03 1,39 0,00
4 Biopsie 2
5 Biopsie 3 63,91 0,13 1,49 0,04
6 Biopsie 4
Fig. 38: Analyse des courbes de fusion: Fluorescence (640/530) émise en fonction de la température:
témoin positif (courbe bleu), témoin négatif (courbe vert clair), biopsie 1(courbe rouge), biopsie 2
(courbe noir), biopsie 3(courbe rose), et biopsie 4 (courbe vert foncé).
112
Résultats
2. Isolement et caractérisation des bactéries lactiques:
2.1. Analyses du lait cru:
Des échantillons du lait cru de vache, chèvre et brebis prélevés de Miliana et de
Ain Defla; et d'autres échantillons du lait de chamelle prélevés de Biskra et Tamanrasset
(au nombre de trois échantillons pour chaque type de lait et pour chaque région), ayant
subi des analyses afin de prendre une idée sur la qualité du lait cru prélevé avant d'entamer
l'isolement des bactéries lactiques.
2.1.1. Tests préliminaires:
Les mesures de pH du lait cru qui ont été faites dés l'arrivée des échantillons au
laboratoire permettent de savoir le stade d’évolution du lait au cours de la traite, du
Fig. 39: Les courbes de fusion : dérivées primaires donnant les Tm afin de déterminer les souches
wildtype et mutantes. La courbe de fusion des souches d'H.pylori Wildtype de la biopsie 1 (courbe
rouge) (Tm = 64,48) et la biopsie 3 (courbe rose) (Tm= 63,913).
113
Résultats
transport, du stockage,…etc. Le test de la réductase réalisé sur les échantillons du lait cru
après ajout du bleu de méthylène à 1% et incubation à 37 oC indique la charge
microbienne du lait. Les résultats de ces deux tests sont présentés dans le tableau VIII. Les
valeurs moyennes du pH des échantillons du lait varient entre 6,42 et 6, 62, dont nous
avons enregistré un pH moyen acide de 6,42 avec les échantillons du lait de chamelle
prélevés de Tamanrasset (E19, E20 et E21). D'autre part, les échantillons E10, E11 et E12
prélevés du lait cru de vache de Ain Defla ont donné un pH moyen de 6,68 par apport au
autres types de lait (Tableau VIII).
Le test de la réductase indique que 9 échantillons sur 24 décolorent le bleu de
méthylène en moins de deux heures, qui sont présentés par :
Trois échantillons du lait de chèvre : E1, E4 et E5;
Deux échantillons du lait de vache: E10 et E11;
Deux échantillons du lait de Brebis: E13 et E16;
Deux échantillons du lait de chamelle: E19 et E24.
2.1.2. Analyses microbiologiques:
Le lait cru peut contenir une grande variabilité des germes, un dénombrement de
ces derniers nécessite la préparation des dilutions décimales des échantillons du lait cru
prélevés. Ces dilutions servent à l'inoculation des milieux de culture appropriés.
Les analyses microbiologiques effectuées ont pour but de rechercher:
- les germes potentiellement pathogènes pour le consommateur (les anaérobies sulfito-
réducteurs et Staphylococcus aureus).
- les germes tests d’hygiène générale (les germes aérobies mésophiles totaux "flore totale"
"GAMT", les coliformes fécaux et les streptocoques fécaux).
114
Résultats
Tableau VIII: Résultats des tests de pH et la réductase des échantillons du lait cru.
Test N° échantillons
pH pH moyen Réductase
E1 M Ch 6,55
6,57
<2h
E2 M Ch 6,60 >5h
E3 M Ch 6,57 =3h
E4 AD Ch 6 ,48
6,52
<2h
E5 AD Ch 6,50 <2h
E6 AD Ch 6,60 >5h
E7 M V 6,60
6,62
> 5h
E8 M V 6,63 >5h
E9 M V 6,65 > 5h
E10 AD V 6,68
6,68
<2h
E11 AD V 6,64 <2h
E12 AD V 6,72 >5h
E13 M B 6,50
6,61
< 2h
E14 M B 6,52 > 5h
E15 M B 6,82 >5h
E16 AD B 6,75
6,66
<2h
E17 AD B 6,60 >5h
E18 AD B 6,65 > 5h
E19 T Cm 6,40
6,42
<2h
E20 T Cm 6,45 =4h
E21 T Cm 6,42 >5 h
E22 Bs Cm 6,47
6,5
>5h
E23 Bs Cm 6,50 >5h
E24 Bs Cm 6,55 <2h
E: échantillon; M: Miliana;AD: Ain Defla;T: Tamanrasset, Bs: Biskra; Ch:Chèvre, V: Vache, B:Brebis;
Cm:Chamelle
115
Résultats
2.1.2.1. Dénombrement des germes mésophiles totaux:
La flore totale ou les germes aérobies mésophiles totaux "GAMT" englobe les
microorganismes pathogènes d'une part, divers microorganismes d'altération d'autre part.
Le dénombrement de cette flore se fait après ensemencement des dilutions décimales sur
gélose PCA et incubation à 30oC pendant 72h. Après la durée d'incubation, des colonies
apparaissent sur la gélose PCA. Un comptage des colonies a été effectué, dont les
échantillons E1, E4, E5, E10, E11, E13, E16, E19 et E24 ont présenté un nombre
supérieur à celui lancé par la législation Algérienne qui est 105 germes/ mL, dont
l'échantillon E11 prélevé du lait cru de vache de la région de Ain Defla contient un taux
de 107 germes aérobies mésophiles totaux. Les résultats de dénombrement des germes
mésophiles totaux sont représentés par le tableau IX et la Figure 40.
GAMT: Germes Aérobies Mésophiles Totaux, E: Echantillon, Nbr: Nombre
Fig.40: Résultats de dénombrement des Germes aérobies mésophiles totaux (GAMT)
dans les échantillons du lait cru.
107
9x106
8x106
7x106
6x106
5x106
4x106
3x106
2x106
106
116
Résultats
Tableau IX: Résultats des analyses microbiologiques des échantillons du lait cru.
Analyse
microbiologique
GAMT CSD SF Staphyl.a CLF
Norme (JORA, 1998) 105 50 0/0,1ml Abs 103
Miliana Ch E1 106 30 Abs Abs 101
E2 105 00 Abs Abs 00
E3 2x104 00 Abs Abs 00
V E7 104 10 Abs Abs 00
E8 7x104 00 Abs Abs 00
E9 2x104 00 Abs Abs 00
B E13 9x106 10 Abs Abs 100
E14 8x104 00 Abs Abs 00
E15 105 00 Abs Abs 00
A.Defla Ch E4 5x105 00 Abs Abs 220
E5 106 00 Abs Abs 150
E6 7x104 00 Abs Abs 00
V E10 2x106 40 Abs Abs 320
E11 107 35 Abs Abs 118
E12 104 00 Abs Abs 00
B E16 7x105 00 Abs Abs 250
E17 2x104 00 Abs Abs 00
E18 5x104 00 Abs Abs 00
Tamanrasset Cm E19 9x105 25 Abs Abs 160
E20 104 00 Abs Abs 00
E21 4x104 00 Abs Abs 00
Biskra Cm E22 9x104 00 Abs Abs 00
E23 105 00 Abs Abs 00
E24 2x106 00 Abs Abs 100
E: échantillon, Ch: Chèvre; V: Vache; B: Brebis; Cm: Chamelle, Abs: absence
GAMT: germes aérobies mésophiles totaux, CSD: Clostridium sulfito-réducteurs, SF: streptocoques fécaux,
Staphyl.a: Staphylococcus aureus, CLF: Coliformes fécaux
117
Résultats
2.1.2.2. Dénombrement des coliformes fécaux:
Le dénombrement des coliformes dans le lait permet la mise en évidence d'une
pollution fécale et donc la possibilité d'une contamination par les entérobactéries
pathogènes. Les coliformes fécaux sont thermotolérants, l'espèce la plus recherchée est
Escherichia coli. Le dénombrement de ce pathogène a été réalisé après 24 à 48h
d'incubation à 44 oC sur gélose désoxycholaté à 0,1%. Des colonies violacées d’un
diamètre supérieur ou égal à 0,5mm et parfois entourées d'une zone rougeâtre due à la
précipitation de la bile ont été comptées. Parmi 24 échantillons, 9 contiennent des
coliformes fécaux, dont nous avons enregistré un taux le plus élevé de 320 germes/mL
avec l'échantillon E10 prélevé du lait de vache de Ain Defla. D'après les résultats obtenus,
tous les échantillons du lait cru présentent un taux moins de 103 germes /mL fixé par la
législation Algérienne (Figure 41).
CF:coliformes fécaux, E:Echantillon, Nbr: Nombre
Fig. 41: Résultats de dénombrement des coliformes fécaux (CLF) dans les échantillons
(E) du lait cru.
118
Résultats
2.1.2.3. Dénombrement des Clostridium sulfito- réducteurs:
Les clostridiums sulfito-réducteurs sont dénombrés sur gélose viande foie après
traitement thermique des dilutions décimales à 80 oC pendant 8 à 10 minutes. Après 24 à
48 h, des colonies noires caractéristiques des clostridiums sulfito-réducteurs apparaissent
dans 6 échantillons du lait cru, dont nous avons enregistré un taux plus élevé de 40 germes
/mL pour l'échantillon E10 prélevé du lait cru de vache de Ain Defla, des taux moyens de
35, 30 et 25 germes /mL ont été trouvés dans les échantillons E11, E1 et E19,
respectivement.
Alors les échantillons E7 et E13 prélevés du lait cru de vache et de brebis de la
région de Miliana contiennent que 10 clostridiums sulfito-réducteurs (Figure 42).
CSR: Clostridium sulfito-réducteurs, E: Echantillon, Nbr: Nombre
Fig.42: Résultats de dénombrement des Clostridium sulfito-réducteurs (CSD) dans les
échantillons du lait cru.
119
Résultats
2.1.2.4. Dénombrement de streptocoques fécaux et Straphylococcus aureus:
La recherche de ces germes dans les 24 échantillons du lait cru de vache, chèvre,
brebis et chamelle montre une absence totale de Staphylococcus aureus et streptocoques
fécaux. Notant que, Staphylococcus aureus et streptocoques fécaux leur absence dans les
échantillons du lait cru témoignent que le produit ne présent pas un risque pour la santé du
consommateur.
2.2. Isolement des bactéries lactiques:
Les analyses microbiologiques des échantillons du lait cru prélevés ont montré
que 15 échantillons sur 24 sont de bonne qualité microbiologique, ce qui nous a permis de
procéder à un isolement des bactéries lactiques. Après une préparation d'une gamme de
dilutions décimales, 1 mL des dernières dilutions (10-4, 10-5 et 10-6) a été ensemencé sur
gélose M17 afin d'isoler des souches de Lactococcus et Enterococcus a activité
bactériocinogénique. L'incubation des boites de Pétri se fait à 30 °C pour les bactéries
mésophiles et à 45°C pour les bactéries thermophiles, pendant 48h à 72h.
2.2.1. Identification phénotypique:
Après la durée d'incubation, des colonies rondes, blanchâtres et bien visibles
(Figure 43) apparaissent sur gélose M17. Le nombre de colonies par souche est évalué en
UFC (unité formant colonie) par millilitre d’échantillon de lait analysé.
Les résultats du dénombrement des bactéries lactiques sont rassemblés dans le
Tableau X. Le nombre moyen de colonies le plus important a obtenu avec le lait de vache
prélevé de Miliana (7x107 UFC/mL) et lait de vache prélevé de Ain Defla (6,8x107
UFC/mL).
D'autres nombres moyens de colonies moins importants sont obtenus avec les
autres types du lait.
120
Résultats
Tableau X: Nombre moyen de colonies dénombrées (UFC/mL) dans chaque type de
lait.
Miliana Ain Defla Biskra Tamanrasset
Lait de vache 7x107 UFC/mL 6,8x107
UFC/mL
/ /
Lait de chèvre 6,5x107
UFC/mL
6x107 UFC/mL / /
Lait de brebis 5,9x106
UFC/mL
5,3x106
UFC/mL
/ /
Lait de
chamelle
/ / 6,5x107
UFC/mL
5,8x107
UFC/mL
A B
Fig.43: Aspect des bactéries lactiques après culture sur gélose M17. A: Enterococcus, B:
Lactococcus
121
Résultats
L'examen microscopique des frottis préparés à partir des colonies des bactéries
lactiques isolées et repiquées plusieurs fois jusqu'à leur purification a montré que ces
bactéries retiennent le violet de gentiane ce ci indique qu'elles ont un Gram dit positif.
L'ensemble des bactéries lactiques isolées apparaît sous microscope optique en forme de
coques (coccis) qui se regroupent soit en paires ou en courtes chaînes (Figures 44 et 45).
Fig. 44:Observation des bactéries lactiques genre Lactococcus sous microscope optique après
coloration de Gram (10X100).
Fig.45: Observation des bactéries lactiques genre Enterococcus sous microscope optique
après coloration de Gram (10X100).
122
Résultats
2.2.2. Identification biochimique et physiologique:
L'identification biochimique a montré que les bactéries lactiques isolées n'ont pas
d'oxydase et dénuées de catalase. Ces bactéries lactiques sont testées pour leur type
fermentaire sur bouillon nutritif additionné de glucose et de la cloche de Durham. Sous
anaérobiose, toutes les bactéries lactiques sont des homofermentaires car aucun
dégagement gazeux n'a été observé sur l'ensemble des tubes de bouillon nutritif incubés à
37°C pendant 48 heures.
Dans les conditions hostiles, toutes les souches isolées poussent à 37 °C. Les
espèces présentent une certaine variabilité de croissance vis-à-vis des conditions hostiles:
pH, NaCl et température (Tableau XI).
Les résultas de la galerie API 20 strep relatifs aux tests biochimiques sont
représentés au niveau du Tableau XII.
Il s'agirait des espèces de Lactococcus lactis subsp. lactis, de Lactococcus lactis
subsp. cremoris, de Lactococcus garvieae et de Enterococcus faecium (Tableau XIII)
(Figure 46), dont:
L'espèce Lactococcus lactis subsp. lactis présente 36,66% de l'ensemble des espèces
bactériennes identifiées;
L'espèce Lactococcus lactis subsp. cremoris présente 30%;
L'espèce Lactococcus garvieae présente 13,33%;
L'espèce Enterococcus faecium présente 20%.
Toutes les souches:
produisent d'acétoine (Vp +);
hydrolysent l'esculine;
fermentent les sucres suivants: Ribose, Mannose, Lactose et Tréhalose;
sont dépourvues de β-glucuronidase, de phosphatase alcaline et le pouvoir
hémolytique.
ne fermentent pas le glycogène.
Les caractères biochimiques obtenus montrent que toutes les bactéries lactiques
produisent de l'acétoine et hydrolysent l'esculine qui présente un intérêt technologique.
Ces bactéries sont dépourvues du pouvoir pathogène, ce ci s'exprime par l'absence de la
phosphatase alcaline et le caractère hémolytique.
123
Résultats
L'espèce Lactococcus lactis subsp. lactis est présentée par les souches B01, B03,
B06, B07, B08 et B09(isolées à partir du lait de vache), les souches B12 et B15(isolées de
lait de chèvre), les souches B21, B26 et B29 (isolées du lait de chamelle et brebis). Toutes
ces souches croissent en présence de 4% de NaCl et à pH 6,5.
Pour l'espèce Lactococcus lactis subsp. cremoris neuf souches ont été identifiées:
une isolée de lait de vache(B04), deux de lait de chèvre(B14 et B16), quatre de lait de
chamelle (B20, B22, B24 et B25), deux de lait de brebis (B28 et B30). Toutes ces souches
croissent en présence de 2% de NaCl et à pH 6,5. Des souches de Lactococcus garvieae
ont été isolées de lait de vache (B02 et B11) et de lait de chamelle (B18 et B23). Ces
souches supportent un milieu acide (pH 4,5) et 4% de NaCl.
Six souches de Enterococcus faecium ont été trouvées dans tous les échantillons
du lait: deux dans le lait de vache (B05 et B10), deux dans le lait de chèvre (B13 et B17),
une dans le lait de chamelle (B19) et une dans le lait de brebis (B27). Les souches de
Enterococcus faecium croissent à 45 °C, en présence d'une concentration de 6,5% de NaCl
et à pH 6,5. Elles sont aussi thermorésistantes (65°C).
Pour l'espèce Ec.faecium isolée de lait cru est la seule espèce du genre
Enterococcus trouvée dans les échantillons prélevés. Ces résultats supposent que les
conditions de la traite et de stockage des laits sont défavorables aux espèces d'origine
fécale.
Fig.46: Répartition des souches de bactéries lactiques selon l'espèce dans les
échantillons du lait cru.
124
Résultats
Tableau XI: caractères physiologiques des souches de bactéries lactiques.
Type
de lait
Origine
De la
collection
Croissance à
Température NaCl pH
37oC 45 oC 65oC
2% 4% 6,5% 4,5 6,5
B01 V M + - - - + - - +
B02 V M + - - - + - + -
B03 V M + - - - + - - +
B04 V M + - - + - - - +
B05 V M + + + - - + - +
B06 V M + - - - + - - +
B07 V M + - - - + - - +
B08 V AD + - - - + - - +
B09 V AD + - - - + - - +
B10 V AD + + + - - + - +
B11 V AD + - - - + - + -
B12 Ch M + - - - + - - +
B13 Ch M + + + - - + - +
B14 Ch M + - - + - - - +
B15 Ch M + - - - + - - +
B16 Ch AD + - - + - - - +
B17 Ch AD + + + - - + - +
B18 Cm T + - - - + - + -
B19 Cm T + + + - - + - +
B20 Cm T + - - + - - - +
B21 Cm T + - - - + - - +
B22 Cm T + - - + - - - +
B23 Cm Bs + - - - + - + -
B24 Cm Bs + - - + - - - +
B25 Cm Bs + - - + - - - +
B26 B M + - - - + - - +
B27 B M + + + - - + - +
B28 B M + - - + - - - +
B29 B AD + - - - + - - +
B30 B AD + - - + - - - +
V: Vache Ch: Chèvre Cm: Chamelle B: Brebis M: Miliana AD: Ain Defla Bs: Biskra T: Tamenrasset
(+): Réaction positive (-): Réaction négative
125
Résultats
Tableau XII: Résultats de l’identification des bactéries lactiques obtenus par Api20strep et le test d'hémolyse Vp: Voges-Proskauer, HIP: Hippurate, ESC: Esculine, PYR: pyrrolidonyl arylamidase , α GAL: α galactosidase, βGUR: β Glucuronidase, LAP: leucine amiopeptidase, ADH: Arginine dihydrolase, RIB: Ribose, ARA:
Arabinose, MAN: Mannose, SOR: Sorbitol, LAC: Lactose, TRE: Tréhalose, INU: Inuline, RAF: Raffinose, AMD: Amidon, Glyg: Glycogène, Hem: Hémolyse, βGAL : β-galactosidase; PAL: Phosphatase alcaline,
B01 B02 B03 B04 B05 B06 B07 B08 B09 B10 B11 B12 B13 B14 B15 B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30 Vp + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
HIP + - + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + - + + + + + + +
ESC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
PYRA + - + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + - + + + + + + +
α
GAL - + - + + - - - - + + - + + - + + + + + - + + + + - + + - +
βGUR - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
βGAL + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
PAL - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
LAP + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
ADH + - + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + - + + + + + + +
RIB + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
ARA - + - + + - - - - + + - + + - + + + + + - + + + + - + + - +
MAN + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
SOR - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
LAC + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
TRE + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
INU - - - + + - - - - + - - + + - + + - + + - + - + + - + + - +
RAF - + - - - - - - - - + - - - - - - + - - - - + - - - - - - -
AMD + - + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + - + + + + + + +
Glyg - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
HEM - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
126
Résultats
Tableau XIII: Résultats de l'identification des espèces de bactéries lactiques
Lait de vache Miliana
Lactococcus lactis subsp. lactis (B01) Lactococcus garvieae (B02)
Lactococcus lactis subsp. lactis (B03)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B04)
Enterococcus faecium (B05)
Lactococcus lactis subsp. lactis (B06)
Lactococcus lactis subsp. lactis (B07)
Ain Defla
Lactococcus lactis subsp. lactis (B08)
Lactococcus lactis subsp. lactis (B09)
Enterococcus faecium (B10)
Lactococcus garvieae (B11)
Lait de chèvre Miliana
Lactococcus lactis subsp.lactis (B12)
Enterococcus faecium (B13)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B14)
Lactococcus lactis subsp.lactis (B15)
Ain Defla
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B16)
Enterococcus faecium (B17)
Lait de
chamelle
Tamenrasset
Lactococcus garvieae (B18)
Enterococcus faecium (B19)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B20)
Lactococcus lactis subsp. lactis (B21)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B22)
Biskra
Lactococcus garvieae (B23)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B24)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B25)
Lait de brebis Miliana
Lactococcus lactis subsp.lactis (B26)
Enterococcus faecium (B27)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B28)
Ain Defla
Lactococcus lactis subsp. lactis (B29)
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B30)
127
Résultats
2.2.3. Pouvoir acidifiant :
La mesure de l’activité acidifiante consiste à suivre d’une part l’évolution du pH
des différentes cultures en fonction du temps et d’autre part à doser simultanément
l’acidité totale par la soude. Après incubation à 37°C, à un intervalle du temps qui varie
de 2h jusqu'à 24h; 10mL du lait est prélevé puis titrer par la soude Dornic (N/9) en
présence de 5 gouttes de phénolptaléine, jusqu’au virage de la couleur au rose pâle
persistant au moins 10 secondes. La mesure de pH est faite directement par le pH-mètre,
en plongeant l’électrode dans le volume du lait.
Le pH a été déterminé à chaque fois qu’on procède au dosage de l’acide lactique,
dont au temps t=0h, toutes les bactéries lactiques secrètent une quantité d'acide estimée à
13 oD. Le meilleur pouvoir acidifiant a été enregistré au bout de 24 h avec les deux
souches de Lactococcus lactis subsp. cremoris :B30 et B28 avec une quantité d'acide
estimée à 45 oD et 40 oD, respectivement. Une quantité de 35 oD a été trouvée en présence
des souches: Lactococcus lactis subsp. lactis (B03), Lactococcus lactis subsp. cremoris
(B04), Lactococcus lactis subsp. lactis (B06), Lactococcus lactis subsp. lactis (B09),
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B20), Lactococcus garvieae(B23) et Lactococcus
lactis subsp. lactis (B29). D'autres souches de Lactococcus ont sécrété une quantité
d'acide lactique estimée à 30 oD: Lactococcus garvieae(B02), Lactococcus lactis subsp.
lactis (B07), Lactococcus garvieae (B11), Lactococcus lactis subsp.lactis(B12),
Lactococcus lactis subsp. cremoris (B16), Lactococcus garvieae (B18), Lactococcus
lactis subsp. cremoris (B24). Alors que les autres souches ont montré un faible pouvoir
acidifiant avec une quantité d'acide lactique qui varie de 20 oD à 25 oD (Figures 47, 48,
49, 50).
128
Résultats
Fig. 48 : Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus lactis subsp cremoris.
Fig. 47 : Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Lactococcus lactis subsp. lactis.
05
10
15
20
25
3035
40
45
Acidité (D)
0h 2h 4h 6h 24h
Temps (h)
B04B14B16B20B22B24B25B28B30
0
5
10
15
20
25
30
35
Acidité (D)
0h 2h 4h 6h 24h
Temps(h)
B01B03B06B07B08B09B12B15B21B26B29
129
Résultats
Fig. 50 : Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de
Lactococcus garvieae.
Fig. 49 : Détermination de l'activité acidifiante en fonction du temps des souches de Enterococcus faecium.
0
5
10
15
20
25
Acidité (D)
0h 2h 4h 6h 24h
Temps (h)
B05B10B13B17B19B27
0
5
10
15
20
25
30
35
Acidité (D)
0h 2h 4h 6h 24h
Temps (h)
B02B11B18B23
130
Résultats
II. Examen anatomo-pathologique et cytologique des biopsies gastriques :
Des coupes histologiques ont été préparées à partir des biopsies gastriques
prélevées des patients ayant subi une endoscopie digestive haute. Les tissus sont colorés
par l'Hématoxyline-Éosine et Giemsa Lent. L’analyse anatomo-pathologique et
cytologique permet conjointement le dépistage de la gastrite et la recherche de
complications, telles qu’atrophie, métaplasie, lymphome ou cancer. L'observation
microscopique a montré la présence de bactéries incurvées à la surface de l'épithélium
gastrique ou dans la lumière des glandes pyloriques des patients (Figures 51, 52, 53 et
54). Par l'Hématoxyline-Éosine on peut observer les noyaux des cellules colorés en bleu-
noir, le cytoplasme et la matrice extracellulaire en rose. Alors que, le Giemsa colore le
cytoplasme des neutrophiles, des monocytes, des lymphocytes et la chromatine des
noyaux.
Sur le plan histologique, la muqueuse gastrique est constituée d'une simple
couche d'épithélium glandulaire et d'un tissu conjonctif lâche, appelé chorion (Lamina
propria), entourant les glandes pyloriques. Dans le chorion les fibres réticulaires et
collagènes prédominent alors que les fibres élastiques sont rares. Les glandes pyloriques
ont une lumière plus large et sont très ramifiées. Leurs cryptes ou fovéoles, sont plus
profondes et s'étendent sur la moitié de l'épaisseur de la muqueuse. La présence de
Helicobacter pylori a provoqué une gastrite aiguée œdimateuse avec une activité
inflammatoire légère exprimée par la présence dans le chorion d'un nombre limité des
polynucléaires neutrophiles (coloration Giemsa L x1000) chez un homme âgé de 19 ans et
une femme de 64ans (Figure 51 et 53). L'observation microscopique d'une lame préparée
à partir d'une biopsie gastrique d'un homme âgé de 43 ans a révélé une gastrite chronique
suite à l'effet infectieux de Helicobacter pylori (Figure 52). Cette gastrite s'exprime par
un infiltrat dense surtout en surface, d'un foyer de Polynucléaires neutrophiles dans le
chorion et l'épithélium gastrique. On peut aussi observé une atrophie des glandes
pyloriques. L'infection à H.pylori (arcs et bâtonnets) dans ce cas était modérée dans la
lumière glandulaire et au contact de l'épithélium gastrique. L'observation microscopique
de H.pylori était positive chez trois patients. Ce ci peut être due au suivi du traitement
médical (antibiotiques+ IPP) par les patients avant d'entamer l'examen
anatomopathologique qui va fausser les résultats. Au grossissement 100, on peut très bien
131
Résultats
visualiser la glande pylorique qui est constituée de plusieurs cellules, dont chacune a une
forme et une fonction particulière (Figure 54). Les différentes caractéristiques
cytologiques sont présentées par le tableau XIV.
Tableau XIV: cytologie des coupes histologiques des biopsies gastriques.
Coloration Grossissement Observation
Hématoxyline-éosine
40 Artérioles, glandes, cryptes
100 Epithélium simple, glandes avec lumière, chorion, cryptes,
artérioles
400 Artérioles plus visibles, Chorion, fibres collagènes et
réticulaires, Cellules à mucus, Cellules muqueuses
superficielles, H.pylori (arcs, bâtonnets)
1000 Fibres de collagènes et réticulaires bien visibles, cellules
endocrines, Cellules à mucus, Noyau bien visible, Cellules
muqueuses superficielles, H.pylori (spirale, incurvé).
Giemsa lent
40 Artérioles, glandes, cryptes, Atrophie glandulaire, Lumière
glandulaire.
100 Epithélium simple, glandes avec lumière, chorion, crypte
400 Artérioles plus visibles, Chorion, fibres collagènes et
réticulaires, Polynucléaires, Cellules à mucus, Cellules
muqueuses superficielles, H.pylori(arcs, bâtonnets, coccoides)
1000 Chromatine des noyaux, fibres de collagènes et réticulaires
bien visibles, chorion, lumière glandulaire, Cellules
muqueuses superficielles, Cellues à mucus, Cellules
endocrines, Noyau bien visible, Polynucléaires neutrophiles,
H.pylori (coccoide, spirale, incurvé).
132
A (10X4) (10X10) (10X40)
B (10X4) (10X10) (10X40)
C: Crypte, Ch: Chorion, CE:Cellule Endocrine, P: Polynucléaire, CMS: Cellule Muqueuse Superficielle, CM: Cellule à Mucus, N: Noyau Fig.51: Gastrite aigue type B oedimateuse (présence des vaisseaux sanguins) (grande flèche), infection légère à H.pylori+: arcs, bâtonnets (flèche rouge) dans la lumière glandulaire: A: HE, B:Giemsa L
C
P
CMS
LG
LG
Ch
Ch
CE
CM
CM
CE
CMS
C
N
N
Ch
LG
LG
LG
133
A (10X4) (10X10) (10X40)
B (10X4) (10X10) (10X40)
C: Crypte, Ch: Chorion, CE: Cellule Endocrine, P: Polynucléaire, CM: Cellule à Mucus, CMS: Cellule Muqueuse Superficielle Détachée, P: Polynucléaire, N: Noyau, Fc: Fibre Collagène, FR: Fibre Réticulaire Fig. 52: Gastrite chronique avec atrophie glandulaire modérée (grande flèche), infection modérée à H.pylori++: arcs, bâtonnets et coccis (flèche rouge) dans la lumière glandulaire de la muqueuse gastrique: A:HE, B:Giemsa L
P
Ch
C
CM
P CMS
LG
Ch
Ch
Ch FC FR
CE
CM
CE
CM
N
N
CMS
Ch
134
CP
A (10X4) (10X10) (10X40)
B (10X4) (10X10) (10X40)
C: Crypte , Ch: Chorion, CM: Cellule Muqueuse, CMS: Cellule Muqueuse Superficielle, CE: Cellule Endocrine, N: Noyau, FC: Fibre collagène, Fr: Fibre Réticulaire Fig. 53: Gastrite aigue type B oedimateuse (présence des vaisseaux sanguins) (grande flèche), infection légère à H.pylori+: arcs et bâtonnets (flèche rouge) dans la lumière glandulaire et au contact de l'épithélium gastrique (flèche rose): A: HE, B:Giemsa L
Ch
C
FC
CE
CM
P
CM
CE
N
N
CMS
CMS
Fr
135
Résultats
C:Crypte, Ch: Chorion, CMS: Cellule Muqueuse Superficielle, CM: Cellule à Mucus, CE: Cellule Endocrine, Chr: Chromatine, N:Noyau, HP: H.pylori, Lg: Lumière Glandulaire, PN: Polynucléaire Neutrophile, Fr: Fibre Réticulaire, Fc: Fibre Collagène. Fig.54: Observation microscopique d'une glande pylorique à 1000 après coloration A:HE et B: Giemsa Lent
C
CMS
CM
CE
HP
Ch HP
Lg
CE
PN
Fr Fc
Chr
N
N
Ch
CM
Chr
136
Résultats
III. Etude de l'activité antibactérienne: 1. Interaction des bactéries lactiques avec les souches d’H.pylori in vitro:
Des précultures des bactéries lactiques isolées et caractérisées à partir du lait cru
sont testées pour leur pouvoir antibactérien vis-à-vis des souches de Helicobacter pylori
suivant la méthode de disques.
Les souches de Helicobacter pylori utilisées dans cet étude proviennent du centre
national de référence des Campylobacters et des Helicobacters de Bordeaux (souches de
références: 26695 ; J99 ; TN2GF4 et HPAG1, souche clinique : HSA3068). D'autres
souches de H.pylori ont été isolées au niveau de laboratoire de bactériologie de l'hôpital
Cochin à Paris, à partir des biopsies gastriques prélevées des patients par endoscopie
digestive haute.
Après 24 h d'incubation des boites de Pétri contenant les bactéries lactiques et les
souches d'H.pylori, des zones claires autour des disques ont été observées. La lecture se
fait par la mesure du diamètre en mm des zones d’inhibition formées autour des disques
(Zi). On prend en considération les zones qui mesurent plus de 2 mm de diamètre. La
mesure du diamètre de Zi est effectuée selon la formule suivante :
Zi en (mm)= diamètre de la zone d’inhibition obtenue (mm)- diamètre de disque (6mm).
L’interaction in vitro des bactéries lactiques avec les souches de H.pylori a
montré que 14 souches de bactéries lactiques sur 30 ont un effet inhibiteur (Tableau XV).
D’après les résultats obtenus, il en ressort que les deux souches E.faecium (B13)
et Lc. lactis subsp. lactis (B01) sont à l’origine des zones d’inhibition importantes dont les
diamètres enregistrés sont 20mm et 18mm avec la souche TN2GF4; 16mm et 13mm avec
la souche HSA3068, 15mm et 11mm avec la souche 26695, 15mm et 13 mm avec la
souche J99. Pour la souche HPAG1 la meilleure zone d'inhibition a été trouvée avec la
bactérie Enterococcus faecium (B19) (diamètre=7mm).
137
Résultats
Tableau XV: Diamètres des zones d'inhibition (mm) des bactéries lactiques vis-à-vis
des souches d' H.pylori Diamètre des zones d'inhibition (mm)
TN2GF4
J99
26695
HPAG1
HSA3068
Hp1
Hp3
B01 18 13 11 00 13 03 03
B02 00 00 00 00 00 00 00
B03 00 00 00 00 00 00 00
B04 00 00 00 00 00 09 07
B05 00 00 00 00 00 00 00
B06 00 00 00 00 00 00 00
B07 10 06 05 00 04 03 03
B08 00 00 00 00 00 00 00
B09 00 00 00 00 00 00 00
B10 00 00 00 00 00 10 08
B11 00 00 00 00 00 00 00
B12 08 00 00 00 00 04 03
B13 20 15 15 00 16 04 03
B14 04 04 03 00 00 00 00
B15 00 00 00 00 00 00 00
B16 00 00 00 00 00 00 00
B17 06 06 05 00 03 00 00
B18 00 04 00 00 00 00 00
B19 00 06 00 07 00 05 03
B20 00 00 00 00 00 00 00
B21 00 00 00 00 00 00 00
B22 03 00 00 00 00 00 00
B23 00 00 00 00 00 00 00
B24 00 00 00 00 00 00 00
B25 08 07 07 00 06 03 00
B26 05 00 00 05 00 03 03
B27 00 00 00 00 00 00 00
B28 00 00 00 00 00 00 00
B29 03 00 00 04 00 04 00
B30 00 00 00 00 00 00 00
138
Résultats
Avec la souche Hp1, 10 zones d'inhibition ont été enregistrées avec les souches
E.faecium(B10), Lactococcus lactis subsp.cremoris(B04), Enterococcus faecium (B19),
Lactococcus lactis subsp. lactis (B12), Enterococcus faecium(B13), Lactococcus lactis
subsp. lactis B29, Lactococcus lactis subsp. lactis (B01), Lactococcus lactis subsp. lactis
(B07), Lactococcus lactis subsp.cremoris (B25), Lactococcus lactis subsp. lactis (B26)
dont les diamètres sont 10mm, 09 mm, 5mm,4mm,4mm, 4mm, 3mm, 3mm, 3mm et 3mm,
respectivement. Alors, la souche Hp3 a donné des zones d'inhibition avec 08 bactéries
lactiques sur 30, dont les diamètres varient de 8mm à 3 mm (Figure 55 et 56).
Les résultats de l’inhibition des souches d’ H.pylori (TN2GF4, HPAG1, J99,
26695, HSA3068, Hp1 et Hp3) montrent que les bactéries lactiques ne présentent pas le
même spectre d’action; elles expriment des variations plus ou moins importantes qui
dépendent en premier lieu de la souche cible d’H.pylori et en second lieu de la souche
indicatrice de bactérie lactique. Les meilleures zones d’inhibition ont été enregistrées avec
les souches E.faecium (B13) et Lactococcus lactis subsp. lactis (B01), dont la souche
E.faecium (B13) a montré un faible pouvoir acidifiant avec la sécrétion d'une quantité
d'acide lactique égale à 19oD au bout de 24h. Ce ci indique que l'inhibition est due soit à
l'acide lactique malgré que la souche B13 secrète une faible quantité, soit aux d'autres
substances de nature différente de l'acide lactique.
D'après les caractères des souches de H.pylori, la souche de référence TN2GF4
est résistante vers les antibiotiques Amoxicilline, Clarithromycine et Levofloxacine mais
elle est sensible vers les deux souches B13 et B01. Ainsi, la souche J99 a montré une
sensibilité vers les deux bactéries lactiques E.faecium et Lactococcus lactis subsp. lactis,
alors qu' elle résiste bien aux deux antibiotiques Amoxicilline et Clarithromycine. Ce ci
montre une bonne inhibition de ce pathogène par les bactéries lactiques isolées. D'après
les résultats obtenus les souches Hp1 et Hp3 sont sensibles à la clarithromycine et aux
bactéries lactiques B01, B04, B07, B10, B12, B13, B19, B25, B26 et B29, mais les zones
d'inhibition enregistrées ont un diamètre qui ne dépasse pas 10mm. La souche HPAG1 est
la souche la plus résistante parmi toutes les souches de H.pylori utilisées dans ce travail
dont seulement trois bactéries lactiques ont montré un effet inhibiteur.
139
Résultats
A B
C D
Fig.55: Activité antibactérienne des souches de Lactococcus et Enterococcus vis-à-vis des
souches d'Helicobacter pylori par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B:
J99, C: 26695 et D: HSA3068.
140
Résultats
A B
C
Fig.56: Activité antibactérienne des souches de Lactococcus et Enterococcus vis-à-vis des
souches de Helicobacter pylori par la méthode de diffusion sur gélose:A: HPAG1, B:
Hp1, C:Hp3.
141
Résultats
2. Détermination de l’activité bactériocinogénique :
D'après les résultas obtenus dans l'étude de l'activité antibactérienne des souches
de bactéries lactiques vis-à-vis des souches de Helicobacter pylori par la méthode de
diffusion sur gélose, la souche Enterococcus faecium (B13) isolée du lait de chèvre de
Miliana a montré un net effet inhibiteur des souches de Helicobacter pylori( TN2GF4,
HSA3068, J99 et 26695, Hp1 et Hp3).
2.1. Elimination de l’effet des acides organiques et de peroxyde d’hydrogène:
Les bactéries lactiques produisent plusieurs substances à effet antibactérien.
Parmi ces substances les acides organiques, peroxyde d'hydrogène et les bactériocines.
Des centrifugations successives du milieu de culture contenant la bactérie lactique B13
ont été réalisées afin de déterminer la présence de la substance inhibitrice dans le
surnageant ou dans le culot obtenu. Afin de déterminer l'activité bactériocinogénique de la
souche Enterococcus faecium(B13), l’effet des acides organiques, notamment des acides
lactique et acétique a été éliminé, dont le surnageant a été neutralisé à pH 6,5 par une
solution de NaOH. Ainsi le peroxyde d’hydrogène accumulé dans le milieu de culture a
été éliminé avec un traitement du surnageant par 5mg d'une catalase à 30°C pendant 2h
avant de procéder au test d’inhibition. Les résultats montrent que l’extrait cellulaire
obtenu (culot) après centrifugation à 10 000 tours / min ne présente aucun effet inhibiteur
sur la croissance des souches d’H.pylori utilisées. Malgré la neutralisation et l’ajout du
catalase à la fraction extracellulaire (surnageant de B13) le même effet inhibiteur a été
constaté vis-à-vis les souches d’H.pylori (TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1, Hp3 et
HPAG1) dont les zones d’inhibition sont 20mm, 16mm, 15mm et 15mm, 4mm, 3mm et
0mm, respectivement (Figure 57). D’après les résultats obtenus, le culot ne contient pas
la substance inhibitrice alors cette dernière est présente dans la fraction extracellulaire. Ce
ci peut s'expliquer par la synthèse et la sécrétion par la bactérie B13 d'une substance autre
que le peroxyde d'hydrogène et les acides organiques dans le milieu extracellulaire.
142
Résultats
. A B
C D
Fig.57: Effet de l'extrait cellulaire (EC) et la fraction extracellulaire (FEC) de
Enterococcus faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode
de diffusion sur gélose:A:TN2GF4, B: J99, C:HSA3068, D: 26695.
143
Résultats
2.2. Effet de l'extrait bactériocinogénique sur H.pylori en milieu liquide:
L'effet bactériocinogénique de la bactérie lactique, qui a une inhibition
importante de H.pylori sur milieu gélose par la méthode de diffusion, a été étudié sur le
surnageant neutralisé à pH 6,5 par une solution de NaOH (0,1 N) et traité par une catalase
(5mg/1mL) à 30°C pendant 2h afin d'éliminer les acides organiques et la H2O2 présentent
dans le milieu. Le test d'inhibition est réalisé en milieu liquide, dont 250 µL du surnageant
a été ensemencé avec 250µL des précultures d'H.pylori (107 CFU/ mL) et incubé à 37oC
pendant 126h. Après chaque 18h, une culture de Helicobacter pylori a été faite sur milieu
Brucella additionné à 10% du sang de cheval et incubé à 37oC sous une atmosphère
microaérophile.
Le dénombrement des fines colonies, transparentes à grisâtres et luisantes qui
appartiennent à Helicobacter pylori révèle une diminution du nombre des souches
d'H.pylori utilisées dans ce travail (TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1 et Hp3 ) avec
le temps (Figure 58). La souche TN2GF4 a montré une grande sensibilité au surnageant
de E.faecium(B13), avec une baisse du taux de H.pylori du 1x107 à 106UFC/mL au bout
de 18h, dont ce taux continue à diminuer jusqu'à l'obtention de 00UFC/mL à 54h, 72h,
90h,108h et 126h.
Ainsi, nous avons enregistré une inhibition importante de la souche HSA3068
(00UFC/mL au bout de 90h). Avec les deux souches J99 et 26695 d'H.pylori, l'inhibition
était moins importante ce qui nous a laissé suivi l'effet du surnageant jusqu'à 108h où on a
obtenu 00UFC/mL sur la gélose Brucella. Alors les deux souches HP1 et Hp3 ont montré
une faible sensibilité vers l'effet du surnageant, car la diminution du taux d'H.pylori était
faible après chaque 18h, le dénombrement a été fait jusqu'à 126h, avec une absence totale
des colonies sur gélose.
Par contre, le nombre des colonies de HPAG1 était le même après 126h (107
UFC/mL), ce ci s'exprime par l'effet bactéricide/bactériostatique du surnageant de B13.
144
Résultats
Les résultats obtenus par la méthode de diffusion sur gélose et dans le bouillon
ont montré que le surnageant a un effet inhibiteur sur H.pylori. Dans le bouillon et avec le
temps le nombre d'H.pylori diminue jusqu'à l'obtention d'une culture négative. Ce ci
indique que le surnageant devient bactéricide/bactériostatique de H.pylori .
Fig. 58: Nombre de colonies de Helicobacter pylori obtenu après culture sur gélose
Brucella.
2.3. Influence du pH, température et enzymes sur les bactériocines:
Après élimination des acides organiques et du H2O2 de l'extrait cellulaire qui a
montré une activité antibactérienne vis-à-vis des souches de H.pylori, la stabilité de la
substance antagoniste aux pH acide et basique a été étudiée en ajustant le pH à 4 et 8. Les
résultats de l’activité antibactérienne montrent que le surnageant de culture de E.faecium
(B13) après l’ajustement de pH garde la même activité (figure 59) dont les zones
d’inhibition vis-à-vis les souches TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1, Hp3 et HPAG1
sont 20mm, 16mm, 15mm, 15 mm, 4mm, 3mm et 0mm, respectivement. Cette substance
145
Résultats
est stable à pH 4 et à pH 8. Ces caractéristiques confèrent à cette substance un grand
intérêt technologique dans la bioconservation des aliments.
Les traitements thermiques du surnageant de culture de E.faecium (60°C pendant
30minutes, 80°C pendant 10minutes et 100°C pendant 05minutes) n’agissent pas sur
l’activité antibactérienne dont on trouve les mêmes résultats d’inhibition qui ont été déjà
enregistrés avec les souches TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1, Hp3 et HPAG1
(20mm, 16mm, 15mm et 15mm, 4mm, 3mm et 0mm, respectivement) (Figure 60). Ces
résultats suggèrent que le facteur antibactérien produit conserve son activité antagoniste
après avoir été soumis à des traitements thermiques assez élevés comparables à la
pasteurisation et la stérilisation du lait.
Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice extraite d'une culture de
la bactérie lactique E.faecium, des enzymes ont été utilisées à cet égard : Pepsine,
Trypsine et α amylase. L’activité de cette substance est testée par la méthode de diffusion
sur gélose. Après 24h d'incubation, le surnagent de la culture de E.faecium traité par des
enzymes non protéolytiques comme α -amylase inhibe la croissance des souches de
H.pylori : TN2GF4, HSA3068, J99 et 26695, Hp1, Hp3 et HPAG1 dont les diamètres sont
20mm, 16mm, 15mm et 15mm, 4mm, 3mm et 0mm, respectivement.
Alors la substance extraite perd son activité antibactérienne en présence de deux
enzymes protéolytiques : Pepsine et Trypsine. Ce ci indique que la substance
antibactérienne est de nature protéique, dont ces deux enzymes hydrolysent une protéine
sécrétée par la bactérie lactique E.faecium (B13) (figure 61). Cette protéine contient des
acides aminés aromatiques et basiques.
D'après les résultats obtenus in vitro, la substance inhibitrice de la souche
H.pylori sécrétée par E.faecium (B13) est de nature protéique, thermorésistante et stable
aux pH 4et 8.
146
Résultats
A B
C D
Fig.59: Effet de pH(4 et 8) sur l’activité bactériocinogénique de Enterococcus faecium
(B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur
gélose:A:TN2GF4, B: J99, C:HSA3086, D: 26695.
147
Résultats
A B
C D
Fig.60 : Effet du traitement thermique (60°C pendant 30min, 80°C pendant 10min et
100°C pendant 5min) de la fraction extracellulaire (FEC) de E.faecium (B13) vis-à-vis des
souches de H.pylori déterminé par la méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B:J99,
C: 26695, D: HSA3086.
148
Résultats
A B
C D
Amy: Amylase, Try: Trypsine, Pep: Pepsine
Fig. 61: Effet des enzymes (Pepsine, Trypsine et α- Amylase) sur la fraction
extracellulaire de E.faecium (B13) vis-à-vis des souches de H.pylori déterminé par la
méthode de diffusion sur gélose: A: TN2GF4, B: J99, C: HSA3086, D: 26695.
149
Résultats
3. Etude de l'activité antibactérienne in vivo:
Les résultas obtenus in vitro ont montré que la souche Enterococcus faecium
(B13) isolée du lait de chèvre de Miliana est douée d’une activité inhibitrice plus
importante de la souche d' Helicobacter pylori TN2GF4 en sécrétant une substance de
nature protéique, thermorésistante et stable à pH 4 et 8. Ce qui nous a conduit à étudier
son effet probiotique in vivo.
Pour cela, des souris Balb/c holoxéniques, femelles, âgées de deux mois
provenant de l'institut Pasteur d'Algérie, sont reparties en 3 lots de 12 souris chacun: un
lot témoin, un lot infecté par la souche TN2GF4 et un lot infecté par TN2GF4 et traité par
Enterococcus faecium (B13). Avant toute administration de la souche H.pylori et
Enterococcus faecium (B13), une analyse des selles des souris est faite afin de déterminer
des germes occupés par l’intestin et contrôler la présence surtout de la bactérie lactique
Enterococcus faecium .
Les germes recherchés dans cette partie sont: E.coli, Salmonella spp, Shigella
spp, Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Clostridium, Enterococcus spp,
Lactobacillus spp, Lactococcus spp, levures et moisissures. Après isolement, les bactéries
trouvées ont été identifiées à l'échelle de l'espèce (Annexe). Les résultats des analyses
bactériologiques des selles de souris sont mentionnés dans la figure 62.
La recherche de H.pylori dans les souris holoxéniques a été étudiée, pour cela
une souris du lot témoin a subi une dissection dont un fragment biopsique a été prélevé et
broyé. La culture de H.pylori est réalisée sur gélose Brucella additionnée à 10% du sang
de cheval et incubée à 37oC pendant 3 à 5 jours et sous une atmosphère microaérophile.
La flore intestinale des souris holoxéniques utilisées dans ce travail est
principalement composée de levures et de champignons, ainsi de Streptococcus, E.coli,
Staphylococcus cohnii et Alcaligenes faecalis. La présence de champignons chez les
souris peut être due au stockage de grains de blé qui est un substrat excellent pour le
développement des moisissures, par ailleurs l’absence de Salmonella et Shigella montre
que les conditions d’élevage semblent bonnes sur le plan hygiénique.
150
Résultats
Fig. 62: Les microorganismes présents chez des souris Balb/C (lot témoin).
La répartition de ces microorganismes chez les souris est variable de l’une à
l’autre. Les levures, Alcaligenes faecalis et Streptococcus sont présents dans la flore de
toutes les souris étudiées. Tandis que Staphylococcus apparaît chez la moitié des souris (3
sur 6), ce ci peut s’expliquer par une simple contamination ou envahissement de cette
bactérie dans leur intestin. E.coli présente chez 4 souris parmi les 6 souris étudiées, ce qui
explique l'appartenance de cette bactérie à la flore colique normale des souris.
151
Résultats
L’analyse des selles des souris avant toute expérimentation ne révèle aucune
présence de Enterococcus faecium. H.pylori n'a pas été observée sur un frottis réalisé à
partir de biopsie gastrique d'une souris témoin (figure 63). L'observation microscopique
de la muqueuse a révélé que ce tissu est constitué d'un épithélium reposant sur le chorion.
L'épithélium muqueux est formé d'une seule couche de cellules présentant de nombreuses
invaginations: les cryptes profondes, ou fovéoles qui s'étendent profondément dans la
muqueuse. Alors, après infection des souris par H.pylori, la coloration de Gram des
biopsies gastriques prélevées au cours des 2 phases de l'observation (21j et 30 j) a montré
la présence de ce pathogène sur la muqueuse gastrique ainsi une érosion des cellules
épithéliales superficielles, un rétrécissement des corps glandulaires et la présence des
amas cellulaires de petite et de grande taille dans le chorion (Lamina propria) qui indique
une activité inflammatoire de Helicobacter pylori. Ces amas ont l'aspect des follicules
(figure 64).
Cg:corps du glande, Cr: crypte
Fig.63: Aspect d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris (lot témoin) après
coloration de Gram (10X100). 152
Résultats
Hp: Helicobacter pylori, ED:épithélium endommagé, AC: amas cellulaire, C:chorion
Le dénombrement de la souche TN2GF4 réalisé sur gélose Brucella à partir des
fragments biopsiques prélevés et broyés, a donné un taux qui varie de 1,5x105 à 1,2x 106
UFC/mL. Les colonies sont transparentes et luisantes et ont une catalase, une oxydase et
une uréase (Figures 65).
A partir de la 2éme phase (30 j) on note une augmentation de la population d’H
pylori pour atteindre son maximum soit 2,9x106 UFC/mL. Avec un taux d’accroissement
égal à 52.42% entre les moyennes des 2 phases de lot 2. Après 3 semaines post infection
dans le groupe traité, la culture d’ H.pylori effectuée sur des fragments des biopsies
gastriques prélevés de 6 souris infectées avec la souche TN2GF4 montre un nombre de
bactéries variant de 1,8x105 à 1,2x106 UfC/mL. Ce ci indique la colonisation de la
muqueuse gastrique des souris par la souche TN2GF4.
Fig.64: Aspect d'une biopsie gastrique prélevée de l’estomac d’une souris infectée par H.pylori après
coloration de Gram (10X100).
153
Résultats
Ce nombre commence à diminuer après l’administration de E.faecium soit de
1,2x106 à 1,6x105 UFC/mL à J 30. E.faecium réduit la colonisation d’H pylori chez les
souris, en effet du nombre du 4,9.105 à 2,8.105 UFC/mL soit un abaissement de 42,86 %
entre les moyennes des 2 phases de lot 3. Ces résultats sont confirmés grâce à l’analyse de
la variance au seuil de 5% appliquée à l’évolution du nombre de H pylori au niveau de
deux lots (Hp, Hp+Ec.f). Cette analyse montre qu’il y a une différence hautement
significative entre le groupe infecté et le groupe traité. En effet la charge d’H pylori dans
les souris traitées avec E.faecium est diminuée de prés un log comparée avec les souris
recevant H pylori seul durant les 2 phases (Figure 66). Les deux colonnes représentent
la moyenne de la charge de TN2GF4 dans les 6 souris. Une analyse statistique réalisée
avec un test t de Student entre le groupe infecté et le groupe traité par E.faecium montre
une différence hautement significative (α=0.05).
Fig.65: Aspect des colonies de Helicobacter pylori isolées sur gélose au sang d'une biopsie gastrique
prélevée de l’estomac d’une souris infectée après incubation à 37oC pendant 5jours sous atmosphère
microaérophile.
Colonies H.pylori
154
Résultats
Fig. 66:Nombre de colonies d’H pylori avant et après traitement par Enterococcus
faecium (J21 et J30).
L’analyse des selles des souris traitées par la bactérie lactique a révélé la
présence de Enterococcus faecium avec des concentrations fécales variaient de 6x 105 à
1.03x 106 UFC/mL. La souche Enterococcus faecium (B13) a un effet inhibiteur de la
souche TN2GF4 de Helicobacter pylori. La bactérie lactique B13 a réduit le nombre de
H.pylori à 42,86 % entre les moyennes des 2 phases, ce qui montre que cette bactérie peut
inhibé la croissance de ce pathogène en réduisant sa colonisation. Cette bactérie résiste
bien aux conditions physiologiques du tube digestif (pH, sels biliaires, etc…). Elle répond
aux conditions des bactéries probiotiques (Figure 67).
69
155
Résultats
Fig. 67: Culture de Enterococcus faecium à partir des selles des souris traitées
156
DISCUSSION
Discussion
1. Isolement et caractérisation des souches d'Helicobacter pylori:
H. pylori est l'agent pathogène qui infecte l'homme, on estime 50% de la
population mondiale. Il s'agit d'une cause commune de dyspepsie et d'ulcère gastro-
duodénal potentiellement curable (Malfertheiner et al. 2012). Le diagnostic de
l’infection à H. pylori se fait le plus souvent à partir des biopsies antrales ou fundiques
prélevées au cours de l’endoscopie par le gastroentérologue. Différents tests sont possibles
tels: un examen histologique des biopsies permet de détecter la présence de H. pylori par
examen microscopique ; la mise en culture des bactéries à partir des biopsies peut
également être réalisée ; des tests moléculaires d’amplification génique permettant la
détection rapide de H. pylori et la détermination de sa sensibilité à la clarithromycine
(Zine-Charaf, 2007).
Pour cela nous avons procédé à isoler et caractériser des souches de Helicobacter
pylori à partir des biopsies gastriques prélevées par endoscopie digestive haute des
patients d'âge et de sexe différents. Après observation microscopique des frottis préparés à
partir des biopsies gastriques, une culture des broyats des biopsies a été faite sur gélose
Muller Hinton additionnée au sang de cheval et deux antibiotiques et gélose pylori
(Biomérieux) dont nous avons observé des petites colonies transparentes après incubation
à 37oC pendant 7jours sur gélose Muller Hinton. Ces résultats montrent la possibilité
d'isoler H.pylori sur cette gélose et la présence de cette bactérie chez les deux sexes.
D'après Faik et Raiss, (1998), l’examen bactériologique nécessite des biopsies
conservées dans le sérum physiologique à 4°C. Il faut utiliser un milieu de transport si le
délai entre le prélèvement et la réalisation de l’examen dépasse 4 heures, au delà de 24
heures, la congélation à -70°C permet de retarder l’étude. Après coloration de Gram, les
bacilles à Gram négatif sont recherchés sur l’ensemble du frottis. Ensuite la culture de la
biopsie broyée est ensemencée dans deux milieux dont l’un est sélectif, et incubée à 37°C
sous une atmosphère microaérophile .
Les études de Cassel-Béraud et al. (1996) réalisées pendant une période de 8
mois, dont l’infection à Helicobacter pylori a été recherchée chez 140 patients qui
157
Discussion
présentaient une symptomatologie digestive haute, par les méthodes classiques
bactériologiques (coloration de Gram, test à l’urée, mise en culture) et histologiques ont
permis l’identification de cette bactérie à partir de prélèvements biopsiques de la
muqueuse antro-pylorique. La prévalence de l’infection à H. pylori était de 59 %. Les taux
de prévalence ne semblaient pas différer selon l’âge et le sexe mais l’infection à H. pylori
était significativement plus fréquemment retrouvée chez des malades présentant un ulcère
duodénal évolutif (30 cas sur 41) que chez les patients ayant une endoscopie normale (21
cas sur 47)(p<0,02).
Cette bactérie a été aussi isolée viable dans les selles d'une personne infectée de
la Gambie. Le micoorganisme a été cultivé sur un milieu sélectif après concentration de
bactéries fécales par centrifugation dans un tampon équilibré avec un mélange de gaz
microaérophile. Les caractéristiques de croissance, les apparences microscopiques, et les
activités enzymatiques de H.pylori étaient les mêmes que celles d'un isolat de type
gastrique. Des préparations de protéines dérivées de la nouvelle souche sont de type
antigéniquement similaires, et de profils électrophorétiques très similaires (y compris les
deux bandes de protéines majeures de 62 et 26 kDa, correspondant aux sous-unités
d'uréase) (Thomas et al. 1992).
Plusieurs milieux de culture ont été proposés pour isoler Helicobacter pylori.
Piccolomini et al. (1997), dans une étude ont pu comparés huit milieux de culture, quatre
non sélectifs et quatre sélectifs, et de déterminer la meilleure combinaison de milieux de
culture pour l'isolement primaire de Helicobacter pylori. Sur une période de 5 mois, des
biopsies de la muqueuse antrale ont été obtenues par endoscopie digestive haute de 222
patients dyspeptiques. Les biopsies ont été étalées en parallèle sur l'ensemble des huit
milieux. La gélose en émulsion de jaune d'oeuf (EYE), milieu de Skirrow, milieu de Dent
et le milieu modifié de Thayer-Martin ont été utilisés comme milieux sélectifs. Alors, la
gélose chocolat modifiée (MCHOC), gélose de soja Triptycase (TSA), gélose Brucella, et
la gélose coeur-cervelle ont été utilisées comme des milieux non sélectifs. Dans
l'ensemble, à l'aide de ces huit milieux, H. pylori a été récupérée à partir de biopsies de
114 sur 222 patients, soit un taux d'isolement de 51%. En comparaison de toutes les
combinaisons possibles des huit milieux de culture, le taux le plus élevé de l'isolement de
158
Discussion
H. pylori a été de 100% (114 sur 114) avec EYE-MCHOC, suivie par 96,5% (110 sur
114) lorsque EYE-TSA a été utilisé. A l'inverse, ils ont constaté qu'aucun des milieux
utilisés seuls donne un taux de 100% de récupération. Par conséquent, l'utilisation des
milieux sélectifs et non sélectifs en parallèle offre un optimal de récupération de H.pylori.
Un travail de Otth et al. réalisé en 2011 dans le sud du Chili sur 240 patients ont
une gastrite ou un ulcère gastrique, chaque biopsie gastrique a été homogénéisée et
ensemencée sur une gélose au sang contenant un mélange sélectif des antibiotiques
(supplément DENT). Des boites de Pétri ont été incubées à 37 ° C dans un environnement
microaérophile pendant cinq jours. H. pylori a été isolée à partir de 99 patients (41,3%)
avec une fréquence légèrement plus élevée chez les femmes (42% des cultures positives)
que les hommes (40,2% des cultures positives). En ce qui concerne l'âge et le niveau
d'éducation, les fréquences les plus élevées d'isolation ont été obtenus chez des patients
entre 21-30 ans (55%) , 41-50 ans (52,6%) et 43,9% du secondaire et 46,2% de
l'université.
En Algérie, Allem et al. (2007), ont isolé une souche de H.pylori à partir d'une
biopsie gastrique prélevée à 2 cm du pylore d'un patient présentant un ulcère. Cette
biopsie est broyée dans 0.5 mL de bouillon nutritif et ensemencée dans des boites de Pétri
contenant de la gélose chocolat. Elles sont mises dans une jarre sous atmosphère
microaérophile pour une incubation de 5 jours à 37oC. Pour l'enrichissement, les colonies
suspectes sont mises dans un bouillon glucose tamponné additionné du sang de cheval.
L'identification a été faite par l'appréciation de la morphologie de cette bactérie; des
caractères biochimiques tels que: l'oxydase, l'uréase, la catalase et la production d'H2S sur
TSI sont également recherchés.
Après culture, un examen microscopique d'un frottis préparé à partir des colonies
suspectes, nous a permis d'observer des fins bacilles à Gram négatif qui peuvent être de
Helicobacter pylori. Ces caractères ont été démontrés par les travaux de Sobhani et al.
(1995).
Nos résultats de l'identification des souches isolées de H.pylori ont montré que
ces souches possèdent d'une part une activité uréasique très marquante exprimée par le
changement de la couleur du milieu urée-indole de l'orange vers le rose au bout de 24h
159
Discussion
d'incubation, d'autre part, une oxydase et une catalase. Ces caractères biochimiques ont été
démontrés par Monteiro en 1995. Cassel-Beraud et al. (1996) ont constaté qu'après 60
min, le changement de la couleur du milieu urée - indole de l’orange au rouge indique la
présence de la bactérie dans la biopsie gastrique. Cette bactérie a une particularité très
marquante qui est la présence d’une activité uréase très intense ; cette propriété a été mise
à profit pour un diagnostic rapide, la sensibilité de cette méthode est comprise entre 71 et
91% à la 24ème heure. L’uréase de cette bactérie hydrolyse l’urée en ammoniac et en
bicarbonates dans le but de neutraliser l’acidité de l’estomac, un moyen pour adhérer aux
cellules du mucus (Sobhani et al. 1995).
H.pylori possède plusieurs facteurs de virulence, dont la mobilité flagellaire qui a
été reconnue dans différents modèles animaux et semble essentielle à la colonisation de la
muqueuse gastrique et à la persistance d’infections chroniques (Fauconnier, 1998).
D'après Mégraud et Lehours, (2007) le cytochrome oxydase est présent dans tous les
membres du Epsilonproteobacteria. Il est habituellement détecté avec des réactifs
spéciaux sur un disque ou une bande. La catalase est aussi présente dans tous les
Helicobacters et la plupart des membres de la Campylobacteraceae et est détectée par
l'introduction d'une anse de bactéries dans une goutte de peroxyde d'hydrogène et
l'observation d'une production très abondante de bulles. L'uréase est certainement le plus
important enzyme pour l'identification. Pour survivre dans sa niche écologique, H. pylori
produit de grandes quantités de cette enzyme à tamponner le milieu acide et crée un
micro-environnement.
Selon Dunn et al. (1997) les souches de H. pylori sont des spirales à Gram
négatif et microaérophiles. Des bactéries qui démontrent des extrémités arrondies dans des
échantillons des biopsies gastriques. Toutefois, lorsqu'elles sont cultivées sur un milieu
solide, les bactéries prendre une forme analogue à une tige. Après une culture prolongée
sur des milieux solides ou liquides, généralement les formes coccoïdes prédominent. En
microscopie électronique, les formes apparaissent comme des coccis, ce sont des bacilles
avec les extrémités des deux bras reliés par une structure membraneuse. Les formes
coccoïdes sont métaboliquement inactives. Cependant, ils ne peuvent pas être cultivées in
vitro. En biopsies gastriques les H. pylori sont de 2,5 à 5,0 mm de longueur et de 0,5 à 1,0
160
Discussion
mm de largeur, il y a quatre à six flagelles unipolaires gainés, qui sont essentiels pour la
motilité bactérienne.
Des biopsies gastriques d'un échantillon de six patients sur 100 sont broyées et
leur ADN est extrait pour être quantifié par PCR en temps réel. Dans notre travail, la
détection qualitative à 640 nm a révélé la présence de deux souches d' H.pylori. Selon les
valeurs de Tm trouvées, H.pylori est sensible au clarithromycine (Wildtype).
L’amplification génique par PCR est une technique qui permet d’obtenir
rapidement de multiples copies d’un fragment d’ADN bactérien cible. Plusieurs
techniques sont utilisées : la PCR standard multiplexe et la PCR en temps réel détectent
plusieurs cibles (présence de H. pylori et résistance à la clarithromycine) et la PCR
multiplexe couplée à l’hybridation sur bandelette détecte en plus la résistance aux
quinolones. Les performances diagnostiques sont supérieures à celles de l’histologie et de
la culture. Elle nécessite des conditions de transport moins contraignantes que la culture.
L’amplification génique a une excellente sensibilité et spécificité pour le diagnostic de
l’infection par H. pylori et permet la détermination des principales mutations impliquées
dans la résistance aux macrolides et aux fluoroquinolones (Lamarque et al. 2012).
Selon Debongie, (1998), la biologie moléculaire est utile dans l’étude de la
pathogénicité et de l’immunisation vis-à-vis Helicobacter pylori. La description récente
du génome de H. pylori amène la biologie moléculaire à l’avant plan dans la recherche
concernant H. pylori. La PCR est considérée comme la méthode la plus sensible pour la
détection de micro-organismes. Ceci rendrait le test particulièrement utile dans
l’évaluation de l’éradication. D’autres indications incluent la détection de H. pylori en
dehors de l’estomac, même si H. pylori n’est présent qu’en petit nombre parmi beaucoup
d’autres micro-organismes provoquant des faux positives dans d’autres tests basés sur
l’uréase ou la culture. H. pylori a ainsi été trouvée par PCR au niveau de la bouche et les
selles.
161
Discussion
La résistance au clarithromycine peut être expliquée par une diminution de
l'affinité des ribosomes de H. pylori pour les macrolides. Le support génétique de cette
résistance a été initialement déterminé par Versalovic et al. (1996): il s'agit bien de
mutations dans le gène de l'ARNr 23S. La quasi-totalité des souches résistantes présente
une mutation: les mutations A2143G et A2144G sont les plus fréquentes. Ils ont montré
qu'une mutation sur l'une des deux copies du gène de l'ARNr 23S était suffisante pour
conférer la résistance. Une forte association a ainsi été démontrée entre la résistance aux
macrolides, l'absence de fixation de l'antibiotique sur le ribosome, et la présence d'une
mutation dans le gène de l'ARNr 23S en position 2143 ou 2144. Il est donc maintenant
bien admis que ces mutations sont à l'origine de la résistance aux macrolides de la très
grande majorité des souches (Sevin et al. 2000).
Dans notre travail, la méthode de PCR en temps réel comprenait une détection
simultanée des amplicons par hybridation de deux sondes marquées avec LC-Red et la
fluorescéine en utilisant la technique du transfert de fluorescence par l'énergie de
résonance (FRET) et une analyse des courbes de fusion avec le LightCycler
thermocycleur. En 2003, Oleastro et al. ont développé une PCR en temps réel qui est une
méthode rapide et précise pour détecter ces mutations directement sur les échantillons
biopsiques. Dans leur travail, le test a été appliqué avec succès sur des souches de
référence, des plasmides de référence et des biopsies H. pylori-négatifs. Des biopsies de
200 patients ayant échoué d'une première tentative d'éradication et pour lesquels la souche
H. pylori était disponible, sont testées avec la nouvelle méthode. Un résultat a été obtenu
dans 199 cas, un seul génotype a été détecté dans 157 cas, deux génotypes ont été détectés
dans 41 cas et trois génotypes ont été détectés dans un cas. Dans quatre cas avec des
résultats discordants, la PCR en temps réel a détecté la population résistante à une
concentration si faible qu'il ne pouvait pas être détectée par la méthode phénotypique,
tandis que dans trois cas d'autres mutations pourraient être impliqués. Ce dosage a une
précision au moins aussi satisfaisante que celle des essais phénotypiques et peut être
réalisée dans 2 h, ce qui lui permet d'être utilisé avant l'administration de la thérapie dans
le cas d'une première élimination de H. pylori.
162
Discussion
Pour mieux comprendre l'effet de H.pylori sur la muqueuse gastrique, un examen
anatomopathologique et cytologique au microscope optique est réalisé sur des coupes
histologiques préparées à partir des biopsies gastriques et colorées par l'Hématoxyline –
éosine et par le Giemsa lent. L'observation a montré la présence des bâtonnets incurvés
d'H.pylori à la surface de l'épithélium gastrique et dans la lumière glandulaire des trois
patients. La présence de ce pathogène a provoqué une gastrite chronique chez un homme
âgé de 43 ans, marquée par une atrophie glandulaire et un infiltrat dense surtout en surface
ainsi que la présence d'un foyer de polynucléaires neutrophiles dans le chorion . Alors les
autres patients (homme âgé de 19 ans et une femme de 64 ans), l'observation
microscopique de leurs tissus indique la présence d'un petit nombre de H.pylori. Cette
bactérie a provoqué une gastrite aigue d'intensité légère.
L'examen histopathologique permet en plus de la détection de H.pylori, l'étude de
l'état de la muqueuse; il est indispensable au diagnostic, au typage, au grading et à la
stadification des lésions associées à l'infection. Il permet de visualiser des
microorganismes sous forme de bâtonnets, en S et/ou en virgule, à la surface de la
muqueuse gastrique, dans le mucus au contact de l'épithélium de revêtement de surface et
des cryptes. L'ingestion de ce pathogène provoque une inflammation aigue dont en
absence de guérison, la colonisation bactérienne persiste à la surface de la muqueuse
entraînant une gastrite chronique active. S'y associe fréquemment une réaction lymphoïde
folliculaire (MALT aquis) induit par H.pylori ( Zine-Charaf, 2007).
Plusieurs facteurs interviennent dans la colonisation de la muqueuse gastrique
chez l'Homme. Selon Occhialin et Megraud, (2002) Helicobacter pylori est un bacille à
Gram négatif de forme hélicoïdale qui colonise la muqueuse gastrique de l'homme, 50 %
de la population mondiale est infectée par cette bactérie. Il s'agit donc de l'infection
bactérienne chronique la plus répandue au monde. L'infection a lieu pendant l'enfance et
peut perdurer pendant toute la vie du sujet infecté. Elle induit toujours une lésion de la
muqueuse gastrique qui, dans la majorité des cas, reste asymptomatique. Une minorité de
sujets infectés (10 % au total) développe une pathologie gastrique grave telle que la
gastrite chronique, l'ulcère duodénal ou gastrique, et deux types de néoplasie,
l'adénocarcinome et le lymphome du Malt (mucosa associated lymphoid tissue) de type B.
163
Discussion
2. Isolement et caractérisation des souches de bactéries lactiques:
Le lait cru par sa richesse en substances nutritives (protéines, graisses, glucides,
vitamines…etc), constitue un milieu favorable pour le développement des germes. Il
s’agit de germes saprophytes et parmi eux, on trouve les streptocoques lactiques et les
lactobacilles. Ainsi, le lait cru représente une source de nouvelles souches de bactéries
lactiques pouvant présenter des potentialités fermentaires intéressant les industries
alimentaires et pharmaceutiques (Kacem et al. 2002). Les laits de mammifères qui ont
une importance économique et nutritionnelle sont avant tout les laits de vache, chèvre et
de brebis. Dans certaines régions spécifiques, le lait d'autres mammifères est également
exploité: c'est le cas par exemple du lait de chamelle (Afrique et Asie) (Chau et al. 2008).
Dans ce contexte, notre étude s'intéresse à isoler et caractériser des souches de
bactéries lactiques ayant une activité bactériocinogénique qui peuvent être utilisées pour
lutter contre la bactérie pathogène Helicobacter pylori. Pour cela, des échantillons du lait
cru de vache, chèvre et brebis prélevés de Miliana et Ain Defla; et d'autres échantillons du
lait cru de chamelle prélevés de Biskra et Tamanrasset ont subi des analyses dans le but de
déterminer leur qualité microbiologique. Les résultats du test de la réductase indiquent que 9
échantillons du lait cru sur 24 décolorent le bleu de méthylène en moins de deux heures.
Selon ALP, (2009), le test de la réductase, très utilisé dans l’industrie laitière,
représente une méthode indirecte simple pour surveiller la charge microbienne du lait cru.
La "réductase" figure parfois dans des contrats d’achat de lait en tant que critère de
qualité. Lors du test de la réductase, la charge en germes du lait est mesurée indirectement
par la diminution du potentiel Redox, qui résulte de l’activité métabolique des
microorganismes qui consomment l’oxygène du lait. Enfin, le bleu de méthylène est réduit
et le lait se décolore. De propres enzymes et d’autres composants du lait tels que la
vitamine C, la riboflavine et le cuivre mais également la lumière ont un impact sur la
réduction du bleu de méthylène. De plus, les différents microorganismes présentent
également des grandes différences par rapport à leur capacité à décolorer le bleu de
méthylène.
164
Discussion
Nos résultats de dénombrement du germes mésophiles totaux montre que 9
échantillons sur 30 ont un nombre élevé de 105 germes/ mL. Alors que le taux de
streptocoques et les coliformes fécaux, Staphylococcus aureus, Clostridium sulfito-
réducteurs a révélé soit un nombre inférieur à celui cité par le journal officiel algérien (105
germes/ mL) soit une absence totale de ces microorganismes dans l'échantillon analysé
(JORA, 1998).
D'après FAO, (1998), le lait traité aseptiquement d'un animal parfaitement saint,
est normalement dépourvu de micro-organismes. A la sortie des mamelles, le nombre de
germes est très faible généralement inférieur à 5000/mL. Ils proviennent de l'extérieur et
pénètrent dans la mamelle par le canal du trayon. Dans le cas d'infections de la mamelle,
le nombre de germes augmente peu (sauf dans le cas de mammites cliniques), mais ils
sont en majorité constitués de bactéries pathogènes, notamment les staphylocoques ou les
streptocoques. Ainsi, hormis les maladies de la mamelle, l'ensemencement du lait se fait
au cours des diverses manipulations dont il est l'objet à partir de la traite. Le niveau de
contamination est étroitement dépendant des conditions d'hygiène dans lesquelles sont
effectuées ces manipulations, à savoir l'état de propreté de l'animal et particulièrement
celui des mamelles, du milieu environnant (étable, local de traite), du trayon, du matériel
de récolte du lait (seaux à traire, machines à traire) et, enfin, du matériel de conservation
et de transport du lait (bidons, cuves, tanks). A noter qu'il est généralement moins élevé
dans le cas de la traite manuelle que dans la traite mécanique, car cette dernière met en
œuvre un équipement plus important et plus difficile à nettoyer.
Loumani et al. (2013) ont pu isoler et identifier 8 souches de Streptococcus
thermophilus et Lactobacillus bulgaricus à partir de 4 échantillons du yaourt collectés de
différentes régions de l'Algérie, telles que: Relizane, Oran, Ain Temouchent et
Mostaganem. Le contrôle de qualité hygiénique a révélé l'absence des bactéries
pathogènes (coliformes totaux et fécaux, Staphylococcus aureus et Salmonella) et la
présence de quelques levures qui n'influent pas sur la qualité du yaourt.
165
Discussion
Afin d'isoler des bactéries lactiques, on a réalisé des dilutions décimales à partir
des échantillons du lait cru représentant une bonne qualité microbiologique. La dernière
dilution a été ensemencée en surface de la gélose M17. Les souches mésophiles sont
incubées à 30oC et les thermophiles à 45oC. Après 24h à 48h, des colonies blanchâtres,
rondes à contour régulier apparaissent à la surface de la gélose.
Parmi les bactéries lactiques isolées dans notre travail 30 ont été purifiées et
identifiées dont leur coloration de Gram montre que les cellules bactériennes sont des
coques à Gram positif. Toutes les souches isolées sont homofermentaires, ne possédant ni
de la catalase ni de l'oxydase. L'identification biochimique et physiologique montre que
les échantillons du lait cru prélevés contiennent les espèces suivantes: Lactococcus lactis
subsp. lactis (36,66%), de Lactococcus lactis subsp. cremoris (30%), de Enterococcus
faecium (20%) et Lactococcus garvieae (13,33%). Ces souches hydrolysent l'esculine et
sont dépourvues de β-glucuronidase, de phosphatase alcaline et de pouvoir hémolytique.
Elles fermentent le Ribose, Mannose, Lactose et Tréhalose, mais pas le glycogène. Ces
bactéries lactiques produisent aussi de l'acétoine. La mesure de l'activité acidifiante de ces
souches montre que le meilleur pouvoir a été enregistré au bout de 24 h avec les deux
souches de Lactococcus lactis subsp. cremoris :B30 et B28, la quantité d'acide mesurée
égale à 45 oD et 40 oD, respectivement.
D'après Ammor et al. (2006) ; Monnet et al. (2008), les bactéries susceptibles
d'être produites et utilisées comme ferments lactiques ne doivent évidement pas présenter
de caractère pathogène et ne pas générer de substances toxiques. C’est le cas de la plupart
des espèces de bactéries lactiques, qui possèdent le statut GRAS (Generally Recognized
As Safe).
La fonction acidifiante constitue la propriété métabolique la plus recherchée des
bactéries lactiques utilisées dans les industries alimentaires. Elle se manifeste par la
production de l’acide lactique à partir de la fermentation des hydrates de carbone au cours
de la croissance bactérienne (Mäyrä-Mäkinen et Bigret, 2004 ; Monnet et al. 2008).
Une dominance des souches de Lactococcus a été observée dans nos échantillons
utilisés dans notre travail. Cette dominance de Lactococcus a été aussi trouvée par les
travaux de Kacem et al. (2002). Ils ont isolées 117 bactéries lactiques à partir de 18
166
Discussion
échantillons du lait de vache, brebis et de chèvre prélevés de la région de l'ouest Algérien.
Parmi ces souches isolées 95 sont des lactocoques: 37 souches de Lactococcus lactis
subsp. lactis, 26 souches de Lactococcus lactis subsp. diacetylactis et 32 souches de
Lactococcus lactis subsp. cremoris.
En 2006, Zadi-Karam et Karam ont permis d'isoler et identifier sur 8
échantillons du lait cru de chamelle prélevés de deux régions Timimoun et Béchar des
souches de Lactococcus lactis subsp. diacetylactis, Lactococcus cremoris et Lactococcus
lactis.
Badis et al. (2005) ont isolé des souches de Lactococcus à partir de 19
échantillons de lait provenaient de chèvres de la population Arabia de Djelfa et de la
population Kabyle de Tizi ouzou. Le genre Lactococcus représente 22.9% des souches
isolées de la population Kabyle, alors dans la population Arabia le même genre bactérien
est représenté par 31.02%. L'identification morphologique, physiologique et biochimique
a permis de rattacher 14 isolats qui convient à l'espèce Lactococcus lactis subsp. lactis.
Nous avons identifié dans nos échantillons du lait cru une espèce Ec.faecium.
Ces résultats supposent que les conditions de la traite et de stockage des laits sont
défavorables aux espèces d'origine fécale.
Le travail de Cheriguene et al. (2007) sur des échantillons du lait cru de vache a
permis d'isoler 153 souches de bactéries lactiques. Les souches ont été identifiées selon
les critères morphologiques, biochimiques et physiologiques en utilisant le système Api et
la technique d'électrophorèse SDS-PAGE. L'identification a rélevé la présence de six
genres dans les échantillons du lait: Enterococcus(41,82%), Lactobacillus (29,40%),
Lactococcus (19,60%), Leconostoc (4, 57%), Streptococcus thermophilus (3,26%), et
Pediococcus (1,30%). Les espèces identifiées sont présentées par Enterococcus faecium
(24), Enterococcus durans (22), Lactococcus lactis subsp. lactis (25), Lactobacillus
rhamnosus (9) et Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus (7).
D'après Aguilar-Galvez et al. (2012), les bactéries les plus couramment
présents dans les fromages sont E. faecium, E. faecalis et E. durans, aussi bien les
fromages à base de lait cru que de lait pasteurisé, retrouve moins souvent E. casseliflavus.
Les entérocoques ont un rôle important dans la maturation de plusieurs variétés de
167
Discussion
fromages, probablement en raison de leur activité protéolytique, lipolytique, de leur
capacité de production du diacétyle et d’autres composants volatils contribuant à
l’aromatisation, la flaveur et au goût caractéristique. Les Enterococcus sont des coccoïdes,
à Gram positif, oxydase et catalase négatives. Certaines espèces présentent une activité
pseudo-catalase. Ils sont généralement des anaérobies facultatifs et non mobiles. Les
cellules sont ovoïdes et se présentent sous forme de cellules isolées, par paire ou encore
sous forme de chaînette. Généralement, les entérocoques produisent des colonies de
couleur blanche. Les entérocoques capables de croître dans des conditions extrêmes
(milieux très alcalins, hypothermie à 10oC ou hyperthermie à 60oC, sels biliaires) (Dupont
et Plantefève, 2002). L'isolement et l'identification des bactéries lactiques fait l'objet de
Bekhouche et Boulahrouf, (2005). Les dénombrements et l’identification des bactéries
lactiques isolées à partir de lait cru de vaches appartenant à six stations d’élevage de la
région de Constantine ont été effectués. Le nombre moyen de bactéries lactiques varie de
0,579x 107 à 11,40x 107 UFC/mL. Sur 1645 souches isolées 1000 souches ont pu être
purifiées et identifiées. Il s'agirait des genres Streptococcus (147 souches), Lactococcus
(121), Enterococcus (95), Leuconostoc (272), Lactobacillus (197) et Pediococcus. (168).
L’étude des caractéristiques biochimiques et physiologiques a permis d’identifier soixante
six souches aux espèces suivantes : Lactococcus lactis subsp.lactis (2), Lac. lactis subsp.
cremoris (1), Enterococcus faecium (5), Ec. faecalis (2), Ec. durans (1), Streptococcus
thermophilus (8), Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (9), Ln. lactis (7),
Pediococcus acidilactici(4), Pc. urinae equi (7), Pc. pentosaceus (1), Pc. parvulus (4) et
Pc. dextrinicus (1). Dans le genre Lactobacillus , 14 souches sont classées parmi le groupe
Betabacterium et appartiennent aux espèces Lactobacillus cellobiosus (10), Lb. brevis ou
Lb. buchneri(4). Les quatre dernières souches appartenant au groupe Thermobacterium se
rapprochent des espèces suivantes : Lactobacillus delbruekii (1) et Lb. acidophilus (2) et
au groupe Streptobacterium avec comme espèce Lb. plantarum (1).
Maghnia et al. 2013, ont isolé 39 souches de bactéries lactiques du fromage
artisanal de la région d'Oran. Ces souches appartiennent au quatre genres, dont 49% sont
des souches de Lactobacillus, 20% de Lactococcus, 18% de Leuconostoc et 13%
d'Enterococcus. Une dominance de Lactococcus lactis et Lactobacillus dulbrueckii sp a
été constaté dans les échantillons du fromage.
168
Discussion
3. Etude de l'activité antibactérienne in vitro:
Le système digestif chez l'humain en santé pourrait contenir des espèces
bactériennes différentes. Le rôle biologique de ces bactéries est important pour la
régulation de la transition intestinale, la protection contre les bactéries pathogènes qui se
trouvent dans l'intestin, la stimulation du système immunitaire et la production des
vitamines. Les bactéries lactiques sont connues pour leur capacité d'adhésion aux cellules
épithéliales de l'homme: cette adhésion apparaît chez Lactobacillus acidophilus et les
Bifidobactéries. Ces souches sont connues pour leur forte capacité d'adhésion à la surface
de l'intestin, ceci peut les aider à résister aux conditions défavorables de l'intestin. De
l'autre côté, les bactéries lactiques peuvent empêcher l'adhésion de plusieurs bactéries
pathogènes par la sécrétion d'inhibiteurs d'adhérence (Matto et al. 2006). Reid et al.
(2003), ont clairement démontré l'application des bactéries lactiques dans la maintenance
de la santé humaine, ainsi que dans la stimulation du système immunitaire. Les bactéries
lactiques possèdent aussi des propriétés antitumorales contre le cancer du colon. De plus,
elles sont capables de diminuer le taux de cholestérol sanguin et elles présentent un effet
antidiabétique (Rafter , 2003). L'activité antagoniste des bactéries lactiques vis-à-vis des
bactéries pathogènes a été confirmée par plusieurs travaux. Les études de Makras et al.
(2006), ont montré une activité inhibitrice de Salmonella sp, Staphylococcus aureus et le
E. coli par des bactéries lactiques. Henni et al. (2013) ont montré aussi que deux souches
de Streptococcus thermophilus et Lactobacillus delbruekii subsp.bulgaricus isolées des
échantillons du lait cru de vache ont une activité inhibitrice de deux pathogènes
Staphylococcus aureus et Salmonella sp.
Les bactéries lactiques forment actuellement un groupe d’organismes utilisés
pour l'enrichissement de certains yaourts et laits. Cette utilisation est due aux effets
nutritionnels et thérapeutiques de ces bactéries car elles enrichissent le milieu où elles se
trouvent en vitamines (B et K), acides aminés, composés organiques (acides lactique et
acétique), enzymes (lactase) et bactériocines responsables de l'inhibition des bactéries
pathogènes. Les bactéries les plus fréquemment utilisées comme probiotiques sont des
Lactobacillus et des Bifidobacterium . Les lactobacilles ont été incorporés dans des laits
fermentés, des fromages et des glaces (Dib et al. 2012).
169
Discussion
Afin de rechercher des bactéries lactiques ayant un effet inhibiteur de la
croissance des souches de H.pylori, des interactions ont été faites entre 30 souches de
bactéries lactiques isolées du laits crus au cours de notre travail et des souches de
Helicobacter pylori (souches de références: 26695 ; J99 ; TN2GF4 et HPAG1, souche
clinique : HSA3068) proviennent du centre national de référence des Campylobacters et
des Helicobacters de Bordeaux, et deux souches Hp1 et Hp3 isolées au niveau de
laboratoire de bactériologie de l'hôpital Cochin, Paris . La méthode de diffusion sur gélose
permet d'obtenir des zones claires autour des disques imbibés par les précultures des
bactéries lactiques.
D’après nos résultats, les meilleures zones d'inhibition ont été trouvées avec les
deux souches E.faecium (B13) et Lc. lactis subsp. lactis (B01).Ces résultats montrent que
les bactéries lactiques ne présentent pas le même spectre d’action vis-à-vis les souches de
H.pylori. L'antibiogramme de la souche de réference TN2GF4 a révélé une sensibilité à
Amoxicilline, Clarithromycine et Levofloxacine, ainsi que ce pathogène est sensible aux
effet des deux bactéries B13 et B01. La souche J99 a montré une sensibilité vers les deux
bactéries lactiques E.faecium et Lactococcus lactis subsp. lactis exprimée par des zones
d'inhibition, mais elle résiste bien à l'effet de Amoxicilline et Clarithromycine. Les deux
souches Hp1 et Hp3 sont sensibles au Clarithromycine et aux effets inhibiteurs de
bactéries lactiques utilisées dans notre travail, dont le plus grand diamètre de la zone
d'inhibition est égale à 10mm, enregistré avec la souche Hp1.
Plusieurs travaux réalisés dans le domaine, montrent que les probiotiques ont des
effets bénéfiques dans le traitement de plusieurs maladies gastro-intestinales. Parmi ces
travaux, ceux de Allem et al. (2007), dont l’effet antagonique des souches de bactéries
lactiques vis-à-vis Helicobacter pylori a été évalué par la méthode de diffusion en gélose.
Des inhibitions ont été constatées avec les souches de Streptococcus thermophilus,
Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus et Bifidobacterium longum ; les
diamètres obtenus des zones d’inhibition sont entre 5 mm et 14 mm. L’analyse qualitative
des acides organiques par la chromatographie sur couche mince a montré la présence
d’acide lactique dans les cultures de bactéries lactiques. Leur activité antibactérienne est
170
Discussion
due à la production d’acide lactique. Lin et al. (2011) ont montré que des souches de
Enterococcus et Pediococcus ont un effet inhibiteur H.pylori.
Un autre travail effectuée in vitro par Medouakh et al. (2010) a pour but de
tester l'effet inhibiteur des souches de Lactobacillus isolées à partir du lait cru de chèvre,
en utilisant la méthode de puits. Les résultats montrent que toutes les souches utilisées
inhibent la croissance des souches cliniques de H.pylori, dont cette activité inhibitrice a
été perdu après neutralisation de surnageant des cultures de Lactobacillus. L'ajout de
surnageant de la culture de Lactobacillus rhamnosus 1 aux cultures de deux souches de
H.pylori(Hp1 et Hp2) a diminué la viabilité de ce pathogène de 105 au 103 UFC/mL après
24 h et aucune cellule viable a été trouvée après 72h pour Hp1 et après 60h pour Hp2.
Ces résultats ont confirmé que l'acide lactique est l'agent responsable de l'inhibition de
H.pylori.
Boyanova et al. (2009) révèlent qu'à un pH bas le diamètre moyen d'inhibition
des souches de H. pylori par Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus variait de 8-4 à
10-4 mm, alors à pH neutralisé le diamètre moyen d'inhibition variait de 7-7 à 9-0 mm.
Les écarts entre les activités de souches Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
contre les souches sensibles aux antibiotiques de H. pylori et contre les souches résistantes
aux antibiotiques n'étaient pas statistiquement important pour le métronidazole (P ≥ 0-
071), la clarithromycine (P ≥ 0-274) et les deux métronidazole et la clarithromycine (P ≥
0-054). À faible pH et neutralisé, la souche LB3 était active contre 11 et 8 de 12 souches
résistantes au métronidazole, respectivement, et contre quatre et trois de quatre souches
résistantes de clarithromycine de H.pylori, respectivement. De même, à un pH faible et
neutralisé, la souche LB2 est active contre 10 et 6 de 12 souches de H.pylori résistantes à
la métronidazole et contre quatre et deux de quatre souches de H.pylori résistantes à la
clarithromycine, respectivement. De plus, à la fois LB2 et LB3 inhibent la croissance de
trois (à pH faible) et deux (à pH neutralisé) de trois souches de H. pylori marquées une
résistance à la fois de métronidazole et la clarithromycine.
171
Discussion
D'après Aguilar-Galvez et al. (2012), les Enterococcus sont des bactéries
lactiques, ubiquitaires, trouvées fréquemment dans la flore microbienne du tractus gastro-
intestinal des animaux à sang chaud, ainsi que dans une variété de produits alimentaires.
Ils sont utilisés dans les aliments soit comme agents antimicrobiens, soit pour leurs
propriétés organoleptiques et parfois comme probiotique.
Le spectre d’inhibition des Enterococcus a été largement étudié et caractérisé
notamment au niveau de la lutte contre Listeria monocytogenes, Staphylococcus spp. et
Clostridium spp. (Ghrairi et al. 2008). López-Brea et al. (2008) ont testé l'effet de 32
souches de bactéries lactiques sur des souches cliniques de H.pylori par la méthode de
diffusion sur gélose. Parmi les souches utilisées une souche de Enterococcus faecium a
permis d'inhiber des souches de H.pylori.
Une autre souche de bactérie lactique parmi les souches isolées dans notre travail
a donné des zones d'inhibition vis-à-vis H.pylori, c'est la souche Lactococcus lactis subsp.
lactis (B01) qui possède une activité antibactérienne contre les souches à Gram négatif
d’H.pylori (J99, HSA3068, 26695, TN2GF4). Ces résultats vont dans le même sens que
ceux trouvés par Vinod Kumar et al. (2006) qui ont isolé du radis, une souche de
Lactococcus lactis qui possède une activité antibactérienne contre plusieurs espèces à
Gram négatif. La souche B25 (Lactococcus lactis subsp. cremoris) isolée du lait de
chamelle de Biskra a inhibé la croissance de quatre souches d'H.pylori: TN2GF4, J99,
26695 et HSA3068. Une souche de Lactococcus lactis subsp. cremoris isolée par
Elmoualdi et al. (2008) à partir de jus de presse de canne à sucre a inhibé in vitro la
souche Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Les propriétés antibactériennes des bactéries lactiques dépendent de plusieurs
critères: le pH, le milieu de croissance et la production de substances antibactériennes
comme les bactériocines, les acides organiques et le peroxyde d'hydrogène. La
fermentation des glucides est un procédé très important pour les bactéries lactiques.
L'acidification du milieu par l'acide lactique joue un rôle considérable dans la capacité
inhibitrice des bactéries lactiques contre plusieurs bactéries pathogènes , Hicks et
Goepfert en 1968 ont bien confirmé que l'acide lactique et l'acide acétique produits par
les bactéries lactiques participent à l'inhibition de Staphylococcus aureus. Ils ont démontré
172
Discussion
aussi que Salmonella pouvait être inhibée par le pH inférieur à 4.4 pour l'acide lactique et
à 5.4 pour l'acide acétique (Huttunen et al. 1995).
Pour déterminer l'agent inhibiteur de Helicobacter pylori, des associations
bactériènnes en milieu liquide ont été effectuées entre une souche de H. pylori isolée à
partir d'une biopsie gastrique d'un patient ayant un ulcère et de deux souches de bactéries
lactiques: Streptococcus thermophilus et Lactobacillus acidophilus. Les Surnageants
obtenus par centrifugation (12400tr/min pendant 10 min) des cultures bactériennes traitées
avec différentes températures: 100oC/60mn, 100oC/30mn et 121oC/15mn, sont analysés
par HPLC. L'analyse qualitative a montré la présence de l'acide lactique et l'absence de
l'acide acétique dans les deux surnageants obtenus, dont nous avons constaté une quantité
de 0,019 g / L sécrétée par Streptococcus thermophilus et d'une quantité de 0,058 g / L
sécrétée par Lactobacillus acidophilus (Guetarni et al. 2012).
D'après Vinod Kumar et al. (2006) , les bactéries lactiques produisent lors de
leurs croissance plusieurs composés actifs à savoir les acides organiques, du peroxyde
d’hydrogène et des substances naturelles de nature protéique (les bactériocines) douées
d’une activité antagoniste. Pour cela, l'effet des acides organiques et de peroxyde
d'hydrogène a été éliminé du milieu de culture.
Dans notre travail la culture bactérienne de Enterococcus faecium B13 a subi des
centrifugations, dont la fraction extracellulaire a montré un effet inhibiteur vis-à-vis les
souches d’H.pylori (TN2GF4, HSA3068, J99, 26695, Hp1 et Hp3) que l'extrait cellulaire
(culot). Ce ci indique que la substance inhibitrice est présente dans la fraction
extracellulaire. L’extrait cellulaire de culture de E.faecium (B13) a une activité inhibitrice
qui due à une molécule de nature protéique car elle est sensible aux enzymes
protéolytiques: Pepsine et Trypsine. Nos résultats suggèrent que le facteur antibactérien
produit est de nature protéique, c'est une bactériocine. Elle conserve son activité
antagoniste après avoir été soumise à des traitements thermiques assez élevés comparables
à la pasteurisation et la stérilisation du lait (60oC pendant 30min, 80oC pendant 10min et
100oC pendant 5min). Cette bactériocine est aussi stable à pH 4 et à pH 8. Ces
173
Discussion
caractéristiques confèrent à cette bactériocine un grand intérêt technologique dans la
bioconservation des aliments et la lutte contre les bactéries pathogènes.
Les bactériocines produites par les bactéries lactiques sont des peptides
antimicrobiens de faible poids moléculaire. Leur spectre d'action est généralement étroit.
Cependant, la plupart ont une activité contre des pathogènes alimentaire tel que Listeria
monocytogenes. L'application des bactériocines ou des souches productrices dans les
aliments pour y éviter le développement de bactéries pathogènes ou altérantes a donc été
envisagée (Dortu et Thonart, 2009). Des études furent conduites in vitro par Kang et
Lee, (2005) afin d'évaluer les effets inhibiteurs de E. faecium GM-1 sur H. pylori, souche
isolée des selles des nouveaux-nés. E. faecium GM-1 a été choisi pour sa capacité de
résister aux conditions physiologiques du tube digestif surtout l'acidité et la bile. Les
résultats montrent que le surnageant de culture de E. faecium diminue significativement le
taux de l'uréase sécrétée par H. pylori. Cette activité inhibitrice fut conservée après
l'ajustement du pH du surnageant de culture à neutralité. Toutefois, un traitement avec des
enzymes protéolytiques a diminué l'activité anti-H. pylori de GM-1. Par conséquent, une
ou des substances de E. faecium GM-1 autre que l'acide lactique pourraient être associées
avec cette activité inhibitrice.
Vinod Kumar et al. (2006) ont démontré que le pH optimal de production des
bactériocines par les bactéries lactiques est 6,5, de plus, ils ont confirmé que l’action de
ces bactériocines est maximale au même pH (6,5). Les bactériocines sécrétées par
Enterococcus faecium ont fait l'objet des études de Cintas et al. (1998). La bactériocine
Entérocine P qui a été purifiée d'une souche de Enterococcus faecium P13 appartient à la
classe II, sous classe IIa. Cette classe est douée d'une activité inhibitrice de Listeria spp.
Ces molécules présentent en effet, soit purifiées soit à travers leur production in situ par
une bactérie lactique, un très fort potentiel en protection alimentaire. Ces bactériocines
sont des peptides de taille réduite, comprise entre 37 et 48 résidus, qui possèdent de très
fortes homologies en séquence, en particulier dans leur moitié N-terminale. L'enterocine P
est responsable de la dissipation du ∆ψ à partir de cellules énergisées uniquement, et de
l'efflux de 86 Rb+, un analogue de K+, à partir de cellules énergisées.
174
Discussion
4. Etude de l'activité antibactérienne in vivo:
Nos travaux réalisés in vitro, ont montré une activité anti-H.pylori de la bactérie
lactique isolée du lait cru de chèvre de Miliana: Enterococcus faecium (B13). Cette
bactérie produit une substance de nature protéique douée d'une activité inhibitrice de ce
pathogène. Afin de déterminer l'effet probiotique de B13, des souris Balb/c, femelles,
âgées de deux mois sont utilisées comme modèle d'étude. Ces souris sont divisées en trois
lots, chaque lot contient 12 souris. Avant toute expérimentation les selles des souris du
groupe témoin ont subi une analyse microbiologique. Le but de ce contrôle est de
connaître surtout la présence de la bactérie lactique Enterococcus faecium. D'autres
microorganismes ont été recherchés comme: E.coli, Salmonella spp, Shigella spp,
Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Clostridium, Enterococcus spp, Lactobacillus
spp, Lactococcus spp, levures et moisissures. Le contrôle microbiologique des selles des
souris avant toute expérimentation n'a révélé aucune présence de Enterococcus faecium.
Les souris BalB sont utiles dans la recherche du cancer et l'immunologie. Ils
produisent des plasmocytomes avec l'injection de l'huile minérale, un processus important
pour la production d'anticorps monoclonaux. Ils sont également signalés comme ayant une
faible incidence de tumeurs mammaires, mais ne développent d'autres types de cancers à
l'âge adulte, les tumeurs les plus couramment connus sont des tumeurs pulmonaires et des
tumeurs rénales. La plupart des sous espèces ont une longue durée de vie reproductive, et
sont connus par des niveaux élevés d'anxiété et d'être relativement résistants à la diète
induite par l'athérosclérose, ce qui les rend un modèle utile pour la recherche dans les
maladies cardiovasculaires (The Jackson Laboratory, 1987).
La souris est un des animaux de laboratoire les plus utilisés. La microflore de la
souris est caractérisée par une grande dominance des bactéroïdes dans le cæcum et le gros
intestin. La microflore autochtone de la souris est constituée essentiellement des
streptocoques anaérobies qui apparaissent en premier après la naissance et persistent en
plus grand nombre dans tout l’intestin et l’estomac. On trouve également des
streptocoques, des microcoques et Clostridium welchii, et la présence de levures est
souvent constatée. E. coli est trouvé constamment, mais parfois en quantité proche de
175
Discussion
celui des lactobacilles et parfois en quantité bien plus faible. Enfin certaines espèces, par
exemple les Flavobacterium, apparaissent très transitoirement et uniquement dans
l’intestin grêle, puis disparaissent rapidement (Tannock 1997; Pena et al. 2004).
Avant l'infection de nos souris, un fragment de l'estomac d'une souris du groupe
témoin a été broyé dans quelques millilitres de bouillon BGT, pour assurer la dispersion
des cellules de Helicobacter pylori de la muqueuse gastrique. L'ensemencement de ce
broyat sur la gélose Brucella, à 37oC et sous une atmosphère microaérophile, n'a pas
donné des colonies de Helicobacter pylori après 3 à 5 jours d'incubation. Ce ci indique
que les souris utilisées dans cette étude ne sont pas infectées pas Helicobacter pylori.
Alors, après infection des souris par la souche TN2GF4, H. pylori a été détectée
avec succès dans la muqueuse gastrique des souris au cours des 2 phases de l’observation
(21 J et 30 J). Cette bactérie a provoqué une érosion de l'épithélium gastrique,
rétrécissement du corps glandulaire et l'apparition des amas cellulaires (petites et grandes
follicules) parsemés sur le chorion (Lamina propria). Un dénombrement de Helicobacter
pylori a été réalisé sur des cultures sur gélose Columbia du broyat des fragments
biopsiques de l'estomac des souris infectées. Après 3 à 5 jours d'incubation à 37oC sous
une atmosphère microaérophile, des colonies grisâtres et translucides apparaissent dont
leur nombre variait de 1,5x105 à 1,2x 106 UFC/mL.
Les souris sont inoculées par 0,5mL (109 CFU/mL), cette dose est administrée
trois fois pendant une semaine, avec un intervalle de 2 jours entre les inoculations. A
partir du 30 ème jour, le nombre de H.pylori commence a augmenté pour atteindre un
maximum de 2,9x106 UFC/mL, le taux d'accroissement est 52.42% entre les moyennes
des 2 phases de lot 2. Durant les 30 jours de l'infection, H.pylori colonise bien la
muqueuse gastrique de l'estomac des souris, elle se multiplie bien dans ce tissu, ce qui
montre une augmentation du nombre d'H.pylori.
La souche TN2GF4 a l'îlot de pathogénicité CagPAI, une CagA3', CagE et CagI.
D'après Zine-Charaf, (2007) les sujets infectés par H.pylori Cag+ présenteraient un
risque plus grand de développer un ulcère, un degré plus sévère d'inflammation, d'atrophie
176
Discussion
et de lésions précancéreuses avec une synthèse augmenté d'interleukine 8 et 6 au niveau
de la muqueuse gastrique, une concentration plus faible d'acide ascorbique dans le liquide
gastrique, et une probabilité plus grande de développer un lymphome gastrique de type
MALT. Le degré de sévérité des lésions dégénératives des cellules épithéliales de la
muqueuse gastrique est en corrélation avec le nombre de bactéries adhérentes à
l'épithélium, ce qui suggère que cette adhérence soit cruciale pour l'action cytotoxique de
la bactérie. L'adhérence est considérée comme une propriété indispensable à la
multiplication et à la persistance de la bactérie au contact de la muqueuse gastrique.
H.pylori se trouve majoritairement sous la couche de mucus, à proximité de la surface des
cellules épithéliales antrales ce qui témoigne de l'existence d'antigènes bactériens
(adhésines) capables d'interagir spécifiquement avec des récepteurs cellulaires de
l'épithélium antral. Outre un effacement des microvillosités au site d'attachement,
l'adhérence de H.pylori entraîne un réarrangement du cytosquelette cellulaire et la
formation d'un piédestal.
H. pylori colonise facilement l’estomac des souris, grâce à ses flagelles et sa
forme hélicoïdale. Elle glisse à travers la muqueuse de l’estomac et s’ancre aux cellules
épithéliales grâce à des adhésines. Elle secrète une uréase et en présence de protéines
transforme l’urée en ammoniac et CO2. Cette production d’ammoniaque crée un
microenvironnement tamponné autour de la bactérie et permet sa survie en milieu acide.
L’ammoniac est toxique pour les cellules épithéliales et va endommager la surface des
cellules épithéliales. Cependant aucun effet n’a été observé chez les souris groupe témoin
qui ne sont pas infectées par la souche TN2GF4.
Le traitement des souris par une dose de 107 CFU/mL de Enterococcus faecium
(B13) isolée du lait de chèvre diminue le nombre de TN2GF4 soit de 1,2x106 à 1,6x105
UFC/mL au J 30. Ce qui indique que la souche E.faecium (B13) réduit bien la
colonisation d’H pylori de la muqueuse gastrique des souris infectées et traitées. Cette
bactérie lactique a montré un effet inhibiteur de ce pathogène in vitro par la sécrétion
d'une bactériocine. Le dénombrement des colonies de H.pylori obtenus par culture sur
gélose, révèle un abaissement de 4,9.105 à 2,8.105 UFC/mL, un taux de 42,86 % entre les
moyennes des 2 phases de lot 3.
177
Discussion
Une analyse de la variance au seuil de 5% appliquée au nombre de colonies de
H.pylori au niveau de deux lots infecté et traité par E.faecium, dont la charge de H.pylori
est diminuée de prés un log après administration de E.faecium. Le test t de Student réalisé
entre le groupe infecté et le groupe traité a montré une différence hautement significative
(α=0.05). L’analyse des selles des souris traitées par la bactérie lactique a révélé la
présence de Enterococcus faecium avec des concentrations fécales variaient de 6x 105 à
1.03x 106 UFC/ml.
Les résultats trouvés in vivo indiquent clairement que la souche Enterococcus
faecium ne colonise pas l’épithélium intestinal et sera donc présente dans la microflore
seulement pendant la période de consommation. Elle est ensuite éliminée en quelques
jours sans colonisation durable. Durant son passage B13 sécrète des métabolites ayant une
activité inhibitrice de TN2GF4. Ces molécules peuvent être de l'acide lactique ou une
bactériocine, car in vitro cette bactérie a montré un pouvoir acidifiant par la synthèse
d'une faible quantité de l'acide lactique. Aussi après élimination de l'effet antibactérien des
acides organiques et de peroxyde d'hydrogène, B13 synthétise et sécrète dans le milieu
extracellulaire une substance de nature protéique, résiste bien à l'effet de la chaleur et
stable aux pH 4 et8.
L'analyse quantitative par HPLC a révélé qu' une souche de Streptococcus
thermophilus, qui a montré un effet inhibiteur important d'une souche de Helicobacter
pylori isolée chez un patient ayant l'ulcère gastrique, sécrète une faible quantité de l'acide
lactique estimée à 0,019 g / L (Guetarni et al. 2012).
Menad et al. (2012) ont démontré in vivo l'effet antibactérien des souches de
bactéries lactiques vis-à-vis Salmonella enterica sérotype typhimurium. Cette étude a été
menée sur des souris albinos suisses afin de connaître l'effet probiotique des souches de
référence Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus et
Lactobacillus paracasei en combinaison avec Bifidobacterium sp sur les complications
intestinales liées à la présence de Salmonella enterica sérotype typhimurium. Le nombre
de Salmonella enterica sérotype typhimurium diminue dans l'intestin, l'estomac et dans le
foie dans le cas d'un traitement préventif.
178
Discussion
Un travail réalisé in vivo par Doumandji, (2007) révèle que les probiotiques ont
un effet antibactérien sur des bactéries pathogènes impliquées dans la physiopathologie
gastro-intestinale. Une souche de Streptococcus thermophilus est associée à
Bifidobacterium bifidum dans du lait adapté au 1er âge. Le rapport respectif d’association
7/1 en nombre de cellules semble favorable à la croissance de B.bifidum. L’effet
antagoniste in vitro apparaît après 4 h de fermentation en présence de B. bifidum en
culture mixte avec S. thermophilus. Le pourcentage d’inhibition d’Escherichia coli est de
90 %. Ce pourcentage de diminution du nombre d’E. coli n’est observé qu’après 8 h de
fermentation en présence de B. bifidum seul. Une mortalité de 50 % est notée chez les
souris ayant reçu E. coli seul (lot 1). L’effet antagoniste in vivo lors d’un traitement
préventif est significativement plus important en présence des deux espèces associées (lot
3) que lorsque B. bifidum est donné seul (lot 2). Au niveau des lots 4 et 5 (traitement
thérapeutique), une diminution d’E. coli a été constaté au terme du 2ème jour après la prise
du lait fermenté au B. bifidum en culture mixte (lot 5) avec un taux de diminution de 89,52
%. Or cet effet n’est observé qu’après le 5ème jour de la prise du lait fermenté au B.
bifidum seul (lot 4).
Le devenir après ingestion d’une souche d’ Enterococcus faecium utilisée dans
un produit probiotique a été étudié par Lund et al. (2002). Ils ont montré que chez 8
volontaires sur 10 qui avaient consommé quotidiennement environ 109 UFC pendant 10
jours, que la bactérie était récupérée à des taux entre 103.1 et 106.6 UFC/g. Les auteurs
montraient aussi que la présence de la souche était transitoire et ne persistait pas après
l’arrêt de la consommation.
Des souches d'Enterococcus faecium isolées à partir de Chungkukjang ont une
résistance éprouvée contre les conditions gastro-intestinales telles que l'environnement
acide et des sels biliaires. Ces souches ont également montré une activité hydrolase des
sels biliaires, mais ni l'activité hémolytique ni le facteur de virulence a été détecté. Pour
cette raison, les souches pourraient être utilisées comme entrée ou des cultures de
couvertures sélectionnées dans la production alimentaire à partir de graines de soja
fermentées. Cette bactérie a montré une activité inhibitrice in vitro de la bactérie Listeria
monocytogenes (Yoon et al. 2008).
179
Discussion
La présence de Enterococcus faecium dans les selles indique que cette bactérie
résiste bien aux conditions physiologiques du tube digestif (bile, sécrétion pancréatique et
l'acidité de l'estomac). Durant son transit, cette bactérie n'a pas causé une pathologie chez
les souris par contre elle a inhibé la croissance de H.pylori. Cette bactérie transite dans le
système digestif et résiste à l’acidité gastrique et les sécrétions bilio-pancréatiques par un
passage rapide dans l’estomac. Tsai et al. (2004) ont observé que la souche Enterococcus
faecium TM 39 ayant la capacité de tolérer l’acide et les sels biliaires et inhiber la
croissance d’H pylori in vitro
Dans le modèle de souris, l’inhibition d’H pylori par Enterococcus faecium peut
se faire par différentes manières:
Diminution de synthèse d’ammoniaque: H. pylori possède une activité uréase et peut
produire de l'ammoniaque par hydrolyse de l'urée. Il peut donc contribuer à
l'hyperammoniémie (Gubbins et al., 1993) mais l’introduction d’ Enterococcus faecium
ralentie la synthèse de NH3. L'efficacité de l'administration d' Enterococcus
faecium (SF68) a été démontrée par les travaux de Loguercio et al. (1995) qui confirment
que cette bactérie dépourvue d'uréase diminue la synthèse colique d'ammoniaque.
Des effets immunomodulateurs : Ces effets ont été signalés par les travaux de Sun et al.
(2010). Cette étude a démontré que E. faecium SF68 affecte la flore microbienne
intestinale et module les réponses immunitaires par l’augmentation des niveaux
d'interleukine-4 (IL-4), l'interleukine-6 (IL-6) et l'interféron γ-(IFN-γ), ce qui indique une
caractéristique probiotique de E. faecium SF68 dans la modification de la fonction
immunitaire.
Des résultats similaires sont obtenus par Kang et Lee, (2005) montrent que le
surnageant de culture de E. faecium (GM-1) diminue significativement la viabilité et
l'uréase d’ H. pylori ainsi l'analyse par microscopie électronique a également démontré
que l'ajout de GM-1 détruisait la structure cellulaire de H. pylori. Des études
supplémentaires ont suggéré que la liaison de H. pylori à des cellules humaines du côlon a
diminué en présence de GM-1. Tsai et al. (2004) ont décrit que le traitement
de H. pylori avec les cellules de la souche Enterococcus faeciumTM39 réduit
significativement sa liaison aux cellules de carcinome gastrique (TSGH 9201).
180
Discussion
De ce fait, certaines souches d’Enterococcus faecium sont montrées comme des
probiotiques qui induisent des effets bénéfiques sur la santé du consommateur. Sur le
marché, ces microorganismes sont disponibles sous forme de compléments alimentaires,
tels que la souche Enterococcus faecium Cernelle 68 (SF 68) sous une forme déshydratée,
commercialisée par la société bioflorin (Suède) (Özcan et al. 2003).
Plusieurs études in vitro ont montré l'addition de certains probiotiques, également
des bactéries, inhibe Helicobacter pylori. Pourtant les démonstrations de cette action in
vivo restent rares. Des chercheurs espagnols de l’université de Valence ont montré que
Bifidobacterium bifidum est le prometteur dans la prévention des infections gastro-
intestinales et il a un effet inhibiteur in vitro sur l’Helicobacter pylori. Dans leur étude, les
scientifiques ont isolé Bifidobacterium bifidum des selles d’enfants allaités et ont évalué
ensuite son action contre l'Helicobacter pylori. Il est effectivement capable d’inhiber 82%
des Helicobacters et cette action peut aller jusqu’à 95% dans certaines conditions de
purification préalables. Son effet a ensuite été évalué in vivo chez des souris
génétiquement modifiées pour déclencher des ulcères. Après 21 jours, les animaux
recevant Bifidobacterium bifidum ont développé moins d’ulcères. Bifidobacterium
bifidum réduit les dommages causés par l’acidité gastrique tout comme il réduit la
pathogénécité d’Helicobacter pylori, sans que son ingestion ne déclenche de maladie
particulière. Ce nouveau probiotique remplit selon les auteurs “les propriétés nécessaires
et recherchées pour un probiotique : résistance aux sels billiaires, au chlorure de sodium et
à un pH bas ; adhérence à la muqueuse intestinale ; sensibilité aux antibotiques". Des
essais chez l’homme doivent être conduits avant que la commercialisation de ce
probiotique ne puisse être autorisée (Chenoll et al. 2011).
181
CONCLUSION
Conclusion
CONCLUSION
Helicobacter pylori constitue un problème majeur de la santé publique en
Algérie. Pour cela, à partir des broyats de biopsies gastriques deux souches d'H.pylori sont
isolées sur gélose au sang (Hp1 et Hp3). L'utilisation de la PCR en temps réel a révélé la
présence des souches sensibles à la clarithromycine de Helicobacter pylori dans des
biopsies gastriques prélevées par endoscopie digestive haute des patients ayant subi un
examen anatomopathologique et cytologique. L'observation microscopique a montré la
présence de Helicobacter pylori. Ce pathogène a provoqué une gastrite aigue et
chronique.
L'identification phénotypique, biochimique et physiologique des bactéries
lactiques isolées à partir des laits crus de vache, brebis, chèvre et chamelle a permis
d'obtenir 30 souches des espèces suivantes: Lactococcus lactis subsp.lactis(36,66%),
Lactococcus lactis subsp cremoris (30%), Enterococcus faecium(20%), et Lactococcus
garvieae(13,33%). Toutes les souches isolées sont homofermentaires et poussent à 37oC.
Elles hydrolysent l'esculine, produisent de l'acétoine et fermentent le ribose, mannose,
lactose et tréhalose. Elles sont dépourvues de β -glucuronidase, de phosphatase alcaline et
le pouvoir hémolytique. Le meilleur pouvoir acidifiant a été enregistré au bout de 24 h
avec les deux souches de Lactococcus lactis subsp. cremoris :B30 et B28 avec une
quantité d'acide estimée à 45 oD et 40 oD, respectivement
Afin de déterminer l'effet antagonique des bactéries lactiques isolées vis-à-vis
des souches d'H.pylori(Hp1, Hp3, TN2GF4, J99, 26695, HPAG1 et HSA3068) des
interactions ont été faites par la méthode de diffusion sur gélose. Sur 30 souches de
bactéries lactiques seulement 14 souches ont un effet inhibiteur in vitro. Le meilleur effet
inhibiteur a été trouvé avec les souches Enterococcus faecium (B13) et Lc. lactis
subsp.lactis (B01) dont les diamètres varient entre 20mm et 03mm, respectivement.
182
Conclusion
Le surnageant de la culture de Enterococcus faecium B13 contient une substance
secrétée dans le milieu extracellulaire. L'inhibition a été confirmée par la méthode de
diffusion sur gélose et dans le bouillon, dont l'inhibition a été suivie après chaque 18h par
un dénombrement des colonies d'H.pylori ensemencées sur gélose au sang. Cette
substance conserve son activité antagoniste à pH 4 et 8 et après traitements thermiques à
60oC pendant 30 min, 80oC pendant 10 min et 100 oC pendant 5min. Alors que, le pouvoir
inhibiteur de surnagent de B13 disparaît complètement en présence de deux enzymes
protéolytiques Trypsine et Pepsine, ce qui indique la nature protéique de la substance
inhibitrice. De plus l'activité antibactérienne persiste après contacte avec l'α -amylase.
L'effet antibactérien de la souche Enterococcus faecium B13 a été confirmé in
vivo. Une infection des souris, femelles, holoxéniques et âgées de deux mois, pendant 3
semaines par la souche TN2GF4, qui a montré une sensibilité vis-à-vis les bactéries
lactiques isolées, provoque l'apparition d'une érosion de l'épithélium gastrique avec la
présence des masses cellulaires dans leur chorion. Un traitement avec B13 pendant 7 jours
a prouvé une efficacité de cette bactérie lactique à inhiber la croissance d'H.pylori et à
bien résister aux conditions physiologiques du tractus gastro-intestinal. En effet, elle
réduit le nombre d'H.pylori de prés un log durant les deux phases d'observation (J21 et
J30) soit 43%.
183
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220
ANNEXES
Annexes
ANNEXE I : milieux de culture Bouillon urée-indole (g/L): En grammes par litre d'eau purifiée
• L-Tryptophane: 3,00 • Phosphate monopotasique: 1,00 • Phosphate dipotassique: 1,00 • Chlorure de sodium: 5,00 • Urée: 20,00 • Rouge de Phénol à 1% 2,50 mL • Alcool à 95% 10,00 mL
pH final : 6.7 + /- 0.2 à 25°C Gélose pour dénombrement (PCA) (g/L):
• Tryptone:5,0 g • Extrait de levure:2,5 g • Glucose:4,0 g • Agar:9,0 g • Eau qsp 1L
pH = 7
Gélose désoxycholaté à 1% (g/L):
• Peptone: 10,0 g • Citrate de sodium: 1,0 g • Lactose: 10,0 g • Rouge Neutre: 0,03 g • Désoxycholate de sodium: 1,0 g • Chlorure de sodium: 5,0 g • Hydrogénophosphate de potassium: 2,0 g • Agar: 13,0 g
pH = 7,3
Brucella bouillon (g/L)
• Peptone de caséine: 10g • Peptone de viande: 10g • Extrait de levure: 2g • Dextrose: 1g • Chlorure de sodium: 5g • Bisulfite de sodium: 0,1g
pH=7
Annexes
Gélose Brucella (g/L):
• Tryptone : 10,0. • Extrait de tissus animal : 10,0 • Glucose : 1,0 • Extrait de levure : 2,0 • Sodium chlorure : 5,0 • Bisulfite de sodium : 0,1 • Agar : 15,0
pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C : 7,0 ± 0,2
Gélose Columbia (g/L):
• Polypeptone: 17g • Peptone pancréatique de cœur: 3g • Extrait autolytique de levure: 3g • Amidon de mais:1g • Chlorure de sodium: 5g • Agar: 13,5
Ajouter de 5 à 10% de sang de cheval stérile, après autoclavage et refroidissement.
Milieu BGT (Bouillon Glucose Tamponné) (g/L):
• Peptone : 20.00g • Extrait de viande: 02,00g • Chlorure de sodium: 2,5g • Phosphate monopotassique: 0,7g • Chlorure di-sodique: 8,3g • Glucose: 4,0g
pH= 7.7
Gélose maison (g/L): Pour une série de 24 boites de géloses au sang de cheval avec un flacon de sang à 50mL:
- Prendre 2 flacons de milieu Muller Hinton agar dans la pièce;
- Décongeler la solution d'antibiotique;
- Faire fondre le milieu Muller Hinton agar à 100oC puis laisser refroidir à 54oC dans un bain-marie;
- Ajouter 0,5 mL de solution d'antibiotiques par flacon de 225 mL de milieu, bien homogénéiser.
- Répartir dans 24 tubes stériles: 2mL de sang de cheval stérile+18 mL de milieu Muller Hinton agar;
Annexes
- Couler le tout dans une boite de Pétri ronde de 20mL - Laisser solidifier la gélose; - Ranger dans le réfrigérateur.
Solution d'antibiotiques: Elle est préalablement préparée et congelée. Elle se compose de:
- 50 mg d'Amphotéricine à reconstituer; - 0,25 g de Vancomycine à reconstituer; - QSP 40mL.
Aliquoter à 2mL; Conserver au congélateur à -20oC.
Gélose Chapman (g/L):
• Peptone: 10,0 g • Extrait de viande de bœuf: 1,0 g • Chlorure de sodium: 75,0 g • Mannitol: 10,0 g • Rouge de phénol: 0,025 g • Agar-Agar: 15,0 g • Eu distillée qsp 1 Litre
pH = 7,4
Gélose Viande foie(g/L):
• Base viande foie : 30,0 g • Glucose : 2,0 g • Agar : 6,0 g
pH = 7,4
Gélose M17 (g/L):
Tryptone: 2,5 g
• Peptone papaïnique de soja: 5,0 g • Peptone pepsique de viande: 2,5 g • Extrait de viande: 5,0 g • Extrait autolytique de levure: 2,5 g • Béta-Glycérophosphate de sodium: 19,0 g • Sulfate de magnésium: 0,25 g • Lactose: 5,0 g • Acide ascorbique: 0,5 g • Agar-agar bactériologique: 15,0 g • pH à 25 °C : 7,1 ± 0,2
Annexes
ANNEXEII:
Tableau I: Résultats de l’identification des espèces bactériennes des selles des souris
(témoin)
CIT: Citrate-Simmons, MAN: Mannitol-mobilité, LAC: Lactose, GLU: Glucose, SAC: Saccharose, LDC: Lysine déshydrogénase, ODC: Ornithine décarboxylase, ADH: Arginine dihydrolase, ONPG: Ortho-Nitro-Phenyl-Galactopyranozide, URE: Urée-indole, CAT: Catalase, OXY: Oxydase.
Tableau II: Dénombrement des colonies de H.pylori sur gélose Brucella (UFC/mL).
Temps(h)
H.pylori
0h 18h 36h 54h 72h 90h 108h 126h
Hp1 107 7x106 105 2x104 2x103 2x102 2x10 00
Hp3 107 6x106 2x105 4x104 3x103 4x102 10 00
TN2GF4 107 106 104 10 00 00 00 00
HSA3068 107 2x106 6x104 3x102 10 00 00 00
26695 107 4x106 6x105 3x103 2x102 10 00 00
J99 107 3x106 5x105 103 2x102 10 00 00
HPAG1 107 107 107 107 107 107 107 107
Identification sur galerie biochimique classique Espèce C I T
M A N
L A C
G L U
S A C
L D C
O D C
ADH
O N P G
U R E
C A T
O X Y
- + - - - - - - - + + - Staphylococcus cohnii
+ - - - - - - + - - + + Alcaligenes faecalis
- + + + + + + - + - + - Escherichia coli
Annexes
Tableau III: le pouvoir acidifiant des bactéries lactiques
Temps(h) Bactérie
0h 2h 4h 6h 24h
B01 13 16 17 20 25 B02 13 15 20 22 30 B03 13 15 20 23 35 B04 13 16 21 25 35 B05 13 14 15 17 25 B06 13 16 21 25 35 B07 13 17 22 25 30 B08 13 15 20 23 25 B09 13 15 20 25 35 B10 13 15 17 19 20 B11 13 16 21 25 30 B12 13 16 21 25 30 B13 13 15 17 19 19 B14 13 16 20 23 25 B15 13 15 21 22 25 B16 13 15 23 25 30 B17 13 14 15 17 20 B18 13 17 20 21 30 B19 13 16 17 18 25 B20 13 15 20 21 35 B21 13 14 16 20 25 B22 13 15 19 20 25 B23 13 15 20 25 35 B24 13 16 20 23 30 B25 13 15 16 20 25 B26 13 16 21 23 25 B27 13 14 16 17 19 B28 13 15 23 30 40 B29 13 16 25 30 35 B30 13 15 25 30 45
Annexes
Tableau IV: Résultats de dénombrement de H pylori isolée à partir de l’estomac
Nombre de colonies d’H pylori en UFC/mL
prélèvement J 21 J 30
Lot 2 : groupe infecté par H pylori
1 7.105 1,7. 106 2 5. 105 6. 105 3 1,2. 106 2,9. 106 4 6,5. 105 1,21. 106 5 3,8. 105 5,6. 105 6 1,5. 105 4,7. 105
moyenne 5,9. 105 1,24. 106
Lot 3 : groupe infecté par H pylori et traité par E.faecium
1 2,7. 105 2. 105 2 4. 105 3. 105 3 3. 105 2,7. 105 4 1,2. 106 4,5. 105 5 1,8. 105 1,6. 105 6 6. 105 3,1. 105
moyenne 4,9. 105 2,8. 105
Annexes
Tableau VI: Analyse statistique Nombre de colonie (CFU/mL) Lot 2(infecté) Lot 3(infecté +traité) A 21jour post infection 70 27 50 40 120 30 65 120 38 18 15 60 A30 jour post infection 170 20 60 30 290 27 121 45 56 16 47 31 Nombre de souris (n) =12 =12
La moyenne arithmétique ) = 91.83 = 38.66
La variance ( ) = 5256.63 = 811.86 Ecart type (S) =72.5 =28.49 DDL= + - 2 DDL=12+12 -2= 22 H0 : U1=U2 pas de différence entre lot2 et lot 3
T cal = -
1 + 1 +
+ - 2 Tcal =23.44 T α = 2.074 avec α =0.05 T cal > tα donc H0 rejeté, il y a une différence significative entre le groupe infecté et le groupe infecté plus traité.
PUBLICATIONS
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-2-
-3-
PERSPECTIVES
Ce travail a pour but de rechercher des souches de bactéries lactiques isolées des
laits crus Algériens ayant une activité inhibitrice de la souche pathogène Helicobacter
pylori. A cet effet, certains aspects de la thèse méritent d'être approfondis et qui restent en
perspectives entre autres:
1. Un séquençage (16S) des souches de Helicobacter pylori isolées en Algérie;
2. Un séquençage (16S) de la souche Enterococcus faecium (B13) qui a montré un
effet inhibiteur important de Helicobacter pylori;
3. Caractérisation de la substance protéique (bactériocine) sécrétée par la bactérie
lactique Enterococcus faecium (B13) par HPLC et MS;
4. Étudier d'autres mécanismes d'action de E.faecium(B13) pour inhiber la croissance
de H.pylori in vivo (adhérence, compétition, etc…);
5. Production d'un lait fermenté probiotique par Enterococcus faecium B13.
RESUME
L'objectif de ce travail est de chercher des souches de bactéries lactiques qui
pourraient inhiber in vitro et in vivo la croissance d’Helicobacter pylori impliquée dans la
pathologie gastroduodénale. Pour cela, deux souches de Helicobacter pylori (Hp1 et
Hp3) sensibles à la clarithromycine, ont été isolées des biopsies prélevées par endoscopie
digestive haute par culture sur gélose au sang et caractériser par PCR en temps réel. Ces
souches ont provoqué des gastrites aigue et chronique déterminer par un examen
anatomopathologique et cytologique. 30 souches de bactéries lactiques du genre
Lactococcus et Enterococcus ont été isolées à partir des échantillons des laits crus de
chèvre, vache, brebis et chamelle prélevés de différentes régions de l'Algérie. Des
interactions ont été réalisées entre des bactéries lactiques isolées, les deux souches
d’Helicobacter pylori et d'autres souches de références (TN2GF4, J99, 26695, HPAG1) et
clinique (HSA3068). La meilleure zone d'inhibition a été constatée avec la souche
TN2GF4 en présence d’Enterococcus faecium (B13) isolée du lait de chèvre de Miliana
(Zi=20mm). La recherche de la substance antagoniste a été réalisée suivant la méthode de
diffusion sur gélose et dans le bouillon après élimination de l'effet des acides organiques
(neutralisation du milieu à pH 6,5) et le peroxyde d'hydrogène (ajout du catalase). Les
substances inhibitrices produites par la souche d'Enterococcus faecium (B13) perdent leur
activité après traitement par la trypsine et la pepsine, mais retiennent cette activité
antibactérienne après traitement thermique pendant 30 minutes à 60oC, 80oC pendant 10
minutes et 100oC pendant 5 minutes. Cette protéine est stable à pH acide et basique. In
vivo, l'administration orale de la souche Enterococcus faecium (B13) réduit le nombre de
H pylori dans l’estomac des souris Balb/c prés d'un log soit 43%.
Mots clés: Lait cru, bactéries lactiques, Helicobacter pylori, PCR en temps réel,
bactériocines, inhibition, in vitro, in vivo.