Download - Tic Delia _Michiu_. RO-Rezumat teza
ING. DELIA ȚÎC (MICHIU)
TEZĂ DE DOCTORAT
INFLUENȚA HAMEIULUI ASUPRA
BACTERIILOR ŞI ÎN PROCESUL DE
FERMENTA ȚIE AL MUSTULUI DE BERE
(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)
Coordonatori ştiin țifici:
Prof. Univ. Dr. Maria TOFANĂ
Prof. Univ. Dr. Philippe THONART
CLUJ-NAPOCA 2012
UNIVERSITATEA DE ŞTIINȚE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ
VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALĂ
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII
UNIVERSITATEA DIN LIEGE GEMBLOUX
AGRO-BIO TECH
2
CUPRINS INTRODUCERE. SCOP ŞI OBIECTIVE ALE TEZEI 4
CAPITOLUL 1. ACTIVITATEA DE INHIBI ȚIE A ACIZILOR
AMARI DIN HAMEI ASUPRA BACTERIILOR 6
1.1. ACTIVITATEA DE INHIBIȚIE A ISO-α ŞI β ACIZILOR DIN HAMEI
ASUPRA SUŞELOR BACTERIENE LACTOBACILLUS PLANTARUM THT,
PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS ŞI BACILLUS SUBTILLIS S 499 6
1.1.1. Materiale şi metode 6
1.1.2. Metode microbiologice utilizate pentru determinarea activității
de inhibiție a iso-α şi β acizilor din hamei în mediu lichid selectiv 7
1.1.2.1. Creşterea bacteriilor Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus
pentosaceus şi Bacillus subtillis S499 sub influența extractului de iso-α acizi 7
1.1.2.2. Creşterea bacteriilor Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus
pentosaceus şi Bacillus subtillis S499 sub influența extractului de β acizi 7
1.1.2.3. Metoda turbidității sau metoda densității optice 7
1.1.3. Rezultate şi discuții 8
1.1.3.1. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor din hamei asupra
suşelor bacteriene Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus
şi Bacillus subtillis S499 8
1.1.3.2. Activitatea de inhibiție a β acizilor din hamei asupra
suşelor bacteriene Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus
şi Bacillus subtillis S499 10
1.2. ACTIVITATEA DE INHIBI ȚIE A ISO-α ŞI β ACIZILOR DIN HAMEI
ASUPRA BACTERIEI PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS PE PARCURSUL
FERMENTAȚIEI MUSTULUI DE BERE CU DROJDIE SACCHAROMYCES
CEREVISIAE BOULARDII, FERMENTAȚIE CONTAMINATĂ
ARTIFICIAL CU PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS 12
1.2.1. Materiale şi metode 12
1.2.2. Metode microbiologice utilizate pentru determinarea activității
de inhibiție a iso-α acizilor din hamei în mustul de bere 12
1.2.2.1. Creşterea drojdiei Saccharomyces cerevisiae boulardii în
3
mustul de bere aflat în fermentație contaminată artificial cu
Pediococcus pentosaceus sub influența iso-α acizilor din hamei 12
1.2.2.2. Determinarea etanolului prin metoda UV 13
1.2.2.3. Metoda turbidității sau metoda densității optice 13
1.2.2.4. Analiza prin citometrie în flux 13
1.2.3. Rezultate şi discuții 13
1.2.3.1. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor asupra drojdiei S. cerevisiae 13
1.2.3.2. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor asupra Pediococcus pentosaceus 14
CAPITOLUL 2. EVALUAREA COMPARATIV Ă A UNOR PROFILE
DE AROMĂ ALE MUSTULUI DE BERE: FERMENTA ȚII
TRADI ȚIONALE ŞI AROMATIZATE CU ULEIURI ESEN ȚIALE
PROVENITE DE LA VARIET ĂȚI DE HAMEI CU
POTENȚIAL DE AROM Ă DIFERIT 16
2.1. ANALIZA COMPUŞILOR VOLATILI DIN MUSTURILE DE BERE
HAMEIATE CU VARIETĂȚILE MAGNUM/HULLER BITTER,
PRIN TEHNICA ITEX/GC-MS 16
2.1.1.Materiale şi metode 16
2.1.2. Metode de analiză 17
2.1.2.1. Producția la scară de laborator a musturilor de bere hameiate cu
varietățile de hamei Magnum/Hüller Bitter 17
2.1.2.2. Monitorizarea conținutului de compuşi volatili, pe parcursul
proceselor de fierbere şi fermentație primară a musturilor de bere
hameiate cu varietățile Magnum/Hüller Bitter 17
2.1.2.3. Analiza GC-MS 18
2.1.3. Rezultate şi discuții 18
2.1.3.1. Analiza musturilor de bere hameiate cu varietatea Magnum 18
2.1.3.2. Analiza musturilor de bere hameiate cu varietatea Hüller Bitter 21
CAPITOLUL 3. EVALUAREA STATISTIC Ă A DATELOR 24
CAPITOLUL 4. CONCLUZII GENERALE 26
BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă 29
4
INTRODUCERE
Hameiul (Humulus lupulus L.), este o plantă perenă, unisexuat dioică care aparține
familiei Cannabaceae.
Pentru industria berii sau în scop medicinal, sunt utilizate doar plantele female
care produc flori, în timp ce plantele mascule nu au valoare comercială, au rol doar în
polenizarea plantelor female.
Prima utilizare a hameiului a fost ca şi plantă medicinală, datorită proprietăților sale de
conservare. În prezent hameiul este folosit în industria berii, 98% din cantitatea de hamei
utilizată în lume fiind destinată aceasteia.
S-a demonstrat, de asemenea că hameiul deține proprietăți antiseptice, prezentând
activitate de inhibiție doar asupra bacteriilor Gram-pozitive, nu şi asupra celor Gram-
negative.
Studiul prezentei teze de doctorat a început cu investigațiile asupra activității de
inhibiție a iso-α şi β acizilor amari din hamei asupra bacteriilor Gram-pozitive:
Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtilis S499 .
Prin multe studii s-a raportat pericolul semnificativ pe care îl reprezintă
contaminarea microbiană, pentru industria etanolului, datorită potențialelor pierderi din
punct de vedere al randamentului şi datorită producției de acizi organici nedoriți.
De asemenea, studiile au arătat că prezența acizilor acetic şi lactic, pe parcursul
fermentației poate cauza moartea suşei de drojdie Saccharomyces cerevisiae în anumite
medii şi chiar scăderea producției de etanol.
Având în vedere semnificația contaminărilor bacteriene, pentru industria
etanolului, prezentul studiu a fost continuat cu investigarea activității de inhibiție a iso-α
acizilor din hamei asupra bacteriei Pediococcus pentosaceus pe parcursul fermentației
mustului de bere cu drojdie Saccharomices cerevisiae bulardii.
Prezentul studiu a fost continuat cu analiza unor profile de aromă ale mustului de
bere imbogățit cu uleiuri esențiale provenite de la varietăți de hamei cu potențial de
aromă diferit, prin identificarea compuşilor volatili marker, pe parcursul procesului de
fermentație primară a unor musturi de bere hameiate cu două varietăți de hamei:
fermentații tradiționale şi fermentații aromatizate.
5
Pentru hameierea musturilor de bere şi pentru aromatizarea ulterioară a acestora cu
ulei essențial de hamei extras prin hidrodistilare, s-au folosit două varietăți de hamei:
Magnum şi Hüller Bitter, cultivate în zone pedo-climatice din Transilvania, la ferma
Saaschiz din Mureş, România.
Extracția şi identificarea compuşilor volatili din mustul de bere Magnum/Hüller
Bitter fiert şi fermentat (pe parcursul fermentației primare), s-a realizat prin tehnica
ITEX/GC-MS.
SCOP ŞI OBIECTIVE
Scopul tezei este de a studia eficiența antibacteriană a α şi β acizilor din hamei
asupra suşelor bacteriene Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus şi
Bacillus subtillis S499 şi evaluarea comparativă a unor profile de aromă ale mustului de
bere, îmbogățit cu uleiuri esențiale provenite de la varietăți de hamei cu potențial de
aromă diferit.
Principalele obiective ale prezentei teze sunt:
Investigarea condițiilor în care iso α şi β acizii din hamei prezintă activitate de
inhibiție asupra creşterii suşei bacteriene Lactobacillus plantarum THT ;
Investigarea condițiilor în care iso α şi β acizii din hamei prezintă activitate de
inhibiție asupra creşterii suşei bacteriene Pediococcus pentosaceus;
Evaluarea activității de inhibiție a iso-α acizilor din hamei asupra suşei bacteriene
Pediococcus pentosaceus, pe parcursul fermentației mustului de bere cu suşa de
drojdie Saccharomyces cerevisiae bulardii, fermentație contaminată artificial cu
Pediococcus pentosaceus şi testarea ulterioară a inhibiției asupra drojdiei;
Investigarea condițiilor în care iso-α şi β acizii din hamei prezintă activitate de
inhibiție asupra creşterii suşei bacteriene Bacillus subtillis S499;
Optimizarea unei metode ITEX/GC-MS pentru caracterizarea compuşilor volatili
din mustul de bere, pe parcursul procesului de fermentație primară;
6
Identificarea compuşilor volatili marker, pe parcursul procesului de fermentație
primară a musturilor de bere hameiate cu varietatea Magnum: fermentație
tradițională şi fermentații aromatizate cu ulei esențial de hamei Magnum;
Identificarea compuşilor volatili marker, pe parcursul procesului de fermentație
primară a musturilor de bere hameiate cu varietatea Hüller Bitter: fermentație
tradițională şi fermentații aromatizate cu ulei esențial de hamei Hüller Bitter.
CAPITOLUL 1. ACTIVITATEA DE INHIBI ȚIE A ACIZILOR AMARI
DIN HAMEI ASUPRA BACTERIILOR
1.1. ACTIVITATEA DE INHIBIȚIE A ISO α ŞI β ACIZILOR AMARI DIN HAMEI
ASUPRA SUŞELOR BACTERIENE LACTOBACILLUS PLANTARUM THT,
PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS AND BACILLUS SUBTILLIS S 499
1.1.1. Materiale şi metode
Microorganisme
Suşe bacteriene precum Lactobacillus plantarum subsp. THT, Pediococcus
pentosaceus şi Bacillus subtillis S499, de la Universitatea din Liege, Gembloux Agro
Bio Tech, din Belgia.
Extract de iso-α acizi din hamei: 30%, extract de β acizi din hamei: 10%
Extract de iso-α acizi din hamei ‘’YC ISO 30’’, de concentrație 30% şi extract de
β acizi din hamei ‘’YC ISO 10’’, de concentrație 10%, obținute prin extracție cu CO2 , şi
standardizate la concentrațiile de 30%/10% prin analiza HPLC, de la Universitatea din
Liege, Gembloux Agro Bio Tech, Belgia.
7
1.2.2. Metode microbiologice pentru determinarea activității de inhibi ție a iso-α
acizilor din hamei în mediu lichid selectiv
1.2.2.1. Creşterea bacteriilor Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus
şi Bacillus subtillis S499 sub influența extractului de iso-α acizi
Pentru analiza activității de inhibiție a extractului de iso-α acizi din hamei asupra
celor trei suşe bacteriene în mediu lichid selectiv, s-a folosit metoda care urmează a fii
descrisă, numită ’αβIM1’.
Probele, au fost pregătite prin inocularea culturilor lichide de Lactobacillus
plantarum THT, Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S499 în 100 ml mediu
lichid selectiv MRS (pentru Lactobacillus plantarum THT şi Pediococcus pentosaceus)
şi în 100 ml mediu lichid selectiv 868 (pentru Bacillus subtillis S499), la care s-a adăugat
extractul de iso-α acizi de hamei în concentrații crescătoare.
Densitatea la inoculare a culturilor bacteriene lichide a fost OD600nm = 0.4-0.6 A.
Extractul de iso-α acizi de hamei (30%) a fost utilizat în concentrații de: 50mg/l,
100mg/l, 150mg/l, 200mg/l, 250mg/l (pentru Lactobacillus plantarum THT şi
Pediococcus pentosaceus) şi de 5mg/l, 10mg/l, 15mg/l, 20mg/l, 25mg/l (pentru Bacillus
subtillis S499). S-a preparat de asemenea şi o probă martor, în aceleaşi condiții, dar fără
adiția extractului de hamei.
Probele au fost inoculate cu culturi bacteriene Lactobacillus plantarum THT,
Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S499 şi incubate la 37°C/30°C sub agitare
la 100Rpm, 4h şi 30min.
1.2.2.2. Creşterea bacteriilor Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus
şi Bacillus subtillis S499 sub influența extractului de β acizi
S-a utilizat metoda ’αβIM1’ , iar concentrațiile extractului de β acizi au fost:
15mg/l; 30 mg/l; 60mg/l; 100mg/l; 200mg/l (pentru Lactobacillus plantarum THT şi
Pediococcus pentosaceus) şi 0,05 mg/l; 0,15 mg/l; 0,25 mg/l; 0,35 mg/l; 0,45 mg/l,
(pentru Bacillus subtillis S499).
1.2.2.3. Metoda turbidității sau metoda densității optice
Creşterea bacteriilor în mediu lichid selectiv sub influența extractelor de iso-α şi β
acizi de hamei, a fost stabilită prin metoda turbidității sau metoda densității optice.
8
1.1.3. Rezultate şi discuții
1.1.3.1. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor din hamei asupra suşelor bacteriene
Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S499
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0 50 100 150 200 250 300
0
50
100
150
200
250
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
0 50 100 150 200 250 300
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 50 100 150 200 250 300
Figura 1. Creşterea suşei Lactobacillus plantarum sub influența iso-α acizilor
Timp ( minute )
D.O
. 60
0nm
Figura 2. Creşterea procentului de inhibiție pentru Lactobacillus
plantarum
Concentrația ( mg/l )
Inh
ibiți
e (%
)
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0 50 100 150 200 250 300
0
50
100
150
200
250
Figura 3. Creşterea suşei Pediococcus pentosaceus sub influența iso-α acizilor
Figura 4. Creşterea procentului de inhibiție pentru
Pediococcus pentosaceus
D.O
. 600
nm
Timp ( minute )
Inh
ibiți
e (%
)
Concentrație ( mg/l )
mg/l
mg/l
9
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0 50 100 150 200 250 300
0
5
10
15
20
25
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
0 5 10 15 20 25 30
� Suşele bacteriene Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus
au fost inhibate în prezența extractului de iso-α acizi de hamei (30%) la diferite
concentrații în mediu lichid selectiv MRS cu pH inițial 6.5;
� Concentrația minimă inhibitorie (MIC) de iso-α acizi asupra Lactobacillus
plantarum THT a fost de 50mg/l (7,5% inhibiție) la pH 6.2 după o incubare de 4h şi
30min la 37°C/100Rpm, iar concentrația care a generat inhibiția cea mai mare a fost de
250 mg/l (68,7% inhibiție) la pH 7.0;
� Pediococcus pentosaceus a fost inhibat la o concentrație minimă (MIC) de
iso-α acizi de 50mg/l (13,2 % inhibiție) la pH 6.4. Inhibițiile cele mai mari, au fost la 150
mg/l şi 200 mg/l (71,1%/96,3% inhibiție) la pH 6.5-7.0; Concentrația maximă inhibitorie
a fost de 250 mg/l (100% inhibiție);
� Concentrațiile de iso-α acizi utilizate pentru testul de inhibiție asupra suşei
Bacillus subtillis S499 au fost de 10 ori mai mici decât în cazul celorlalte două suşe
bacteriene, şi de asemenea aceste concentrații au fost foarte apropiate datorită
sensibilității mari a acestei bacterii la iso-α acizii din hamei;
� Concentrația minimă inhibitorie asupra suşei Bacillus subtillis S499, a fost
de 5mg/l (6,7 % inhibiție) la pH 5.9 după o incubare de 4h şi 30 min la 30°C/100Rpm;
� Rezultatele analizei asupra Bacillus subtillis S499 au arătat de asemenea
existența unei concentrații maxime inhibitorii a iso-α acizilor: 25 mg/l (100% inhibiție);
Figura 5. Creşterea suşei Bacillus subtillis S 499 sub influența iso-α
acizilor
Figura 6. Creşterea procentului de inhibiție pentru Bacillus subtillis S 499
D.O
. 600
nm
Timp ( minute )
Inh
ibiți
e (%
)
Concentrație ( mg/l )
mg/l
10
1.1.3.2. Activitatea de inhibiție a β acizilor din hamei asupra suşelor bacteriene
Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S499
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0 50 100 150 200 250 300
0
15
30
60
100
200
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
0 50 100 150 200 250
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
0 50 100 150 200 250 300
0
15
30
60
100
200
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
100,0
0 50 100 150 200 250
D.O
. 600
nm
Timp ( minute )
Inh
ibiți
e (%
)
Concentrație ( mg/l )
Figura 7. Creşterea bacteriei Lactobacillus plantarum sub influența β
acizilor
Figura 8. Creşterea procentului de inhibiție pentru Lactobacillus plantarum
D.O
. 600
nm
Timp ( minute )
Inh
ibiți
e (%
)
Concentrație ( mg/l )
Figura 9. Creşterea bacteriei Pediococcus pentosaceus sub influența
β acizilor
Figura 10. Creşterea procentului de inhibiție pentru Pediococcus pentosaceus
mg/l
mg/l
11
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
0 50 100 150 200 250 300
0
0,05
0,15
0,25
0,35
0,45
-5,0
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
50,0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
� Suşele bacteriene Lactobacillus plantarum THT şi Pediococcus pentosaceus
au fost inhibate în prezența extractului de β acizi de hamei (10%) la diferite concentrații
în mediu lichid selectiv MRS cu pH inițial 6.5;
� Concentrația minimă inhibitorie (MIC) de β acizi asupra Lactobacillus
plantarum THT a fost de 15mg/l (4,0% inhibiție) la pH 6.2 după o incubare de 4h şi
30min la 37°C/100Rpm, iar concentrațiile cu inhibițiile cele mai mari au fost de 100
mg/l şi 200 mg/l (68,7 and 74,9 % inhibiție) la pH 6.5-7.0;
� În cazul bacteriei Pediococcus pentosaceus, aceasta a fost inhibată la o
concentrație minimă de β- acizi de 15mg/l (2,8 % inhibiție) la pH 6.2, după 4h şi 30min
incubare la 30°C/100Rpm; Inhibițiile cele mai mari, au fost la 100 mg/l şi 200 mg/l
(73,2 şi 89,6% inhibiție) la pH 6.5-7.0;
� Asupra bacteriei Bacillus subtillis S499 s-au utilizat concentrații foarte mici
de β acizi, de 100 de ori mai mici decât în cazul celorlalte două bacterii, şi de asemenea şi
în acest caz concentrațiile au fost foarte apropiate datorită sensibilității şi mai mari a
bacteriei Bacillus subtillis S499 la β acizi față de iso-α acizii din hamei;
� Concentrația minimă inhibitorie (MIC) a β-acizilor asupra Bacillus
subtillis S499, a fost 0,05mg/l (0,4 % inhibiție) la pH 5.8 după o incubare de 4h şi 30 min
la 30°C/100Rpm;
D.O
. 600
nm
Timp ( minute )
Inh
ibiți
e (%
)
Concentrație ( mg/l )
Figura 11. Creşterea bacteriei Bacillus subtillis S 499 sub influența β acizilor
Figura 12. Creşterea procentului de inhibiție pentru Bacillus subtillis S499
mg/l
12
1.2. ACTIVITATEA DE INHIBIȚIE A ISO α ACIZILOR AMARI DIN HAMEI
ASUPRA SUŞEI BACTERIENE PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS PE PARCURSUL
FERMENTAȚIEI MUSTULUI DE BERE CU DROJDIE SACCHAROMYCES
CEREVISIAE BOULARDII, CONTAMINATĂ ARTIFICIAL CU PEDIOCOCCUS
PENTOSACEUS
1.2.1. Materiale şi metode
Microorganisme
Suşa de drojdie Saccharomyces cerevisiae subsp. boulardii şi suşa bacteriană
Pediococcus pentosaceus, de la Universitatea din Liege, Gembloux Agro Bio Tech,
Belgia.
Extract de iso-α-acizi din hamei: 30%
S-a utilizat acelaşi extract de iso-α-acizi din hamei ‚’’YC ISO 30’’, cu concentrație
de 30% , ca şi în cazul testelor de inhibiție realizate pe mediu lichid selectiv.
1.2.2. Metode microbiologice pentru determinarea activit ății de inhibi ție a iso-α
acizilor în mustul de bere
1.2.2.1. Creşterea drojdiei Saccharomyces cerevisiae boulardii în mustul de bere aflat
în fermentație contaminată artificial cu Pediococcus pentosaceus sub influența iso-α
acizilor din hamei
Pentru testarea acțiunii antibacteriene a extractului de iso-α acizi din hamei, asupra
bacteriei P. pentosaceus în mustul de bere, s-a utilizat metoda microbiologică ‘αβIM1’.
Probele au fost pregătite în 100 ml must de bere (5.0 pH), la o densitate optică de
OD600nm = 0.4 A. S-au folosit cinci concentrații crescătoare de extract de iso-α acizi
(30%): 20mg/l; 50 mg/l; 100mg/l; 150mg/l; 300mg/l.
Primul pas în analiză, a fost inocularea mustului de bere cu 1 ml cultură lichidă de
drojdie Saccharomyces cerevisiae boulardii , urmând după aceea adăugarea extractului
de iso-α acizi, în concentrații diferite.
13
În final probele de must de bere au fost contaminate artificial cu 1ml cultură
bacteriană lichidă Pediococcus pentosaceus şi ulterior incubate timp de 4h şi 30min la
30°C/100Rpm.
1.2.2.2. Determinarea etanolului prin metoda UV
Etanolul este oxidat la acetaldehidă de către nicotinamid-adenin dinucleotida
(NAD), în prezența enzimei alcool dehidrogenaza (ADH).
1.2.2.3. Metoda turbidității sau metoda densității optice
Creşterea bacteriilor în mustul de bere sub influența extractului de iso-α acizi din
hamei a fost stabilită prin metoda turbidității sau metoda densității optice.
1.2.2.4. Analiza prin citometrie în flux
Analiza nivelului de expresie GFP a fost efectuată prin sortarea celulelor active
(FACS) cu ajutorul fluorescenței şi a unui citometru în flux FACScan (Becton
Dickinson).
1.2.3. Rezultate şi discuții
1.2.3.1. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor asupra drojdiei S.cerevisiae
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0
300
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
Timp de fermentatie (minute)
Eta
nol
(g/l
)
Blank 20mg/l 100mg/l 300mg/l
Blank 0,249 0,618 2,240
20mg/l 0,290 0,810 1,664
100mg/l 0,309 1,067 2,240
300mg/l 0,236 1,024 2,475
30 270 1080
Figura 14. Concentrațiile de etanol în mustul de bere fermentat cu
S.cerevisiae, sub influența iso-α-acizilor şi a contaminării cu P. pentosaceus : proba martor, 20mg/l; 100mg/l;
300mg/l
D.O
. 600
nm
Timp ( minute )
Figura 13. Creşterea drojdiei Saccharomyces cerevisiae boulardii sub influența iso-α-acizilor: 300mg/l (T2) şi
proba martor (T1),
mg/l
14
1.2.3.2. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor asupra Pediococcus pentosaceus
A.
B.
Figura 15. Analiza viabilității celulare prin citometrie în flux a S. cerevisiae şi P.pentosaceus, intensitatea fluorescenței roşii (FL-
3) în funcție mărimea celulelor (FSC) după un tratament cu iodură de propidiu (PI): Rândul A: proba martor;
Rândul B: 20mg/l iso-α-acizi;
(t0= 30min) (t4= 4h30min) (t5= 18h)
15
C.
D.
Figura 16. Analiza viabilității celulare prin citometrie în flux a S. cerevisiae şi P.pentosaceus, intensitatea fluorescenței roşii (FL-
3) în funcție mărimea celulelor (FSC) după un tratament cu iodură de propidiu (PI): Rândul C: 100mg/l iso-α-acizi;
Rândul D: 300mg/l iso-α-acizi;
(t0= 30min) (t4= 4h30min) (t5= 18h)
16
� În comparație cu analiza pe mediu selectiv, în mustul de bere fermentat suşa
bacteriană Pediococcus pentosaceus se dezvoltă mult mai lent şi de asemenea este mult
mai sensibilă la extractul de iso-α acizi din hamei;
� Mustul de bere nu reprezintă un mediu specific de creştere pentru
Pediococcus pentosaceus, datorită pH-ului scăzut, bacteria dezvoltându-se într-un
interval de pH de 4.5-8.0 şi datorită conținutului redus în nutrienți;
� Cu privire la acțiunea iso-α acizilor asupra drojdiei S. cerevisiae boulardii,
rezultatele au arătat că aceasta nu a fost inhibată în prezența extractului de iso-α acizi
din hamei;
� Concentrația de etanol de asemenea nu a fost influențată, evidențiindu-se şi
mai mult faptul că activitatea drojdiei nu a fost compromisă;
CAPITOLUL 2. EVALUAREA COMPARATIV Ă A UNOR PROFILE DE
AROMĂ ALE MUSTULUI DE BERE: FERMENTA ȚII TRADI ȚIONALE
ŞI AROMATIZATE CU ULEIURI ESEN ȚIALE PROVENITE DE LA
VARIET ĂȚI DE HAMEI CU POTEN ȚIAL DE AROM Ă DIFERIT
2.1. ANALIZA COMPUŞILOR VOLATILI DIN MUSTURILE DE BERE HAMEIATE
CU VARIETĂȚI DE HAMEI MAGNUM/H ÜLLER BITTER, PRIN TEHNICA
ITEX/GC-MS
2.1.1. Materiale şi metode
Hameiul
S-au luat în analiză două varietăți de hamei: Magnum şi Hüller Bitter cultivate în
zone pedo-climatice din Transilvania, la ferma Saschiz din Mures, Romania.
Suşa de drojdie
Suşa de drojdie luată în studiu a fost Saccharomyces cerevisiae W 34/70, suşă de
fermentație inferioară.
17
2.1.2. Metode de analiză
2.1.2.1. Producția la scară de laborator a musturilor de bere hameiate cu varietățile de
hamei Magnum/Hüller Bitter
Pentru acest studiu comparativ, s-au realizat două musturi de bere, unul hameiat
cu varietatea Magnum şi unul cu Hüller Bitter, fiecare dintre acestea fiind divizate
ulterior pentru trei fermentații, acestea diferențiindu-se doar prin regimul de hameiere.
Musturile (12°P) au fost obținute la scară de laborator (2L), utilizându-se malț din orz
100%. Hameiul utilizat a fost sub formă de peleți Magnum - 12.9 % şi Hüller Bitter - 6.9
% α-acizi în scopul de a obține o valoare amară a produsului finit de 10g α-acids/hL.
Musturile au fost răcite ulterior la 8-9°C şi aromatizate cu ulei esențial de hamei
Magnum/Hüller Bitter extras prin hidrodistilare, în concentrații de 0.6mg/l (aromatizare
după Opstaele, 2010) respectiv 0.9mg/l pentru fiecare varietate.
Toate musturile au fost însămânțate cu suşa de drojdie Saccharomyces cerevisiae
W 34/70, (106 cells/ml – 0,500 L/hL) şi supuse fermentării. Fermentația inferioară a fost
condusă la 8-10°C, timp de 5 zile.
2.1.2.2. Monitorizarea conținutului de compuşi volatili, pe parcursul proceselor de
fierbere şi fermentație primară a musturilor de bere hameiate cu varietățile
Magnum/Hüller Bitter
Probele de must de bere, prelevate pe parcursul fierberii acestuia au fost
codificate “ WMGb5”, “ WMGb20” şi “ WMGb60” (Magnum) şi “ WHBb5”,
WHBb20”, “ WHBb60” (Hüller Bitter), prelevarea acestora realizându-se după 5, 20, şi
60min (sfârşitul fierberii) de fierbere.
Pe parcursul procesului de fermentație primară atât probele de must de bere
nearomatizate cât şi cele aromatizate cu ulei esențial de hamei Magnum/Hüller Bitter, s-
au recoltat zilnic la 24h, 48h, 72h, 96h, 120h şi au fost codificate ’’W-varietatea-f-ore de
fermentație nearomatizată’’ şi ’’W-varietatea-VO1/VO2-f-ore de fermentație
aromatizată’’.
18
2.1.2.3. Analiza GC-MS
Extracția compuşilor volatili din musturile de bere hameiate cu varietățile
Magnum/Hüller Bitter, pe parcursul proceselor de fierbere şi fermentație primară, s-a
realizat prin tehnica ITEX/GC-MS.
Analiza a fost realizată cu ajutorul unui GC-MS Shimadzu model QP-2010, dotat
cu un autosampler AOC-5000 (CombiPAL).
Separarea compuşilor s-a realizat printr-o coloană capilară ZB-5ms: 50m x
0.32mm x 0.25µm, Phenomenex, USA.
Musturile de bere hameiate cu varietățile Magnum/Hüller Bitter, pe parcursul
proceselor de fierbere şi fermentație primară, au fost analizate prin metodele
mMB1/mMB1 s.t. 5.5- pentru musturile nearomatizate/split 100 - pentru musturile
aromatizate(metode descrise detaliat în teza de doctorat).
2.1.3.Rezultate şi discuții
2.1.3.1. Analiza musturilor de bere hameiate cu varietatea Magnum
0
5
10
15
20
25
WMGb5 WMGb20 WMGb60 WMGf 24 WMGf 48 WMGf 72 WMGf 96 WMGf 120
WMG beer wort during boiling and primary fermentation (hours)
Co
nce
ntr
atio
n (
% f
rom
to
tal
pea
ks a
rea)
D - Limonene β - Mircene
Propanoic acid 2methyl 2methylpropyl ester Propanoic acid 2methyl 2methylbutyl ester
Propanoic acid 2methyl 3methylbutyl ester Propanoic acid 2 methyl hexyl ester
Figura 17. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere WMG
asupra concentrației compuşilor volatili marker din hamei
19
0
5
10
15
20
25
WMGb5 WMGb20 WMGb60 WMGVO1f 24 WMGVO1f 48 WMGVO1f 72 WMGVO1f 96 WMGVO1f 120
Mustul de bere WMGVO1- fierbere si fermentatie primara (h)
Co
nce
ntr
atia
(%
din
ari
a to
tala
a
pea
k-u
rilo
r)
D - Limonene β - Mircene
Propanoic acid 2methyl 2methylpropyl ester Propanoic acid 2methyl 2methylbutyl ester
Propanoic acid 2methyl 3methylbutyl ester Propanoic acid 2 methyl hexyl ester
Figura 18. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere
WMGVO1 asupra concentrației compuşilor volatili marker din hamei
0
5
10
15
20
25
WMGb5 WMGb20 WMGb60 WMGVO2f 24 WMGVO2f 48 WMGVO2f 72 WMGVO2f 96 WMGVO2f120
Mustul de bere WMGVO2- fierbere si fermentatie primara (h)
Co
nce
ntr
atia
(%
din
ari
a to
tala
a p
eak-
uri
lor)
D - Limonene β - Mircene
Propanoic acid 2methyl 2methylpropyl ester Propanoic acid 2methyl 2methylbutyl esterPropanoic acid 2methyl 3methylbutyl ester Propanoic acid 2 methyl hexyl ester
Figura 19. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere
WMGVO2 asupra concentrației compuşilor volatili marker din hamei
20
0
2
4
6
8
10
12
WMGf 2
4
WMGVO1f
24
WMGVO2f
24
WMGf 4
8
WMGVO1f
48
WMGVO2f
48
WMGf 7
2
WMGVO1f
72
WMGVO2f 7
2
WMGf 9
6
WMGVO1f
96
WMGVO2f
96
WMGf 120
WMGVO1f 12
0
WMGVO2f 12
0
Mustul de bere WMG, WMGVO1, WMGVO2 - fermentatie primara (h)
Co
nce
ntr
atie
(%
)
Etanol Extract aparent
Figura 20. Evoluția concentrației de etanol şi a extractului aparent, pe parcursul
procesului de fermentație primară a musturilor de bere WMG, WMGVO1, WGVO2
Mustul de bere WMG
În probele de must de bere WMG (must nearomatizat), s-au identificat 15
compuşi marker de proces, care s-au pierdut pe parcursul procesului de fermentație
primară;
Au fost identificați 5 compuşi marker de autentificare de proces, prezenți de la
inceputul şi până la sfârşitul fermentației primare a mustului de bere; Dintre acesti
compuşi doar unul a fost identificat ca şi compus marker provenit din hamei: Propanoic
acid 2-metil 2-metilbutil ester;
Compuşii 1-Butanol 3-metil acetat, Hexanoic acid etil ester (Etil caproat),
Acetic acid hexil ester, Octanoic acid etil ester (Etil caprilat), Decanoic acid etil ester
(Etil caprat) au apărut pe parcursul fermentației primare şi concentrația lor a crescut spre
sfârşitul acesteia, aceştia fiind identificați ca şi markeri de concentrare.
Musturile de bere WMGVO1/WMGVO2
S-a identificat un număr mai mic de compuşi markeri de proces: 8 compuşi
volatili;
21
Un număr mai mare de compuşi marker de autentificare din hamei, a fost
evidențiat: 15/18 compuşi volatili (WMGVO1/ WMGVO2), majoritatea aparținând
varietății de hamei;
În musturile aromatizate, concentrația compuşilor marker de concentrare scade
semnificativ, pierderile fiind mai mari în cazul mustului de bere aromatizat în
concentrație de 0.9mg/l ulei esențial Magnum, în special pentru 1-Butanol 3-metil acetat,
Hexanoic acid etil ester, Octanoic acid etil ester şi Decanoic acid etil ester;
2.1.3.2. Analiza musturilor de bere hameiate cu varietatea Hüller Bitter
0
5
10
15
20
25
30
WHBb5 WHBb20 WHBb60 WHBf 24 WHBf 48 WHBf 72 WHBf 96 WHBf 120
Mustul de bere WHB- fierbere si fermentatie primara (h)
Co
nce
ntr
atia
(%
din
ari
a to
tala
a p
eak-
uri
lor)
D - Limonene β - Mircene
Propanoic acid 2methyl 2methylpropyl ester Propanoic acid 2methyl 2methylbutyl ester
Propanoic acid 2methyl 3methylbutyl ester Propanoic acid 2 methyl hexyl ester
Figura 21. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere WHB
asupra concentrației compuşilor volatili marker din hamei
22
0
5
10
15
20
25
30
WHBb5 WHBb20 WHBb60 WHBVO1f 24 WHBVO1f 48 WHBVO1f 72 WHBVO1f 96 WHBVO1f 120
Mustul de bere WHBVO1- fierbere si fermentatie primara (h)
Co
nce
ntr
atia
(%
din
ari
a to
tala
a p
eak-
uri
lor)
D - Limonene β - Mircene
Propanoic acid 2methyl 2methylpropyl ester Propanoic acid 2methyl 2methylbutyl ester
Propanoic acid 2methyl 3methylbutyl ester Propanoic acid 2 methyl hexyl ester
Figura 22. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere WHBVO1
asupra concentrației compuşilor volatili marker din hamei
0
5
10
15
20
25
30
WHBb5 WHBb20 WHBb60 WHBVO2f 24 WHBVO2f 48 WHBVO2f 72 WHBVO2f 96 WHBVO2f 120
Mustul de bere WHBVO2- fierbere si fermentatie primara (h)
Co
nce
ntr
atia
(%
din
ari
a to
tala
a p
eak-
uri
lor)
D - Limonene β - Mircene
Propanoic acid 2methyl 2methylpropyl ester Propanoic acid 2methyl 2methylbutyl esterPropanoic acid 2methyl 3methylbutyl ester Propanoic acid 2 methyl hexyl ester
Figura 23. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere WHBVO2
asupra concentrației compuşilor volatili marker din hamei
23
0
2
4
6
8
10
12
WHBf 2
4
WHBVO1f 2
4
WHBVO2f
24
WHBf 4
8
WHBVO1f
48
WHBVO2f
48
WHBf 7
2
WHBVO1f
72
WHBVO2f
72
WHBf 9
6
WHBVO1f
96
WHBVO2f
96
WHBf 1
20
WHBVO1f1
20
WHBVO2f1
20
Mustul de bere WHB, WHBVO1, WHBVO2-fermentatie primara (h)
Co
nce
ntr
atie
(%
)
Etanol Extract aparent
Figura 24. Evoluția concentrației de etanol şi a extractului aparent, pe parcursul
procesului de fermentație primară a musturilor de bere WHB, WHBVO1, WHBVO2
Mustul de bere WHB
S-au identificat 13 compuşi marker de proces, care spre sfârşitul fermentației
primare au dispărut;
Ca şi compuşi marker de autentificare s-au identificat doar 5 compuşi ; Nu a fost
identificat nici un compus marker al varietății de hamei;
Concentrațiile compuşilor foarte volatili, proveniți de la varietatea de hamei Hüller
Bitter, au scăzut foarte mult pe parcursul procesului de fermentație primară pierderea
unora fiind evidențiată chiar după fierbere: Propanoic acic 2-metil, 3-metilbutil ester, sau
după 24h/48h de fermentație primară: β-mircen, D-limonen, Propanoic acic 2-metil, 2-
methilpropil ester ;
Concentrațiile esterilor etilici rezultați din activitatea drojdiei, au fost mari spre
sfârşitul fermentației primare;
Musturile de bere WHBVO1/ WHBVO2
În musturile de bere aromatizate cu ulei esențial de hamei varietatea Hüller Bitter,
au fost identificați mai puțini compuşi volatili marker de proces: 5 compuşi volatili;
24
De asemenea compuşii marker de autentificare din hamei au fost într-un număr
mai mare față de mustul de bere nearomatizat: 16/18 compuşi volatili (WHBVO1/
WHBVO2), majoritatea aparținând varietății hameiului;
În comparație cu mustul nearomatizat, fermentațiile aromatizate s-au dovedit a fi
mai intense, remarcându-se de asemenea o creştere a concentrației compuşilor
terpenoidici şi a esterilor .
CAPITOLUL 3. EVALUAREA STATISTIC Ă A DATELOR
Datele obținute în urma identificării compuşilor volatili marker din musturile de
bere hameiate cu două varietăți de hamei: Magnum şi Hüller Bitter, pe parcursul fierberii
şi fermentației primare, prin tehnica ITEX/GC-MS, au fost analizate folosind metode de
analiză statistică multivariantă.
Pentru analiza statistică PCA, au fost aleşi 12 compuşi volatili marker, identificați
prin tehnica ITEX/GC-MS în musturile de bere nearomatizate şi aromatizate în
concentrație de 0.6 mg/l, la anumite intervale de timp pe durata fierberii şi fermentației
primare.
Analiza chemometrică PCA a datelor rezultate privind compuşii volatili marker
identificați în mustul de bere aromatizat cu ulei esențial, varietatea Magnum, este
prezentată în figura 25.
Biplot (axes F1 and F2: 91,79 %)
WMGVO1f 120
WMGVO1f 96
WMGVO1f 72
WMGVO1f 48 WMGVO1f 24
WMGb60
WMGb20
WMGb5
1 Butanol 3methy l acetate
Acetic acid hexy l ester
Decanoic acid ethy l
ester
Hexanoic acid ethy l ester
Octanoic acid ethy l ester
Propanoic acid 2 methy l hexy l ester
Propanoic acid 2methy l 3methy lbuty l
ester
Propanoic acid
2methy l 2methy lbuty l esterPropanoic acid
2methy l 2methy lpropy l
ester
β - Mircene
D - Limonene
-10
-5
0
5
10
-15 -10 -5 0 5 10 15
F1 (48,06 %)
F2 (4
3,73
%)
Figura 25. Analiza chemometrică PCA a rezultatelor obținute prin tehnica ITEX/GC-
MS în mustul de bere aromatizat WMGVO1 pe parcursul fierberii şi fermentației primare
25
Au fost identificate corelații semnificativ pozitive între compuşii volatili marker
Decanoic acid etil ester, 1 Butanol 3-metil acetat, Hexanoic acid etil ester şi Octanoic
acid etill ester. Alți compuşi precum D-limonenul, a stabilit corelații negative cu
compusul β-mircen în timp ce Propanoic acid 2 metil, 2metilpropil ester a prezentat
corelații pozitive cu compuşii Decanoic acid etil ester, 1 Butanol 3-metil acetat, Hexanoic
acid etil ester şi Octanoic acid etil ester.
Dintre toate probele analizate pe durata fierberii si fermentației primare, doar proba
martor a prezentat valori negative atât pe axa F1 cât şi pe axa F2 a reprezentării
compuşilor principali.
În ceea ce priveşte analiza chemometrică PCA a datelor obținute prin tehnica
ITEX/GC-MS în cazul mustului de bere aromatizat cu ulei esențial de hamei, varietatea
Hüller Bitter, prezentată în figura 26, majoritatea compuşilor volatili marker au prezentat
valori pozitive atât pe reprezentarea compuşilor principali F2 cât şi pe reprezentările F1 şi
F2.
Probele WHBVO1f72, WHBVO1f120 au avut valori pozitive pe axele F1,
respectiv F2 în timp ce probele WMGb20, WMGb60, şi WMGVO1f24 au prezentat
valori pozitive doar pe axa F2 a reprezentării compuşilor principali.
In cazul mustului de bere WHBVO1, trei probe nu au putut fi interpretate pe
această reprezentare: WMGb5, WMGVO1f48 şi WMGVO1f96, datorită faptului că se
aflau foarte aproape de centrul intersecției compuşilor principali.
Compuşii Acetic acid hexil ester şi Propanoic acid 2 metil hexyl ester, nu au putut
fii interpretați pe această reprezentare, de asemenea pentru că se aflau foarte aproape de
centrul intersecției compuşilor principali (datorită neexistenței lor în aceste probe).
26
Biplot (axes F1 and F2: 85,52 %)
WHBVO1f 120
WHBVO1f 96
WHBVO1f 72
WHBVO1f 48
WHBVO1f 24
WHBb60
WHBb20
WHBb5
1 Butanol 3methy l
acetate
Acetic acid hexy l ester
Decanoic acid ethy l
ester
Hexanoic acid ethy l ester
Octanoic acid ethy l ester
Propanoic acid 2 methy l hexy l ester
Propanoic acid 2methy l 3methy lbuty l ester
Propanoic acid 2methy l
2methy lbuty l ester
Propanoic acid 2methy l
2methy lpropy l esterβ - Mircene
D - Limonene
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12
F1 (47,07 %)
F2 (3
8,46
%)
Figura 26. Analiza chemometrică PCA a rezultatelor obținute prin tehnica ITEX/GC-MS
în mustul de bere aromatizat WHBVO1 pe parcursul fierberii şi fermentației primare
CAPITOLUL 4. CONCLUZII GENERALE
3.1. Activitatea antibacteriană a extractului de iso-α şi β acizilor din hamei asupra
suşelor bacteriene Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus şi
Bacillus subtillis S 499
Dintre cele trei suşe studiate, cea mai rezistentă la acțiunea extractelor de iso-
α şi β acizi din hamei, a fost Lactobacillus plantarum THT;
Cea mai sensibilă suşă, a fost Bacillus subtillis S499 pentru care s-au folosit
concentrații de extract iso-α de 10 ori mai mici, şi β de 100 de ori mai mici, față de
celelalte suşe bacteriene;
Pentru toate bacteriile luate în studiu Lactobacillus plantarum THT,
Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S49, extractele de iso-α şi β acizi din hamei
au prezentat o acțiune bacteriostatică, la pH 6.0-7.0, respectiv la pH 5.8-6.0 ( Bacillus
subtillis S499),pe durata unei incubări de 4h30min.
27
3.2. Activitatea antibacteriană a extractului de iso-α acizi din hamei asupra
Pediococcus pentosaceus în mustul de bere fermentat cu drojdie
Saccharomyces cerevisiae boulardii
Extractul de iso-α acizi din hamei a prezentat activitate de inhibiție doar asupra
suşei bacteriene Pediococcus pentosaceus;
Concentrația de etanol nu a fost influențată, evidențiindu-se astfel faptul că
activitatea drojdiei pe parcursul fermentației nu a fost compromisă;
Rezultatele obținute evidențiază acțiunea bacteriostatică a extractului de iso-α
acizi asupra bacteriei Pediococcus pentosaceus la pH mic: 3.8-4.2.
3.3. Identificarea compuşilor volatili marker, pe parcursul procesului de
fermentație al musturilor de bere hameiate cu varietățile Magnum şi Hüller
Bitter: fermenta ții tradi ționale şi aromatizate
În mustul WMG nearomatizat a fost identificat un singur compus marker de
proces din hamei Propanoic acid, 2 metil, 2-metilbutil ester, iar în mustul WHB nu s-a
identificat nici un astfel de marker;
S-au identificat doi compuşi marker speciali: Propanoic acid 2 metil hexil ester
(Hexil isobutirat) - marker de discriminare a varietății de hamei Magnum şi Propanoic
acid 2 metil, 2-metilbutl ester - marker de autentificare din hamei atât în musturile de
bere hameiate cu varietatea Magnum cât şi cu Hüller Bitter, excepție făcând mustul
WHB;
Scăderea concentrațiilor compuşilor marker de concentrare, rezultați pe durata
fermentației musturilor aromatizate, a fost mai intensă în cazul varietății Magnum,
darorită conținutului ridicat în compuşi volatili marker din hamei;
Profilul de aromă al hameiului în produsul finit, poate fi îmbunătățit prin
aromatizarea mustului de bere, înainte de însămânțare, cu ulei esențial de hamei în
condițiile unei fermentații normale.
28
PERSPECTIVE
1. Utilizarea metodei microbiologice de inhibiție asupra altor suşe bacteriene şi de
drojdii, în mediu lichid selectiv la pH mic;
2. Optimizarea unei metode ITEX/GC-MS, indicată pentru a oferi o amprentă mai
complexă al compuşilor volatili din musturile de bere aromatizate;
3. Aplicarea parametrilor de aromatizare în producțiile industriale.
29
BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă
1. Behr, J. and R. F. Vogel, 2009, Mechanisms of Hop Inhibition: Hop Ionophores,
J. of Agricultural and Food Chemistry, 57, 6074-6075
2. Blanco, C., A. Rojas, Dieudonné Nimubona, 2007, Effects of acidity and
molecular size on bacteriostatic properties of beer hop derivates, Trends in Food
Science & Technology, 18, 144-149
3. Delvigne, F., Alison Brognauxa, Nathalie Gorretb, P. Neubauerc, Angélique
Delafossed, Marie-Laure Collignond, Dominique Toyed, M. Crined, M.
Boxuse, P. Thonart, 2011, Characterization of the response of GFP microbial
biosensors sensitive to substrate limitation in scale-down bioreactors, Biochemical
Engineering Journal, 55, 131-139
4. Dragone, G., S. I. Mussatto, João Almeida E. Silva, 2007, High Gravity
Brewing by Continuous Process Using Immobilised Yeast: Effect of Wort
Original Gravity on Fermentation Performance, J. Inst. Brew., 113(4), 391–398
5. Guido, L. F., J. R. Carneiro, J. R. Santos, P. J. Almeida, J. A. Rodrigues,
2004, A.A. Barros, J. Chromatogr., 17, 1032
6. King, A. J., R. Dickinson, 2003, Biotransformation of hop aroma terpenoids by
ale and lager yeasts, FEMS Yeast Research, 3, 53-62
7. Opstaele, F. V., G. De Rouck, Jessika De Clippeleer, G. Aerts , L. De
Cooman, 2010, Analytical and Sensory Assessment of Hoppy Aroma and
Bitterness of Conventionally Hopped and Advanced Hopped Pilsner Beers, J. Inst.
Brew., 116 (4), 445–458
8. Teuber, M. and A. F. Sehmalreck, 1973, Membrane Leakage in Bacillus
subtilis 168 Induced by the Hop Constituents Lupulone, Humulone,
Isohumulone and Humulinic Acid, Arch. Mikrobiol., 94, 159-171
9. Tofană Maria, Sonia Ancuţa Socaci, Carmen Socaciu, D. E. Mihăiescu,
Cristina Semeniuc, Delia Truţa, 2009, Optimization of HS/GC-MS Method for
the Determination of Volatile Compounds from some Indigenous Hop Varieties,
Bulletin UASVM Agriculture, 66 (2), 500-505