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Un nuovo approccio:la VEQ in biologia molecolare
Il crescente interesse nella biologia molecolare applicata alla diagnostica è il risultato dei profondi progressi ottenuti nelleconoscenze scientifiche in genetica, rese possibili dall’introduzione delle tecniche di amplificazione genica.
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Il numero di laboratori che utilizzano la tecnologia dell’ amplificazione genica sta crescendo rapidamente e una conseguenza inevitabile di questa “esplosione demografica” è la necessità di standardizzazione oltre che di una definizione dell’organizzazione dei laboratori.
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Microbiologia Genetica Oncologia Farmacogenetica
Biologia Molecolare applicataalla diagnostica
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Tecniche impiegate
PCR: amplificazione del DNA
RT-PCR: amplificazione dell’RNA
PCR-SEQ: sequenziamento del DNA/RNA, previa amplificazione
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Campioni sottoposti a tecniche diagnostiche di biologia molecolare nell’U.O.
Microbiologia nel primo semestre 2005
PCR o altre tecniche di amplificazione del bersaglio
4090
RT-PCR 14722
PCR-SEQ 235
Toxoplasma, Antrace, Chlamydia, Micoplasma, HSV 1-2, VZV, CMV, EBV, HHV6, HHV8, Enterovirus, HPV, Parvovirus, HBV, HCV, HIV.
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Talloni d’Achille delle tecniche di amplificazione degli acidi
nucleici
• Elevata sensibilità: rischio di contaminazioni
• Inattivazione delle DNA polimerasi da impurezze
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Rischio di contaminazioni
Organizzazione del laboratorio e della strumentazione:
1. Area conservazione dei reagenti e allestimento master mix
2. Area preparazione del campione3. Area assemblaggio miscele di reazione e mplificazione4. Area analisi amplificati
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Aspetti preanalitici
Necessaria una chiara definizione dei passagi preanalitici
Rischi:
Degradazione degli acidi nucleici da parte di nucleasi ubiquitarie
Sensibilità della PCR rende possibile l’amplificazione di materiale contaminante
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Lavaggio bronchiale
Sciacquo orale
Saliva
Buffy Coat
Sangue dessicato
Siero o plasma
Sangue intero
Fluido cerebrospinale
Midollo osseo
Urina
Feci
Materiale bioptico
CAMPIONI BIOLOGICI
Campioni omogenei PCR compatibili
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Centralità del campione
Validazione
AssicurazioneQualità
Interna
Tipo dicampione
ValutazioneEsterna
Qualità
Approccio integrato allo sviluppo di un saggio PCR diagnostico
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Campionamento
Dove possibile evitare contenitori aperti
In caso diverso è importante evitare contaminazione con materiale dell’operatore
Preferibili contenitori di plastica monouso
Sangue e midollo osseo non devono coagulare
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Conservazione dei campioniI campioni destinati all’analisi del DNA dovrebbero essere conservati in tamponi di T10-E1 10 (mM Tris, 1 mM EDTA pH 7.5– 8.0) a 4 °C.
I campioni destinati all’analisi dell’RNA dovrebbero essere conservati in soluzioni tamponate preferibilmente a -80°C o in azoto liquido. Adeguata anche la conservazione sotto forma di precipitato in etanolo a -20 °C.Campioni di RNA stabilizzati con ITCG possono essere conservati 7 gg a T ambiente.
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Otto preparazioni diverse di genoma di CitomegalovirusConservate a 4°C in TE per 5 anni
Amplificazione del gene UL44 (1299pb)
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Fattori che interferiscono con le procedure analitiche
Preparazione dei campioni
DNA. Eliminazione incompleta di inibitori: • dal campione stesso (eme e precursori)• da campionamento inadeguato (eparina)• dalla procedura di purificazione (solventi organici)
RNA. Eliminazione incompleta di inibitori,Contaminazione con RnasiPerdita durante la precipitazione
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Fattori che interferiscono con le procedure analitiche
Contaminazioni
• Dagli stessi ampliconi• Da acidi nucleici nativi• Dei reagenti• Crociate (fra un campione positivo e uno negativo)
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Fattori che interferiscono con le procedure analitiche
Analisi dei prodotti di amplificazione
ElettroforesiDigestioni di restrizioneTrasferimento degli ampliconi (blotting)IbridizzazioneSequenziamento
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Validazione mediante “GoldStandard”
I risultati ottenuti con il saggio PCR dovrebbero essere paragonabili a quelli ottenuti con un metodo di
riferimento
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Validazione mediante “GoldStandard”
Definizioni usate nella validazione di saggi PCR (protocollo MicroVal, ISO 16140, 2003)
• PCR qualitativa: la risposta al saggio è la presenza o l’assenzadi un prodotto di PCR (amplicone) rilevato o per osservazione diretta o con strumentazione
• PCR quantitativa: la risposta al saggio può essere correlatacon il numero delle copie di amplicone, determinato dal numero di copie di sequenza bersaglio
• Limite di determinazione: il minimo numero di microrganismi bersaglio per produrre una risposta PCR positiva
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Validazione mediante “GoldStandard”
• Selettività: misura della inclusione di ceppi bersaglio (fra unampio spettro di ceppi) ed esclusione (la mancata amplificabilità di un rilevante spettro di ceppi non bersaglio strettamente correlati)
• Deviazione positiva (DP): caso PCR + a fronte di un risultato - del saggio di riferimento (SR) (falso positivo)
• Deviazione negativa (DN): caso PCR - a fronte di un risultato + del SR (falso negativo)
• Accordo positivo (AP): campione PCR + e SR +
• Accordo negativo (AN): campione PCR - e SR -
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Validazione mediante “GoldStandard”
• Accuratezza diagnostica (AC): grado di corrispondenzatra risultato ottenuto con PCR e SR su campioni identici (AC=(AP+AN)/Numero totale dei campioni
• Sensibilità diagnostica (SE): capacità del saggio PCR dirilevare il bersaglio quando è rilevato dal SR {(AP/N+)x100}
• Specificità diagnostica (SP): capacità del saggio PCR di non rilevare il bersaglio quando non è rilevato dal SR {(AP/N-)x100}
• Robustezza: riproducibilità da parte di altri laboratori che usinoaltri lotti e altre marche di reagenti, termociclatori e strumentazione validati
N+ numero totale di risultati positivi con SRN- numero totale di risultati negativi con SR
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Controlli di qualitàControlli interni 1
• Relativi alla preparazione del materiale da saggiare:
DNA Integrità - elettroforesi in gel d’agarosioInibitori - digestione con ER, quindi elettroforesi
analisi spettrofotometrica a 260 e 280nm
RNA Integrità - elettroforesi in gel d’agarosio non denat.o denaturante
Inibitori - analisi spettrofotometrica a 260 e 280nm
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Controlli di qualitàControlli interni 2
• Relativi alla sintesi di cDNA e amplificazione:sintesi di cDNA
Controllo interno (CI) - mRNA presenti nel campione (messaggeri ubiquitari) o RNA aggiunto al momentoSe il prodotto del CI non viene amplificato:
• degradazione dell’RNA• mancato priming della sintesi del cDNA• assenza di attività enzimatica
L’aggiunta di quantità note di un CI consente di rilevare diminuita sensibilità dell’RT-PCR
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Controlli di qualitàControlli interni 3
•Relativi alla sintesi di cDNA e amplificazione:PCR.:
Controllo interno (CI) - gene essenziale per la sopravvivenza (fattore di letalità, presente almeno allo stato di emizigote) opure aggiunto al momento
In questo caso il CI consente di distinguere tra assenza della sequenza bersaglio e insuccesso della PCR.
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Controlli di qualità
Controlli esterni
Controllo esterno positivo: aliquote di DNA appropriate e loro appropriate diluizioni consentono un controllo di qualità della miscela di reazione.E’ essenziale se si sospetta che il limite di determinazione possa essere inadeguato a rivelare la presenza del bersaglio.
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Controlli di qualitàControlli esterni
Controllo esterno negativo: Campione negativo contenente materiale genetico
strettamente imparentato con quello cercato, ma che non può funzionare da bersaglio
Bianco: contiene tutti i reattivi ma non il campione da amplificare. Diversi bianchi possono essere inseriti ai passaggi che si ritengano a rischio di contaminazione.
Controllo ambientale: provetta contenente la miscela di reazione lasciata aperta durante lo svolgimento di tutto il saggio per la rivelazione di DNA contaminante proveniente dall’ambiente.
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Controlli di qualitàControlli per la valutazione dei risultati
Se l’amplicone deve essere sottoposto a digestione enzimatica (RFLP) la funzionalità dell’enzima usato può essere controllata mediante la scelta di frammenti diagnostici che includano siti di restrizione costanti per lo stesso enzima
Elettroforesi: calibratori delle dimensioni degli ampliconi e ampliconi di controllo a concentrazione nota. Devono subire le stesse procedure di preparazione dei campioni
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Controlli di qualitàControlli per la valutazione dei risultati
Controlli per il sequenziamento: le ditte produttrici in genere forniscono opportuni templati per l’amplificazione e i corrispondenti primer per il controllo delle reazioni di sequenziamento. Queste reazioni consentono anche di controllarela qualità del gel di sequenziamento. Per l’analisi di mutazioni sarebbe opportuno l’analisi in parallelo di alleli wt di controllo e campioni da altri membri della famiglia.
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Valutazione esterna di qualitàproficiency testing
• Methodological proficiency testingVerifica della qualità dei passaggi analitici elementari:
Preparazione di DNA/RNAPerformance del metodo di amplificazione con primer fornitielettroforesi in gel d’agarosio
• Application based proficiency testing: Realizzabile per saggi eseguiti con relativa frequenza
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Valutazione esterna di qualitàApplication based proficiency testing
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Valutazione esterna di qualitàApplication based proficiency testing
1. Determinazione di mutazioni genetiche2. Interpretazione dei risultati
Campioni
DNA purificato
Azioni
Determinazione di mutazioni specifiche per:
Fibrosi cistica, Poliposi adenomatosa
familiare
β-talassemia, sindrome dell’ X fragile
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Valutazione esterna di qualitàMethodological proficiency testing
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1. Estrazione del DNA2. Performance della PCR3. Interpretazione dei risultati
Campioni
DNA standard
Campione di sangue
DNA di riferimento e Primer
Azioni
Determinazione spettrofotometrica
Estrazione di DNA e det. spettrofotom.
PCR in parallelo con il DNA estratto con
3 coppie di primer e analisi dei prodotti
Valutazione esterna di qualitàMethodological proficiency testing
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Da C. Casini Raggi, Clin. Biochem. (2003); 49:782-791
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Da C. Casini Raggi, Clin. Biochem. (2003); 49:782-791
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Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare
Il Vostro laboratorio esegue metodiche di biologia olecolare?
16 No17 Si
Il sistema di estrazione degli acidi nucleici utilizzato è:
6 Si5 No6 Non so
Protocollo riconosciuto come gold standard?
0Protocollo in house17Kit commerciale
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Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare
Il materiale genetico estratto viene controllato per qualità e purezza prima di essere processato?
Il laboratorio dispone di uno spettrofotometro?
3 Non Risponde4 No10 Si
Il laboratorio utilizza enzimi di restrizione?
2 Non Risponde11 No4 Si
1 A volte13 No3 Si
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Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare
Quale/i metodo/i di amplificazione genica è/sono in usonel vostro laboratorio?
2 PCR-SEQ
5 RT-PCR
3 RealTime PCR
14 PCR
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Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare
I risultati sono interpretati con l’aiuto di:
1Non Risponde
1 Metodi propri
5Standard Interno e Standard esterno
4 Standard esterno
6 Standard Interno
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Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare
Viene eseguita l’identificazione del genoma di microrganismi patogeni?
2 Non risponde6 NO10 Si
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Programma VEQ biologia molecolare
1. Estrazione del DNA2. Performance della PCR3. Interpretazione dei risultati
Campioni
Campione di sangue
DNA di riferimento, Primer
ed Enzima di Restrizione
Azioni
Estrazione di DNA:
determinazione quantità e verifica
purezza.
PCR in parallelo con il DNA estratto con
3 coppie di primer e analisi dei prodotti
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Programma VEQ biologia molecolare
Estrazione del DNA Determinazione spettrofotometricaA260/A280
Digestione con ER e analisi elettroforetica
Amplificazione DNA estratto e DNA di riferimento con primerForniti in doppio
Analisi diretta
Interpretazione dei risultati
Spedizione gruppo VEQ BMS.Orsola - Verifica
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Variabilià dei saggi di PCRLa qualità dei risultati del saggio è influenzata in modo determinante da fattori che riguardano il prelievo del campione, la preparazione del campione e la preparazione della miscela di reazione.
I saggi PCR di routine andrebbero controllati a livelli di vari parametri: specificità, limite di determinazione, linearità, precisione, etc.)
Il limite di determinazione dovrebbe essere valutato su tutta laprocedura, dalla raccolta del campione, alla sua preparazione, all’amplificazione dell’acido nucleico e alla rivelazione degli ampliconi