Un pathogène d’actualité
Clostridium difficile
Dr Levent: Équipe opérationnelle en hygiène - référent en antibiothérapie. CHSA
Manica Vasseur: Laboratoire de biologie. CHSA
Maubeuge FMC 09/11/2006
2. Diagnostic Bactériologique
Manica Vasseur – Biologiste Laboratoire. CHSA
La bactérie : caractéristiques et facteurs de virulence
Le diagnostic bactériologique
État des résistances
2. Caractéristiques de la bactérie
Bacille Gram Positif anaérobie strict
Spore subterminale peu déformante
Souches:
toxinogènes (pathogènes)
non toxinogènes (non pathogènes)
Toxine A:entérotoxine
Toxine B: cytotoxine
2. Caractéristiques de la bactérie
La Toxine A induit:
une inflammation importante
Une infiltration massive de la muqueuse intestinale par des polynucléaires et des cellules mononuclées
Une nécrose de l’épithélium intestinal
Une accumulation de fluide dans l’épithélium intestinal
2. Caractéristiques de la bactérie
La Toxine B :
1000 fois plus puissante/toxine A. Elle est cytotoxique
induit un effet cytopathogène (rétraction cellulaire, dépolimérisation des filaments d’actine du cytosquelette
Induit une augmentation de la perméabilité de la muqeuse intestinale
2. Caractéristiques de la bactérie
Les toxines A et B agissent en synergie
Distinction classique Toxine A/Toxine B n’est pas aussi tranchée. Les 2 toxines sont dotées de propriétés cytotoxiques et entérotoxiques (Savidge et coll 2003)
Polypeptides de grandes tailles (308 et 270 Kda) présentant toutes 2 des structures primaires similaires
Joueraient un rôle dans l’adhérence bactérienne (Tasfeyne et coll-2001, Borriello et coll-1998)
Domaine transmembranaire intervenant dans la translocation des toxines dans le cytosol
Domaine N terminal
Activité enzymatique toxique Site de liaison aux cellules cibles
Mécanisme d'action des toxines
Liaison aux récepteurs des entérocytes
Production de cytokines proinflammatoires
par les monocytes (TNF IL1 ,et 6) et les entérocytes (MIP 2, IL8 )
Internalisation
Inactivation des proteines Rho
Désorganisation du cytosquelette cellulaire
Augmentation de la perméabilité paracellulaire
Diarrhée aqueuse
Action directeActions indirectes
Infiltration massive de polynucléaires activés
Nécrose des cellules coliques
Inflammation sévéreDestruction des cryptes intestinales Lésions épithéliales
Pseudomembranes : PN , fibrine , débris cellulaires
Induction de
L'apoptose de certaines cellules intestinales
2. Caractéristiques de la bactérie
Autres facteurs de virulence:
Facteurs d’adhésion
Structures spécifiques favorisant la persistance de la bactérie dans le tube digestif continuellement lavé par les fluides intestinaux
Structures d’adhésion au mucus: flagelles ou Fumbriae
Structures d’adhésion aux cellules hôtes: prteines de la couche S, Adhésine Cwp66, Proteine Fbp68
2. Caractéristiques de la bactérie
Autres facteurs de virulence:
Enzymzes hydrolytiques (gélatinases, hyaluronidases…)
facilitent le maintien de la bactérie dans le tube digestif
Les souches les plus virulentes sont les plus protéolytiques dans les modèles animaux.
Autres facteurs de virulence Sécrétion d'autres toxines Toxine binaire ( ADP ribosyl- transférase spécifique de l'actine )
Dépolymérisation de l'actine
Ballonisation des cellules
Aurait un rôle dans la virulence de souches particuliéres
2. Réponse immunitaire de l’hôte
La production d’anticorps (IgG anti-toxine A notamment) serait protectrice
Une bonne réponse humorale pourrait assurer une bonne protection contre les récidives (Kyne et coll- Lancet 2001)
Facteurs de virulence et réponse immunitaire
Le degré de virulence de chaque souche et les différents niveaux de réponse de l'hôte pourraient expliquer les présentations cliniques très variées observées
Le diagnostic biologique : Principes d’utilisation des tests
Respect des indications :
• Patients diarrhéiques
• Facteurs de risque : antibiothérapie < 4 s ( la durée de l'antibiothérapie majore le risque ) ou hospitalisation récente , chimiothérapie , laxatifs , stimulants gastro-intestinaux, tous les facteurs modifiant l'écosystéme ou la motilité intestinale )
Test non effectué
•sur selles solides
• sur écouvillon
Quantité de selles suffisante (au minimum 3 ml )
Généralement un seul prélévement suffit
Inutiles chez les patients asymptomatiques
Test de contrôle pendant ou après le traitement non recommandé
Un test positif sans diarrhée ne nécessite pas de traitement (portage sain)
Taux d’isolement de Clostridium difficile
Diarrhées post antibiotiques : d'autres responsables ?
Staphylococcus aureus Candida Clostridium perfringens Klebsiella Oxytoca
Mise en évidence des toxines
Mise en évidence de Clostridium Difficile
Isolement Dépistage de l'antigéne Ag GDH
Elisa Cytotoxicité PCR
4. Le diagnostic biologique
Selles
Mise en évidence des toxines dans les selles
- Recherche de l'Effet cytopathogéne
- Recherche des toxines
- Recherche par PCR
La technique de référence :Culture cellulaire
Sensibilité 80-90% Spécificité 100% Infrastructure lourde requise
Recherche d' un effet cytopathogène de la toxine B
Après dépôt d’un filtrat
de selles sur les cellules
L’ECP correspond à une
ballonisation des cellules
Recherche de toxines
Test Elisa ou immunochromatographiques utilisant des anticorps monoclonaux dépistant -la toxine A -ou les toxines A et B
En France : 1 à 3% des souches sont Toxine A- B+
Technique rapide : environ 30 minutes Limites des tests :
Spécificité > 97% Sensibilité : 52- 95% (100- 1000 pg de toxines) Faux négatifs
Techniques de biologie moléculaire La PCR : Amplification génétique
Sensibilité (91 à 97%) Spécificité : 100%
Nécessitant un équipement particulier :non réalisable dans les laboratoires classiques
Problème de fiabilité : présence d’inhibiteurs de la réaction dans les prélèvements
Techniques de PCR en temps réel :
Plus rapides et plus fiables
Réalisable dans tous les laboratoires
En développement
Problème de côut
Mise en culture
Ensemencement d'une suspension de la selles sur un milieu contenant:
des inhibiteurs: Cyclosérine Céfoxitine du Taurocholate : permettant la germination de spores ( augmente la
sensibilité de la culture )
Incubation en anaérobiose stricte 48-72 h à 37°C
Aspect en culture
Colonies circulaires à bords irréguliers (3-5 mm), non hémolytiques
- présentant un aspect de verre fritté - odeur caractéristique de crottin de cheval - colonies fluorescentes sous UV
Identification
Equipement enzymatique : Rapid 32A ( bioMérieux )
Inoculum lourd (4 - 5 McF )
Importance de la culture
Manque de sensibilité des tests de recherche de toxine
10 % des infections à Clostridium Difficile ne seraient dépistées que par la culture
Méthodes génotypiques : • PCR-ribotypage•Toxinotypie
Typage des souches recues au CHSA
N° sexe Date pvt origine Toxinotype PCR ribotype Toxine binaire ERY CM MXF5 MTZ1 F 24/05/06 A III O 27 pos 6 12 62 F 18/05/06 A III O 27 pos 6 12 63 M 28/06/06 A XXIV O 27 pos 6 12 64 F 23/06/06 A III O 27 pos 6 6 95 M 12/06/06 A III O 27 pos 6 12 86 M 12/06/06 A III O 27 pos 6 12 67 F 02/09/06 A III "027" pos 6 12 6 338 F 31/08/06 B III "027" pos 6 13 6 329 M 01/09/06 A III "027" pos 6 15 6 28
10 F 26/09/06 C III "027" pos 6 14 10 3611 F 22/09/06 A III "027" pos 6 12 10 3712 F 22/09/06 A III "027" pos 6 13 10 327 F 22/09/06 A III "027" pos 6 12 10 37
13 F 25/06/06 A "027" pos 6 13 6 4614 F 26/09/06 C III "027" pos 6 14 10 3615 M 30/09/06 A "027" pos 6 17 10 3116 F 05/10/06 A "027" pos 6 12 10 3217 ERY : erythromycine
CM : clindamycineMXF : moxifloxacineMTZ : métronidazole
Méthodes génotypiques :• PCR-ribotypage• Toxinotypie• Marqueurs de différenciation des souches isolées
En période épidémique
Démonstrer l'existence de contamination croisée entre patients hospitalisés Analyse des souches en circulation Suivi de l'émergence de nouveau variants Différencier une rechute d'une réinfection en cas d'isolement répété d'un Clostridium Difficile chez un même patient
Typage des souches
4. La sensibilité aux antibiotiques
En pratique courante, les études de sensibilité sont rarement effectuées En effet: ► les traitements habituels sont toujours efficaces (pour l’instant) ► ATBgramme standard (par diffusion en gélose) mal adapté
aux anaérobies stricts
Antibiotiques incriminés
Fréquemment : Clindamycine, Lincomycine, Amoxicilline, Augmentin Céphalosporines, Bactrim
Moins souvent:
Macrolides, Phénicolés, Quinolones, Cotrimoxazole, Rifampicine,Tétracyclines
Jamais Aminosides
Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (2)
CéphalosporinesCéfoxitine
MoxalactamFluoroquinolones
Résistance naturelle
AmoxicillinePipéracillineImipénème
GlycopeptidesImidazolés
ErythromycineTétracyclineRifampicine
Chloramphénicol
Habituellement sensible
Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (3)
► 3 souches Vanco-R (Dworczynski 1991) ► 3%Souches toxinogénes Vanco-I (Pelaez 1998
► 11% (49/469) de souches R (Pelaez 1998) ►6%Souches toxinogénes metro cmi > 32 ( 415 isolats )(Pelaez 2000) ► 3% de souches non toxinogénes I (Barbut 1999)
Vancomycine
Métronidazole
Vancomycine: 0,25-4 mg/l Métronidazole: 0,25-1 mg/l
CMI
La vancomycine et le métronidazole sont les molécules les plus fréquemment prescrites
Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (1)
Rares études disponibles sur la fréquence des résistances
23,764,223
14,5
11,6---
7,58-6
18,522,79,7-
TetracyclinesErythromycineRifampicineChloramphénicol
Barbut 1999Niyogi 1992Levett 1988Delmée 1988
% de résistance de C.difficile aux ATB
Sensibilité de C.difficile aux antibiotiques (4)
Chromosomique transférable (altération du ribosome) Chromosomique transférable (modification du ribosome)Inactivation enzymatique
MacrolidesTétracyclines
Chloramphénicol
Mécanismes de résistanceAntibiotiques
Mécanismes et supports génétiques des résistances
Sensibilité de C.difficile aux quinolones
Ofloxacine , Ciprofloxacine: CMI 8 à 16 mg/l
Levofloxacine : CMI 4 à 8 mg/L
Moxifloxacine : cmi plus basses : 0,5 à 2 mg/lRésistance à la moxifloxacine 12% : étude Allemande ( 1986-2001)
Sensibilité de C.difficile au linézolide
Cmi des souches sensibles : 0,03 à 4 mg/l
Des souches résistantes ont été décrites :
Ackerlman et Coll en 2003 : 23 souches de sensibilité diminuée sur 192 isolats
Résistance associée aux fluoroquinolones et macrolides