Docteur Laurent PELLETIERAnnée universitaire 2010/2011
Université Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits réservés.
UE2 : Biologie cellulaire
Chapitre 4 :La communication inter-
cellulaire via les récepteurs membranaires
Récepteurs membranaires
• Propriétés générales
• Mise en évidence – caractérisation
• Structure
• Divers types de récepteurs
Récepteurs membranaires« Ligand »
Récepteur
Milieu extracellulaire
Membraneplasmique
Cytosol« Effecteur
primaire »
« 2nd
messager »
« Transduction »
« Effecteursecondaire »
Récepteurs membranaires
Ehrlich, 1910 : « Pour qu’une substance puisse agir, elle doit se fixer »
Récepteurs membranaires
R membranaires : protéines membranaires intrinsèquesreconnaissant des molécules hydrophiles(peptides, protéines…)
3 Domaines :- Extracellulaire
hydrophile (glycosylé)site de reconnaissance & fixation spécifique du ligand
- TransmembranaireSéquence(s) hydrophobe(s)
- IntracellulaireDomaine fonctionnel (Transduction)
Mono / multimère
Récepteurs membranaires
Ligand
libre Récepteur Complexe L-R
Liaison de faible énergieL. hydrogèneL. Van der WaalsL. ioniquesL. hydrophobes
Grand nombre
Sensibles l’environnement (pH, ions…)
Récepteurs membranaires
Mise en évidence
1. Liaison du ligand marqué (3H, 125I, 14C…)
2. Lavage
3. Mesure du ligand fixé
Interaction ligand-récepteur :
• Réversible
• Haute affinité
• Spécificité
• Capacité limitée
Récepteurs membranaires
K
RLRL
dRL ]][[RL ][
10-8 M
Récepteurs membranairesTous les ligands sont-ils égaux devant un
récepteur ?
Signal intracellulaire
Agoniste
Signal intracellulaire
Antagoniste
AgonisteLigands
Antagoniste - Compétitifs- Non compétitifs
« Substance qui se lie à un récepteur spécifique sans provoquer son activation mais qui peut bloquer l’action d’un médiateur agoniste »
« Agent qui se lie à un récepteur spécifique en induisant son activation »
Ligands / Agonistes / Antagonistes
- Curare, -bungarotoxine
- Tétracaïne et Proadifen
Ligands / Agonistes / Antagonistes
Récepteurs membranaires
FGF
ChondrocytesChondrocytes- Cellules épithéliales (vessie, prostate)- lignée B - Cellules épithéliales (vessie, prostate)- lignée B
Prolifération Prolifération
Carcinome Hypochondroplasie,Nanisme thanatophore
FGF-R3 FGF-R3
+
VEGF-A
VEGF-R1 VEGF-R2
Membrane plasmique
Cytosol
+1 ligand → x récepteurs
VEGF-B
+
&x ligands → 1 récepteur
Cellule endothéliale
Récepteurs membranairesExemples
-+
Ang-1 Ang-2
Tie-2
1 ligand → plusieurs récepteurs
Récepteurs membranaires
1 récepteur → plusieurs ligands
Effet cellulaire = F (récepteur, ligand, type cellulaire)Effet cellulaire = F (récepteur, ligand, type cellulaire)
1 ligand + 1 récepteur → plusieurs effets (cellules)
Sans oublier les interactions entre les voies de signalisation !!!
Purification difficile car - concentration basse
- protéines membranaires
Marquage d’affinité
Chromatographie d’affinité
Clonage par expression
Récepteurs membranairesPurification
L marqué R L-R
NH2│
NH2│
NH2│
NH2│
+
L-R
C — C│ │NH NH│ │
O O
Réactif de pontage
ex : N-hydroxysuccinimide (NHS)
→ Visualisation de R-L*
→ Caractérisation moléculaire (PM en SDS-PAGE)
→ Purification
PurificationMarquage d’affinité
- Support solide + ligand spécifique (agoniste / antagoniste)
PurificationChromatographie
d’affinité
- R retenu par liaison au ligand
- R élué par ligand en excès (ou pH, force ionique)
Récepteursmembranaires
À activité enzymatique
Sans activitéenzymatique
RTK(RYK)
Canaux ioniques
Couplés Prot G
R cytokines
RTP(RYP)
Récepteurs membranaires
Récepteursmembranaires
À activité enzymatique
Sans activitéenzymatique
RTK(RYK)
Canaux ioniques
Couplés Prot G
R cytokines
RTP(RYP)
Récepteurs membranaires
Récepteursmembranaires
À activité enzymatique
Sans activitéenzymatique
RTK(RYK)
Canaux ioniques
Couplés Prot G
R cytokines
RTP(RYP)
Récepteurs membranaires
Récepteur canal ionique
Ionotropique Métabotropique
Canal ionique = pore aqueux → transport passif d’ions (sens gradient électrochimique)
Ionotropique Métabotropique
Acétylcholine Nicotinique
(muscle squelettique)
Muscarinique
(muscle cardiaque)
Glutamate NMDA, AMPA, kainate mGluR
GABA(Ac. -amino butyrique)
GABAA GABAB
Autres Sérotonine Adrénaline (β-adr.)
Récepteur canal ionique
Récepteur canal ioniqueRécepteurs cholinergiques
Ionotropique MétabotropiqueType
nicotinique muscariniqueNom
rapide LenteConduction
SNC (10 %)+ SNP
SNC (90 %)+ SNPExpression S.N.
7 5Sous-types
Excitateur Excitateur / InhibiteurEffet
Cell. Musc. Sq.Musc. card.,Cell. Endo.
Expression périphérique
pentamérique : 2, ou
Monomère : 4 hélices (M1-M4)
Récepteur nicotinique
Structure
M2→ Canal
Récepteur nicotinique
Activation
2 Ach → 2
10 000 Na+ / 0.5 s
Récepteur nicotinique
Désensibilisation
Ach rapidement dissociée
AchE
Phosphorylation → fermeture
Récepteur nicotinique
AXONE
MUSCLE
Récepteur nicotinique
La jonction neuro-musculaire
Sarcoplasme
Myofibrille
SarcolemmeCellule satellite
Récepteur nicotinique
La jonction neuro-musculaire
Tubule TCiternes terminales
Triade
MitochondrieSarcolemme
Myofibrille
Myofibrilles Reticulum sarcoplasmique
Filament épaisFilament fin
Récepteur nicotiniqueLa jonction neuro-musculaire
Récepteur nicotinique
R. à la Dihydropyridine
• Sarcolemme (Tubule T)
• Canal Ca2+
• Voltage-dépendant
R. à la Ryanodine
• Mb R. sarcoplasmique
• Canal Ca2+
La jonction neuro-musculaire
Récepteur nicotinique
3.105 Ach /AChE/min
La jonction neuro-musculaire
Récepteur nicotinique
Pharmacologie
Pathologie
• Myasthénie
CH2 CH2 N
CH3
OC
CH3
OCH3
CH3
+ CH2 CH2 N
CH3
OC
NH2
OCH3
CH3
+
Acétylcholine Carbachol
Autres : • Tubocurarine• Physostigmine
Récepteur nicotinique
Et la toxine botulique ?!
Pharmacologie
CH2 CH2 N
CH3
OC
CH3
OCH3
CH3
+
Acétylcholine
Protéine G
Acétylcholine
Effet biologique
Récepteur muscarinique
…
Dépolarisation
…
Hyperpolarisation
Récepteur muscarinique
Récepteur canal ionique
Etude des canaux ioniques et de la perméabilité membranaire
Temps (ms)
Patch clamp
ddp
Echelle : 1 canalPatch clamp
Récepteur canal ionique
Récepteur canal ionique
LigandIons
Cellule attachée
Récepteur-canal Messager intracellulaire
2nd
messager
« Inside out »
Patch clamp
Récepteursmembranaires
À activité enzymatique
Sans activitéenzymatique
RTK(RYK)
Canaux ioniques
Couplés Prot G
R cytokines
RTP(RYP)
Récepteurs membranaires
Protéine│
OH
Protéine│OI
HO – P = O I
OH
Protéine kinase
Protéine phosphatase
H2OPi
Adénine
Ribose ATP ADP
PhosphorylationGénéralités
Groupements phosphate
Phosphorylation
Tyrosine (Y) Sérine (S) Thréonine (T)
Tyrosine kinases
Récepteurs : EGF-R, Ins-R…
Autres : JAK, Src, MEK…
Sérine-thréonine kinases
Ex : MAPKs, PKA, PKC, ERK1,2, Raf…
Généralités
cellules en culture
ElectrophorèseSDS-PAGE
-
+
Coloration Autoradiographie
Stimulus- +
Récepteurs à activité TKMise en évidence de la phosphorylation
de protéines in vitro
Na332PO4
ATP 32P
Extraction protéines
stimulus
Phosphorylation
Un interrupteur biochimique
5’AMP
PhosphorylationProtéine Kinase A(PK AMPc-dépendante)
PKA
Phosphodiesterase(PDE)PP AMPcATP
PhosphorylationProtéine Kinase A
• AMPc
• PKA
Cytoplasme
Noyau
Glycogène synthase
Glycogène synthase
Glycogènen+1
Glycogène + UDP-glucosen
Phosphorylation
Phosphorylase kinase
Phosphorylasekinase
PKA
Glycogène phosphorylase
Glycogène phosphorylase
Glycogènen
Glycogène n-1+
glucose 1-PGlycolyse
PPPhosphorylasekinase
PPGlycogènePhosphorylase
PPGlycogènesyntase
Récepteursmembranaires
À activité enzymatique
Sans activitéenzymatique
RTK(RYK)
Canaux ioniques
Couplés Prot G
R cytokines
RTP(RYP)
Récepteurs membranaires
Domaine extracellulaire :
N-terminal, glycosylé, riche en cystéines,
Site de reconnaissance du ligand
Récepteurs à activité TKCaractères communs
Domaine transmembranaire :
hélice , 22-25 aa
Domaine intracellulaire
C-terminal, domaine activité TK,
Tyrosines
Protéines transmembranairesN
C
Récepteurs à activité TK
Principe d’activation
Principe d’activation
P
P
P
P
P
P
Récepteurs à activité TKMise en évidence de l’autophosphorylation
Méthode historique :
ATP 32P
Na332PO4
EGF
Lysat cellulaire
Electrophorèse + autoradiographie
Récepteurs à activité TKMise en évidence de l’autophosphorylation
EGF-R
UnT EGF
170 kDa
Pi-EGF-R 170 kDa
UnT : Non traité (Témoin)EGF : cellules stimulées avec l’EGF
Récepteurs à activité TKPrincipe d’activation
??
Opération séduction en Espagnela biocel…
Récepteurs à activité TKPrincipe d’activation
Récepteurs à activité TKEGF-R
Récepteurs à activité TKEGF-R
• SH1 : Tyrosine Kinase activity
• SH2 : pTyr-Met/Val-X-Met
• SH3 : R-X-X-P-X-X-P
• SH4 : myristylation
N CSH4 SH3 SH2 SH1
Domaines SH = Src homology domains
Récepteurs à activité TKEGF-R
Src1911, Peyton ROUS Rous Sarcoma Virus (RSV) Gag, pol, env, src
Oncogène, proto-oncogèneV-src, c-src1966, Nobel
Récepteurs à activité TKEGF-R
Récepteurs à activité TK
SH3SH2
GRB-2(Growth Receptor Binding protein)
SH3
SOS(Son Of Sevenless)
Pro-richRasGEF
EGF-R
Récepteurs à activité TKEGF-R
Ras/GDP
Ras
21 kDa
Monomère
GTPase
GTP / GDP
Active / Inactive
Proto-oncogène
Récepteurs à activité TKEGF-R
GAP
SOS (GEF)
GEF : Guanine nucleotide Exchange FactorGAP : GTPase Activating Protein
Récepteurs membranairesRécepteur à activité TK
PP
membrane
EGF
RasRas RasGTPGTP MAPKKK
ERK1/2 ERK1/2
Noyau
MAPK
MEK MEKMAPKKPP
PP PP
SOSSOSGRB2GRB2
GDP RafRaf
MAPK… : Mitogen-Activated Kinase (Kinase…)MEK : MAPK/ERK KinaseERK : Extracellular signal-Regulated Kinase
Cytoplasme
Récepteurs membranaires
ERK
P P
ERK
P P
MEKATP
ADP
SRF : Serum Response FactorSRE : Serum Response Element
Récepteurs membranaires
ERK
P P
ERK
P P
MEKATP
ADP
SRF : Serum Response FactorSRE : Serum Response Element
Récepteurs à activité TKEGF-R
Récepteurs à activité TKEGF-R
Récepteurs à activité TKEGF-R - Cross-Talk
P
membrane
GF
PLC
RasGRF
Ras RasGTP
PIP2GDP
DAG
IP3
[Ca2+]Cm
Cm : calmoduline
Ca2+-dependent Ras activation
Voie PLCγ Voie Ras
Récepteurs à activité TKEGF-R
Récepteurs à activité TKPI3K = phosphatidylinositol-3-OH kinaseLipide kinase 3’ du cycle inositol des phospho-inositides membranaires.
PI(4,5)P2 PI (3,4,5)P3 >> PI PI(3)P ; PI(4)P PI(3,4)P2
Hétérodimères :
• p110 (110 kDa) : Sous-unité catalytique
• p85 (85 kDa) : Sous-unité régulatrice (2 domaines SH2)
An aval…• PKB (Akt) & PDK (Phosphoinositide-Dependent Kinase)• Pleckstrin Homology domain (PH)
Récepteurs à activité TKPI3K
PIP3PIP2
Récepteurs à activité TKIns-R
PI3K Grb2/SOS & RasIRS : Insulin Receptor Substrate
Récepteurs à activité TKIns-R
Défaut dans la voie de signalisation de l’insuline Conséquences :
• Hyperglycémie,• Glycosurie,• …
• Type 1
Diabète juvénile ou diabète sucré insulino-dépendant (IDDM)
• Type 2
Diabète sucré non insulino-dépendant (NIDDM)
Pathologie
Récepteurs à activité TKEn médecine…
EGR, ErbB, Herceptine et Cie…
EGF-R/
ErbB-1
EGF-R/
ErbB-1
EGF-R/
ErbB-1
EGF-R/
ErbB-1
EGF-R/
ErbB-1
EGF-R/
ErbB-1ErbB-2ErbB-2
EGF-R/
ErbB-1
EGF-R/
ErbB-1
ErbB3 ou 4ErbB3 ou 4
EGF
Récepteurs à activité TKEn médecine…
• EGFR/ErbB-1• 30 % des cancers du poumon• Agressivité, mauvais pronostic
• ErbB-2 (HER2/neu)– Normal: 20 000 - 100 000 recepteurs à la surface d’une cellule– nombreux cancers (cell. épithéliales) → 1-2 106 récepteurs– Cancer du poumon : Agressivité, survie courte– Oncogène +++– Orphelin
• ErbB-3, ErbB-4
EGR, ErbB, Herceptine et Cie…
Récepteurs à activité TKEn médecine…
Surexpression de ErbB-2 : Immunohistochimie
EGR, ErbB, Herceptine et Cie…
Tumeur du poumonErbB-2 +
Tumeur du poumonErbB-2 + + +
myc cyclin D1
Jun Fos
RR
Effets de l’activation de Tyrosine Kinase de EGFR
K K
Transcription génique et progression du cycle
EGF & cellules cancéreuses
Invasion & metastasesAngiogenèse
myc cyclin D1
Jun Fos
RR
Effets de l’activation de Tyrosine Kinase de EGFR
K K
Transcription génique et progression du cycle
MAPK
MEK
RAS RAFSOS
GRB2
Prolifération
PI3-K
AKT
Inhibition de l’apoptose
PP
P
EGF & cellules cancéreuses
Invasion & metastasesAngiogenèse
myc cyclin D1
Jun Fos
RR
EGR, ErbB, IRESSA, Herceptine & Cie…
K K
Transcription génique et progression du cycle
MAPK
MEK
RAS RAFSOS
GRB2
Prolifération
PI3-K
AKT
Inhibition de l’apoptose
PP
P
EGF & cellules cancéreuses
Récepteurs à activité TK
En médecine…
Herceptin® (Trastuzumab)
EGR, ErbB, Herceptine et Cie…
• Anticorps monoclonal
• Humanisé
• IV
• ErbB-2
• Inhibiteur
Récepteursmembranaires
À activité enzymatique
Sans activitéenzymatique
RTK(RYK)
Canaux ioniques
Couplés Prot G
R cytokines
RTP(RYP)
Récepteurs membranaires
Récepteurs membranaires
Erythropoïétine (EPO),
Granulocyte Colony-Stimulating Factor (G-CSF),
Granulocyte Macrophage Colony-stimulating Factor (GM-CSF),
Thrombopoïétine (TPO),
Prolactine (PRL),
Hormone de croissance (hGH)
Cytokines
Interleukines (IL)
Récepteurs membranaires
Cellulesouche
Cellule hématopoïétique
pluripotente
CSFFlt3L
Erythrocyte
BFU-E
Méga-caryocyte
CFU-GEMMProgéniteurmyéloïde
CFU-GM
Eosinophile
Neutrophile
Mastocyte
Macrophage
Cellule dendritique
Basophile
Progéniteurlymphoïde
Lymphocyte B
pré-T
Lymphocyte T
pré-B
Récepteurs membranairesEPO-R
165 AA ~ 40% glucides
Erythropoïétine
• Produite par le rein
• Progéniteurs érythrocytaires
• Anémie
Récepteurs membranairesEPO-R
Cellule souche BFU-E CFU-E
Réticulocyte Globule rouge
EPOEPO
EPOEPO EPOEPOEPOEPO
ProliférationProlifération
MaturationMaturation
Récepteurs membranairesEPO-R
Récepteurs membranairesEPO-R
EpoR
Epo
IP : anti-EpoRWB : anti PY
- +
Récepteurs membranairesEPO-R
PPPP
PPPP
JAKJAKJAKJAK
JAK = Janus Kinase ou Just Another Kinase
JAKJAKJAKJAKPPPP
Noyau
CytosolCytosol
Récepteurs membranairesEPO-R
PPPP
PPPP
Transcription
JAKJAK JAKJAKPPPP
STATSTAT
STATSTAT
PPPPSTATSTAT
STATSTAT
STATSTAT STATSTATPP PP
STAT : Signal Transducing Transcription Activator
Récepteurs membranairesEPO-R
Récepteurs membranairesEPO-R
PJAK JAK
P
P
JAK JAKP
SHP-1 : SH2- containingphosphotyrosine Phosphatase -1
CIS : Cytokine Inducible SH2-containing proteinsSOCS : Suppressor of Cytokine Signalling
CIS CIS
CISP
PP P
Récepteursmembranaires
À activité enzymatique
Sans activitéenzymatique
RTK(RYK)
Canaux ioniques
Couplés Prot G
R cytokines
RTP(RYP)
Récepteurs membranaires
Substrats cytosoliques, membranaires
CD45 / Leucocyte Common Antigen
1 Chaîne transmembranaire.
Cell. hémato. & cell. immun.
Récepteurs membranaires
Récepteur phosphotyrosine phosphatase
Récepteursmembranaires
À activité enzymatique
Sans activitéenzymatique
RTK(RYK)
Canaux ioniques
Couplés Prot G
R cytokines
RTP(RYP)
Récepteurs membranaires
Et les autres !Et les autres !
Récepteurs membranairesRécepteur guanylyl cyclase
Facteur Natriurétique Atrial (ANF)• Détection de l’extension (stretch) des fibres musculaires des
oreillettes
prohormone ANFPro-ANF (126 aa) (28 aa)
Récepteurs membranaires
Récepteur guanylyl cyclase
Domaine TK
Domaine GC
Mb pl
Récepteurs membranairesRécepteur guanylyl cyclase
• ANF → R Guanylyl cyclase → cGMP → PKG → phosphorylations(→ GMP (PDE))
• Rein : natriurèse (sortie Na+ + H2O) → volume plasmatique
Cellules musculaires lisses : relaxation → vasodilatation
PA
Récepteurs membranaires
Récepteur guanylyl cyclase
Récepteurs membranairesRécepteur guanylyl cyclase
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1998
"for their discoveries concerning nitric oxide as a signalling molecule in the cardiovascular system"
Robert F. Furchgott
USASUNY Health Science Center Brooklyn, NY, USA 1916 -
Louis J. Ignarro
USAUCLA School of Medicine Los Angeles, CA, USA 1941 -
Ferid Murad
USA University of Texas, Health Science Center Dallas, TX, USA 1936 -
Récepteur guanylyl cyclaseRécepteurs membranaires
Récepteurs membranaires
Hanahan and WeinbergCell 100:57
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