UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica
Área de Tecnologia Químico-Farmacêutica Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados
utilizando sistemas de duas fases aquosas
Tatiana Souza Porto
Tese para obtenção do grau de DOUTOR
Orientador: Prof. Dr. Adalberto Pessoa Junior
São Paulo 2008
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Bioquímico-
Farmacêutica Área de Tecnologia Químico-Farmacêutica
Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados
utilizando sistemas de duas fases aquosas
Tatiana Souza Porto
Tese para obtenção do grau de DOUTOR
Orientador: Prof. Dr. Adalberto Pessoa Junior
São Paulo 2008
Ficha Catalográfica Elaborada pela Divisão de Bibliotecas e
Documentação do Conjunto das Químicas da USP.
Porto, Tatiana Souza P853e Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por
processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados utilizando sistemas de duas fases aquosas / Tatiana Souza Porto. – São Paulo, 2008.
123p. Tese (doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas
da Universidade de São Paulo. Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica.
Orientador: Pessoa Junior, Adalberto 1. Enzima: Biotecnologia 2. Engenharia bioquímica
3. Engenharia de Alimentos I. T. II. Pessoa Junior, Adalberto, orientador.
620.8 CDD
Tatiana Souza Porto Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados
utilizando sistemas de duas fases aquosas
Comissão Julgadora da
Tese para obtenção do grau de Doutor
Prof. Titular Adalberto Pessoa Junior
orientador/presidente
____________________________ 1o. examinador
____________________________ 2o. examinador
____________________________ 3o. examinador
____________________________ 4o. examinador
São Paulo, Maio de 2008.
Dedico esta tese à minha família, principalmente a minha Mãe, Graça, que sempre esteve ao meu lado e ao meu namorado Fábio, por todo o amor e apoio.
“A alegria está na luta,, na tentativa,, no sofrimento envolvido. Não na vitória propriamente dita”.
Mahatma Gandhi
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Adalberto Pessoa Junior pela excelente orientação, apoio e
incentivo dados durante os quase seis anos em que trabalhamos juntos.
Declaro aqui a minha enorme admiração e agradeço pela confiança depositada
em mim, pois fazer a pós-graduação na USP possibilitou a realização de um
sonho.
À Profa Dra Ana Lúcia Figueiredo Porto, pela oportunidade e incentivo
dados para o ingresso na pesquisa científica e pelas orientações durante toda
a minha vida científica. Obrigada pelo carinho, amizade e dedicação, que tanto
colaboraram para a realização deste trabalho.
Ao Prof. Attilio Converti que me recebeu de braços abertos em seu
laboratório em Genova e me orientou da melhor forma possível durante o
período que fiquei na Itália. Não posso deixar de agradecer também sua família
que sempre foi muito simpática. Agradeço pela a orientação, mas
principalmente pela amizade que surgiu durante este tempo.
Ao Prof. Dr. Benício Barros Neto, pela enorme colaboração, sempre com
bom humor, para ajudar na análise estatística dos dados deste trabalho.
Obrigada pelos ensinamentos, que tanto me ajudam neste mundo da pesquisa.
Os meus mais sinceros agradecimentos.
Ao Prof. Dr. José Luiz de Lima Filho, Diretor do Laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami – LIKA por sempre estar disposto a colaborar com
o trabalho nos mais diferentes aspectos, além de ter disponibilizado a infra-
estrutura deste grande laboratório para a realização dos experimentos.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
pelos recursos financeiros e pela bolsa concedida durante toda a minha pós-
graduação.
Agradeço à CAPES (Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior), pela concessão da bolsa de Estágio de Doutorado no Exterior,
sem a qual eu não poderia ter vivenciado um período tão especial na minha
vida profissional e pessoal.
À Doutora Maria Taciana Cavalcanti, que sempre ajuda na realização e
na coordenação dos experimentos, trabalhamos muito juntas em função das
nossas teses. Obrigada por ter me apoiado no momento tão difícil no início do
meu mestrado e também por todos esses anos de trabalho em conjunto.
Agradeço especialmente à minha irmã e colaboradora científica Camila
Souza Porto, por todo o apoio, incentivo e ajuda nos momento que mais
necessitei durante o meu mestrado e doutorado. Obrigada por todos os
experimentos realizados e coordenados durante todo este período,
principalmente durante a minha viagem ao exterior.
Às amigas, em especial à Ana Carolina, Ana Cecília, Catarina, Juliana,
Mariana, Michaelle, Veruska, pela força, carinho e amizade dados durante esta
fase.
Aos amigos da USP, Ângelo Samir, Carlota Yagui, Francislene
Hashmann, André Moreni, Daniela Gurpilhares, Daniele Maia, Alziana Pedrosa,
Alexandre Ferreira, Raquel Bezerra e Marcelo Matsudo. Obrigada pelo
acolhimento e pela força dados durante o tempo que permaneci em São Paulo.
Aos funcionários da FCF Elza, Mirian, Juarez, Elaine e Jorge, que sempre
foram muito atenciosos comigo e me ajudaram no que foi preciso.
Aos amigos do LIKA, Keila, Daniela, Carol, Petrus, Germana, Pedro,
Roberto, Márcia, e Edgar. Obrigada pelo carinho e amizade.
Ringrazio a tutti amici del Dipartimento di Ingegneria Chimica e di
Processo “G. B. Bonino” - DICHEP, Bahar, Davide, Alberto, Chiara, Eliseo,
Eugenia, Andréa, Marco, Danilo, Carla, per tutti momenti belli che abbiamo
avuto in quel periodo che sono stata a Genova. I miei saluti, voi mi mancati
tantissimo.
Agradeço por tudo e a todos que me ajudaram de alguma forma neste
trabalho.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS........................................................................................... I
LISTA DE TABELAS .........................................................................................V
LISTA DE SÍMBOLOS......................................................................................VI
RESUMO..........................................................................................................VII
ABSTRACT.....................................................................................................VIII
OBJETIVOS...................................................................................................... IX OBJETIVO GERAL ..............................................................................................IX OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................IX
INTRODUÇÃO................................................................................................... 1
CAPITULO I ....................................................................................................... 3
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................................. 3 1.1. ASCORBATO OXIDASE ................................................................................ 3 1.2. PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS....................................................................... 7 1.3. SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS (SDFA) .............................................. 8 1.4. POLIETILENO GLICOL ................................................................................ 10 1.5. FATORES QUE INFLUENCIAM O SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS. ............. 11
1.5.1. Massa molar e concentração do polímero ...................................... 11 1.5.2. pH.................................................................................................... 12 1.5.3. Adição de sais ................................................................................. 14 1.5.4. Temperatura.................................................................................... 15
1.6. SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS (SDFA) ............................................ 15 1.7. EQUIPAMENTOS PARA EXTRAÇÃO UTILIZANDO SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS ....................................................................................................... 16
1.7.1. Coluna de discos perfurados rotativos (PRDC)............................... 18 1.8. APLICAÇÃO DE PLANEJAMENTOS EXPERIMENTAIS EM SDFA ....................... 20
CAPITULO II .................................................................................................... 22
SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS PEG/CITRATO: ESTUDO DAS VARIÁVEIS QUE INFLUENCIAM A PARTIÇÃO E PURIFICAÇÃO DA ASCORBATO OXIDASE DE CUCURBITA MAXIMA ..................................... 22
2.1. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 23 2.2. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 24
2.2.1. Ascorbato oxidase........................................................................... 24 2.2.2. Preparo do Extrato Enzimático........................................................ 24 2.2.3. Preparo dos sistemas de duas fases aquosas para os estudos de partição da ascorbato oxidase em PEG/Citrato. ....................................... 25 2.2.4. Planejamento fatorial fracionário para a extração da ascorbato oxidase...................................................................................................... 25
2.2.5. Planejamento fatorial completo para a extração da ascorbato oxidase...................................................................................................... 26 2.2.6. Determinação da atividade ascorbato oxidase................................ 28 2.2.7. Determinação do conteúdo protéico................................................ 28
2.3. DEFINIÇÃO DOS PARÂMETROS DE ANÁLISE DO PROCESSO...... 28 2.3.1. Atividade Específica ........................................................................ 28 2.3.2. Aumento de Pureza (AP) ................................................................ 29 2.3.3. Recuperação da ascorbato oxidase (Y) .......................................... 29 2.3.4. Coeficiente de Partição da ascorbato oxidase (K) .......................... 29
2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 30 2.4.1. Planejamento fatorial fracionário para a extração da ascorbato oxidase...................................................................................................... 30 2.4.2. Primeiro planejamento fatorial completo para a extração da ascorbato oxidase ..................................................................................... 41 2.4.3. Segundo planejamento fatorial completo para extração da ascorbato oxidase em SDFA. .................................................................................... 47
2.5. CONCLUSÃO........................................................................................ 51 CAPITULO III ................................................................................................... 52
EFEITO DO PH E DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE E ESTABILIDADE DA ASCORBATO OXIDASE NO EXTRATO BRUTO E NO PRÉ-PURIFICADO POR SDFA....................................................................................................... 52
3.1. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 53 3.2. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 54
3.2.1. Preparo do Extrato Enzimático........................................................ 54 3.2.2. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático .................................................. 54 3.2.3. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da AO após pré-purificação em SDFA. ................................................................ 55 3.2.4. Determinações analíticas ................................................................ 56
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 57 3.3.1. Obtenção do extrato enzimático de Cucurbita maxima contendo a ascorbato oxidase ..................................................................................... 57 3.3.2. Efeito do pH na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático ..................................................................................... 57 3.3.3. Efeito da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático................................................................... 60 3.3.4. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da AO após pré-purificação em SDFA. ................................................................ 62
3.4. CONCLUSÃO........................................................................................ 65 CAPITULO IV................................................................................................... 66
INVESTIGAÇÃO CINÉTICA E TERMODINÂMICA NA ATIVIDADE DA ASCORBATO OXIDASE E ESTABILIDADE DO EXTRATO DE CUCURBITA MAXIMA........................................................................................................... 66
4.1 INTRODUÇÃO ....................................................................................... 67 4.2. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 68
4.2.1. Preparo do Extrato Enzimático........................................................ 68
4.2.2. Determinação dos Parâmetros Cinéticos e Termodinâmicos da AO.................................................................................................................. 68 4.2.3. Determinação da atividade ascorbato oxidase................................ 69
4.3. TEORIA ................................................................................................. 69 4.3.1. Cinética da Atividade Enzimática. ................................................... 69 4.3.2. Termodinâmica da Reação Enzimática........................................... 70 4.3.3. Inativação Térmica da Enzima. ....................................................... 70 4.3.4.Tempo de Meia-Vida da Enzima. ..................................................... 71 4.4.5. Atividade Integral da Enzima........................................................... 71
4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 72 4.4.1. Caracterização Cinética da Atividade da AO. ................................. 72 4.4.2. Termodinâmica da Reação Enzimática........................................... 73 4.4.3. Termodinâmica da Inativação Térmica da AO. ............................... 76 4.4.4. Atividade Integral............................................................................. 80
4.5. CONCLUSÃO........................................................................................ 81 CAPITULO V.................................................................................................... 83
EXTRAÇÃO CONTÍNUA DA ASCORBATO OXIDASE EM SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS PEG/CITRATO, UTILIZANDO A COLUNA DE DISCOS PERFURADOS ROTATIVOS............................................................ 83
5.1. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 84 5.2. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................... 85
5.2.1. Ascorbato oxidase........................................................................... 85 5.2.2. Preparo do Extrato Enzimático........................................................ 86 5.2.3. Coluna de discos perfurados rotativos ............................................ 86 5.2.4. Extração contínua em sistema de duas fases aquosas .................. 87 5.2.5. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos .................................................................................. 88 5.2.6. Determinações analíticas ................................................................ 89
5.3. DEFINIÇÃO DOS PARÂMETROS DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO CONTÍNUA................................................................................................... 90 5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................ 91
5.4.1. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos .................................................................................. 91 5.4.2. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos para avaliação dos parâmetros operacionais ........... 99
5.5. CONCLUSÃO...................................................................................... 107 CONCLUSÕES.............................................................................................. 108
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 109
ANEXOS ........................................................................................................ 124 ANEXO 1 – NORMAS PARA A DEFESA DA TESE ............................................... 125 ANEXO 2 – ARTIGO PUBLICADO..................................................................... 126
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1: Reação catalisada pela enzima ascorbato oxidase. 3 Figura 1.2: Estrutura da enzima ascorbato oxidase (Protein Data Bank
/PDB: 1AOZ). 5 Figura 1.3 : Coluna de discos perfurados rotativos em operação (A), e
em (B) vista frontal da coluna com mais detalhes, onde se pode observar o eixo com os discos e as bombas de alimentação, a alimentação da fase leve e drenagem da fase pesada será realizada pela parte inferior da coluna, e pelo topo da coluna ocorreu a alimentação da fase pesada e drenagem da fase leve. 19
Figura 2.1: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl. 32
Figura 2.2: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos do
fator de diluição e massa molar do PEG, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K) 33
Figura 2.3: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos da
concentração de citrato e massa molar do PEG, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K). 35
Figura 2.4: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-Fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl. 36
Figura 2.5: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG,
concentração de PEG e concentração de citrato), tendo como variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase. 37
Figura 2.6: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta o aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH,
ii
(5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-Fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl. 38
Figura 2.7: Valores de recuperação da enzima e aumento de pureza
na fase superior dos sistemas de duas fases aquosas PEG/Citrato. 40
Figura 2.8: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)CPEG-concentração do PEG, (2)Citrato-concentração de citrato. 43
Figura 2.9: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos, tendo
como variável-resposta a recuperação (Y) para analisar a concentração de citrato em função da concentração do PEG no SDFA. 44
Figura 2.10: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta o aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)CPEG-concentração do PEG, (2)Citrato-concentração de citrato. 45
Figura 2.11: Superfície de resposta do planejamento experimental
para o aumento de pureza da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas (PEG/citrato). 46
Figura 2.12: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1) CPEG-concentração do PEG, (2) Citrato-concentração de citrato. 49
Figura 2.13: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1) CPEG-concentração do PEG, (2) Citrato-concentração de citrato. 50
Figura 3.1: Efeito do pH na atividade da ascorbato oxidase a 25°C.
Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 ( ), tampão fosfato 0,1M pH 7,0 ( ) e tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e 9,0( ). 58
Figura 3.2: Efeito do pH na estabilidade da ascorbato oxidase contida
no extrato de Cucurbita máxima, durante 20 horas a 5°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0, tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e 9,0. 59
iii
Figura 3.3: Efeito da temperatura na atividade da ascorbato oxidase a pH 6,0. 60
Figura 3.4: Efeito da temperatura na estabilidade da ascorbato
oxidase durante 60 min. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0. 61 Figura 3.5: Efeito do pH na atividade da ascorbato oxidase pré-
purificada em SDFA a 25°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 ( ) e tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e 8,0 ( ). 62
Figura 3.6: Efeito do pH na estabilidade da ascorbato oxidase pré-
purificada em SDFA durante 20 horas a 25°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 e tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e 8,0. 63
Figura 3.7: Efeito da temperatura na atividade da AO pré-purificada
em SDFA a pH 6,0. 64 Figura 3.8: Efeito da temperatura na estabilidade da AO pré-purificada
em SDFA durante 60 min. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0. 64 Figura 4.1: Curva de Lineweaver-Burk. Inverso da velocidade inicial
de oxidação do AA em função do inverso da concentração inicial de substrato (R2 =0,98). 73
Figura 4.2: Gráfico semi-logarítimico de Eyring para a determinação
dos parâmetros termodinâmicos da reação enzimática. 74 Figura 4.3: Gráficos semi-logarítimos de Eyring com correlação entre
o tempo e o coeficiente de atividade residual da AO (ψ ) do extrato bruto de C. maxima. 77
Figura 4.4: Gráfico semi-logarítimo de Eyring para a estimativa dos
parâmetros termodinâmicos da inativação térmica irreversível da AO. 79
Figura 4.5: Atividade Integral de AO (P, μm) em função do tempo (t,
min) no extrato bruto de C. maxima a diferentes temperaturas. 81 Figura 5.1: Desenho esquemático da extração contínua em coluna de
discos rotativos perfurados. Os números significam: 1=eixo rotativo central, 2=entrada da fase pesada (sal), 3=saída da fase pesada ou contínua (rafinado), 4=entrada da fase leve ou dispersa (PEG), 5=saída da fase leve (extrativa), 6=entrada de água d refrigeração e 7=saída da água de refrigeração. 86
Figura 5.2: Comportamento de extração da ascorbato oxidase em
PRDC. Proteína total residual na fase sal (rafinado) (-♦-), Proteína total na fase PEG (- -), Atividade total residual na fase sal ( ), Atividade total na fase PEG ( ), após extração com
iv
sistemas PEG 20000/citrato (20% e 15% m/m) e pH 6,0, 23°C±2°C. 92
Figura 5.3: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição da ascorbato oxidase na fase dispersa. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato. 94
Figura 5.4: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG,
concentração de PEG e concentração de citrato) de um planejamento 23, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase. 95
Figura 5.5: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta o coeficiente de transferência. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato. 96
Figura 5.6: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG,
concentração de PEG e concentração de citrato) de um planejamento 23, tendo como variável-resposta o coeficiente de transferência de massa (kda) para a extração contínua em PRDC. 97
Figura 5.7: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta a eficiência de separação. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato. 98
Figura 5.8: Comportamento de extração da ascorbato oxidase em
PRDC em função do tempo. Proteína total residual na fase sal ou contínua (rafinado) (-♦-), Proteína total na fase PEG ou dispersa (- -), Atividade total residual na fase sal ( ), Atividade total na fase PEG ( ). Extração conduzida com sistemas PEG 20000/citrato (20% e 15% m/m) e ph 6,0, 23°C±2°C. 100
Figura 5.9: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta o coeficiente de partição da ascorbato oxidase na fase dispersa do sistema de duas fases aquosas. 102
Figura 5.10: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como
variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase dispersa do sistema de duas fases aquosas. 105
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 - Níveis das variáveis do planejamento fatorial fracionário (27-2),
utilizadas na extração em SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase. 26 Tabela 2.2 - Níveis das variáveis do primeiro planejamento fatorial completo (22),
utilizados na extração SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase. 27 Tabela 2.3 - Níveis das variáveis do segundo planejamento fatorial completo
(22), utilizados na extração SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase. 27 Tabela 2.4 - Resultados do planejamento fatorial fracionário (27-2) da extração da
ascorbato oxidase na fase superior do sistema PEG/citrato. 31 Tabela 2.5 - Resultados do primeiro planejamento fatorial completo (22) para
extração da ascorbato oxidase no sistema PEG/citrato. 42 Tabela 2.6 - Resultados confirmatórios do sistema selecionado (ensaio 2) de
extração descontínua da ascorbato oxidase em SDFA. 47 Tabela 2.7 - Resultados do segundo planejamento fatorial completo (22) para a
extração da ascorbato oxidase no sistema PEG/Citrato. 48 Tabela 4.1 - Parâmetros Termodinâmicos da reação enzimática e Inativação
Térmica do extrato bruto de C. maxima 75 Tabela 4.2 - Velocidade Específica de Desnaturação da AO (kd), Meia-Vida (t1/2)
e Atividade Integral até t1/2 (P1/2) e Tempo Infinito (P∞) estimados para o extrato bruto de C. maxima a diferentes temperaturas 78
Tabela 5.1 - Planejamento fatorial completo (23) para a extração continua da
ascorbato oxidase em sistema de duas fases aquosas, utilizando PRDC. 88 Tabela 5.2 - Planejamento fatorial completo (22) para a extração continua da
ascorbato oxidase em sistema de duas fases aquosas, utilizando PRDC. 89 Tabela 5.3 - Resultados do planejamento fatorial completo (23) da extração
contínua da ascorbato oxidase em PRDC utilizando PEG/Citrato. 93 Tabela 5.4 - Resultados do planejamento fatorial completo (22) da extração
contínua da ascorbato oxidase em PRDC utilizando PEG/Citrato. 101
vi
LISTA DE SÍMBOLOS A atividade da AO, (mM min-1) Ao atividade inicial da AO, (mM min-1) Ao,max atividade inicial máxima da AO, (mM min-1) CE2A concentração do dímero ativo de AO, (μM) CE2Ao inicial concentração do dímero ativo de AO, (μM) h constante de Planck, (J min) kB constante de Boltzmann, (J K-1) Km constante de Michaelis, (μM) kv velocidade de reação específica, (min-1) kd velocidade específica de desnaturação irreversível da AO, (min-1) P atividade integral da AO, (mM) P1/2 atividade integral da AO até t1/2, (mM) P∞ atividade integral da AO até tempo infinito, (mM) R constante universal do gás ideal, (J mol-1 K-1) r2 coeficiente de determinação, adimensional So concentração inicial de AA, (μM) t tempo de reação, (min) T temperatura, (°C ou K) t1/2 tempo de meia-vida da AO, (min) K coeficiente de Partição, adimensional Pt concentração de proteínas totais na fase superior “top”, (mg/mL) Pb concentração de proteínas totais na fase inferior “bottom”, (mg/mL) At atividade da ascorbato oxidase na fase superior, “top”, (U/mL) Ab atividade da ascorbato oxidase na fase inferior, “bottom”, (U/mL) AA ácido ascórbico AO ascorbato oxidase SDFA sistema de duas fases aquosas PRDC coluna de discos rotativos perfurados E2A dímero ativo da AO E1I monômero inativo da AO PEG polietileno glicol MMPEG massa molar do PEG (g/mol) CPEG concentração de PEG (%) CIT concentração de citrato de sódio (%) AP aumento de pureza, adimensional Y recuperação da enzima na fase PEG (%) KDa coeficiente de transferência de massa (min-1) Es Eficiência de separação (%) H Hold up, adimensional ΔG* energia livre de ativação da reação enzimática, (kJ mol-1) ΔG*D energia livre de ativação da inativação da AO, (kJ mol-1) ΔH* entalpia de ativação da reação enzimática, (kJ mol-1) ΔH*D entalpia de ativação da inativação da AO, (kJ mol-1) ΔS* entropia de ativação da reação enzimática, (J mol-1 K-1) ΔS*D entropia de ativação da inativação da AO, (J mol-1 K-1) ψ coeficiente de atividade residual, adimensional
vii
RESUMO
PORTO, T.S. Extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por processo descontínuo e contínuo em coluna de discos rotativos perfurados utilizando sistemas de duas fases aquosas. 2008. 126f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo. 2008. A partição e purificação de ascorbato oxidase de abóbora (Cucurbita maxima) por extração líquido-líquido em sistema de duas fases aquosas (SDFA), pelos processos descontínuos e contínuos, utilizando coluna de discos rotativos perfurados (PRDC), foram estudadas. Foram utilizados planejamentos estatísticos para selecionar as variáveis significativas no processo descontínuo de purificação, e as variáveis estudadas foram massa molar e concentração do polietileno glicol (PEG), concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição e massa total do sistema. Os melhores resultados (coeficiente de partição 1,72, recuperação 90,8% e aumento de pureza 3,12) foram obtidos nas seguintes condições: massa molar do PEG 20000 (g/mol), pH 6,0, concentração de PEG 25% (m/m) e concentração de citrato 10% (m/m). No valor de pH 6,0 e temperatura 35°C a ascorbato oxidase apresentou seus maiores valores de atividade, e manteve a estabilidade na faixa de pH 5,0 a 9,0 durante 36 horas e a temperaturas de até 40°C durante 1 hora. Experimentos também foram realizados para estimar as principais propriedades cinéticas e termodinâmicas da atividade e estabilidade da ascorbato oxidase, e esse estudo revelou que a enzima foi estável nas condições testadas. A PRDC mostrou um bom desempenho para extração da ascorbato oxidase em modo contínuo utilizando SDFA. A melhor condição operacional selecionada neste estudo foi selecionada com o auxílio de planejamentos estatísticos, sendo selecionadas as seguintes condições: massa molar do PEG 20000 (g/mol), concentração de PEG 20% (m/m), concentração de citrato 10% (m/m), velocidade de rotação dos discos de 80 rpm e velocidade da fase dispersa de 2 mL/min. Os melhores resultados em valores médios foram: coeficiente de partição 3,36, recuperação 152%, aumento de pureza 2,31, coeficiente de transferência de massa 0,045, eficiência de separação 43,7% e hold up 0,33. Os dados experimentais demonstram o potencial da aplicação do sistema de duas fases aquosas PEG/citrato para purificar a ascorbato oxidase utilizando coluna de discos rotativos perfurados.
PALAVRAS-CHAVE: Sistemas de duas fases aquosas, Ascorbato oxidase, coluna de discos perfurados rotativos e PEG/citrato.
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ABSTRACT PORTO, T.S. Extraction of ascorbate oxidase from Cucurbita maxima by discontinuous and continuous process in perforated rotating disc contactor using aqueous two-phase systems. 2008. 126f. Thesis (Ph.D) – College of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, São Paulo. 2008.
The partition and purification of ascorbate oxidase from pumpkin (Cucurbita maxima) by liquid-liquid extraction in aqueous two-phase system (ATPS) by discontinuous and continuous process, using perforated rotating disc contactor (PRDC) was studied. Experimental designs were used to choose the significant variables for discontinuous process, and polyethylene glycol (PEG) molar mass and concentration, citrate concentration, pH, NaCl concentration, dilution factor and total mass of the system, were the variables studied. The better results (partition coefficient 1.72, recovery 90.8% and purification factor 3.12) were obtained with following conditions: PEG molar mass of 20000 g/mol, pH 6.0, PEG concentration of 25% (w/w) and citrate concentration of 10% (w/w). In the pH 6.0 and temperature of 35°C the ascorbate oxidase showed their high activity values and the enzyme was stable in the pH range of 5.0 to 9.0 during 36 hours and temperatures up to 40°C for 1 hour. Experiments were also conducted to estimate the main kinetic and thermodynamic properties of ascorbate oxidase activity and stability, and this study revealed the interesting stability of this enzyme. The PRDC showed a good performance for extracting in continuous mode using aqueous two-phase systems. The best operating condition was selected in this study for the extraction of ascorbate oxidase in the PRDC, and it was obtained with PEG molar mass of 20000 g/mol, PEG concentration of 20% (w/w) and citrate concentration of 10% (w/w), the disc rotational speed of 80 rpm and dispersed phase flowrate of 2 mL/min. The results in mean values were: partition coefficient 3.36, recovery 152%, purification factor 2.31, mass transfer coefficient 0.045, separation efficiency 43.7% and Hold up 0.33. The experimental data showed the potential application of aqueous two-phase systems PEG/citrate to purification ascorbate oxidase using perforated rotating disc contactor. KEY-WORDS: Aqueous two-phase systems, Ascorbate oxidase, perforated rotating disc contactor, PEG/citrate
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OBJETIVOS Objetivo geral
Purificar a enzima ascorbato oxidase (E.C.1.10.3.3.) obtida de
Cucurbita maxima, pelo processo de extração líquido-líquido em sistema de
duas fases aquosas PEG/Citrato, de modo descontínuo e contínuo utilizando
coluna de discos perfurados rotativos.
Objetivos específicos
• Selecionar as variáveis que influenciam a purificação e determinar as
melhores condições do sistema de duas fases aquosas para a extração
descontínua da ascorbato oxidase em sistemas PEG/Citrato. Analisar as
variáveis (massa molar e concentração do polietileno glicol (PEG),
concentração de citrato, pH, concentração de NaCl, fator de diluição e
massa total do sistema) para selecionar o melhor resultado da combinação
das variáveis respostas (recuperação, aumento de pureza e coeficiente de
partição da enzima).
• Avaliar as propriedades físico-químicas da ascorbato oxidase, no extrato
enzimático e no pré-purificado por SDFA, em relação ao pH ótimo,
temperatura ótima, estabilidade ao pH e à temperatura.
• Analisar a cinética e a termodinâmica da ascorbato oxidase, bem como
estimar os seus parâmetros termodinâmicos e a inativação térmica da
enzima.
• Extrair a ascorbato oxidase em coluna de discos rotativos perfurados
(PRDC) utilizando SDFA em processo contínuo. Avaliar a melhor
composição do sistema e os parâmetros operacionais da coluna no
processo de purificação da ascorbato oxidase.
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INTRODUÇÃO
Os avanços na biotecnologia têm aberto numerosas possibilidades para
a produção em larga escala de diversas biomoléculas que são importantes
para as pesquisas, fármacos e aplicações industriais. O desenvolvimento de
técnicas e métodos para a separação e purificação de proteínas e outras
biomoléculas tem sido parâmetro importante para vários destes avanços na
indústria biotecnológica. Métodos tradicionais para purificar biomoléculas
envolvem muitos passos, tais como diálise, cromatografias de troca iônica e de
afinidade, entre outros. Todavia, a extração líquido-líquido é uma alternativa
interessante de purificação, desde que diversas etapas dos passos iniciais de
processamento possam ser combinadas em uma única operação (MAZZOLA et
al., 2008).
A extração líquido-líquido tem sido extensivamente estudada para
concentração e purificação de biomoléculas principalmente por causa das suas
vantagens intrínsecas, tais como eficiência, versatilidade e baixo custo
(PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005, CAVALCANTI et al., 2007; PORTO et al.,
2008). Sistemas de duas fases aquosas (SDFA) podem ser facilmente
aumentados de escala sem significativas mudanças na natureza ou eficiência
do processo. Além disso, a partição de biomoléculas e de moléculas do
polímero entre as fases é rápida, devido à ausência de uma fase sólida.
Poucos segundos são necessários para levar a maioria dos sistemas de duas
fases aquosas para o equilíbrio. Outro benefício é que as fases são
compatíveis com quase todas as proteínas conhecidas, mas a seletividade da
partição das proteínas ainda necessita ser melhor compreendida. Um maior
conhecimento sobre o comportamento das proteínas no sistema de duas fases
aquosas propiciará também a capacidade de estimar a partição da proteína
alvo, freqüentemente encontradas em uma mistura de proteínas heterogêneas
e complexas (SILVA; FRANCO, 2000).
O sistema de duas fases aquosas é formado pela mistura de dois ou
mais polímeros imiscíveis em ambiente aquoso. A separação das fases ocorre
acima de certas concentrações dos componentes das fases. Alternativamente,
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polímeros e sais podem ser usados para a formação dos sistemas de duas
fases aquosas (MAYERHOFF et al., 2004; PORTO et al., 2008). Os sistemas
PEG/sais tem sido introduzidos para a aplicação prática de separação de
proteínas em larga-escala, por causa da maior diferença na densidade entre as
fases, baixa viscosidade e menor custo, levando a uma maior rapidez na
separação quando comparada com os sistemas PEG/dextrana (MARCOS et
al., 2002). A aplicação industrial dos sistemas PEG/sais foi aumentada pela
viabilidade de separadores comerciais, os quais permitiram rápida separação
de proteínas de modo contínuo (SILVA; FRANCO, 2000).
O expressivo número de pesquisas relacionadas com a extração líquido-
líquido nos últimos 20 anos, impulsionou estudos mais aprofundados, de
caráter fenomenológico, relativos a equipamentos de extração. Após décadas
de trabalho para maior detalhamento dos fundamentos da extração líquido-
líquido, foi verificado crescimento considerável da aplicação dessa operação
unitária nas áreas da indústria petroquímica, metalúrgica e de processos
bioquímicos. Em seguida houve uma concentração de esforços para esclarecer
o comportamento de sistemas em equipamentos de extração. Entretanto o
comportamento da interface e o das gotas no interior do extrator ainda não é
bem compreendido (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).
Dada a importância do sistema de duas fases aquosas e dos
equipamentos de extração por contato diferencial utilizando SDFA, este
trabalho se concentrou no estudo da composição do sistema e das
características operacionais do equipamento para a purificação da ascorbato
oxidase.
O presente trabalho encontra-se dividido em capítulos redigidos sob a
forma de artigos, com exceção do Capítulo I que consiste em uma revisão
bibliográfica do tema abordado nesta tese.
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CAPITULO I REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. Ascorbato oxidase
O ácido ascórbico ou vitamina C foi inicialmente, isolado e purificado de
páprica, possivelmente devido à alta concentração deste ácido. O conteúdo de
ácido L-ascórbico alto é característico de tecidos vegetais, e o ascorbato é
reconhecido como uma das moléculas antioxidantes mais importantes, tanto no
metabolismo normal de plantas como no metabolismo de células animais
(GARCÍA-PINEDA et al., 2004).
A determinação e/ou monitoramento da vitamina C (ácido ascórbico),
em produtos comercializados e fármacos em geral, é de extrema importância.
O ácido ascórbico, presente em sucos de frutas naturais, oxida-se
rapidamente, e em sucos comercializados a oxidação desse ácido depende da
concentração e tipo de antioxidante utilizado, bem como das características da
embalagem e condições de armazenamento dos produtos (FATIBELLO-FILHO;
VIEIRA, 2002).
A ascorbato oxidase (AO) catalisa a oxidação reversível do ácido
ascórbico para ácido dehidroascórbico com a concomitante redução de quatro
elétrons do oxigênio para água. Esta reação está representada na Figura 1.1.
Figura 1.1: Reação catalisada pela enzima ascorbato oxidase.
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A reação enzimática pode ser facilmente detectada pela diminuição do
coeficiente de extinção do ácido L-ascórbico a 268nm (λ máx. na qual os
produtos da reação não absorvem) ou pelo consumo do oxigênio,
polarograficamente. Pequenas quantidades de peróxido de hidrogênio podem
ser produzidas como subproduto da reação, causando desnaturação
enzimática. Este fenômeno é denominado de reação de inativação
(CARVALHO et al., 1981).
A enzima ascorbato oxidase (EC 1.10.3.3) tem sido extraída de
diversos vegetais, tais como: melão, abóbora, pepino, uva, laranja, pimenta,
tomate, pimentão e carambola. Estudos de purificação, caracterização e
expressão gênica foram realizados, porém, sua função biológica ainda é pouco
conhecida. Sabe-se que extrações, feridas e outras condições de tensão ou
estresse da planta estão relacionados com a modificação dos níveis de ácido
ascórbico (GARCÍA-PINEDA et al., 2004).
Kato e Esaka (2000) propuseram que a AO pode ter um papel
importante no crescimento da planta, na divisão celular e na regulação da
expansão celular, talvez pelo controle dos processos de transporte através da
membrana. Também, a enzima pode ter uma função durante respostas de
estresse modificando os níveis de ácido ascórbico.
A ascorbato oxidase é uma enzima dimérica, contém cobre como
cofator e catalisa a redução de quatro elétrons de dois oxigênios para água,
usando preferivelmente a molécula do ácido ascórbico como substrato. Esta
enzima pertence à família das oxidases azuis multicobres que incluem lacases
(E.C.1.10.3.2) em plantas e microrganismos, e ceruloplasminas (E.C.1.16.3.1)
em animais (SANTAGOSTINI et al., 2004).
As oxidases azuis multicobres formam um subgrupo de cupro-
proteínas, que são classificadas de acordo com suas propriedades
espectroscópicas dos seus íons metálicos (Cu), dividindo-as em três grupos,
cobre tipo 1 ou T1, tipo 2 ou T2 e tipo 3 ou T3 (SAID; PIETRO, 2004). O cobre
T1 é responsável pela intensa coloração azul da AO, enquanto o cobre T2 pela
transferência de elétrons para o O2 (GUPTA et al., 2004). Dois íons de cobre
T3 são ligados através de uma ponte OH e acredita-se de atuar como
receptores de elétrons (MESSERSCHMIDT et al., 1992). Este último pode
ainda formar o arranjo trinuclear T2/T3 (SAID; PIETRO, 2004). AO de plantas
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são homodímeros com cada subunidade contendo um cobre Tipo T1 e um
T2/T3 arranjo trinuclear (MESSERSCHMIDT et al., 1992).
Figura 1.2: Estrutura da enzima ascorbato oxidase (Protein Data Bank /PDB: 1AOZ).
Ascorbato oxidase, isolada de plantas pertencentes à família
Cucurbitaceae, foi caracterizada quanto às propriedades físico-químicas, como
massa molar, ponto isoelétrico, pH ótimo e temperatura ótima para cada
espécie vegetal. Baseado em análise cristalográfica da ascorbato oxidase de
abobrinha (Cucurbita pepo medulosa), foi observado que todos os resíduos de
aminoácidos envolvidos na ligação com o cobre estão situados em quatro
regiões ricas em histidina, a qual exibe uma seqüência de notável homologia
com as oxidases multicobres (SUGINO et al., 2002).
A estrutura da ascorbato oxidase consiste de duas subunidades
idênticas com 552 resíduos de aminoácidos e formadas por três domínios,
predominantemente em estado β-conformacional e foram encontradas poucas
formas helicoidais (MESSERSCHMIDT et al., 1990). A enzima apresenta uma
molécula espectroscopicamente muito complexa porque cada monômero
contém 23 resíduos de tirosina e 14 resíduos de triptofano (DI VENERE et al.,
1998)
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A enzima AO extraída da Cucurbita maxima e da Cucurbita pepo
condensa possuem massa molar de 150 kDa (AMON; MARKAKIS, 1973; LEE;
DAWSON , 1979 ; CARVALHO et al., 1981) e a extraída da Cucurbita pepo
medulosa tem massa molar de 140 kDa (MARITANO et al., 1996). AO é
constituída de duas subunidades idênticas ligadas por duas pontes dissulfeto,
cada subunidade tem uma massa molar de 70 kDa (CASELLA et al., 1999;
SUGINO et al., 2002).
A atividade da AO de Cucurbita maxima demonstrou seguir a lei de
Michaelis-Menten, que depende da ligação com o ácido ascórbico e com o
oxigênio (CARVALHO et al., 1981). AO de C. maxima é considerada
relativamente resistente ao calor, pois sua atividade permaneceu quase
inalterada quando foi incubada a 0-40° C por 30 min, mas a atividade foi
completamente perdida após 1 min a 100°C (CARVALHO et al., 1981). A
ascorbato oxidase dimérica, extraída de pepino, demonstrou ser a forma mais
resistente à inativação térmica (AMON; MARKAKIS, 1973). Todavia, não foram
realizados até agora estudos termodinâmicos sistemáticos, com este sistema
enzimático.
Em virtude da alta seletividade e poder catalítico, as enzimas têm sido
muito empregadas em química analítica, bem como na medicina, agricultura,
tecnologia de alimentos e estudos ambientais. O emprego de enzimas
purificadas foi encontrado em diversos trabalhos, no entanto, há uma carência
de trabalhos que utilizem tecidos e/ou extratos vegetais. Embora o uso de
extratos brutos seja extremamente econômico e possua tempo de vida superior
às enzimas purificadas, estes apresentam certa desvantagem quanto ao seu
uso nos métodos analíticos devido a sua baixa seletividade (FATIBELLO-
FILHO; VIEIRA, 2002).
O Brasil tem uma grande variedade de vegetais que podem constituir
fontes inesgotáveis de enzimas para serem aplicadas nas mais diversas áreas
de conhecimento. Há uma tendência recente de utilização de tecidos vegetais
e/ou extratos brutos, como fonte de enzimas, para confecção de biossensores
e nos procedimentos enzimáticos de análise (JAWAHEER et al., 2003;
CAMPANELLA et al., 2004). AO tem sido usada na composição de
biossensores bem como nas análises clinicas e alimentares do ácido ascórbico
(SHLEEV et al., 2005).
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1.2. Purificação de proteínas
A purificação de produtos biotecnológicos, produzidos por células
microbianas, animais ou vegetais, constitui a etapa complexa do processo,
dada as variadas características dos meios e das biomoléculas de interesse,
como as proteínas, aminoácidos, antibióticos, polissacarídeos e hormônios. Em
resultado à variedade de características, as etapas de purificação são tão ou
mais desafiantes que o estudo de produção, pois não há processos de
purificação de aplicação geral. No entanto, a purificação pode ser dividida em
quatro etapas genéricas: separação de células; concentração e/ou purificação
de baixa resolução; purificação de alta resolução; e operações para
acondicionamento final do produto (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).
O impulso nas pesquisas de desenvolvimento, na área de
biosseparação, tem sido limitado pela dificuldade e complexidade dos
processos aplicados aos produtos farmacêuticos e biológicos. Cerca de 50 a
90% do custo de produção para um produto biológico reside na estratégia de
purificação. Existe a necessidade de se obter técnicas de biosseparação em
larga escala que sejam: eficientes, econômicas, que atinjam altos graus de
recuperação e pureza, mantendo a atividade biológica da molécula. Uma
promissora técnica de extração e purificação, que se enquadra nestes critérios,
e já vem sendo utilizada industrialmente, envolve a partição de biomoléculas
entre duas ou mais fases imiscíveis nos sistemas aquosos (DIAMOND; HSU,
1992, DYR; SUTTNAR, 1997).
A recuperação de produtos biotecnológicos é essencial em muitos
processos industriais, e a dificuldade nos processos de recuperação depende
significativamente da natureza do produto. Com isso, sob o ponto de vista
econômico, o desenvolvimento e otimização de processos de recuperação e
purificação de proteínas passaram a ser de vital importância na produção
industrial dessas biomoléculas (SEADER; HENLEY, 1998).
A definição de processo de purificação depende da aplicação final da
molécula-alvo, suas características físico-químicas, bem como aquelas das
impurezas. Há produtos (enzimas industriais) cuja aplicação não requer
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elevado grau de pureza, de modo que operações cromatográficas não são
necessárias e, por vezes, a simples concentração do meio é suficiente para a
comercialização e o uso. Produtos farmacêuticos (diagnósticos e terapêuticos)
são os que requerem maior grau de pureza e, portanto, a complexidade do
processo de purificação é elevada (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).
1.3. Sistema de Duas Fases Aquosas (SDFA)
Os sistemas de duas fases aquosas foram inicialmente descritos na
literatura por Beijerick (1896), quando ele descobriu que ao se misturar
gelatina, ágar e água, em certas concentrações formava um sistema de duas
fases, sendo a fase superior rica em gelatina e a fase inferior rica em ágar.
Posteriormente, nos anos 50, Per-Aka Albertsson descobriu que o polietileno
glicol (PEG), fosfato de potássio e água, assim como PEG, dextrana e água
formavam sistemas de duas fases. Os sistemas PEG/dextrana/água e
PEG/sal/água têm sido, desde então, os mais freqüentemente investigados e
utilizados para purificação de um grande número de biomoléculas (DIAMOND;
HSU, 1992; COSTA et al., 1998; COSTA et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2001).
Os sistemas de duas fases aquosas são geralmente formados por uma
solução aquosa de dois polímeros hidrófilos, ou de um polímero com
determinados sais. Acima da concentração crítica destes componentes ocorre
espontaneamente a separação de fases, predominando um ou outro
componente em cada uma das duas fases resultantes (TUBIO; NERLI; PICÒ,
2004).
Uma das características importantes dos sistemas de duas fases
aquosas é sua composição de cerca de 85-99% do seu conteúdo em água, o
que permite a partição de biomoléculas e de partículas celulares em condições
não desnaturantes. As propriedades físicas dos sistemas bifásicos aquosos
podem ser alteradas por manipulação de sua concentração e composição dos
polímeros e sais. Deste modo, a partição de moléculas e de partículas
biológicas pode ser explorada para obtenção de separações, que de outro
modo seriam difíceis ou mesmo impossíveis de serem realizadas (GAVASANE;
GAIKAR, 2003).
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Os sistemas bifásicos aquosos têm um grande potencial para a
eficiente separação e baixo custo das proteínas que podem ser difíceis de
separar em grande escala. Estes sistemas têm vantagens importantes em sua
habilidade de extrair pequenos materiais particulados (extração direta do meio
fermentado) e de obter grandes volumes em uma modalidade contínua com
tempo de contato curto. Entretanto, os recentes avanços em obter elevados
fatores de purificação para a separação da proteína alvo de seus
contaminantes usando SDFAs, foram bem sucedidos na escala de laboratório e
em operações industriais. Isto é, em parte, devido ao conhecimento da
engenharia básica e do entendimento dos sistemas (MERCHUK et al., 1998).
As ótimas condições para a recuperação e altos fatores de purificação
têm sido obtidas para várias proteínas que foram estudadas. Isto é comumente
feito seguindo um procedimento semi-empírico que inclui estudos
experimentais dos efeitos das variáveis que influenciam o sistema. Como um
exemplo típico tem-se a separação e purificação da proteína taumatina, que foi
purificada em 20 vezes e recuperação de 90-95% alcançados em um único
passo usando SDFA (CASCONE et al., 1991). Isto também foi realizado para
anticorpos monoclonais (NIELSEN; ASENJO, 1991).
A técnica de separação em sistemas de duas fases aquosas é
aconselhável para purificação de proteínas em larga escala (“scale-up”) porque
possibilita separação seletiva, uma baixa tensão superficial, biocompatibilidade,
bem como boa relação custo-benefício. Quando comparada com outras
técnicas de recuperação, o SDFA apresenta diversas vantagens, como:
operação rápida e contínua, altos rendimentos, baixo custo dos materiais,
reciclagem dos polímeros e minimização da desnaturação de proteínas
(CASCONE et al., 1991).
O desenvolvimento de extrações líquido-líquido utilizando sistema
bifásico aquoso em grande escala está muito limitado aos sistemas de
PEG/dextrana e PEG/sal. Estes possuem propriedades físicas favoráveis,
especialmente no que se refere à viscosidade e à diferença de densidade entre
as fases. Esta escolha é bastante influenciada por questões a que os
processos de produção têm que obedecer, tanto o PEG como a dextrana são
substâncias atóxicas e não causam distúrbios ao ambiente (SARMENTO et al.,
1994).
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Nos últimos anos, o interesse pela extração em sistema de duas fases
aquosas tem aumentado devido a sua aplicação na separação e purificação de
proteínas e enzimas tais como: purificação de ricina B (ZHANG et al., 2005),
xilose redutase (MAYERHOFF et al., 2004), fosfolipase D (TEOTIA; GUPTA,
2004); purificação de corantes: ficoeritrina B (BENAVIDES; RITO-
PALOMARES, 2004), luteína (CISNEROS et al., 2004), policetideos
(ESMANHOTO; KILIKIAN, 2004) e toxina alfa de Clostridium perfringens
(CAVALCANTI et al., 2007). Todavia, apesar da importância das técnicas de
sistemas de duas fases aquosas para o futuro das tecnologias de
biosseparação, pouco é conhecido sobre as interações básicas moleculares da
partição protéica (LIN et al., 2003, TUBIO; NERLI; PICÒ, 2004).
Outro aspecto importante é que para produtos que exigem elevado grau
de pureza, a extração em SDFA não é suficiente e, nesses casos, será
sucedida por uma ou mais etapas cromatográficas. Assim o sistema de duas
fases aquosas é considerado uma etapa de purificação parcial ou de baixa
resolução (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).
1.4. Polietileno glicol O polietileno glicol (PEG) é um composto de grande importância para as
áreas biomédicas e de biomateriais. É produzido mundialmente em grandes
quantidades e com massas molares variando de poucas centenas a milhares
de Daltons. A designação PEG é usada para compostos de baixa massa molar
(abaixo 20.000g/mol) e a designação PEO poli (óxido de etileno) é restrito para
compostos de altas massas molares (maiores que 20.000g/mol). Os PEGs com
massas molares menores que 1.000g/mol são fornecidos na forma de soluções
incolores estáveis ou pastas. Os polímeros de massas molares elevadas,
acima de 1.000g/mol, são encontrados na forma de pó ou flocos brancos. Pode
ser estocado à temperatura ambiente, embora a 4°C, a ocorrência de oxidação
em soluções seja retardada (HARRIS, 1992).
A utilização do PEG é de grande interesse na biotecnologia
principalmente por excluir, em ambiente aquoso, outros polímeros de sua
vizinhança, não se solubilizando com eles. Por serem compostos
biodegradáveis e atóxicos, o descarte de PEG não é problemático para o meio
ambiente. O PEG possui uma variedade de propriedades pertinentes para
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aplicações biomédicas, são elas: insolubilidade em água a elevadas
temperaturas, forma complexos com cátions metálicos, alta mobilidade com
grande poder de volume excluído em água, agente precipitante de proteínas e
ácidos nucléicos. Vale ressaltar que o PEG foi aprovado para consumo interno
pelo FDA (Food and Drug Administration) (LI; KAO, 2003).
1.5. Fatores que influenciam o sistema de duas fases aquosas.
A aplicação biotecnológica do SDFA é influenciada pela habilidade de
desenvolver modelos e correlações que permitam compreender como ocorre a
interação entre as propriedades físico-químicas das proteínas e das fases do
polímero e do sal na partição nestes sistemas (OLIVEIRA–NAPPA et al., 2004).
São diversos os fatores que influenciam o sistema de duas fases
aquosas e a seleção das condições adequadas para a extração da proteína de
interesse ainda é empírica. Os fatores se dividem em duas categorias, aqueles
inerentes ao próprio sistema (tipo e concentração do polímero, tipo e
concentração do sal, pH, etc.) e os fatores inerentes à biomolécula (massa
molar, hidrofobicidade, conformação e carga) (OLIVEIRA et al., 2001;
PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).
1.5.1. Massa molar e concentração do polímero
Em geral, o aumento da massa molar do polímero diminui a partição do
material biológico para a fase rica em polímero. Quanto maior a massa molar
do polímero, menor é o volume de solvente disponível, o que implicaria em
uma diminuição da solubilização das proteínas hidrofílicas na fase rica em
polímero (ALBERTSSON, 1986).
O efeito da massa molar dos polímeros por sua vez depende da massa
molar da biomolécula a ser separada. No caso das proteínas, aquelas com
massas molares maiores são mais influenciadas pelas mudanças na massa
molar dos polímeros que as proteínas com pequena massa molar. Segundo
Schmidt et al. (1994) o PEG é capaz de excluir as proteínas sem desnaturação
de acordo com o aumento da sua massa molar (“Efeito do volume excluído”).
Este fenômeno de volume excluído observado com freqüência em sistemas
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PEG/sal, tem sido visto também em sistemas polímero/polímero, nos quais o
PEG faz parte de uma das fases (TUBIO; NERLI; PICÓ, 2004).
Além desse efeito, a massa molar do PEG participa da interação hidrofóbica,
onde aumentando a massa molar há um aumento na capacidade de interação
com proteínas hidrofóbicas. Aparentemente, isto é Independente do volume
excluído, pois PEG com grande massa molar possui a capacidade de formar
ligações intramolecular, assim adquirindo uma conformação mais compacta
(TUBIO; NERLI; PICÓ, 2004; FARRUGIA; NERLI; PICÓ, 2003).
Com relação à concentração do polímero, tem sido demonstrado que o
aumento da concentração do PEG causa um decréscimo da partição das
proteínas, mas este comportamento não é regra geral, depende do tipo do
sistema (SCHIMIDT et al., 1994).
Próximo ao ponto crítico do sistema, que representa a concentração
mínima para a formação de sistemas de duas fases aquosas, moléculas como
proteínas particionam quase igualmente entre as fases. Se a concentração do
polímero é aumentada, ou seja, a composição das fases do sistema desvia
mais do ponto crítico, a partição da proteína terá preferência por uma das fases
dependendo das características da biomolécula (DIAMOND; HSU, 1992). A
concentração do polímero tem sido relatada como um dos fatores que
influenciam a partição de proteínas em sistemas de duas fases aquosas,
principalmente em sistemas PEG/sal (CASCONE et al., 1991). Por isto tem
sido usada como variável de estudo (ESMANHOTO; KILIKIAN, 2004;
CISNEIROS et al., 2004; BENAVIDES; RITO–PALOMARES, 2004).
A viscosidade das fases também aumenta com o aumento da
concentração do polímero e isto pode influenciar a partição da proteína alvo
(ASENJO, 1990; ZHI et al., 2005; SHIBUSAWA et al 2006). A concentração do
polímero a ser usada para a separação de fases depende da massa molar do
mesmo, tem sido observado que o aumento da massa molar do polímero leva
ao uso de baixas concentrações do polímero (DIAMOND; HSU, 1992).
1.5.2. pH
O pH influencia na participação de biomoléculas carregadas
eletricamente, como por exemplo, as proteínas em sistemas de duas fases
13
aquosas, pois a dissociação dos grupos ionizáveis dessas moléculas altera as
cargas de sua superfície e do seu coeficiente de partição (COSTA et al., 1998).
A separação de moléculas carregadas em sistemas de duas fases aquosas
contendo sais tamponantes depende da carga líquida do biomaterial, em
função do pH da solução.
Mudanças no pH podem também induzir mudanças conformacionais na
estrutura das proteínas, causando mudanças em seus comportamentos de
separação. As partições das proteínas e enzimas são dependentes dos seus
pontos isoelétricos (pIs). O ponto isoelétrico pI é o valor de pH no qual a
proteína tem igual número de cargas positivas e negativas. Para valores de pH
acima do ponto isoelétrico os resíduos de aminoácidos expostos na superfície
da proteína se carregam negativamente, tornando a proteína carregada
negativamente. Situação inversa ocorre quando o pH é abaixo do pI (GAUTAM;
SIMON, 2006). Como regra geral, as proteínas carregadas mais negativamente
(nos casos em que o pH é superior ao ponto isoelétrico) têm maior afinidade
pela fase superior que é rica em PEG (ENGEL et al., 2000). Além disso, um
aumento na concentração do íon mais carregado negativamente pode
aumentar a força de repulsão entre a fase inferior rica em sal e a proteína, Os
sais causam mudança na carga eletrostática do SDFA e influenciam na
distribuição de aminoácidos e proteínas carregadas (SHANG et al., 2004).
O aumento do coeficiente de partição relacionado com o aumento do pH
tem sido observado para várias proteínas e a manipulação do pH tem sido
explorada para obter uma separação diferencial de proteínas em uma
variedade de esquemas de purificação. A influência do pH na separação de
várias proteínas puras e de homogeneizados de leveduras tem sido estudada
por Huddleston et al. (1991).
A maioria das proteínas, com ponto isoelétrico na região ácida, são
carregadas negativamente na região de pH neutra, por isso se direcionam para
a fase superior e o coeficiente de partição aumenta ao redor do pH 7, aumento
assim a concentração do íon fosfato. Este fenômeno foi observado por Han e
Lee (1997), quando estudaram a partição de albumina de soro bovino em
SDFA PEG/fosfato, como modelo. Eles observaram também que a protease
neutra produzida por Bacillus subtilis, se direcionou para a fase sal nos
14
sistemas com alta concentração de fosfato por causa da sua carga positiva a
pH neutro (HAN; LEE, 1997).
1.5.3. Adição de sais
A adição de sais, mesmo que em concentrações milimolares, influencia
fortemente a partição de materiais eletricamente carregados. Embora os sais
se distribuam quase que igualmente entre as fases, existem pequenas
diferenças nos coeficientes de partição de diferentes sais, o que significa que
diferentes íons possuem diferentes afinidades pelas fases, criando uma
diferença de potencial elétrico entre as fases, que por sua vez direciona a
partição de materiais biológicos carregados (SARUBBO, 2000).
O deslocamento da curva binodal da origem foi observado com a
adição de NaCl. Todavia o aumento da concentração de NaCl não causa
grande diferença na forma da curva binodal (MARCOS et al., 1999). Diversos
autores (ASENJO, 1990; SCHIMIDT et al., 1994; GÜNDÜZ; KORKMAZ, 2000)
observaram que a adição de NaCl em sistemas PEG/sal aumenta a diferença
na hidrofobicidade das fases, promovendo a partição de proteínas hidrofóbicas
para a fase superior do sistema, aumentando assim a resolução do sistema.
Isto significa que a diferença no coeficiente de partição aumenta com a
concentração de NaCl (MARCOS et al., 2002).
Em sistemas PEG/sal, a adição de outros sais interfere no coeficiente de
partição, pois, existe uma partição desigual entre eles, formando uma diferença
de potencial elétrico. Além disso, íons mais hidrofóbicos se direcionam para a
fase PEG, carregando proteínas igualmente hidrofóbicas e cátions induzem a
transferência de proteínas para a fase PEG, como observado por Farrugia,
Nerli e Picò (2004). Os autores ressaltaram a importância da concentração de
sais no direcionamento de proteínas como albumina bovina sérica,
ovoalbumina, lisozima, tripsina para a fase PEG. Observaram também que um
aumento na concentração dos sais promove uma diminuição do efeito de
volume excluído, devido à perda de água ligada ao polímero. Vale salientar que
estes fenômenos foram visto em baixas concentrações de sais, pois existe o
efeito de saturação.
15
1.5.4. Temperatura
A influência da temperatura em sistemas de duas fases aquosas é
bastante complexa por causa de seu efeito na composição das fases em
equilíbrio, assim como na alteração da estrutura da biomolécula, com
possibilidade de desnaturação. Alguns trabalhos (FORCINITI et al., 1991;
DIAMOND; HSU, 1992; SARUBBO et al., 2004) relatam aumento do coeficiente
de partição com a temperatura e outros afirmam que não há relação entre
essas duas variáveis (JOHANSSON et al., 1973; TJERNELD et al., 1985).
Essas contradições apresentadas na literatura mostram a necessidade de
estudos mais aprofundados para se esclarecer o seu efeito na partição e a
determinação dos seus parâmetros termodinâmicos.
1.6. Sistemas de duas fases aquosas (SDFA)
Os sistemas de duas fases aquosas formados por PEG/sais de fosfato
têm sido amplamente utilizados para extração de proteínas diversas
(SRINIVAS et al., 1999; GÜNDÜZ; KORKMAZ, 2000; MAYERHOFF et al.,
2004; CAVALCANTI et al., 2007), mas outros sais estão sendo utilizados para
a composição dos sistemas, tais como, sulfato de amônio (TRINDADE et al.,
2005) e citrato de sódio (OLIVEIRA et al., 2001; MARCOS et al., 2002).
O trabalho realizado por Vernau e Kula (1990) utilizando PEG e citrato
para extração de R-Oxinitrilase apresentou resultados interessantes. A
utilização do citrato no trabalho foi justificada por apresentar vantagens em
relação ao uso de outros sais equivalentes, como o fosfato e o sulfato, por
apresentar alta seletividade e por razões econômicas e ambientais. Avaliando
os resultados obtidos por Vernau e Kula (1990) e por Oliveira et al. (2001)
pode-se concluir que o sistema de duas fases aquosas envolvendo um
polímero, o PEG, e um sal, como o citrato de sódio, pode ser aplicado para a
extração ou pré-purificação de proteínas. O citrato é um sal biodegradável e
pode ser reciclado ou pode ser descarregado em plantas de tratamento de
água com resíduos biológicos. Uma desvantagem que deve ser considerada é
16
a atividade quelante do citrato de sódio, que pode interferir em reações que
envolvam íons metálicos durante o processo extrativo.
O sistema de duas fases aquosas utilizando PEG/citrato vem sendo
utilizado como uma alternativa para a purificação de biomoléculas, que
possuem aplicação na indústria de medicamentos. Marcos et al. (1999 e 2002)
utilizaram o sistema PEG/citrato e purificaram a enzima Penicilina acilase,
produzida por Escherichia coli, que na indústria farmacêutica participa na
produção de antibióticos β-lactâmicos semi-sintéticos, tais como ampicilina e
amoxilina.
Vários sistemas são utilizados atualmete como PEG-sais e outros
compostos de dextrana, amido, e derivados celulósicos, devido à vantagem de
serem biodegradáveis. Sarubbo (2000) e Oliveira et al. (2002) estudaram um
novo sistema de duas fases aquosas formado por PEG e goma de cajueiro
(POLICAJU) a qual mostrou potencial utilização como polímero para formação
de sistemas aquosos. Os autores afirmam que a disponibilidade de um
polímero barato para a partição de fases favorece economicamente o uso
conjunto com PEG na separação de biomoléculas.
1.7. Equipamentos para extração utilizando sistemas de duas fases aquosas
Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas
funções: i) estabelecer o contato entre as duas fases líquidas presentes no
sistema, em geral pela dispersão de uma fase na outra, com o objetivo de
possibilitar a transferência de massa; e ii) separar os dois líquidos depois da
extração. A mistura de dois líquidos consiste geralmente em um conjunto de
gotas de uma fase dispersa no contínuo da outra (PESSOA-JR; KILIKIAN,
2005).
A escolha de um extrator é função da natureza dos produtos e das
características físicas e químicas do sistema em estudo, além de ser função do
desempenho do equipamento, considerando-se as condições de extração.
Para o desenvolvimento de equipamentos de extração líquido-líquido, deve-se
avaliar além do sistema de trabalho, os dados de equilíbrio e de transferência
de massas nas temperaturas de interesse (RABELO, 1999).
17
A utilização de extratores verticais nos processos de extração líquido-
líquido é justificada pelo fato desses equipamentos ocuparem pequena área,
terem boa eficiência de separação e apresentarem facilidades de operação e
manutenção. Além disso, nesses equipamentos, os processos de transferência
de massa e separação das fases são mais rápidos, e o sistema pode atingir o
equilíbrio, ou aproxima-se dele, em um período de tempo menor do que em
outros tipos de equipamentos (PORTO et al., 2000).
Existem vários tipos de equipamento ou colunas descritos na literatura
sendo utilizados com o sistema de duas fases aquosas, tais como: coluna
spray (SRINIVAS et al., 2002), coluna graesser (GIRALDO-ZUNINGA et al,
2005 e 2006), coluna empacotada (IGARASHI et al., 2004), York-scheibel
(JAPARABAD et al.,1992), coluna PRDC (TAMBOURGI; PEREIRA, 1993;
PORTO et al., 2000; SARUBBO et al., 2003; CUNHA et al., 2003; PORTO et
al., 2004; SARUBBO et al., 2004).
Em todos eles é de fundamental importância o estudo da transferência
de massa, fenômeno definido como o transporte de um constituinte de uma
região de maior concentração para outra de menor concentração, até que o
sistema entre em equilíbrio (SARUBBO, 2000). O estudo da transferência de
massa visa avaliar o quanto o sistema se aproxima do equilíbrio. Com isso
podemos definir um limite ideal de operação para o extrator.
Para avaliar a transferência de massa é necessário compreender o
funcionamento das gotas, pois a mistura de dois líquidos consiste geralmente
em um conjunto de gotas, que por apresentarem pequeno diâmetro garantem
elevada área de contato entre as fases, podendo possibilitar boa transferência
de massa. Mas se o tamanho das gotas for muito pequeno podem ocorrer
dificuldades para posterior decantação e separação das duas fases (PESSOA-
JR; KILIKIAN, 2005).
Nos equipamentos de extração líquido-líquido, em sistema
contracorrente, a transferência de massa ocorre numa dispersão de gotas que
fluem pela gravidade através da fase líquida contínua, sendo a coluna de
discos rotativos um exemplo destes equipamentos (SARUBBO, 2000).
Num processo de extração, existem diversos fatores que influenciam o
desempenho do extrator, principalmente em escala industrial. Durante o
processo vários fenômenos acontecem no interior do extrator, alguns dos quais
18
prejudicam a transferência de massa. Os mais conhecidos estão definidos
abaixo:
• “Hold up”: é a fração retida da fase dispersa, que é a razão do volume
da fase dispersa pelo volume total do equipamento;
• Inundação: quando as condições de operação na coluna fazem com
que seja impossível o escoamento em contracorrente, e uma fase
se dispersa na outra. Nesta situação as correntes entram e saem
da coluna numa mesma extremidade;
• “Backmixing" (mistura axial): é o retorno axial da fase dispersa. A fase
dispersa escoa em sentido oposto ao esperado. Ele faz com que
o gradiente de concentração, que é a força motriz da
transferência de massa na coluna, diminua, prejudicando a taxa
de transferência de massa e a eficiência de separação;
• “Backflow”: é o retorno axial da fase contínua. Ocorre quando a fase
contínua é carregada na direção oposta à esperada.
1.7.1. Coluna de discos perfurados rotativos (PRDC)
Com a finalidade de melhorar a transferência de massa, aumentando a
área interfacial entre as fases e diminuindo o tamanho das gotas tem-se
recorrido a colunas mecanicamente agitadas. Entre esses tipos de coluna
estão as colunas de discos rotativos (RDC), que foram primeiro sugeridas por
Reman em 1951. A coluna de disco rotativo é um equipamento utilizado para
extração contínua em contracorrente.
Em 1971, Pope e Shah apresentaram a coluna de discos perfurados
rotativos (PRDC) que era similar à coluna de discos rotativos proposta
anteriormente por Reman, com a diferença nas perfurações nos discos. Esta
modificação promoveu um aumento nas taxas de transferência de massa e na
eficiência da coluna como foi relatado pelos autores. Desde então a PRDC
(Figura 1.3) tem sido usada na extração líquido-líquido.
19
Figura 1.3: coluna de discos perfurados rotativos em operação (a), e em (b)
vista frontal da coluna com mais detalhes, onde se pode observar o eixo com os discos e as bombas de alimentação, a alimentação da fase leve e drenagem da fase pesada será realizada pela parte inferior da coluna, e pelo topo da coluna ocorreu a alimentação da fase pesada e drenagem da fase leve.
Tambourgi e Pereira (1993), utilizando o sistema ácido acético-butanol-
água, relataram os resultados obtidos com uma coluna PRDC, variando os
espaçamentos e o número de discos, bem como a velocidade de rotação. Os
resultados obtidos demonstraram que o número de discos influencia a
eficiência de separação, tendo sido observado maior eficiência de separação
para 7 discos do que para 5 discos testados. Segundo os autores, este
fenômeno é devido ao fato de que elevado grau de agitação causa maior área
interfacial refletindo num maior valor de coeficiente de transferência de massa.
Resultados semelhantes foram obtidos por Carneiro-Da-Cunha et al. (1994),
que utilizaram uma coluna PRDC para extração de cutinase recombinante com
sistemas micelares, obtendo um rendimento de extração 78% em
proteína.Porto et al. (1997) utilizando uma coluna PRDC para extração do
citocromo b5 recombinante com sistema PEG-fosfato, obtiveram um
rendimento de 75% em proteína.
Coimbra et al. (1998) estudaram a fração retida da fase dispersa (“hold
up”) em uma coluna PRDC com sistema PEG-fosfato. Porto et al. (2000)
avaliaram o hold up para albumina de soro bovino em uma coluna PRDC com
sistema PEG-fosfato. Sarubbo et al. (2003) utilizaram um novo sistema de duas
(B)(A)
20
fases aquosas PEG-POLICAJU em uma coluna PRDC para extração de
albumina de soro bovino.
Porto et al. (2004) avaliaram a transferência de massa e eficiência de
separação para a enzima ascorbato oxidase em PRDC com sistema PEG-
fosfato. Sarubbo et al. (2004) estudaram a eficiência de separação da coluna
PRDC utilizando sistema de duas fases aquosas PEG-POLICAJU para
extração de albumina de soro bovino, e obtiveram uma eficiência de separação
de 96%.
1.8. Aplicação de planejamentos experimentais em SDFA
A separação das proteínas em duas fases depende da natureza do
polímero e da sua massa molar, concentração do polímero e do sal,
composição iônica e força, e pH do sistema, juntos com o tamanho, carga e
hidrofobicidade da molécula, que são as principais variáveis que interferem
com o coeficiente de partição. As variáveis e mecanismos que causam a
distribuição desigual de proteínas entre as fases são pouco conhecidos, mas
regras empíricas têm sido desenvolvidas. A utilização de planejamentos
experimentais é uma ótima ferramenta para se conhecer os principais fatores
relacionados com cada tipo de extração e tipo de proteína que se quer separar.
Costa et al. (2000) avaliaram a influência de 5 variáveis (pH, massa
molar do PEG e concentração de PEG, concentração de fosfato e de NaCl) na
partição do complexo xilanolítico em SDFA, usando um planejamento
experimental 25. A análise estatística dos resultados mostrou que as variáveis
massa molar do PEG, concentração de PEG e concentração de NaCl
exerceram um efeito significativo sobre o valor do coeficiente de partição.
Marcos et al. (2002) otimizaram a purificação da penicilina acilase
utilizando o sistema PEG/citrato de sódio com o auxílio de um planejamento
experimental fatorial 23 , onde as variáveis estudadas foram as concentrações
de PEG com massa molar 3350 (g/mol), citrato de sódio e NaCl.
Mayerhoff et al. (2004) utilizaram um planejamento experimental 24 para
avaliar a influência das variáveis massa molar do PEG, concentração do PEG,
concentração de fosfato e concentração de NaCl, na extração de xilose
redutase utilizando sistemas de duas fases aquosas.
21
A elaboração de planejamentos experimentais tem sido de fundamental
importância nestes estudos, pois reduziu o número de experimentos
necessários, selecionando as principais variáveis que interferem
significativamente no SDFA e ainda indicam os efeitos das variáveis e as
interações entre elas.
A utilização de um planejamento estatístico para avaliar a extração da
toxina alfa de Clostridium perfringens em uma coluna de disco perfurado
rotativo foi recentemente relatada na literatura (CAVALCANTI et al, 2007). Esta
ferramenta já provou ser eficiente em sistema descontínuo, e também auxiliou
no estudo da aplicação da PRDC para extração contínua de biomoléculas com
sistema de duas fases aquosas (PEG/sais).
22
CAPITULO II Sistemas de duas fases aquosas PEG/Citrato: Estudo das variáveis que influenciam a partição e purificação da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima
Tatiana Souza Portoa,b, Camila Souza Portob, Maria Taciana Holanda
Cavalcantia,b, Benício de Barros Netoc, José Luiz Lima-Filhob, Ana Lúcia
Figueiredo Portob,d, Adalberto Pessoa-Jra*
aDepartamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica /FCF,
Universidade de São Paulo; bLaboratório de Imunopatologia Keizo Asami
(LIKA), UFPE; cDepartamento de Química Fundamental, UFPE; dDepartamento
de Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE.
Endereço do autor para correspondência: Adalberto Pessoa Júnior Av. Prof. Lineu Prestes, 580 – Bloco16 CEP: 05508-950, São Paulo, SP, Brasil. Tel: (11) 3091-3710 Fax: (11) 3094-3694 e-mail: [email protected]
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Journal of
Chromatography B.
Parte dos resultados foram apresentados na forma de resumo na X
Semana Farmacêutica de Ciência e Tecnologia da USP
23
2.1. INTRODUÇÃO
A ascorbato oxidase é a enzima utilizada para determinar o conteúdo de
ácido ascórbico na indústria farmacêutica, na alimentícia (suco de frutas,
vinhos, etc.) e nas análises clínicas (FATIBELLO-FILHO; VIEIRA, 2002;
SHLEEV et al., 2005), sendo esta enzima isolada de plantas, principalmente as
pertencentes à família Cucurbitaceae (SUGINO et al., 2002).
As técnicas utilizadas atualmente para purificação dessa enzima fazem
com que o seu custo de produção seja elevado. Com isso, o desenvolvimento
de processos alternativos e com potencial para redução de custos é
interessante. A aplicação do sistema de duas fases aquosas (SDFA) é
proposta como alternativa para extração e purificação da ascorbato oxidase,
pois permite a separação e análise de biomoléculas. Esta técnica é
aconselhável para purificação em larga escala pela possibilidade de partição
seletiva com altas recuperações, além de apresentar uma boa relação custo-
benefício (SILVA; FRANCO, 2000; PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005; MAZZOLA et
al., 2008).
Diferentes parâmetros influenciam o sistema de duas fases aquosas: (i)
a massa molar do PEG – a forma das moléculas de PEG que poderia ser
capaz de distribuir as biomoléculas, quanto maior for a massa molar do PEG,
maior a viscosidade e maior dificuldade para separação e equilíbrio das fases;
(ii) concentração de polímero e de sais – interferência no diagrama de fases;
(iii) pH – determina a hidrofobicidade e hidrofilicidade das biomoléculas,
mudando o seu comportamento de partição. Outros fatores também
influenciam os sistemas aquosos e o comportamento de partição das
biomoléculas, são eles os fenômenos de salt-in, salt-out, densidade, interações
bioespecíficas (afinidade ou repulsão), e temperatura (MAZZOLA et al., 2008).
Diversos autores estudaram as características de sistemas PEG/sais
para a extração de diferentes biomoléculas (MARCOS et al., 2002;
CAVALCANTI et al., 2006; PORTO et al., 2008). Costa et al. (1998)
investigaram a partição de xilanase, utilizando uma ferramenta estatística, com
o objetivo de identificar os fatores chave que governavam a partição da enzima.
Eles avaliaram cinco fatores ou variáveis (concentração e massa molar do
24
PEG, concentração de fosfato, pH e concentração de NaCl) e conseguiram
identificar quais as principais influências e seus efeitos.
A análise estatística dos experimentos é uma ferramenta
frequentemente utilizada para otimização e controle dos processos envolvendo
SDFA. É um método adequado para estudar o efeito das variáveis envolvidas
no processo de purificação, porque é capaz de estimar seus efeitos
significativos nas respostas de interesse, bem como as suas possíveis
interações (BALASUBRAMANIAM et al., 2003; PORTO et al., 2007).
O objetivo deste trabalho foi identificar as variáveis que influenciam a
partição e purificação da ascorbato oxidase, e utilizar estas variáveis para o
estudo de purificação da enzima em SDFA (PEG/citrato).
2.2. MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1. Ascorbato oxidase
A ascorbato oxidase (E.C.1.10.3.3.) foi extraída da abóbora Cucurbita
maxima, conhecida regionalmente no nordeste, como jerimum, variedade
“jerimum caboclo”.
2.2.2. Preparo do Extrato Enzimático As abóboras foram descascadas a uma profundidade de
aproximadamente 3mm. Ao tecido foi adicionado tampão citrato/fosfato 0,1M,
pH 6,0, mantendo a relação de 1g de tecido por 1,5mL de tampão. Em seguida
foi realizada a homogeneização do extrato com o auxílio de um processador de
alimentos, por 5 min. Após a centrifugação do homogeneizado a 13.000xg por
10 min a 0-4°C, o precipitado foi desprezado, e o sobrenadante foi denominado
extrato bruto, que foi armazenado a -20°C. Com a finalidade de minimizar toda
a variação da quantidade de AO no extrato bruto, todos os experimentos foram
realizados usando sempre o mesmo grupo das frutas colhidas imediatamente
antes do seu amadurecimento.
25
2.2.3. Preparo dos sistemas de duas fases aquosas para os estudos de partição da ascorbato oxidase em PEG/Citrato.
Os parâmetros de extração estudados foram: massa molar e
concentração do PEG, pH, concentração do citrato, massa total do sistema,
fator de diluição do extrato enzimático e adição de NaCl na extração da
ascorbato oxidase do extrato bruto obtidos de Cucurbita maxima. Os resultados
obtidos desse estudo foram utilizados para definir quais foram as variáveis
significativas no processo de purificação da ascorbato oxidase.
Para a extração da ascorbato oxidase, os sistemas foram preparados
inicialmente com PEG e sal citrato de sódio (Na3C6H6O7. 2H2O) acrescido de
ácido cítrico para o ajuste do pH. A variação na proporção entre o citrato de
sódio e o ácido cítrico foi o que definiu o valor do pH de extração.
Em tubos de centrífuga graduados (15mL), contendo as quantidades
desejadas de PEG e sal, foi adicionado o extrato enzimático contendo a
ascorbato oxidase, que corresponde a 20% da massa total do sistema. Em
seguida, a água deionizada foi adicionada para ajustar a concentração final
desejada dos componentes e, ainda, manter constante a massa final do
sistema.
A mistura foi agitada em vórtice por 1 min e colocada em repouso
durante 1 hora, para a total separação das fases. Após a leitura dos volumes
das fases, as mesmas foram separadas cuidadosamente com auxílio de
micropipetas. Amostras das fases foram retiradas para a realização das
análises de atividade enzimática e conteúdo protéico, que possibilitaram o
cálculo do aumento de pureza, do coeficiente de partição e da recuperação da
ascorbato oxidase.
2.2.4. Planejamento fatorial fracionário para a extração da ascorbato oxidase
Os estudos de extração foram feitos baseados em planejamentos
experimentais propostos por Barros-Neto (2002). Existem vários fatores que
interferiram no sistema de duas fases aquosas, e eles foram analisados e foi
determinado o nível de significância e a interação entre estes fatores sobre as
respostas: coeficiente de partição, aumento de pureza e recuperação da
ascorbato oxidase, com os respectivos erros experimentais. A melhor condição
26
final de extração foi definida como aquela que proporcionou a melhor
combinação entre as respostas.
Na Tabela 2.1 encontra-se a matriz contendo as condições iniciais de
extração. Como foram 7 variáveis avaliadas em dois níveis, foi realizado um
planejamento fatorial fracionário (27-2) com um total de 32 extrações e 4
repetições no ponto central. Essas extrações no ponto central foram realizadas
para possibilitar o cálculo do erro experimental. Após a realização dos
experimentos a análise estatística dos resultados foi realizada, com o auxílio do
software Statistica 6.1.
Tabela 2.1 - Níveis das variáveis do planejamento fatorial fracionário (27-2), utilizadas na extração em SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase.
Níveis Variáveis Superior
(+1) Central
(0) Inferior
(-1)
Massa molar do PEG (g/mol) - MMPEG 20.000 10.000 1000
Concentração do PEG % (m/m) –CPEG 25 20 15
pH 8,0 7,0 6,0
Concentração de citrato % (m/m) - Citrato 20 15 10
Massa total do sistema (g) – MTS 10 8 6
Fator de diluição do extrato enzimático - FD
4 2 SD*
Adição de NaCl (%) – NaCl 1 0,5 0
* SD = Sem Diluição do extrato
O planejamento fracionário é utilizado quando existem muitas variáveis
e não se sabe quais apresentam efeitos significativos sobre o processo. Estes
planejamentos, com um número reduzido de experimentos avaliam os efeitos
de muitas variáveis para que seja possível fazer uma seleção ou triagem
destas variáveis para estudos subseqüentes, utilizando planejamentos fatoriais
completos.
2.2.5. Planejamento fatorial completo para a extração da ascorbato oxidase
Os estudos de extração foram realizados utilizando as variáveis
selecionadas pelo planejamento experimental fracionário anteriormente
27
descrito. Para análise estatística dos resultados foram utilizadas as mesmas 3
variáveis de respostas: coeficiente de partição, aumento de pureza e
recuperação. A melhor condição final de extração foi definida como aquela que
proporcionar a melhor combinação entre as respostas, mas priorizando o
aumento de pureza.
Nas Tabela 2.2 e 2.3 encontram-se as variáveis contendo os seus
níveis previamente selecionados para a extração. Como foram selecionadas
duas variáveis para avaliação em diferentes níveis, foi realizado um
planejamento fatorial completo (22) com um total de 8 extrações e 4 repetições
no ponto central, as quais possibilitaram o cálculo do erro experimental. Após a
realização dos experimentos a análise estatística dos resultados foi realizada
com o auxílio do software Statistica 6.1 (STATSOFT INC., 2004).
Tabela 2.2 - Níveis das variáveis do primeiro planejamento fatorial completo (22), utilizados na extração SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase.
Níveis Variáveis Superior
(+1) Central
(0) Inferior
(-1)
Concentração do PEG % (m/m) –
CPEG 25 20 15
Concentração de citrato % (m/m) –
Citrato 20 15 10
Tabela 2.3 - Níveis das variáveis do segundo planejamento fatorial completo (22), utilizados na extração SDFA (PEG/Citrato) da ascorbato oxidase.
Níveis Variáveis Superior
(+1) Central
(0) Inferior
(-1)
Concentração do PEG % (m/m) –
CPEG 30 25 20
Concentração de citrato % (m/m) –
Citrato 15 10 05
28
As demais condições do sistema de duas fases aquosas para ambos os
planejamentos foram: massa molar do PEG 20.000 (g/mol), pH 6,0, o extrato
enzimático sem diluição, sem adição de NaCl e massa total do sistema de 10g.
2.2.6. Determinação da atividade ascorbato oxidase A atividade da ascorbato oxidase foi determinada segundo metodologia
descrita por Carvalho et al. (1981), a qual utiliza o ácido ascórbico 50μM em
tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0 como substrato.
O sistema de reação foi constituído por 675μL do tampão contendo o
substrato e 25μL da solução contendo a enzima. O consumo do substrato foi
acompanhado por espectrofotometria durante 5 min, sendo a absorbância
determinada a 268nm, registrada a cada 1 min.
Uma unidade de atividade equivale à oxidação de 1,0μmol de L-
ascorbato em dehidroascorbato por minuto, no pH 6,0, à temperatura de 25°C,
sendo expressa em μmol de ácido ascórbico/min ou em U/mL. A atividade
específica foi calculada pela razão entre a atividade total e a quantidade de
proteínas contidas em 1mL de amostra (μmol/min.mg ou U/mg).
2.2.7. Determinação do conteúdo protéico A concentração de proteínas totais foi determinada de acordo com o
método de Bradford (1976). As amostras controle dos sistemas de duas fases
aquosas continham água em substituição ao extrato enzimático.
2.3. DEFINIÇÃO DOS PARÂMETROS DE ANÁLISE DO PROCESSO 2.3.1. Atividade Específica
A atividade específica da enzima foi obtida pela relação entre a
atividade da enzima e o teor de proteínas totais, presentes na mesma amostra.
Define-se atividade específica (Ae) em U/mg como:
PAAe =
em que: A = atividade da enzima na amostra expressa em (U/mL); P =
proteínas totais na amostra expressas em (mg/mL)
29
2.3.2. Aumento de Pureza (AP)
O aumento de pureza da ascorbato oxidase foi determinado pela razão
entre as atividades específicas na fase PEG e na amostra antes da extração.
ei
e
AA
AP 1=
em que: Ae1=atividade específica na fase extraída - PEG (U/mg); Aei=atividade
específica da amostra antes da extração (U/mg); AP = aumento de pureza
(adimensional)
2.3.3. Recuperação da ascorbato oxidase (Y)
A recuperação em relação à atividade da ascorbato oxidase foi
determinada pela razão entre a atividade volumétrica da fase superior (PEG) e
a atividade volumétrica no extrato bruto, ambas multiplicadas pelo seu volume.
100..
xVAVA
Yii
tt⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
em que: o At e Ai são as atividades enzimáticas em U/mL na fase superior
(“top”) e no extrato bruto (antes da partição), respectivamente; Vt e Vi são os
volumes da fase superior e do extrato bruto em mL, respectivamente.
2.3.4. Coeficiente de Partição da ascorbato oxidase (K)
A distribuição da enzima entre as fases do SDFA foi caracterizada pelo
coeficiente de partição, que foi calculado pela expressão:
b
t
AA
K =
em que: At e Ab são as atividades enzimáticas nas fases superior (“top”) e
inferior (“bottom”) (U/mL), respectivamente.
30
2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.4.1. Planejamento fatorial fracionário para a extração da ascorbato oxidase Inicialmente foi realizado um planejamento experimental, no qual as
variáveis, que influenciam o sistema de duas fases aquosas, foram estudadas
e avaliadas quanto aos seus efeitos sobre o coeficiente de partição,
recuperação e aumento de pureza da enzima. Foram escolhidas sete variáveis,
descritas como importantes para o SDFA, de acordo com a literatura. O
planejamento fatorial fracionário foi necessário devido ao elevado número de
ensaios (n = 128) determinados pelo planejamento fatorial completo. O
planejamento fatorial fracionário utilizado foi 27-2, que determinou a realização
de apenas 32 ensaios (Tabela 2.4).
O planejamento fracionário não apresenta apenas vantagens, também
existe a desvantagem de ter confundimento em seus efeitos. Na terminologia
estatística, o termo confundimento corresponde à estimativa da soma de dois
efeitos, ou seja, o efeito principal se confunde com o efeito das interações de
terceira ordem (BARROS-NETO et al., 2002). Porém, este padrão de
confundimento não é considerado um problema, pois os efeitos da interação de
terceira ordem são bem menos significativos que os de primeira ordem.
Após a realização dos ensaios foram realizadas análises estatísticas. A
estatística é uma importante ferramenta matemática para a interpretação dos
resultados, na qual os efeitos das variáveis sobre as respostas (coeficiente de
partição, recuperação e aumento de pureza da enzima) foram analisados. Vale
salientar que os valores apresentados nos gráficos correspondem aos valores
de efeitos calculados.
31
Tabela 2.4 - Resultados do planejamento fatorial fracionário (27-2) da extração da ascorbato oxidase na fase superior do sistema PEG/citrato. Ensaios MMPEG
(g/mol) CPEG
(%) Citrato
(%) pH MTS
(g) FD NaCl
(%) K Y
(%) AP
1 1000 15 10 6 6 4 1 0,00 0,00 0,00 2 20000 15 10 6 6 SD 0 0,04 8,06 1,95 3 1000 25 10 6 6 SD 0 0,03 18,35 0,31 4 20000 25 10 6 6 4 1 1,50 72,38 1,04 5 1000 15 20 6 6 SD 1 0,59 6,73 0,22 6 20000 15 20 6 6 4 0 7,42 78,06 0,64 7 1000 25 20 6 6 4 0 0,33 2,53 0,09 8 20000 25 20 6 6 SD 1 26,23 135,5 1,17 9 1000 15 10 8 6 SD 0 0,00 0,00 0,00
10 20000 15 10 8 6 4 1 0,09 8,04 0,27 11 1000 25 10 8 6 4 1 0,15 15,38 0,33 12 20000 25 10 8 6 SD 0 2,01 134,3 1,78 13 1000 15 20 8 6 4 0 0,74 13,40 0,24 14 20000 15 20 8 6 SD 1 19,52 145,0 1,58 15 1000 25 20 8 6 SD 1 0,95 7,84 0,15 16 20000 25 20 8 6 4 0 14,50 109,8 0,89 17 1000 15 10 6 10 4 0 0,00 0,00 0,00 18 20000 15 10 6 10 SD 1 0,04 6,33 1,85 19 1000 25 10 6 10 SD 1 0,04 10,92 0,22 20 20000 25 10 6 10 4 0 0,33 47,99 0,43 21 1000 15 20 6 10 SD 0 0,17 4,84 0,13 22 20000 15 20 6 10 4 1 6,16 49,09 1,30 23 1000 25 20 6 10 4 1 0,73 5,73 0,14 24 20000 25 20 6 10 SD 0 15,96 140,5 2,45 25 1000 15 10 8 10 SD 1 0,00 0,00 0,00 26 20000 15 10 8 10 4 0 0,08 7,87 1,24 27 1000 25 10 8 10 4 0 0,15 14,90 0,48 28 20000 25 10 8 10 SD 1 0,53 108,2 2,26 29 1000 15 20 8 10 4 1 4,67 8,08 0,23 30 20000 15 20 8 10 SD 0 11,34 99,91 1,47 31 1000 25 20 8 10 SD 0 1,36 6,06 0,18 32 20000 25 20 8 10 4 1 9,18 82,99 0,83 33 10000 20 15 7 8 2 0,5 1,49 44,70 1,99 34 10000 20 15 7 8 2 0,5 1,49 46,13 1,20 35 10000 20 15 7 8 2 0,5 2,44 46,20 0,89 36 10000 20 15 7 8 2 0,5 0,68 28,18 1,07
MMPEG-massa molar do PEG, CPEG-concentração de PEG, Citrato-concentração de citrato, MTS-massa total do sistema, FD- fator de diluição do extrato enzimático, NaCl-concentração de NaCl adicionado, K-coeficiente de partição, Y-recuperação da enzima na fase superior do sistema e AP-aumento de pureza na fase superior do sistema.
32
Os ensaios dos sistemas 1, 9, 17 e 25 não formaram duas fases, este
fenômeno foi justificado utilizando as curvas binodais, realizadas em estudos
prévios e publicadas recentemente (PORTO et al., 2007). O artigo apresenta a
curva binodal com a massa molar do PEG de 1000 (g/mol) e citrato de sódio,
na concentração de PEG 15% (m/m), nesta condição o sistema encontra-se na
região monofásica.
O gráfico de Pareto representa os efeitos estimados das variáveis (efeito
principal ou de primeira ordem) e das interações entre as variáveis (efeito de
segunda ordem) sobre a variável resposta (coeficiente de partição,
recuperação ou aumento de pureza) em ordem de magnitude. O comprimento
de cada barra é proporcional ao efeito padronizado da variável. A linha vertical
pode ser usada para julgar os efeitos estatisticamente significantes, pois as
barras que se estendem através desta linha correspondem aos efeitos
estatisticamente significantes com nível de confiança de 95%.
-0,200,510,670,891,40-1,47-1,50-1,52-1,60-1,621,77-1,891,92
-2,813,473,904,04-4,435,02
5,67-5,73
-6,546,86
-7,85-7,85-8,04
-9,41-9,82
23,6925,78
28,20
p=0,05Efeito Estimado (Valor Absoluto)
3*4*74*5
3*4*53*4
(4)pH2*3*7
4*72*3*5
1*42*71*72*6
1*3*72*52*3
(7)NaCl3*73*54*6
(2)CPEG(5)MTS
1*3*51*21*53*6
(6)FD2*41*61*3
(1)MMPEG(3)Citrato
Figura 2.1: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl.
33
Observa-se na Figura 2.1 os efeitos significativos das sete variáveis
estudadas, assim como as interações entre elas. As variáveis e as interações
foram representadas por siglas e números no eixo vertical. Os efeitos principais
da massa molar do PEG, da concentração de citrato e do fator de diluição
foram os mais significativos para o coeficiente de partição.
As interações entre as variáveis, massa molar do PEG (1) e
concentração de citrato (3) e entre a massa molar do PEG (1) e o fator de
diluição (6) apresentaram efeitos significativos. Quando uma interação foi
significativa, significa que uma variável não atua sozinha sobre as respostas, o
seu efeito depende da outra variável. Este efeito de interação foi evidenciado
nos gráficos de interpretação geométrica (Figura 2.2 e 2.3)
0,12
0,58
9,19
4,64
1000 20000
MMPEG (g/mol)
SD
4
FD
Figura 2.2: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos do fator de
diluição e massa molar do PEG, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K)
Os resultados dos efeitos das variáveis envolvidas na interação são
melhor interpretados utilizando o diagrama de interpretação geométrica A
Figura 2.2 mostra a interação existente entre as variáveis, fator de diluição do
extrato enzimático e a massa molar do PEG. Nota-se que ocorreu aumento no
coeficiente de partição (K) com o aumento da massa molar do PEG e
diminuição do fator de diluição, ou seja, a condição mais adequada para a
34
resposta coeficiente de partição foi obtida com a massa molar do PEG 20000 e
sem diluição do extrato enzimático.
Os resultados apresentados neste trabalho têm mostrado uma
preferência da ascorbato oxidase pela fase rica em PEG ou fase superior. Este
comportamento pode ser atribuído à inclusão desta molécula protéica no
volume disponível da fase rica em PEG. Todavia, com a massa molar do PEG
elevada (20000 g/mol), geralmente ocorre uma diminuição do coeficiente de
partição devido à teoria do volume excluído (MARCOS et al., 1999; RABELO et
al., 2004).
O fenômeno de volume excluído ocorre devido à elevada massa molar
do polímero aumentar a área de contato entre a biomolécula e os componentes
do sistema, de acordo com as características da molécula e com o tipo de
interação, mas de um modo geral o K diminui (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005).
Uma explicação para este fenômeno foi descrita quando se avaliou a interação
entre o polímero e a proteína nos sítios hidrofóbicos da molécula, este efeito foi
mais importante que o efeito do volume excluído. Este fenômeno foi observado
na partição de pepsina e quimosina em sistemas de duas fases aquosas
PEG/fosfato (SPELZINI et al. 2005).
Farrugia, Nerli e Picò (2003) reportaram estudos realizados com sonda
óptica para calcular a afinidade da albumina pelo PEG de forma indireta. Os
autores encontraram afinidade entre o PEG e a enzima, que aumentou com a
massa molar do PEG. Esta afinidade é menor quando comparada com outras
ligações que possuem interações específicas com proteínas, sugerindo que a
interação PEG/proteína seja de natureza não-específica para um grande
número de proteínas.
A interação entre a massa molar do PEG e a concentração de citrato
está representada na Figura 2.3. Observou-se que o maior valor do efeito foi
obtido com o PEG 20000 e concentração de citrato 20% (m/m). Nota-se ainda
que os efeitos foram positivos para ambas as variáveis e o efeito de interação
também, pois nos maiores níveis das duas variáveis foi obtido o maior valor do
coeficiente de partição (26,23). Este coeficiente foi obtido com PEG 20000,
citrato 20% (m/m) e sem diluição do extrato enzimático.
35
-0,21
0,92
0,31
13,52
1000 20000
MMPEG (g/mol)
10
20
Citr
ato
(% m
/m)
Figura 2.3: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos da
concentração de citrato e massa molar do PEG, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K).
A partição de proteínas é um fenômeno complexo, guiado
principalmente pelas características da molécula estudada e dos componentes
das fases (HUNDDLESTON et al., 1991; BERGGREN et al., 2000). Os fatores
específicos relacionados à enzima incluem hidrofobicidade e cargas
superficiais, que podem ser utilizadas para aumentar o coeficiente de partição
(CAPEZIO et al., 2005).
Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os apresentados
na literatura. Alves et al. (2000) estudaram a partição de insulina em sistemas
PEG/citrato e obtiveram maior coeficiente de partição (K=22,4) quando a
massa molar do PEG foi aumentada. Este comportamento foi explicado pela
alta solubilidade da insulina quando a maior massa molar do PEG foi usada.
Oliveira et al. (2001) obtiveram os maiores valores de coeficiente de partição
(K=142) quando a concentração de citrato encontrava-se no nível mais alto
(20% m/m), mas a massa molar do PEG apresentou efeito contrário, ou seja,
quanto menor a massa molar maior foram os valores do coeficiente de partição.
36
Foram realizadas análises estatísticas dos efeitos, utilizando como
variável-resposta a recuperação (Y), considerando os resultados da
recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema.
0,05-0,070,08-0,27-0,42-0,48-0,65-0,83-0,92-0,94-1,00-1,27-1,50-1,55-1,681,69-2,082,36-2,712,85
-3,26-3,333,52
-6,16-6,37-6,58
7,678,939,10
9,6322,55
p=0,05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
4*73*72*51*7
1*3*7(7)NaCl
2*3*73*5
1*3*52*74*5
3*4*53*43*62*4
3*4*72*6
2*3*51*51*4
(5)MTS4*6
(4)pH2*3
(6)FD1*61*2
(3)Citrato1*3
(2)CPEG(1)MMPEG
Figura 2.4: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-Fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl.
Observando a Figura 2.4, o efeito da massa molar do PEG se destacou
como o mais significativo dos efeitos principais. O seu efeito positivo indicou
que quanto maior a massa molar do PEG maiores foram os valores da
recuperação da ascorbato oxidase. Este comportamento também pode ser
explicado da mesma forma que para o coeficiente de partição, ocorreu uma
possível interação entre o PEG e a ascorbato oxidase, a qual apresentou
preferência pela fase PEG. Por outro lado, as características hidrofílicas dos
contaminantes podem ter interagido melhor com a fase inferior rica em sal.
A concentração de PEG e de citrato e o fator de diluição foram as
variáveis principais que apresentaram efeitos significativos. Também se
verificou que as interações entre MMPEG(1) e Citrato(3), MMPEG(1) e
37
CPEG(2), e ainda entre MMPEG(1) e FD(6) apresentaram efeitos significativos.
Vale salientar que estes efeitos principais e suas interações também foram
significativos para o coeficiente de partição.
A Figura 2.5 apresenta um cubo, no qual estão as variáveis principais
que apresentaram interações significativas. Os efeitos das três variáveis foram
positivos, determinando que a melhor condição para a recuperação da
ascorbato oxidase foi obtida quando as variáveis estão nos seus maiores níveis
(massa molar do PEG 20000g/mol, concentração de PEG de 25% e
concentração citrato de 20%).
85,473
122,311
12,64
87,76
19,95
0,27
-5,26
13,33
Figura 2.5: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG, concentração
de PEG e concentração de citrato), tendo como variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase.
Os melhores resultados para a recuperação da ascorbato oxidase
foram aproximadamente 140%. Valores de recuperação acima de 100% foram
encontrados para extração enzimática utilizando extração líquido-líquido
(CORTEZ et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2002; MAYERHOFF et al., 2004).
Estes altos valores de recuperação foram explicados pela eliminação ou
diminuição dos inibidores enzimáticos durante o processo de purificação, ou
pela composição do sistema que favoreceu a atividade enzimática
38
(MAYERHOFF et al., 2004). A recuperação enzimática de 129% foi obtida para
tripsina em sistemas de duas fases aquosas PEG/POLICAJU (OLIVEIRA et al.,
2002). Para a ascorbato oxidase em sistemas PEG/fosfato Porto et al. (2004)
obtiveram recuperação da atividade enzimática de 236%, os autores
justificaram que o PEG promoveu maior estabilidade da enzima.
-0,00-0,03-0,09-0,090,12-0,14-0,16-0,19-0,19-0,20-0,25-0,330,34-0,36-0,370,40-0,41
-0,520,560,570,590,630,65
0,760,890,92
-1,48-1,62
-2,75-2,97
6,71
p=0,05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
(4)pH2*52*73*74*51*7
(3)Citrato1*31*24*7
(7)NaCl1*3*7
3*51*42*6
1*3*53*42*3
3*4*73*6
(2)CPEG4*6
2*3*52*41*5
(5)MTS2*3*73*4*5(6)FD
1*6(1)MMPEG
Figura 2.6: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta o aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG-massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)Citrato-concentração de citrato, (4)pH-valor de pH, (5)MTS-massa total do sistema, (6)FD-Fator de diluição do extrato enzimático e (7)NaCl-concentração de NaCl.
Apenas a variável massa molar do PEG apresentou efeito
estatisticamente significativo para o aumento de pureza (Figura 2.6). Este efeito
foi positivo, indicando que quanto maior for o valor da massa molar do PEG
melhor será o aumento de pureza, contudo o PEG 20000 já é a maior massa
molar disponível no mercado. Então podemos considerar que esta massa
molar do PEG foi a mais adequada para a purificação da ascorbato oxidase em
sistemas de duas fases aquosas PEG/citrato.
Estes resultados confirmaram a hipótese de um efeito de interação entre
a enzima e o PEG, pois a massa molar do PEG elevada (20000 g/mol)
39
apresentaria forte efeito de volume excluído. Spelzini et al. (2005) relataram
que vários resultados obtidos sugeriram que a interação PEG/proteína/sal
prevaleceu sobre o efeito do volume excluído. Isso nos permite explicar porque
o aumento da massa molar e da concentração do PEG favoreceu a partição, e
conseqüentemente a purificação, na fase superior do sistema ou fase PEG.
Vale salientar que o pH pode ter apresentado um papel importante para a
purificação, pois os valores de pH 6,0 e 8,0 estudados estavam acima do ponto
isoelétrico da ascorbato oxidase (pI=5,1), nestas condições a enzima
apresentou carga elétrica negativa. Em geral, as proteínas carregadas
negativamente apresentam preferência pela fase superior rica em PEG
(ALBERTSSON, 1986).
Os ensaios realizados com o PEG 20000 (g/mol) apresentaram valores
de aumento de pureza superiores aos com o PEG 1000 (g/mol), destacando-se
os ensaios que foram realizados com o extrato sem diluição (Tabela 2.4). Nas
condições de extração empregadas, ocorreu um aumento da atividade
específica da enzima, devido ao diferente comportamento de partição da
enzima desejada e das proteínas contaminantes para fases opostas.
O melhor resultado obtido neste estudo para o aumento de pureza foi
2,45, associado com o valor de recuperação 140%. Vale salientar que as
condições MMPEG de 20000 e FD sem diluição estavam presentes nos
melhores resultados, tanto para o coeficiente de partição quanto para o
aumento de pureza.
Estudos realizados por Mayerhoff et al. (2004) mostraram a purificação
da xilose redutase de Candida mogii, os autores obtiveram aumento de pureza
de 1,59 e recuperação de 105,8% utilizando sistemas PEG/fosfato. Resultados
semelhantes foram obtidos por Li e Peeples (2004) que purificaram a alfa
amilase recombinante obtendo aumento de pureza de 3,31 e 90% de
recuperação. Avaliando os resultados apresentados pela literatura em relação
ao aumento de pureza e recuperação, constatou-se que mesmo se tratando de
estudos preliminares de extração, os resultados obtidos neste estudo foram
similares aos descritos por outros autores.
40
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33 (C)
34 (C)
35 (C)
36 (C)
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Recuperação (%)
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
2,6
Aum
ento
de
Pur
eza
Figura 2.7: Valores de recuperação da enzima e aumento de pureza na fase
superior dos sistemas de duas fases aquosas PEG/Citrato.
Os sistemas que apresentaram melhores resultados na extração da
ascorbato oxidase estão representados no quadrante superior direito do gráfico
(Figura 2.7). Este quadrante foi delimitado tendo como parâmetros valores de
recuperação acima de 100% e aumentos de pureza acima de 1,4. Foi
observado que os sistemas selecionados apresentavam em comum a massa
molar do PEG 20000, pH 6,0, massa total do sistema de 10g, extrato
enzimático sem diluição e sem adição de NaCl. Desta forma foram
selecionadas as variáveis significativas e seus respectivos níveis, que foram
capazes de purificar a ascorbato oxidase em SDFA.
Vale salientar que o pH, mesmo não apresentando efeito significativo
para o sistema de duas fases aquosas, desempenhou uma função importante
para a purificação, pois os valores de pH acima do ponto isoelétrico da enzima
favoreceram a partição para a fase PEG.
A adição de NaCl foi outra variável que não apresentou efeito
significante para a extração em SDFA. Este sal foi selecionado, pois tem sido
utilizado em diferentes estudos para favorecer a transferência de proteínas
para a fase superior (FORCINITI, 2002; CAPEZIO et al., 2005). A tendência
41
observada nos resultados deste estudo foi a diminuição da partição das
proteínas quando a concentração de NaCl aumenta. Esta tendência também foi
observada nos resultados encontrados para as proteínas estudadas por
Gündüz e Korkmaz (2000).
Neste estudo, verificamos que as três variáveis (pH, massa total do
sistema e a adição de NaCl) podem ser consideradas inertes, ou seja, não
apresentaram efeitos significativos para, no mínimo, duas respostas. Com isto,
podemos fixar os valores destas variáveis para estudos posteriores de
extração. O pH foi fixado no valor da melhor atividade (pH 6,0), a massa total
do sistema foi fixada em 10g e não houve adição de NaCl no sistema, o que
diminuiu a concentração de sais e o custo. Estas condições foram observadas
nos melhores ensaios de extração.
2.4.2. Primeiro planejamento fatorial completo para a extração da ascorbato oxidase
Após a seleção das variáveis (concentração de PEG e concentração de
citrato) que influenciaram significativamente a purificação da ascorbato
oxidase, utilizando o planejamento fracionário, estas variáveis foram estudadas
mais uma vez quanto aos seus efeitos sobre o coeficiente de partição,
recuperação e aumento de pureza da enzima. O planejamento fatorial completo
(22) foi utilizado, constituído por 8 ensaios, sendo 4 pontos centrais. Os
resultados obtidos estão apresentados na Tabela 2.5.
Foram realizadas as análises estatísticas e os efeitos das variáveis
sobre as respostas (coeficiente de partição, recuperação da enzima e aumento
de pureza da enzima) foram analisados.
42
Tabela 2.5 - Resultados do primeiro planejamento fatorial completo (22) para extração da ascorbato oxidase no sistema PEG/citrato.
Ensaios CPEG (%) Citrato (%) K Y (%) AP
1 15 10 0,05 7,52 0,62
2 25 10 1,74 87,86 3,70
3 15 20 4,52 53,02 2,19
4 25 20 5,47 38,47 1,28
5 (C) 20 15 9,05 103,75 1,71
6 (C) 20 15 11,31 106,76 2,60
7 (C) 20 15 13,20 111,47 1,35
8 (C) 20 15 11,17 113,16 1,97 CPEG-concentração de PEG, Citrato-concentração de citrato, K-coeficiente de
partição, Y-recuperação da enzima na fase superior do sistema e AP-aumento de
pureza na fase superior do sistema.
Na análise estatística verificou-se que nenhum dos efeitos principais foi
significativo para o coeficiente de partição, pois os valores dos efeitos
estimados foram menores que o nível de significância (p = 0,05).
A partição preferencial das proteínas para a fase PEG tem sido
explicada com base na hidrofobicidade protéica ou na teoria do volume
excluído. A teoria do volume excluído determina que massas molares do PEG
elevadas induzem a diminuição da quantidade de proteína solúvel na fase rica
em PEG. Esta teoria não pode explicar o aumento do valor de K (coeficiente de
partição) obtido neste estudo, nas condições investigadas. Relatos recentes
sobre a interação PEG/proteína (SPELZINI et al., 2005; CAPEZIO et al., 2005)
têm demonstrado a presença de leve interação ou afinidade entre eles. No
entanto, não foi possível definir os sítios específicos de ligação entre a
molécula de PEG e a superfície da proteína.
43
-0,45
7,62
-10,99
p=0,05
Efeitos Estimados (Valor Absoluto)
(2)CITRATO
(1)CPEG
1*2
Figura 2.8: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)CPEG-concentração do PEG, (2)Citrato-concentração de citrato.
Observa-se na Figura 2.8 o efeito significativo das duas variáveis
estudadas neste planejamento, assim como as interações entre elas. Para a
variável-resposta recuperação, o efeito da concentração do PEG se destacou
como o mais significativo dos efeitos principais. O efeito foi positivo, indicando
que quanto maior a concentração do PEG melhores foram os valores da
recuperação da ascorbato oxidase. Este comportamento pode ser explicado da
mesma forma que para o coeficiente de partição, ocorreu uma possível
interação entre o PEG e a ascorbato oxidase, a qual apresentou preferência
pela fase PEG ou as proteínas contaminantes se deslocaram
preferencialmente para a fase inferior rica em sal.
As interações entre as variáveis concentrações do PEG e de citrato
apresentaram efeitos significativos. Este efeito de interação foi evidenciado no
gráfico de interpretação geométrica (Figura 2.9).
44
38,5
84,0
118,8
69,5
15 25
CPEG
10
20C
ITR
ATO
Figura 2.9: Diagrama para interpretação geométrica dos efeitos, tendo como
variável-resposta a recuperação (Y) para analisar a concentração de citrato em função da concentração do PEG no SDFA.
A Figura 2.9 apresenta a interação observada entre as variáveis,
concentração de citrato e concentração do PEG para a recuperação da enzima.
O efeito da interação foi negativo, indicando que quando a concentração de
citrato esteve no seu menor nível (10% m/m) e a concentração de PEG no seu
maior nível (25% m/m), ocorreu o maior valor do efeito para esta resposta.
Nesta condição a recuperação em atividade enzimática da fase rica em PEG foi
87,86%. Os maiores valores para a recuperação da enzima foram obtidos nos
experimentos dos pontos centrais (ensaios 5 a 8), entretanto a escolha da
melhor condição de purificação da ascorbato oxidase depende também da
análise do aumento de pureza.
45
-0,80
2,04
-3,77
p=0,05
Efeitos Estimados (Valor Absoluto)
(2)CITRATO
(1)CPEG
1*2
Figura 2.10: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta o aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)CPEG-concentração do PEG, (2)Citrato-concentração de citrato.
A interação entre a concentração do PEG e a concentração de citrato
apresentou efeito estatisticamente significativo para o aumento de pureza
(Figura 2.10). Este efeito foi negativo, indicando tendências opostas das
variáveis, ou seja, quanto maior o valor da concentração do PEG e menor a
concentração do citrato, maiores valores para o aumento de pureza foram
obtidos.
Observou-se que o ensaio realizado com a concentração de citrato 10%
(m/m) e a concentração de PEG 25% (m/m) apresentou o maior valor para o
aumento de pureza (3,7) (Tabela 2.5). Nestas condições de extração a
recuperação da atividade enzimática foi 87,86%.
Na análise de variância não foi observado falta de ajuste para a resposta
aumento de pureza, com isto foi possível ajustar um modelo matemático aos
dados experimentais obtendo uma indicação da região ótima para a resposta
estudada. Esta análise utilizou um modelo linear que descreveu a relação entre
o aumento de pureza (AP) e as variáveis, concentração de PEG e
46
concentração de citrato. O modelo foi descrito segundo a equação:
AP = 1,93 + 0,54 * CPEG – 0,21 * Citrato
2,5 2 1,5
Figura 2.11: Superfície de resposta do planejamento experimental para o
aumento de pureza da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas (PEG/citrato).
A Figura 2.11 apresenta a superfície de resposta para o aumento de
pureza utilizando o modelo linear. A região da superfície que indica os
melhores valores do aumento de pureza corresponde à concentração de citrato
10% (m/m) e a concentração de PEG 25% (m/m).
Nestas condições foram obtidos 3,7 de aumento de pureza, associado
com 87,86% de recuperação e 1,74 de coeficiente de partição. Estes
resultados de aumento de pureza e recuperação corroboram com os
apresentados na literatura para a aplicação de SDFA no isolamento e
recuperação de enzimas de extratos brutos. Nos estudos de extração da
superóxido dismutase de extrato de fígado bovino, utilizando sistema PEG/sal,
a enzima foi purificada 4 vezes com uma recuperação de 83% (BOLAND et al.,
1991). O SDFA também foi utilizado para recuperar enzimas de tecidos
vegetais, tais como, folhas de Ipomoea palmetta, da qual foi purificada uma
47
peroxidase, utilizando o sistema PEG/sulfato de amônio, que apresentou
aumento de pureza de 2,18, e redução de volume de 57,5% (SRINIVAS et al.,
1999).
O sistema que apresentou melhor desempenho na extração da
ascorbato oxidase corresponde ao ensaio número 2 (Tabela 2.5). Este sistema
foi selecionado para realização da confirmação destes resultados. Então, foram
realizados experimentos, onde o sistema selecionado foi repetido 3 vezes para
conferir se realmente os resultados eram verdadeiros e apresentavam
reprodutibilidade. Estes resultados estão apresentados na Tabela 2.6.
Tabela 2.6 - Resultados confirmatórios do sistema selecionado (ensaio 2) de extração descontínua da ascorbato oxidase em SDFA.
ensaios K Y (%) AP
2 original 1,74 87,86 3,69
2 A 1,59 89,87 3,28
2 B 2,01 95,06 3,58
2 C 1,84 90,75 3,93
Média 1,79 90,88 3,62
K-Coeficiente de partição, Y-Recuperação em atividade enzimática e AP-
Aumento de pureza.
Estes resultados confirmaram que os valores obtidos anteriormente
eram verdadeiros e que o planejamento, mesmo sem repetição de todas as
extrações, garantiu segurança nos resultados com a análise do erro puro.
2.4.3. Segundo planejamento fatorial completo para extração da ascorbato oxidase em SDFA.
Após a confirmação dos resultados, foi realizado o segundo
planejamento fatorial completo para estudar a região que apresentou o melhor
resultado, ampliando os níveis das variáveis e seguindo a tendência descrita
pelo planejamento anterior. Para isto, foi realizado um segundo planejamento
completo 22 para avaliar se a região de estudo indicada aumentaria a
purificação e a recuperação da ascorbato oxidase (Tabela 2.7).
48
Tabela 2.7 - Resultados do segundo planejamento fatorial completo (22) para a extração da ascorbato oxidase no sistema PEG/Citrato. Ensaios CPEG (%) Citrato
(%) K Y (%) AP
1 20 5 - - - 2 30 5 0,06 30,08 1,49 3 20 15 9,59 94,77 2,26 4 30 15 10,24 123,64 2,78
5 (C) 25 10 1,45 82,95 2,09 6 (C) 25 10 2,07 113,58 3,06 7 (C) 25 10 1,25 75,47 3,18 8 (C) 25 10 1,86 100,78 2,21
CPEG-concentração de PEG, Citrato-concentração de citrato, K-coeficiente de
partição, Y-recuperação da enzima na fase superior do sistema e AP-aumento de
pureza na fase superior do sistema.
Inicialmente foi observado que no ensaio 1 não houve formação das
fases. Apesar de não possuirmos o diagrama de fases para o PEG 20000
(g/mol), foi determinado que a concentração de citrato utilizada neste estudo foi
muito baixa e por isso não obtivemos a formação das duas fases aquosas
quando a concentração de PEG foi 20%, pois a concentração total dos
componentes foi menor que a necessária para formação do SDFA.
Verifica-se ainda, que em todas as condições de extração foi obtida
purificação da ascorbato oxidase e os melhores valores encontram-se nos
experimentos realizados no ponto central. Os pontos centrais correspondem a
melhor condição encontrada no planejamento anterior, ou seja, esta condição
foi confirmada como a mais adequada para a extração e purificação da
ascorbato oxidase.
A análise estatística dos resultados foi realizada para verificar os efeitos
significativos de cada variável e auxiliou na compreensão de como a ascorbato
oxidase particionou no SDFA em diferentes concentrações dos componentes
do sistema.
49
0,78
0,94
26,48
p=0,05
Efeitos Estimados (Valor Absoluto)
1*2
(1)CPEG
(2)CITRATO
Figura 2.12: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1) CPEG-concentração do PEG, (2) Citrato-concentração de citrato.
A Figura 2.12 apresenta o efeito estatisticamente significativo da variável
concentração de citrato como 95% de confiança. O efeito positivo indicou que
aumentando a concentração de citrato (de 5% para 15%) maiores valores para
o coeficiente de partição seriam obtidos. Este fenômeno pode ser explicado
pela teoria do salting-out, pois quando a concentração salina da fase inferior
aumenta, as proteínas são forçadas a particionar para a fase superior (HEY et
al., 2005; TRINDADE et al., 2005; ZAFARANI-MOATTAR et al., 2005). Estes
resultados corroboram com os apresentados por Zhi et al. (2005), que
obtiveram os melhores resultados (coeficiente de partição 2,4, aumento de
pureza 2,0 e recuperação 90%) nas concentrações 14% e 15% de citrato.
Comportamento semelhante foi observado para a variável-resposta
recuperação, como pode ser observado na Figura 2.13, o aumento da
concentração de citrato favoreceu o aumento dos valores de recuperação,
apresentando como melhor valor 123% de recuperação da enzima. Este
50
comportamento similar possibilitou a determinação de condições de extração
considerando as duas respostas (coeficiente de partição e recuperação) ao
mesmo tempo, o que não seria possível se os comportamentos fossem
contrários.
-0,03
1,70
5,45
p=0,05
Efeitos Estimados (Valor Absoluto)
1*2
(1)CPEG
(2)CITRATO
Figura 2.13: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase superior do sistema de duas fases aquosas. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1) CPEG-concentração do PEG, (2) Citrato-concentração de citrato.
Os resultados obtidos neste estudo diferiram dos apresentados por
Klomklao et al. (2005), que purificaram uma proteinase em SDFA. Os autores
descreveram uma diminuição da recuperação enzimática com o aumento da
concentração do sal (sulfato de magnésio) e justificaram que a perda na
atividade poderia ser devido à desnaturação das proteinases causadas pelo
efeito de salting-out, mas este efeito depende do tipo de sal e concentração
empregada.
Avaliando os resultados obtidos para o aumento de pureza, verificou-se
que nenhuma variável ou interação foi significativa com 95% de confiança. Isto
pode ter ocorrido devido aos valores do ponto central apresentarem valores de
51
aumento de pureza dispersos, ou seja, o valor do erro para essa resposta foi
maior e diminuiu os efeitos significativos.
Foi realizada uma análise comparativa do desempenho de extração em
relação ao aumento de pureza e a recuperação, verificou-se que os resultados
obtidos nos ensaios correspondentes aos pontos centrais estão entre os
maiores valores.
Como foram descritas anteriormente, as concentrações dos sistemas
nos pontos centrais corresponderam as melhores condições obtidas no
planejamento experimental. Então, os melhores resultados obtidos para a
extração da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima foram calculados
utilizando a média de oito valores de sistemas realizados em diferentes
períodos, que resultou em coeficiente de partição de 1,72 ± 0,28, recuperação
de 91% ± 11% e aumento de pureza de 3,12 ± 0,67vezes.
2.5. CONCLUSÃO
O sistema PEG/citrato mostrou ser capaz de purificar ascorbato oxidase
de Cucurbita maxima em modo descontínuo. Os três planejamentos sucessivos
utilizados selecionaram as variáveis que influenciaram a extração, bem como
determinaram as melhores condições para a purificação da enzima,
demonstrando que o sistema de duas fases aquosas é uma alternativa para a
purificação de enzimas de interesse biotecnológico.
52
CAPITULO III Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato bruto e no pré-purificado por SDFA
Tatiana Souza Portoa,b, Petrus Pires Marquesb , Camila Souza Portob, José
Luiz Lima-Filhob, Attilio Convertic, Ana Lúcia Figueiredo Portob,d, Adalberto
Pessoa-Jra*
aDepartamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica/FCF,
Universidade de São Paulo; bLaboratório de Imunopatologia Keizo Asami
(LIKA), UFPE; cDepartamento de Engenharia química de materiais e de
processos GB Bonino, UNIGE; dDepartamento de Morfologia e Fisiologia
Animal, UFRPE.
Endereço do autor para correspondência: Adalberto Pessoa Júnior Av. Prof. Lineu Prestes, 580 – Bloco16 CEP: 05508-950, São Paulo, SP, Brasil. Tel: (11) 3091-3710 Fax: (11) 3094-3694 e-mail: [email protected]
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Enzyme Microbial
Technology.
Parte dos resultados foi apresentado na forma de resumos no XI
Semana Farmacêutica de Ciência e Tecnologia da USP (2006) e no I
Workshop Internacional de Biotecnologia (2008).
53
3.1. INTRODUÇÃO Ascorbato oxidase (AO - EC 1.10.3.3), isolada principalmente de plantas
pertencentes à família Cucurbitaceae, e para cada espécie vegetal, já foi
caracterizada em detalhes físico-químicos (massa molar, ponto isoelétrico, pH
e temperatura). Baseado em análise cristalográfica da ascorbato oxidase de
abobrinha (Cucurbita pepo), observou-se que todos os resíduos de
aminoácidos envolvidos na ligação com o cobre estão situados em quatro
regiões ricas em histidina, as quais exibem uma seqüência de notável
homologia com as oxidases multicobres (SUGINO et al., 2002).
A ascorbato oxidase extraída da Cucurbita maxima e da Cucurbita pepo
condensa possuem massa molar de 150 kDa (AMON e MARKAKIS, 1973; LEE
e DAWSON , 1979 ; CARVALHO et al., 1981) e a extraída da Cucurbita pepo
medulosa possui massa molar de 140 kDa (MARITANO et al., 1996). A enzima
existe predominantemente em estado β-conformacional e foram encontradas
poucas formas helicoidais. A ascorbato oxidase é constituída por duas
subunidades idênticas ligadas por duas pontes dissulfeto, cada subunidade tem
massa molar de 70 kDa (CASELLA et al., 1999; SUGINO et al., 2002).
As enzimas são proteínas globulares, e o seu poder catalítico depende
da conformação tridimensional da molécula, em particular do centro ativo,
existindo uma conformação ótima para a ligação do(s) substrato(s) e para a
catálise propriamente dita. Desta forma, são necessários estudos dos fatores
que influenciam a conformação da molécula, e consequentemente, a atividade
e estabilidade enzimática. Dentre estes fatores, destacam-se o pH e a
temperatura.
O pH influencia a ionização dos aminoácidos constituintes de uma
enzima, alterando sua conformação e, portanto, sua atividade. Valores de pH
extremos levam a desnaturação da proteína, com perda permanente da
atividade (LEHNINGER, 2005).
O efeito da temperatura sobre a atividade enzimática é positivo, pois o
aumento da temperatura acelera a velocidade das reações entre as moléculas,
mas este efeito é contrariado pela desnaturação das moléculas da enzima. O
aumento de temperatura acima de um dado valor provoca a destruição das
ligações que mantém a estrutura tridimensional da proteína, podendo levar a
uma destruição irreversível da atividade catalítica. A temperatura ótima para
54
cada enzima será uma conseqüência da interação entre estes dois fatores
(LEHNINGER, 2005).
Em virtude da alta seletividade e poder catalítico, as enzimas têm sido
muito empregadas em química analítica, bem como na medicina, agricultura,
tecnologia de alimentos e estudos ambientais. O emprego de enzimas
purificadas pode ser encontrado em diversos trabalhos, no entanto, há uma
carência de trabalhos que utilizem tecidos e/ou extratos vegetais. Embora o
uso de extratos brutos seja extremamente econômico e possua tempo de vida
superior às enzimas purificadas, estes apresentam certa desvantagem quanto
ao seu uso nos métodos analíticos devido a sua baixa seletividade
(FATIBELLO-FILHO; VIEIRA, 2002).
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do pH e da temperatura na
atividade e estabilidade da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima presente
no extrato enzimático e no pré-purificação por SDFA.
3.2. MATERIAL E MÉTODOS
3.2.1. Preparo do Extrato Enzimático As abóboras, Cucurbita maxima var. jerimum caboclo, foram
descascadas a uma profundidade de aproximadamente 3mm. Ao tecido foi
adicionado tampão citrato/fosfato 0,1M, pH 6,0, mantendo a relação de 1g de
tecido por 1,5mL de tampão. Em seguida foi realizada a homogeneização do
extrato com o auxílio de um processador de alimentos, por 5 min. Após a
centrifugação do homogeneizado a 13.000xg por 10 min a 0-4°C, o precipitado
foi desprezado, e o sobrenadante foi denominado extrato bruto, que foi
armazenado a -20°C. Com a finalidade de minimizar toda a variação da
quantidade de AO no extrato bruto, todos os experimentos foram realizados
usando sempre o mesmo grupo das frutas colhidas imediatamente antes do
seu amadurecimento.
3.2.2. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático
Para verificar o pH ótimo da atividade da ascorbato oxidase, a reação foi
realizada com soluções de substrato (ácido ascórbico) preparadas em tampão
55
0,1M com variação de pH (tampão citrato-fosfato pHs de 3,0 a 6,0; tampão
fosfato pHs 6,0 a 8,0 e tampão Tris-HCl pHs 8,0 e 9,0) a 25°C. Nos estudos de
estabilidade ao pH, 350μL do extrato contendo a ascorbato oxidase foram
adicionados a 34,65mL da solução tampão 0,1M nos valores de pH desejados
(tampão citrato-fosfato pHs de 3,0 a 6,0; tampão fosfato pHs 6,0 a 8,0 e
tampão Tris-HCl pHs 8,0 e 9,0) e incubados a 5°C. Alíquotas foram retiradas
nos tempos (0, 6, 10, 20h) de incubação. As amostras foram analisadas quanto
à atividade enzimática residual.
Para verificar o efeito da temperatura na atividade ótima da ascorbato
oxidase, a reação para a determinação da atividade da enzima foi realizada
nas diferentes temperaturas (25, 30, 32, 35, 40, 45 e 46°C). Para o estudo da
estabilidade à temperatura, o extrato enzimático foi colocado nas temperaturas
desejadas (10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70°C). Alíquotas foram retiradas nos
tempos 0 min, 30 min e 60 min. As amostras foram analisadas quanto à
atividade enzimática residual.
3.2.3. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da AO após pré-purificação em SDFA.
As características bioquímicas da ascorbato oxidase após pré-
purificação em sistemas de duas fases aquosas foram avaliadas para verificar
se o processo de purificação alterou as propriedades da enzima. Para isto
foram realizadas as determinações do pH ótimo, temperatura ótima,
estabilidade ao pH e à temperatura da ascorbato oxidase pré-purificada em
presença de polietileno glicol.
Os sistemas de duas fases aquosas (massa molar do PEG 20.000
g/mol, concentração de PEG 25% (m/m), concentração de citrato 10% (m/m),
pH 6,0) foi selecionado para este estudo, pois apresentou o melhor
desempenho quanto à purificação da enzima (dados não mostrados, obtidos
em estudos prévios).
Para verificar o pH ótimo da atividade da ascorbato oxidase após a pré-
purificação, a reação foi realizada com a fase polimérica contendo a enzima e
soluções de substrato (ácido ascórbico) preparadas em tampão 0,1M em
diferentes valores de pH (tampão citrato-fosfato pHs de 3,0 a 6,0 e tampão
fosfato pHs 6,0 a 8,0) a 25°C. Para avaliar a estabilidade da enzima ao pH,
56
350μL do da fase polimérica contendo a ascorbato oxidase foram adicionados
a 3,65mL da solução tampão nos valores de pH desejados (tampão citrato-
fosfato pHs de 3,0 a 6,0 e tampão fosfato pHs 6,0 a 8,0) a 5°C. Alíquotas foram
retiradas nos tempos (0, 6, 10, 20h) de incubação. As amostras foram
analisadas quanto à atividade enzimática residual.
Para verificar o efeito da temperatura na atividade ótima da enzima pré-
purificada, a determinação da atividade enzimática foi realizada nas diferentes
temperaturas desejada (20, 23, 25, 27, 30, 32, 35, 37, 40, 43, 45 e 48°C). Para
o estudo da estabilidade à temperatura, a fase polimérica foi colocada nas
temperaturas desejadas (5, 25, 30, 40, 50, 60 e 70°C). Alíquotas foram
retiradas nos tempos 0 min, 30 min e 60 min. As amostras foram analisadas
quanto à atividade enzimática residual. Para o controle da interferência do
polímero, foi realizado um sistema branco, no qual não foi adicionado o extrato
enzimático.
3.2.4. Determinações analíticas A atividade da ascorbato oxidase foi determinada segundo metodologia
descrita por Carvalho et al. (1981), a qual utiliza o ácido ascórbico 50μM em
tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0 como substrato.
O sistema de reação foi constituído por 675μL do tampão contendo o
substrato e 25μL da solução contendo a enzima. O consumo do substrato foi
acompanhado por espectrofotometria durante 5 min, sendo a absorbância
determinada a 268nm, registrada a cada 1 min.
Uma unidade de atividade equivale à oxidação de 1,0μmol de L-
ascorbato em dehidroascorbato por minuto, no pH 6,0, à temperatura de 25°C,
sendo expressa em μmol de ácido ascórbico/min ou em U/mL. A atividade
específica foi calculada pela razão entre a atividade total e a quantidade de
proteínas contidas em 1mL de amostra (μmol/min.mg ou U/mg).
Para a determinação do conteúdo protéico foi utilizado o método de
Bradford (1976). Todas as análises foram realizadas em triplicata e os desvios
padrões calculados estão representados nos gráficos dos resultados.
57
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1. Obtenção do extrato enzimático de Cucurbita maxima contendo a ascorbato oxidase
Foram realizados vários processamentos da polpa do jerimum para a
obtenção do extrato enzimático, os quais forneceram aproximadamente 2,0L de
extrato enzimático quando 1,0kg de jerimum foi processado. O extrato
enzimático apresentou em média 300 μg/mL de proteína e 50 U/mL de
atividade enzimática, obtendo assim 166 U/mg de atividade específica.
Estes resultados estão compatíveis com os apresentados por Saari et
al.(1996), que descreveram uma intensa variação na atividade da ascorbato
oxidase em diferentes colheitas (14 a 1250 U/mg) e as frutas da família
Cucurbitacea apresentaram maior atividade quando comparadas com outras
frutas, tais como, laranjas, uvas, repolho e maçãs. A ascorbato oxidase de
carambola (Averrhoa carambola) apresentou atividade específica de 123,3
U/mg (SAARI et al., 1999).
3.3.2. Efeito do pH na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático
O conhecimento das características físico-químicas da enzima é muito
importante, pois reduz a possibilidade de utilizar condições desnaturantes
durante o processo de extração em sistemas de duas fases aquosas. O pH
influencia diretamente a atividade e a estabilidade da enzima, em função disso,
foram realizados estudos sobre o efeito do pH na atividade e estabilidade da
ascorbato oxidase em função do tempo.
O valor de pH que apresentou maior atividade foi o pH 6,0 no tampão
citrato-fosfato, o qual apresentou aproximadamente 50 U/mL (Figura 3.1). Este
tampão é o recomendado pela literatura para ser utilizado na metodologia de
determinação da atividade da ascorbato oxidase.
58
0
10
20
30
40
50
60
2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Ativ
idad
e en
zim
átic
a (U
/mL)
Figura 3.1: Efeito do pH na atividade da ascorbato oxidase a 25°C. Tampão
citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 ( ), tampão fosfato 0,1M pH 7,0 ( ) e tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e 9,0( ).
Estes resultados corroboram com os apresentados por Carvalho et al.
(1981), que obtiveram a faixa de pH 5,5 a 7,0 como ótima para a ascorbato
oxidase de Cucurbita maxima, entretanto os autores reportaram a ocorrência
de 25% de atividade enzimática a pH 3,0. A atividade da ascorbato oxidase
neste pH não foi verificada nos nossos estudos. Vale ressaltar que de acordo
com o descrito na literatura para enzima de outras fontes, a ascorbato oxidase
de jerimum não oxidou o ácido ascórbico quando o pH foi igual a 3,0 (STARK e
DAWSON, 1963).
Os resultados obtidos no presente trabalho também foram semelhantes
aos descritos para a ascorbato oxidase oriunda de outras fontes, tais como, a
AO de Cucurbita pepo medullosa apresentou atividade ótima a pH 6,0
(MACCARRONE et al., 1993) e a AO de Citrus unshi possui pH ótimo igual 5,5
(NAZAMID et al., 1994).
Mudanças no valor do pH alteram a distribuição de cargas da proteína.
Valores de pH acima do ponto isoelétrico tornam a proteína carregada
negativamente e abaixo carregada positivamente. As interações não-
covalentes, como as ligações de hidrogênio, ligações hidrofóbicas e interações
59
eletrostáticas, que mantém a estrutura tridimensional da proteína, são fracas e
podem ser desfeitas com valores extremos de pH, levando a uma
desnaturação (CAMPBEL, 2000).
A enzima apresentou estabilidade nos valores de pH 5,0 a 9,0, nos
quais as atividades residuais se mantiveram superiores a 90% durante 20
horas, como apresentado na Figura 3.2.
Maccarrone et al. (1993) determinaram a atividade da ascorbato
oxidase de Cucurbita pepo medullosa a diferentes valores de pH e verificaram
que a enzima foi estável após ser incubada em soluções com valores de pH na
faixa de 4 a 10, apresentando atividades residuais maiores que 90%.
0
20
40
60
80
100
120
2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
Ativ
idad
e re
sidu
al (%
)
Figura 3.2: Efeito do pH na estabilidade da ascorbato oxidase contida no
extrato de Cucurbita máxima, durante 20 horas a 5°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0, tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e tampão Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e 9,0.
Sereikaite et al. (1993) estudaram a estabilidade da ascorbato oxidase
de Cucurbita sp. e reportaram que a enzima foi estável na faixa de pH 5,0 a
10,0. Entretanto, verificou-se perda da atividade enzimática em valores abaixo
de pH 4,0 e acima de pH 12,0, o que foi justificado pela desnaturação da
enzima em valores extremos de pH. Nazamid et al. (1994) relataram que a
ascorbato oxidase de Citrus unshi foi estável na faixa de pH 5,0 a 8,0.
60
3.3.3. Efeito da temperatura na atividade e estabilidade da ascorbato oxidase no extrato enzimático
O efeito da temperatura na atividade enzimática pode ser observado na
Figura 3.3. A temperatura que proporcionou maior valor de atividade da
ascorbato oxidase foi 35°C.
A temperatura ótima da ascorbato oxidase varia de acordo com a origem
da enzima, mas apresenta faixa de 30 a 45°C, por exemplo, Murao et al (1991)
relataram a temperatura ótima de 45°C para a ascorbato oxidase de
Acremonium sp. e a temperatura de 30°C para a ascorbato oxidase de
Cucumber. No entanto, Maccarrone et al (1993) relataram que a ascorbato
oxidase de Cucurbita pepo medullosa apresentou a temperatura ótima a 35°C.
Os resultados obtidos no presente trabalho corroboram com os relatados pela
literatura, principalmente com os artigos que utilizaram ascorbato oxidase de
fonte vegetal pertencente à mesma família (Cucurbitaceae).
0
10
20
30
40
50
60
20 25 30 35 40 45 50
Temperatura (°C)
Ativ
idad
e en
zim
átic
a (U
/mL)
Figura 3.3: Efeito da temperatura na atividade da ascorbato oxidase a pH 6,0.
As enzimas podem ser também desnaturadas em função da
temperatura, ou seja, o aumento da temperatura favorece a entropia no interior
da molécula e a energia destas vibrações pode tornar-se grande o suficiente
para desfazer a estrutura terciária da enzima (CAMPBEL, 2000).
61
A Figura 3.4 apresenta a estabilidade da ascorbato oxidase frente à
diferentes temperaturas durante 60 min de incubação. Verifica-se que a
ascorbato oxidase de Cucurbita maxima foi estável por 60 min na faixa de
temperatura de 10 a 40°C, mantendo em média aproximadamente 100% de
sua atividade. A 60°C a atividade residual foi maior que 50%.
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (°C)
Ativ
idad
e re
sidu
al (%
)
Figura 3.4: Efeito da temperatura na estabilidade da ascorbato oxidase durante
60 min. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0.
Estes resultados corroboram com os obtidos por Maccarrone et al
(1993), que obtiveram para a ascorbato oxidase de Cucurbita pepo medullosa,
uma estabilidade térmica na faixa de 5°C a 55°C, onde a atividade enzimática
residual não foi menor que 70%. No entanto, foi observada completa ausência
de atividade quando a enzima foi incubada a temperaturas acima de 65°C.
Sereikaite et al. (1993) obtiveram para a ascorbato oxidase de Cucurbita sp,
que apresentou estabilidade até 55°C após 30 min, entretanto, quando a
temperatura estudada foi de 60°C ocorreu diminuição na atividade residual de
45% e a 65°C esta diminuiu 70%, após 30 min.
Carvalho et al. (1981) obtiveram resultados de estabilidade a
temperatura semelhante aos apresentados neste trabalho, pois verificaram que
a ascorbato oxidase de Cucurbita maxima foi estável por 30 min até 40°C. Os
62
resultados obtidos neste trabalho mostram que a ascorbato oxidase de
Cucurbita maxima possui estabilidade térmica melhor que as enzimas de
outras fontes vegetais.
3.3.4. Efeito do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da AO após pré-purificação em SDFA.
O estudo do pH e da temperatura na atividade e estabilidade da enzima
pré-purificada (EPP) foi importante para verificar se o processo de purificação
utilizando sistemas de duas fases aquosas alterou as características da
ascorbato oxidase.
O valor de pH que apresentou maior atividade foi o pH 6,0 no tampão
citrato-fosfato 0,1M, o qual apresentou aproximadamente 54 U/mL (Figura 3.5).
Este resultado foi muito semelhante ao determinado para a ascorbato oxidase
presente no extrato bruto (EB), apresentado anteriormente. Além disso, este
tampão e pH (citrato-fosfato 0,1M pH 6,0) são utilizados na metodologia
recomendada para a determinação da atividade da ascorbato oxidase.
0
10
20
30
40
50
60
2 3 4 5 6 7 8 9
pH
Ativ
idad
e en
zim
átic
a (U
/mL)
Figura 3.5: Efeito do pH na atividade da ascorbato oxidase pré-purificada em
SDFA a 25°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 ( ) e tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e 8,0 ( ).
63
A Figura 3.6 apresenta o efeito do pH na estabilidade da ascorbato
oxidase. A enzima apresentou estabilidade ao pH na faixa de 5,0 a 8,0, as
atividades residuais se mantiveram acima de 85% durante 20 horas. Apenas
nos pHs 3,0 e 4,0 foi observada uma menor atividade residual, sendo 31% e
78%, respectivamente. Estes resultados foram muito semelhantes aos obtidos
com a ascorbato oxidase presente no extrato bruto, pois a enzima foi estável
na mesma faixa de pH. A enzima pré-purificada apresentou maior valor de
atividade residual nos pHs 3,0 e 4,0, que a enzima do extrato bruto.
0
20
40
60
80
100
120
2 3 4 5 6 7 8 9
pH
Ativ
idad
e re
sidu
al (%
)
Figura 3.6: Efeito do pH na estabilidade da ascorbato oxidase pré-purificada
em SDFA durante 20 horas a 25°C. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 3,0 a 6,0 e tampão fosfato 0,1M pH 7,0 e 8,0.
A temperatura que proporcionou maior atividade da ascorbato oxidase
pré-purificada foi 35°C (Figura 3.7). A temperatura ótima da ascorbato oxidase
no extrato bruto foi a mesma obtida para a ascorbato pré-purificada, indicando
que a purificação da enzima em sistemas de duas fases aquosas não alterou
as características da enzima.
64
0
10
20
30
40
50
60
70
80
14 18 22 26 30 34 38 42 46 50
Temperatura (°C)
Ativ
idad
e To
tal (
U/m
L)
Figura 3.7: Efeito da temperatura na atividade da AO pré-purificada em SDFA
a pH 6,0.
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (°C)
Ativ
idad
e re
sidu
al (%
)
Figura 3.8: Efeito da temperatura na estabilidade da AO pré-purificada em
SDFA durante 60 min. Tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0.
A Figura 3.8 apresenta o efeito da temperatura na estabilidade da
enzima pré-purificada. Verifica-se que a ascorbato oxidase de Cucurbita
65
maxima foi estável por 60 min de 10°C a 50°C, mantendo aproximadamente
100% de sua atividade. Nas temperaturas 60 e 70°C ocorreu perda total da
atividade. Comparando a atividade da enzima parcialmente purificada em
relação à do extrato bruto, esta última apresentou atividade residual a 60°C
(53%) e a 70°C (12%) após 60 min, deste modo a enzima pré-purificada foi
menos estável a temperaturas mais elevadas.
3.4. CONCLUSÃO
Os resultados demonstraram que o processo de pré-purificação em
sistemas de duas fases aquosas da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima,
não modificou o pH e temperatura ótimos apresentados pela enzima no extrato
bruto. A estabilidade da enzima pré-purificada foi diminuída, embora esta
diminuição não foi significativa o bastante para comprometer o desempenho do
processo de purificação.
66
CAPITULO IV Investigação Cinética e Termodinâmica na atividade da ascorbato oxidase e estabilidade do extrato de Cucurbita
maxima
Tatiana Souza Portoa,b, Camila Souza Portob, Maria Taciana Holanda
Cavalcantia,b, José Luiz Lima-Filhob, Patrizia Peregoc, Ana Lúcia Figueiredo
Portob,d, Attilio Convertic , Adalberto Pessoa-Jra*
aDepartamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica/FCF,
Universidade de São Paulo; bLaboratório de Imunopatologia Keizo Asami
(LIKA), UFPE; cDepartamento de Engenharia química de materiais e de
processos GB Bonino, UNIGE; dDepartamento de Morfologia e Fisiologia
Animal, UFRPE,.
Endereço do autor para correspondência: Adalberto Pessoa Júnior Av. Prof. Lineu Prestes, 580 – Bloco16 CEP: 05508-950, São Paulo, SP, Brasil. Tel: (11) 3091-3710 Fax: (11) 3094-3694 e-mail: [email protected]
Artigo foi publicado no periódico Biotechnology Progress. (ANEXO 2)
67
4.1 INTRODUÇÃO
Ascorbato oxidase (AO) (EC 1.10.3.3) é uma oxidase multicobre que
catalisa a oxidação de um elétron de ácido L-ascórbico, com concomitante
redução de quatro elétrons de oxigênio diatômico a duas moléculas de água.
AO é uma glicoproteína amplamente distribuída em plantas superiores e
microrganismos, a sua principal fonte são os membros da família
Cucurbitaceae (pepino, abobrinha, abóbora, melão, etc.) (DIALINAS et al.,
1997).
Recentemente, esta enzima tem sido usada na composição de
biossensores, bem como nas análises clinicas e alimentares do ácido ascórbico
(SHLEEV et al., 2005). AO de plantas são homodímeros com cada subunidade
contendo um cobre Tipo T1 e um arranjo T2/T3 trinuclear. O cobre T1 é
responsável pela intensa coloração azul da AO, enquanto o cobre T2 pela
transferência de elétrons para o O2 (GUPTA et al., 2004). Dois íons de cobre
T3 são ligados através de uma ponte OH (GUPTA et al., 2004) e acredita-se de
atuar como receptores de elétrons (MESSERSCHMIDT et al., 1992).
A função biológica da AO não é completamente conhecida. A atividade
da AO apresenta um significante aumento durante um período específico do
desenvolvimento do fruto, o qual sugere que ela deve atuar como um
componente importante durante o amadurecimento. A participação da AO na
expansão celular tem sido demonstrada, mas o mecanismo pelo qual ela afeta
o crescimento celular é ainda obscuro (AL-MADHOUN et al., 2003). Acredita-se
que a enzima protege o fruto contra danos oxidativos resultantes de alguma
injúria.
A atividade da AO de Cucurbita maxima demonstrou seguir a lei de
Michaelis-Menten, que depende da ligação com o ácido ascórbico e com o
oxigênio (CARVALHO et al., 1981). AO de C. maxima é considerada
relativamente resistente ao calor, sua atividade permanece quase inalterada
quando foi incubada a 0-40° C por 30 min e foi completamente perdida a 100°C
após 1 min (CARVALHO et al., 1981). Os dímeros de ascorbato oxidase de
pepino demonstraram ser as formas mais resistentes à inativação térmica
(AMON; MARKAKIS, 1973). Todavia, não foi realizado até agora estudos
68
termodinâmicos sistemáticos, com este sistema enzimático, para melhorar o
seu conhecimento.
O objetivo deste trabalho foi realizar uma caracterização cinética e
termodinâmica da atividade e estabilidade da AO de um extrato de C. maxima.
Estes estudos podem ser de crucial importância tanto para estabelecer
os possíveis efeitos das impurezas nas propriedades cinéticas e
termodinâmicas da enzima, como para concentrar e purificar parcialmente a
AO de C. maxima, por extração em sistemas de duas fases aquosas.
Esta tecnologia tem, de fato, um grande potencial principalmente para
separação industrial de enzimas, porque é um método barato e eficiente de
“downstream” e oferece várias vantagens, tais como, tempo de processo
reduzido, baixo consumo de energia e condições adequadas para a
biomolécula (ANTOV et al., 2006). A parte final deste estudo foi direcionada à
estimativa da atividade integral da enzima, simulando o funcionamento de um
biossensor, que pode ser útil para uma variedade de aplicações na indústria
alimentícia (SHLEEV et al., 2005).
4.2. MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1. Preparo do Extrato Enzimático Abóboras, Cucurbita maxima var. jerimum caboclo, foram descascadas a
uma profundidade de aproximadamente 3mm. Ao tecido foi adicionado tampão
citrato/fosfato 0,1M, pH 6,0, mantendo a relação de 1g de tecido por 1,5mL de
tampão. Em seguida foi realizada a homogeneização do extrato com o auxílio
de um processador de alimentos, por 5 min. Após a centrifugação do
homogeneizado a 13.000xg por 10 min a 0-4°C, o precipitado foi desprezado, e
o sobrenadante foi denominado extrato bruto, que foi armazenado a -20°C.
Com a finalidade de minimizar toda a variação da quantidade de AO no extrato
bruto, todos os experimentos foram realizados usando sempre o mesmo grupo
das frutas colhidas imediatamente antes do seu amadurecimento.
4.2.2. Determinação dos Parâmetros Cinéticos e Termodinâmicos da AO Os testes para a determinação dos parâmetros cinéticos da atividade da
AO foram realizados a 25°C e usando diferentes concentrações iniciais de
69
ácido ascórbico (50 ≤ So ≤ 750μM), enquanto aqueles para a estimativa dos
parâmetros termodinâmicos da reação enzimática foram feitos com So = 50μM
e diferentes temperaturas (25 ≤ T ≤ 48°C).
A atividade residual foi determinada utilizando a diluição de volumes
conhecidos de extrato descongelado em tampão citrato-fosfato, anteriormente
descrito, contidos em tubos de vidro de 10mL e expostos na faixa de
temperatura selecionada (10-70°C) a tempos variáveis. Alíquotas (25μL) foram
retiradas em diferentes períodos de tempo (1, 10, 30 e 60 min), imediatamente
resfriadas a 25°C, para garantir eficiente conformação das moléculas da
enzima, eventualmente inativadas reversivelmente, e posteriormente analisada
a atividade da AO.
4.2.3. Determinação da atividade ascorbato oxidase A atividade da AO no extrato (A) foi mensurado a 268nm através da
oxidação do ácido ascórbico (AA) durante 3 min a 25ºC por espectrofotometria,
uma célula de aquecimento foi utilizada para o controle da temperatura
(CARVALHO et al., 1981; AL-MADHOUN et al., 2003). Uma unidade de
atividade é definida a quantidade de enzima que catalisa a oxidação de
1,0μmol de AA por minuto a pH 6,0, sob as condições determinadas.
4.3. TEORIA
4.3.1. Cinética da Atividade Enzimática. A cinética da AO obedece à lei de Michaelis-Menten sendo, portanto,
dependente da concentração do substrato (CARVALHO et al., 1981; FARVER;
PECHT, 1992). Nas condições em que o substrato ácido ascórbico (AA) foi
limitante, usou-se uma equação tipo Michaelis-Menten para calcular a
regressão das atividades iniciais da oxidação do AA, Ao (mM min-1), a partir dos
dados experimentais. Um método não linear de mínimos quadrados foi utilizado, com um
software para minimização de erros (Table Curve Jandel para Windows),
estimando assim, com boa precisão, os valores máximos da atividade inicial,
Ao,max, e a constante de Michaelis, Km (μM), a partir dos dados experimentais
70
de Ao e concentração inicial de AA, So (μM).
4.3.2. Termodinâmica da Reação Enzimática. A termodinâmica da reação enzimática foi investigada utilizando os
experimentos realizados na faixa de temperatura de 25-48°C sob as condições
em que o substrato AA foi limitante. A velocidade da reação específica, kv (min-
1), foi definida como sendo proporcional à diminuição da densidade ótica sob as
condições selecionadas para a determinação da atividade inicial. Esta razão
aumenta com a temperatura em toda a faixa de temperatura investigada, de
acordo com a equação de Eyring (EYRING, 1935):
RS
RTH
Tkhk **ln
B
v Δ+
Δ−= (1)
em que kB é a constante de Boltzmann, h a constante de Planck, R a constante
ideal dos gases, ΔH* a entalpia de ativação e ΔS* a entropia de ativação.
Gráficos, semi-logarítimos de ln(kvh/kBT) em função de 1/T, foram utilizados
para estimar o valor de ΔH* utilizando a inclinação da reta e ΔS* pela
intersecção no eixo das ordenadas, respectivamente. Então, a energia livre de
ativação (ΔG*) foi calculada a uma temperatura de referência de 25°C de
acordo com a equação:
*** STHG Δ−Δ=Δ (2)
4.3.3. Inativação Térmica da Enzima. A inativação térmica da enzima é geralmente descrita, inicialmente pela
desnaturação reversível da sua forma nativa, seguida de uma conformação
intermediária menos estável, a qual está sujeita a desnaturação irreversível e
torna-se uma forma inativa (VOLKIN; KLIBANOV, 1989; MONTES et al., 1995;
RASHID; SIDDIQUI, 1998; BAPTISTA et al., 2000; CONVERTI et al., 2002).
Em relação às AOs de plantas, estas enzimas são homodímeros
estáveis (E2A) (SHLEEV et al., 2005), visto que sua forma monomérica (E1I) é
inativa (MURPHY et al., 1997); conseqüentemente, um mecanismo de reação
71
de primeira ordem pode ser proposto:
kd
E2A 2 E1I (3)
Em que kd (min-1) é a velocidade específica da inativação irreversível ou
desnaturação da AO.
Assim, a velocidade de inativação de E2A pode ser descrita pela equação:
tkψ d−=ln (4)
em que:
oAE
AE
CC ψ
2
2= (5)
Ψ é denominado coeficiente de atividade residual (adimensional) e CE2A e CE2Ao
são as concentrações atual e inicial de E2A, respectivamente.
De acordo com este modelo, já proposto para outros sistemas enzimáticos
(RASHID; SIDDIQUI, 1998; CONVERTI et al., 2002a; HASMANN et al., 2007),
os valores do kd foram estimados a temperaturas diferentes utilizando os
gráficos semi-logarítimos de lnψ em função do tempo. Do mesmo modo que os
parâmetros termodinâmicos da reação enzimática, aqueles de inativação da
enzima foram estimados por gráficos semi-logarítimos de Eyring, os quais
apresentam lnkd em função de 1/T.
4.3.4.Tempo de Meia-Vida da Enzima. O tempo de meia-vida da enzima (t1/2) é definido como o tempo que a
atividade enzimática foi reduzida à metade da atividade inicial e assim
calculado, de acordo com Rashid e Siddiqui (1998), a partir dos valores de kd
como:
t1/2 = ln2/kd (6)
4.4.5. Atividade Integral da Enzima.
Devido à desnaturação enzimática, a atividade da enzima torna-se uma
72
função do tempo de operação ou reação. A atividade integral, P (mM) pode ser
estimada para um processo, utilizando a integração do produto de Ao pelo
coeficiente de atividade (ROELS, 1983; CONVERTI et al., 2002b):
)]exp(1[)exp()( dd
d tkkAdttkAdtAtP o
oo −−=−== ∫ ∫ψ (7)
De acordo com o modelo acima descrito, este parâmetro obtém, até a meia-
vida da enzima (t1/2), o valor:
d1/2 2k
AP o= (8)
e duas vezes este valor determina o tempo infinito (P∞).
4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.4.1. Caracterização Cinética da Atividade da AO.
A Figura 4.1 mostra o gráfico de Lineweaver-Burk da velocidade inicial da
AO em função da concentração inicial de substrato a 25°C. Entretanto, para
maior exatidão, os valores dos parâmetros cinéticos e bioquímicos (Ao,max =
1,57 ± 0,14mM min-1; Km = 126 ± 11μM) foram estimados utilizando um método
de mínimos quadrados não-linear (desvio-padrão médio de 0,03).
O valor estimado de Ao,max foi muito maior que os descritos pela literatura
para as ascorbato oxidases provenientes de extratos de Cucumis sativus
(0,15mM min-1) (FERNANDES et al., 1999), Cucurbita pepo var. condensa
(0,010mM min-1) (FRIEDEN; MAGGIOLO, 1957) e Cucumis anguria (0,012mM
min-1) (COSTA, 1985). Além disso, o valor de Km foi menor que os já descritos
para extratos brutos ou concentrados de C. maxima (Km=200μM) (CARVALHO
et al., 1981), Cucumis sativus (157μM) (FERNANDES et al., 1999) e
Acremonium sp. (290μM) (ITO et al., 1995). Estes resultados, de forma geral,
demonstram a especificidade da ascorbato oxidase contida no extrato bruto de
73
C. maxima nestas condições, considerando a presença simultânea de várias
outras proteínas no extrato.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025
1/S o (1/μM)
1/A
o (m
in/m
M)
Figura 4.1: Curva de Lineweaver-Burk. Inverso da velocidade inicial de
oxidação do AA em função do inverso da concentração inicial de substrato (R2 =0,98).
4.4.2. Termodinâmica da Reação Enzimática.
A Figura 4.2 apresenta o gráfico de Eyring com o semi-logaritmo da
velocidade específica de reação em função do recíproco da temperatura
absoluta, que tenta estimar, com boa correlação (R2=0,99), a entalpia de
ativação (ΔH*) e entropia (ΔS*) da reação de oxidação do AA pelo extrato bruto
de C. maxima. A faixa de temperatura investigada (25-48°C) foi selecionada
com base em artigos prévios da literatura, que apresentaram como temperatura
ótima para a atividade da AO (30-35°C) (MURAO et al., 1991; MACCARRONE
et al., 1993; FARVER et al., 1998; FERNANDES et al., 1999). Sabe-se que,
uma estimativa gráfica das entropias é de difícil realização, pois uma tentativa
rigorosa de determinação requer a utilização de aproximações matemáticas
complexas, as quais seriam quase impossíveis de se aplicar aos sistemas
biológicos, e estão fora do propósito deste estudo. Os valores estimados
74
destes parâmetros são apresentados na Tabela 4.1 juntamente com aqueles
do ΔG* calculado pela Eq. (2).
A velocidade da reação específica aumentou com temperatura, de acordo
com Eq. (1), dentro da faixa de temperatura selecionada para este estudo.
Contrário ao que tem sido observado para as preparações enzimáticas
similares (CONVERTI et al., 2002a; CONVERTI et al., 2002b; HASMANN et al.,
2007), nenhuma diminuição na atividade inicial em função da temperatura foi
detectada, o que confirmou a resistência térmica do extrato bruto de C. maxima
para a possível aplicação industrial. Este resultado sugere uma temperatura
ótima para a atividade enzimática maior que aquelas para AOs purificadas de
C. pepo medullosa (35°C) (MACCARRONE et al., 1993), Acremonium sp. HI-25
(45°C) e pepino (30°C) (MURAO et al., 1991).
-35,5
-35,3
-35,1
-34,9
-34,7
-34,5
3,10 3,15 3,20 3,25 3,30 3,35 3,40
1/T.103 (1/K)
ln(k
vh/k
BT
)
Figura 4.2: Gráfico semi-logarítimico de Eyring para a determinação dos
parâmetros termodinâmicos da reação enzimática.
75
Tabela 4.1 - Parâmetros Termodinâmicos da reação enzimática e Inativação Térmica do extrato bruto de C. maxima
ΔG*
(kJ mol-1)
ΔH*
(kJ mol-1)
ΔS*
(J mol-1 K-1)
R2
Atividade da AO a 87,2 10,3 -258 0,993
Inativação da AO b 103 51,7 -160 0,967 aTemperatura de referência: 25°C. bTemperatura de referência: 50°C.
É provável que o ambiente natural do extrato enzimático forneceu à
ascorbato oxidase uma proteção contra a inativação térmica, o que sugere a
investigação da estabilidade enzimática a longo do tempo com o auxílio de
testes de atividade residual.
A entalpia de ativação da reação enzimática (ΔH* = 10,3kJ mol-1) foi
muito baixa e está de acordo com a elevada eficiência na oxidação do AA pela
AO. Além disso, está próximo dos valores estimados para a atividade (10kJ
mol-1) (MACCARRONE et al., 1993) e para a transferência eletrônica interna no
Cu (II) de T1 a T3 da AO purificada de C. pepo medullosa (ΔH* = 6,8-9,1kJ mol-
1) (FARVER; PECHT, 1992). Este resultado não deveria ser inesperado,
considerando que tal transferência de elétrons poderia ter se transformado, sob
as condições selecionadas, na etapa determinante da atividade total da AO. O
valor de ΔH* acima descrito não diferiu muito daqueles estimados para a
atividade da AO da fração solúvel de folhas de repolho (Brassica oleracea)
(18,4kJ mol-1) e de abóbora (Cucurbita pepo) (14,6 – 16,7kJ mol-1), sobretudo
se compararmos com os valores de ΔH* das suas células (ΔH* = 50,2 e 28kJ
mol-1, respectivamente) (HALLAWAY et al., 1970), como também com o extrato
de abóbora (C. maxima) 30 vezes purificada (ΔH* = 36,8kJ mol-1) (CARVALHO
et al., 1981), que foram significativamente mais elevados. Os valores
relativamente baixos da entalpia de ativação são típicos da maioria das
oxidorredutases devido à transferência interna de elétrons. Por exemplo, Farver
et al. (1998) reportaram uma entalpia de ativação de 22,7 ± 3,4kJ mol-1 para a
nitrito redutase.
76
O valor estimado de ΔH* neste trabalho foi aproximadamente 8 vezes
menor que a energia de ativação necessária para a reação catalisada pelo
CuSO4 (ΔH* = 92,1kJ mol-1) (CARVALHO et al., 1981).
O valor de ΔS* (-258J mol-1 K-1), alto e negativo, condiz com a formação
de um estado de transição, que é uma estrutura mais rígida com respeito à
separação dos reagentes (AO e AA) e está de acordo com aqueles reportados
para muitos outros sistemas enzimáticos (AIBA et al., 1973; CONVERTI et al.,
2002b; ALBERTY, 2003), particularmente, aqueles estimados para a AO
purificada de C. pepo medullosa (de -215 a -170J mol-1 K-1) (FARVER; PECHT,
1992; FARVER et al., 1998). Pelo fato da entropia de ativação incluir um fator
eletrônico (isto é, o coeficiente de transmissão), uma justificativa dos baixos
valores das constantes cinéticas, poderia ser uma combinação entre as
ligações fracas e as mudanças ocorridas nas estruturas dos respectivos sítios
receptores de elétrons. Em outras palavras, a desvantajosa contribuição da
entropia deveria ter sido quase que completamente contrabalançada a situação
de entalpia favorável. Como resultado, o sistema apresentou um valor
relativamente alto e positivo para a energia livre de ativação (ΔG* = 87,2kJ mol-
1). Este valor é maior que aqueles estimados utilizando os dados de literatura
para a AO purificada (ΔG* = 60-70kJ mol-1).
Comparando os parâmetros termodinâmicos estimados neste trabalho
com aqueles de AO pura, nota-se que a presença da AO no extrato natural de
C. maxima conferiu à enzima uma resistência ao stress do calor inicial, o qual
obviamente diminuiu esta atividade. Todavia, não ficou claro se as impurezas
contidas no extrato exerceram alguma influência sobre os parâmetros
termodinâmicos da reação enzimática, assim necessitando maiores
investigações usando um extrato parcialmente purificado ou mesmo a AO
purificada oriunda desta variedade.
4.4.3. Termodinâmica da Inativação Térmica da AO.
Esta parte do estudo foi direcionada para o efeito da temperatura na
termoestabilidade da AO em período mais longo, uma vez que foi observada
relativa insensibilidade à temperatura da atividade inicial da AO no extrato
enzimático a 25-48°C, como anteriormente descrito. Para este propósito, testes
77
de atividade residual foram realizados com uma larga faixa de temperatura (10-
70°C) cujos resultados, em termos de coeficiente de atividade residual da AO
(ψ), estão apresentados na Figura 4.3. A menor temperatura (10°C) foi
selecionada como a temperatura de referência na qual a inativação térmica da
enzima poderia ser considerada quase desprezível. Tendência linear similar,
relacionada à inativação irreversível pelo calor, também foi observada por
Macarrone et al. (1993) para a AO purificada de C. pepo medullosa.
-2,0
-1,6
-1,2
-0,8
-0,4
0,0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (min)
ln ψ
70°C
60°C
50°C
40°C30°C10-20°C
Figura 4.3: Gráficos semi-logarítimos de Eyring com correlação entre o tempo
e o coeficiente de atividade residual da AO (ψ ) do extrato bruto de C. maxima.
Dentro da faixa de temperatura estudada, a atividade da AO apresentou
típico decaimento de desnaturação, como verificado nas clássicas enzimas
com comportamento de primeira ordem e semelhante ao observado por
Moreno et al. (1997) para as enzimas lipases purificadas, nas formas nativas e
imobilizadas.
Os resultados cinéticos destes testes, resumidos na Tabela 4.2, mostram
que a velocidade específica de desnaturação da AO (kd) aumentou
progressivamente com a temperatura. Isto significa que a inativação enzimática
torna-se progressivamente mais significante, aparentemente devido à ruptura
78
das fortes interações eletrostáticas entre as subunidades de E2A e formação
de um monômero totalmente inativo (E1I).
Tabela 4.2 - Velocidade Específica de Desnaturação da AO (kd), Meia-Vida (t1/2) e Atividade Integral até t1/2 (P1/2) e Tempo Infinito (P∞) estimados para o extrato bruto de C. maxima a diferentes temperaturas
T (°C) 10 20 30 40 50 60 70
kd .103
(min-1) 0,662 0,822 1,80 3,40 6,00 16,7 32,7
t1/2 (min) 1047 844 385 204 115 41,5 21,2
P1/2 (mM) 205 166 78,6 34,2 21,3 6,89 0,535
P∞ (mM) 410 332 157 68,3 42,6 13,8 1,07
Deve ser evidenciado que os valores de kd foram particularmente baixos
(de 6,62.10-4min-1 a 10°C à 0,0327min-1 a 70°C) e os valores de t1/2
particularmente altos (1047min a 10°C e 21,2min a 70°C) se comparados com
aqueles de AO pura de C. pepo medullosa inativada termicamente
(kd=0,032min-1 e t1/2=21,5min a 55°C; perdeu completamente a atividade a T >
65°C) (MACARRONE et al., 1993). Estes resultados condizem tanto com a
termoestabilidade, durante longo prazo, da preparação enzimática, bem como
com a degradação mais lenta da AO à uma temperatura mais baixa.
Por outro lado, em T ≥ 40ºC, os valores de meia-vida foram muito
menores que aqueles à baixa temperatura. Isto é, a enzima foi desnaturada
rapidamente. Como conseqüência destes efeitos, a dependência do tempo
relativa à atividade total da AO foi mais influenciada pelo aumento da
temperatura, do que a atividade inicial foi favorecida. Do mesmo modo,
parâmetros de termoestabilidade melhores (t1/2 ≅ 128min a 60°C) puderam ser
calculados utilizando os dados descritos para a AO monomérica termoestável
de Acremonium sp. HI-25 clonada em Aspergillus nidulans (TAKEDA et al.,
1998).
A Figura 8 apresenta o gráfico semi-logarítimo de kd em função do
recíproco da temperatura absoluta, a qual possibilitou a estimativa dos
parâmetros termodinâmicos da inativação irreversível da AO (Tabela 4.2).
79
-43
-42
-41
-40
-39
-38
-37
-36
2,9 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6
1/T .103 (1/K)
ln(k
dh/k
BT)
Figura 4.4: Gráfico semi-logarítimo de Eyring para a estimativa dos parâmetros
termodinâmicos da inativação térmica irreversível da AO.
A inativação enzimática foi caracterizada por uma entalpia de ativação
de 51,7kJ mol-1 e um valor negativo, relativamente alto, da entropia de ativação
(ΔS*D = -160J mol-1 K-1), resultando, particularmente, em alta energia livre de
ativação (ΔG*D = 103kJ mol-1), a qual foi consistente com a alta
termoestabilidade do extrato bruto. O valor estimado de ΔH*D foi comparável
com aqueles descritos pela literatura para vários sistemas biológicos.
Surpreendentemente, encontraram-se na faixa de valores reportados para
desnaturação térmica reversível (56-150kJ mol-1) (CONVERTI et al., 2002a e
2002b), e foi muito mais baixo que aqueles descritos para desnaturação
irreversível de diferentes enzimas (220-235kJ mol-1) (ROELS, 1983; ROSSI et
al., 2003).
Todavia, alguns estudos interessantes sobre a inativação da AO por
diferentes métodos, destacaram que este fenômeno ocorre irreversivelmente
(SAVINI et al., 1990). O valor negativo estimado para ΔS*D forneceu várias
informações sobre a possível tempo-dependência do mecanismo de inativação.
Inicialmente, a absorção de calor pelo extrato poderia inativar irreversivelmente
o dímero estável a monômeros desnaturados inativos. Em uma etapa
80
subseqüente, duas moléculas monoméricas poderiam ter se agregado dando
um estado de transição com estrutura mais rígida do que as moléculas
separadas.
A tendência, observada neste trabalho, para a termo-inativação da AO
foi qualitativamente diferente das múltiplas etapas descritas na literatura para
as bem conhecidas enzimas termoestáveis, tais como as lipases psicrotróficas
(OWUSU et al., 1992) e a glicose-6-fosfato desidrogenase (HASMANN et al.,
2007).
4.4.4. Atividade Integral Um aumento na termoestabilidade é freqüentemente acompanhado por
uma diminuição na atividade e vice-versa. Uma correlação, entre estas
tendências opostas, deveria então ser pesquisada para selecionar as melhores
condições para implementação em um processo industrial. Para esta
finalidade, a atividade integral até a meia-vida (P1/2) foi calculada pela Eq. (8)
(Tabela 4.2).
Considerando a possível utilização industrial da atividade de AO no
extrato, investigou-se o comportamento da atividade integral em função do
tempo, P (t), definida na Eq. (7), que representa a quantidade de ácido
ascórbico oxidado por 1g de biocatalizador sob condições contínuas de
alimentação (CONVERTI et al, 2002c). Este sistema pode simular uma coluna
oxidativa e funcionar como um biossensor em uma variedade de aplicações no
que diz respeito à indústria alimentícia (IIDA et al., 2003). A possibilidade de
uso com sucesso de extratos brutos para a preparação de biossensores, de
fato, tem sido demonstrada (FATIBELLO-FILHO; VIEIRA, 2002).
O modelo descrito pela Eq. (7) foi ilustrado na Figura 4.5, onde a
atividade integral estimada, na faixa de temperatura 10-70°C, foi traçada em
função do tempo em um gráfico bi-logarítimo. Todas as curvas cresceram
linearmente com quase a mesma velocidade inicial. Como conseqüência, a
desnaturação enzimática tornou-se significante só depois de um tempo
relativamente longo (2000min). Além disso, este tempo foi curto (70min) a
temperaturas elevadas, por causa dos altos valores de kd; conseqüentemente,
a atividade obteve valores progressivamente menores de P∞.
81
-4
-2
0
2
4
6
8
0 2 4 6 8 10 12
lnt
lnP
10°C20°C30°C40°C
60°C
70°C
50°C
Figura 4.5: Atividade Integral de AO (P, mM) em função do tempo (t, min) no
extrato bruto de C. maxima a diferentes temperaturas.
A única exceção desta tendência foi observada nos experimentos
realizados a 70°C, os quais exibiram uma notável perda da atividade inicial em
relação aos outros. Estes resultados estão de acordo com os observados por
Maccarrone et al. (1993), que sugeriram a ocorrência de um decréscimo na
atividade inicial com a temperatura, não evidenciado na faixa anteriormente
investigada (25-48°C) do nosso trabalho. Finalmente, a longa duração deste
aumento linear em todos os casos (≥ 50min) está de acordo com os valores
muito baixos de kd, isto é, com a termoestabilidade do extrato.
4.5. CONCLUSÃO
Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos da atividade e estabilidade da
AO do extrato de Cucurbita maxima foram estimados neste trabalho. A
constante de Michaelis para o ácido ascórbico e a atividade máxima foram
126μM e 1,57mM min-1, respectivamente. Os testes de atividade inicial
realizados a 25-48°C foram utilizados para estimar os seguintes parâmetros
termodinâmicos da reação enzimática: ΔG* = 87.2 kJmol-1; ΔH* = 10.3kJ mol-1;
ΔS* = -258J mol-1 K-1. Testes de atividade residual foram realizados a 10-70°C
para estimar a longa meia-vida da enzima (t1/2 ≥ 204min a T ≤ 40°C), bem
82
como os parâmetros termodinâmicos da inativação irreversível da AO (ΔG*D =
103kJ mol-1; ΔH*D = 51.7kJ mol-1; ΔS*D = -160J mol-1 K-1). Os valores estimados
para a meia-vida da enzima revelaram a termoestabilidade desta preparação
enzimática para futuras aplicações. Com este propósito, a atividade integral da
enzima contida no extrato, foi também predita.
83
CAPITULO V Extração contínua da ascorbato oxidase em sistemas de duas fases aquosas PEG/citrato, utilizando a coluna de discos perfurados rotativos
Tatiana Souza Portoa,b, Petrus Pires Marquesb , Camila Souza Portob, Maria
Taciana Holanda Cavalcantia,b, Benício de Barros Netoc, José Luiz Lima-Filhob,
Attilio Convertie, Ana Lúcia Figueiredo Portob,d, Adalberto Pessoa-Jra*
aDepartamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica /FCF, Universidade de
São Paulo; bLaboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), UFPE; cDepartamento de Química Fundamental, UFPE; dDepartamento de Morfologia
e Fisiologia Animal, UFRPE, eDepartamento de Engenharia química de
materiais e de processos GB Bonino, UNIGE.
Endereço do autor para correspondência: Adalberto Pessoa Júnior Av. Prof. Lineu Prestes, 580 – Bloco16 CEP: 05508-950, São Paulo, SP, Brasil. Tel: (11) 3091-3710 Fax: (11) 3094-3694 e-mail: [email protected]
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Biochemical
Enginieering Journal.
Parte dos resultados será apresentada no XVII Congresso Brasileiro de
engenharia química em setembro de 2008.
84
5.1. INTRODUÇÃO A determinação e/ou monitoramento da vitamina C (ácido ascórbico) em
produtos comercializados e fármacos em geral é de extrema importância, pois
o ácido ascórbico presente em sucos de frutas naturais oxida-se rapidamente
e, em sucos comercializados, a oxidação desse ácido depende da
concentração e tipo de antioxidante utilizado, bem como das características da
embalagem e condições de armazenamento dos produtos (FATIBELLO-FILHO;
VIEIRA, 2002).
A enzima ascorbato oxidase (EC 1.10.3.3) tem sido extraída de diversos
vegetais, tais como: melão, abóbora, pepino, uva, laranja, pimenta, tomate,
pimentão e carambola (GARCÍA-PINEDA et al., 2004).
A ascorbato oxidase é uma enzima dimérica, contém cobre como cofator
e catalisa a redução de quatro elétrons de dois oxigênios para água, usando
preferivelmente a molécula de ácido ascórbico, como um substrato. A enzima
pertence à família das oxidases azuis multicobres que incluem lacases em
plantas e microrganismos, e ceruloplasminas em animais (SANTAGOSTINI et
al., 2004).
Em geral, a recuperação de proteínas de plantas inclui extração,
clarificação, recuperação da proteína, purificação e refinamento. O custo total
de produção é principalmente determinado pela eficiência da recuperação
inicial e dos passos de purificação (RITO-PALOMARES, 2004). Assim, o
estabelecimento de procedimentos de recuperação primária eficientes para as
biomoléculas é necessário. Neste contexto, sistemas de duas fases aquosas
(SDFA) é uma alternativa atrativa para facilitar a adorção de bioprocessos
básicos nas plantas de sistemas de produção (AGUILAR; RITO-PALOMARES,
2008).
As principais vantagens na purificação de biomoléculas pelo sistema de
duas fases aquosas são: a facilidade no aumento da escala; rápida
transferência de massa; equilíbrio alcançado com recursos a baixa energia na
forma de mistura mecânica; possibilidade de operação rápida e seletiva;
possibilidade de operação à temperatura ambiente e mais econômico que
outros processos de separação (ALBERTSSON, 1986).
Planejamento estatístico dos experimentos é frequentemente utilizado
para otimização e controle de processos com SDFA. Sendo um método
85
conveniente para estudar os efeitos das variáveis envolvidas na purificação,
porque ele é capaz de estimar seus efeitos significativos sobre as respostas
selecionadas, bem como suas possíveis interações (CAVALCANTI et al.,
2007).
Outra ferramenta que tem sido aplicada com sucesso para extração
líquido-líquido com sistemas de duas fases aquosas é a coluna de discos
rotativos perfurados (PRDC). Este tipo de equipamento para extração mostrou
grande eficiência e melhor flexibilidade operacional que os tipos de
equipamentos mais convencionais (PORTO et al., 2004).
Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas
funções: i) estabelecer o contato entre as duas fases líquidas presentes no
sistema, em geral pela dispersão de uma fase na outra, com o objetivo de
possibilitar a transferência de massa; e ii) separar os dois líquidos depois da
extração. A mistura de dois líquidos consiste geralmente em um conjunto de
gotas de uma fase dispersa no contínuo da outra (PESSOA-JR; KILIKIAN,
2005).
Ainda é pequeno o número de sistemas de duas fases aquosas
PEG/sais, que têm sido estudados em coluna de discos rotativos perfurados
(SARUBBO et al., 2003), principalmente para o sistema PEG/citrato não foram
encontrados artigos utilizando a PRDC.
Este trabalho teve como finalidade obter condições de extrair e pré-
purificar a enzima ascorbato oxidase de Cucurbita maxima por extração em
sistemas de duas fases aquosas (PEG/citrato) de modo contínuo, utilizando
coluna de discos rotativos perfurados (PRDC).
5.2. MATERIAL E MÉTODOS
5.2.1. Ascorbato oxidase
A ascorbato oxidase (E.C.1.10.3.3.) foi extraída da abóbora Cucurbita
maxima, conhecida regionalmente no nordeste, como jerimum, variedade
“jerimum caboclo”.
86
5.2.2. Preparo do Extrato Enzimático As abóboras foram descascadas a uma profundidade de
aproximadamente 3mm. Ao tecido foi adicionado tampão citrato/fosfato 0,1M,
pH 6,0, mantendo a relação de 1g de tecido por 1,5mL de tampão. Em seguida
foi realizada a homogeneização do extrato com o auxílio de um processador de
alimentos, por 5 min. Após a centrifugação do homogeneizado a 13.000xg por
10 min a 0-4°C, o precipitado foi desprezado, e o sobrenadante foi denominado
extrato bruto, que foi armazenado a -20°C. Com a finalidade de minimizar toda
a variação da quantidade de AO no extrato bruto, todos os experimentos foram
realizados usando sempre o mesmo grupo das frutas colhidas imediatamente
antes do seu amadurecimento.
5.2.3. Coluna de discos perfurados rotativos A coluna foi feita em Acrílico (Perspex) com 32mm de diâmetro interno e
170mm de altura. Seis discos perfurados rotativos com 30mm de diâmetro
cada, com 20 buracos com 2mm de diâmetro cada (área livre
aproximadamente 20%) foram montados em um eixo central e separados
igualmente. A coluna foi mantida a temperatura ambiente (25º C ±2º C).
Figura 5.1: Desenho esquemático da extração contínua em coluna de discos
rotativos perfurados. Os números significam: 1=eixo rotativo central, 2=entrada da fase pesada (sal), 3=saída da fase pesada ou contínua (rafinado), 4=entrada da fase leve ou dispersa (PEG), 5=saída da fase
87
leve (extrativa), 6=entrada de água d refrigeração e 7=saída da água de refrigeração.
5.2.4. Extração contínua em sistema de duas fases aquosas O sistema de duas fases aquosas (700g) foi preparado a partir de
soluções estoque de 30% (m/m) citrato/ácido cítrico a pH 6,0. A solução
estoque de citrato/ácido cítrico consistiu da mistura de citrato de sódio
trissódico anidro (Na3C6H6O7) e ácido cítrico monohidratado (C6H8O7. H2O). A
composição do sistema usada foi determinada em estudos em modo de
extração contínua, sendo de 10% (m/m) de PEG, 25% (m/m) de citrato a pH
6,0. O sistema foi agitado por 4h a temperatura ambiente de 25ºC, depois
incubado em um funil de decantação por um período de 12h a temperatura
ambiente. Decorrido este tempo, as fases foram separadas e serviram para
alimentar a coluna através de bombas peristálticas.
Na extração contínua, realizada com uma coluna de discos perfurados
rotativos, foram utilizadas as seguintes etapas de operação:
• A coluna foi inicialmente alimentada com 90mL da fase contínua (fase
pesada – solução com o sal citrato de sódio e o extrato enzimático). Após,
iniciou-se o bombeamento desta fase com auxílio de uma bomba
peristáltica, tanto para a entrada como para a drenagem da fase contínua.
Este processo foi realizado até o equilíbrio, ou seja, o volume não se
alterava.
• Em seguida, foi acionado o mecanismo de agitação dos discos, e depois de
ajustada a vazão de entrada com a de saída da fase contínua, foi iniciada
então a alimentação da fase dispersa (fase leve - PEG). Para estes
procedimentos foram utilizadas duas bombas peristálticas (cada uma com
dois canais), a fim de garantir a velocidade de fluxo requerida para cada
fase;
• As amostras da fase contínua e dispersa foram recolhidas em intervalos de
tempo de 10, 20, 30, 40, 50 e 60min de operação e em seguida submetidas
às determinações de proteína e atividade enzimática, conforme o caso.
• O processo de extração foi interrompido aos 65min e o conteúdo interno foi
mensurado e verificado o volume referente a cada fase do sistema.
88
5.2.5. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos
Estudos iniciais com a coluna de discos rotativos perfurados (PRDC)
foram realizados para a investigação das melhores condições a serem
utilizadas na coluna de extração, pois não poderia ser utilizada a condição
encontrada para os sistemas PEG/citrato operados em modo descontínuos, já
que a condição determinada apresentou uma alta viscosidade e isso impediu a
sua utilização em sistemas contínuos, pois as bombas peristálticas não foram
capazes de impulsionar uma solução muito viscosa. Então foi necessário testar
diversas composições dos sistemas para saber qual seria a condição mais
adequada a ser utilizada na extração da ascorbato oxidase de Cucurbita
maxima.
Foi realizado um planejamento estatístico experimental 23 com 2 pontos
centrais (Tabela 5.1). As condições utilizadas foram: número de discos 6,
velocidade de rotação dos discos 80rpm, velocidade de fluxo da fase dispersa
2mL/min e velocidade de fluxo da fase contínua 1mL/min.
Tabela 5.1 - Planejamento fatorial completo (23) para a extração continua da ascorbato oxidase em sistema de duas fases aquosas, utilizando PRDC.
Níveis Variáveis
Inferior (-1) Central (0) Superior (+1)
MMPEG (g/mol) 3350 8000 20000
CPEG (%) 10 15 20
Citrato (%) 15 20 25
Para dar continuidade a investigação das melhores condições
operacionais da coluna de extração, utilizando as condições encontradas como
satisfatória para sistemas contínuos em PRDC no planejamento anteriormente
descrito. Foram estudadas velocidades de rotação dos discos e velocidade da
fase dispersa (PEG) para determinar a condição mais eficiente para extrair em
modo contínuo a ascorbato oxidase de Cucurbita maxima.
Foi realizado um planejamento fatorial completo (22) com 4 pontos
centrais. A composição e concentrações do sistema utilizadas foram: massa
molar do PEG 20.000 (g/mol), concentração de PEG 10%, concentração de
89
citrato 25% e pH 6,0. Os estudos de extração em processo contínuo em geral
não utilizavam planejamentos estatísticos, porém Cavalcanti et al., (2008)
utilizou planejamentos estatísticos como uma ferramenta de auxílio para o
estudo da extração em modo contínuo. Foi utilizado o planejamento fatorial
completo para determinar as condições operacionais mais adequadas da
PRDC, para extração da ascorbato oxidase em SDFA (PEG/citrato).
Tabela 5.2 - Planejamento fatorial completo (22) para a extração continua da ascorbato oxidase em sistema de duas fases aquosas, utilizando PRDC.
Níveis Variáveis
Inferior (-1) Central (0) Superior (+1)
Vel. de rotação dos
discos (rpm) 35 80 140
Vel. de fluxo da fase
dispersa (mL/min) 1 2 3
5.2.6. Determinações analíticas A atividade da ascorbato oxidase foi determinada segundo metodologia
descrita por Carvalho et al. (1981), a qual utiliza o ácido ascórbico 50μM em
tampão citrato-fosfato 0,1M pH 6,0 como substrato.
O sistema de reação foi constituído por 675μL do tampão contendo o
substrato e 25μL da solução contendo a enzima. O consumo do substrato foi
acompanhado por espectrofotometria durante 5 min, sendo a absorbância
determinada a 268nm, registrada a cada 1min.
Uma unidade de atividade equivale à oxidação de 1,0μmol de L-
ascorbato em dehidroascorbato por minuto, no pH 6,0, à temperatura de 25°C,
sendo expressa em μmol de ácido ascórbico/min ou em U/mL. A atividade
específica foi calculada pela razão entre a atividade total e a quantidade de
proteínas contidas em 1mL de amostra (μmol/min.mg ou U/mg).
A concentração de proteínas totais foi determinada de acordo com o
método de Bradford (1976). As amostras controle dos sistemas de duas fases
aquosas continham água em substituição ao extrato enzimático.
90
5.3. DEFINIÇÃO DOS PARÂMETROS DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO CONTÍNUA
Considerando o estado de equilíbrio do processo, foram calculados os
seguintes parâmetros do processo de extração contínua:
O hold up (H) determina a quantidade de fase extratora, ou seja, a
capacidade de extração. Este parâmetro foi calculado pela razão do volume da
fase dispersa (VD) e o volume total do sistema no interior da coluna (VT).
TVVH D=
A eficiência de separação (ES) foi calculada utilizando a equação abaixo:
100C
CCE1
21s ∗⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛ −=
C1 = concentração de proteína na entrada da fase contínua (mg/mL)
C2 = concentração de proteína na saída da fase contínua (mg/mL)
O coeficiente de transferência de massa (KDa) foi expresso como função
da concentração pelo seguinte balanço material descrito pela equação abaixo:
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛∗−∗−
∗=∴
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛∗−∗−
∗=
fcsai
fcent
fcsai
fcentD CKC
CKClnVQKda
CKCCKClnV
QaK
Q = velocidade de fluxo da fase dispersa; (mL/min)
Cent = concentração de proteína na entrada da fase contínua; (mg/mL)
Csai = concentração de proteína na saída da fase contínua; (mg/mL)
Cfc = valor médio entre a concentração final da fase dispersa e o valor
inicial na mesma fase; (mg/mL)
K = coeficiente de partição da proteína ou da enzima; (adimensional)
V = volume inicial da fase contínua (coluna) (mL).
O Aumento de pureza (AP) da ascorbato oxidase foi definido como a
razão entre a atividade específica da enzima após a extração em SDFA na
PRDC e a atividade específica da enzima antes da extração.
ei
e
AA
AP 1=
91
em que: Ae1=atividade específica na fase extraída (U/mg); Aei=atividade
específica da amostra antes da extração (U/mg); AP=aumento de pureza
(adimensional)
A recuperação em atividade da ascorbato oxidase foi determinada pela
razão entre a atividade volumétrica da fase e atividade volumétrica no extrato
bruto, ambas multiplicadas pelos seus volumes.
100. xAAY
iC
D⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
em que o AD e AC são as atividades enzimáticas em U/mL na saída da fase
dispersa e na entrada da fase contínua (antes da partição), respectivamente.
O coeficiente de partição da enzima entre as fases de um sistema de
duas fases aquosas foi calculado pela seguinte expressão:
C
D
AAK =
em que: AD e AC são as atividades enzimáticas nas fases dispersa e contínua
(U/mL), respectivamente.
5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.4.1. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos
A Figura 5.2 apresenta os resultados obtidos da extração contínua da
ascorbato oxidase (ensaio 4 da Tabela 5.3). Pode-se verificar um aumento
crescente da quantidade de proteína transferida da fase rica em sal para fase
rica em PEG até o final da extração, e o mesmo comportamento ocorreu em
relação à atividade enzimática.
92
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 10 20 30 40 50 60 700,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18AT salAT PEGPT salPT PEG
Ativ
idad
e to
tal -
AT
(U/m
L)
Tempo (min)
Proteína total - PT (mg/m
L)
Figura 5.2: Comportamento de extração da ascorbato oxidase em PRDC.
Proteína total residual na fase sal (rafinado) (-♦-), Proteína total na fase PEG (- -), Atividade total residual na fase sal ( ), Atividade total na fase PEG ( ), após extração com sistemas PEG 20000/citrato (20% e 15% m/m) e pH 6,0, 23°C±2°C.
Os resultados obtidos do planejamento experimental com a coluna de
discos rotativos perfurados foram resumidamente apresentados na Tabela 5.3.
A eficiência na extração foi avaliada no tempo 30min, no qual o processo
estava no estado estacionário (“steady state”), ou seja, em equilíbrio.
93
Tabela 5.3 - Resultados do planejamento fatorial completo (23) da extração contínua da ascorbato oxidase em PRDC utilizando PEG/Citrato.
ensaios MMPEG (g/mol)
CPEG (%)
Citrato (%)
K AP Y (%) KDa Es (%)
H
1 3350 10 15 0,214 1,99 15,58 0,0041 16,86 0,619
2 20000 10 15 0,162 2,14 16,67 0,0025 10,65 0,552
3 3350 20 15 0,439 2,36 20,16 0,0063 24,57 0,642
4 20000 20 15 0,224 2,49 16,67 0,0163 51,60 0,527
5 3350 10 25 0,381 0,88 13,11 0,0172 53,31 0,561
6 20000 10 25 3,356 1,46 86,78 0,0586 54,98 0,400
7 3350 20 25 1,667 0,95 28,99 0,0143 46,61 0,605
8* 20000 20 25 - - - - - -
9 (C) 8000 15 20 0,364 0,51 14,04 0,0110 39,45 0,718
10 (C) 8000 15 20 0,265 0,18 18,57 0,0136 37,24 0,556
* Não formação de duas fases aquosas.
Observando a Tabela 5.3, nota-se que a enzima migrou para a fase
dispersa rica em PEG apenas em dois ensaios (6 e 7), o que significa que na
maioria das condições estudadas a ascorbato oxidase permaneceu na fase sal.
Este comportamento confirmou os dados apresentados por Porto et al. (2004)
que obteve maior concentração da enzima ascorbato oxidase na fase rica em
sais de fosfato, mesmo quando a enzima foi alimentada na coluna utilizando a
fase PEG. O ensaio de número 8 não pode ser realizado devido à não
solubilização dos componentes do sistema.
94
5,28
8,01
-9,06
-11,98
22,19
-22,77
-24,42
p=0,05
Efeito estimado (valor absoluto)
(1)MMPEG
1*3
(2)CPEG
2*3
(3)Citrato
1*2*3
1*2
Figura 5.3: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta o coeficiente de partição da ascorbato oxidase na fase dispersa. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato.
Observa-se na Figura 5.3, que a interação entre (1)MMPEG e (2)CPEG,
a interação entre as três variáveis (1*2*3) e a concentração de citrato (3) foram
significativas com nível de confiança de 95%.
Observando as interações apresentadas na Figura 5.4, verificou-se que
a massa molar do PEG de 20000 (g/mol), concentração do PEG de 10% (m/m)
e concentração de citrato de 25% (m/m) foram as condições que melhor
favoreceram a partição da enzima para a fase dispersa, rica em PEG. Baixas
concentrações de PEG associadas com elevadas concentrações de citrato e
elevadas massas molares de PEG favoreceram preferencialmente a
transferência da enzima para a fase dispersa, aumentando o coeficiente de
partição.
Alguns autores têm proposto que quando o sistema apresentar elevada
massa molar do PEG, um forte efeito de volume de exclusão deveria ocorrer,
sugerindo então que não existia espaço suficiente para a enzima na Fase PEG
95
do sistema (MARCOS et al., 1999; RABELO et al., 2004; PESSOA-JR;
KILIKIAN, 2005). Todavia, este fenômeno não foi observado nos resultados
obtidos neste trabalho.
0,12
-0,09
0,06
3,25
0,34
1,56
0,11
0,28
Figura 5.4: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG, concentração de PEG e concentração de citrato) de um planejamento 23, tendo como variável-resposta o coeficiente de partição (K) da ascorbato oxidase.
A análise estatística para o aumento de pureza foi realizada, mas
nenhuma variável independente apresentou efeito significativo. Observando a
Tabela 5.3 verificou-se que o sistema com PEG 20000 (g/mol), concentração
do PEG 20% (m/m) e concentração de citrato 15% (m/m) apresentou o maior
valor para o aumento de pureza (2,49), o que confirmou os resultados obtidos
na extração descontínua, apenas com uma diferença na concentração do PEG,
que mudou de 25% para 20%, pois na maior concentração a viscosidade da
fase foi elevada e não foi possível o impulso da fase dispersa para o interior da
coluna de extração pela bomba peristáltica.
Estes resultados foram semelhantes aos obtidos por Rabelo (1999), que
96
estudou a extração da ascorbato oxidase em coluna de campânula pulsada
(PEG 1500/fosfato), e obteve aumento de pureza de 1,34 vezes na fase rica
em sal com recuperação da enzima de 51,7%.
Avaliando a recuperação da enzima na fase PEG, os valores de
recuperação foram baixos, com exceção do ensaio 6, no qual a recuperação da
enzima foi de 86,78%, corroborando com a tendência apresentada pelos outros
parâmetros de resposta, como coeficiente de partição e coeficiente de
transferência de massa. A análise estatística indicou que nenhuma variável foi
significativa para a recuperação.
3,60
6,82
-8,50
-8,78
11,75
-12,96
-14,92
p=0,05
Efeito estimado (valor absoluto)
1*3
(1)MMPEG
1*2
(2)CPEG
(3)Citrato
1*2*3
2*3
Figura 5.5: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta o coeficiente de transferência. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato.
A Figura 5.5 apresenta as variáveis significativas para o coeficiente de
transferência de massa, na qual se destacou a interação entre as
concentrações de PEG e de citrato, seguida pela interação entre os três
fatores. Para avaliar estas interações foi utilizado o gráfico cúbico que
apresentou a relação entre a massa molar do PEG, a concentração do PEG e a
concentração de citrato (Figura 5.6).
97
0,016
-0,001
0,002
0,058
0,006
0,014
0,004
0,017
Figura 5.6: Gráfico cúbico das variáveis (massa molar do PEG, concentração
de PEG e concentração de citrato) de um planejamento 23, tendo como variável-resposta o coeficiente de transferência de massa (KDa) para a extração contínua em PRDC.
A interação entre as variáveis indicou que o coeficiente de transferência
de massa aumentou quando o sistema foi constituído pela maior massa molar
do PEG 20000 (g/mol), menor concentração PEG de 10% (m/m) e maior
concentração de citrato de 25% (m/m). O maior valor obtido para o coeficiente
de transferência de massa foi 0,058 (min-1). Este resultado corrobora com os
obtidos por Porto et al. (2004) para ascorbato oxidase, em PRDC com sistema
PEG/fosfato, utilizando a mesma velocidade da fase dispersa (2mL/min).
Segundo Forciniti et al. (2002) a tensão interfacial aumenta com o
aumento da concentração do polímero, e o efeito total do aumento na
viscosidade das fases resulta na redução da difusibilidade da proteína, e um
aumento da espessura da camada limite entre fases, comprometendo a
transferência de massa. Como conseqüência deste fenômeno, o coeficiente de
98
transferência de massa foi menor, para concentrações de PEG maiores
(PORTO et al., 2004).
-2,94
-3,40
-5,45
11,58
-14,87
-18,44
-24,96
p=0,05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
(2)CPEG
1*2
(1)MMPEG
(3)Citrato
1*3
1*2*3
2*3
Figura 5.7: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta a eficiência de separação. Os significados dos símbolos na ordenada da figura são: (1)MMPEG–massa molar do PEG, (2)CPEG-concentração do PEG, (3)citrato-concentração de citrato.
Para a eficiência de separação a interação entre as concentrações de
PEG e de citrato foi o efeito mais significativo (Figura 5.7). Os melhores
resultados para o parâmetro eficiência de separação (54,9%) foram obtidos
quando se utilizou o sistema de massa molar do PEG 20000 (g/mol), a 10%
(m/m) e concentração de citrato de 25% (m/m). A eficiência de separação
apresentou o mesmo comportamento que o coeficiente de partição e o
coeficiente de transferência de massa. Estes resultados estão de acordo com
os apresentados por Porto et al. (2004).
O desempenho de uma unidade operacional de extração continua é
dependente da quantidade de solvente presente no extrator (SARUBBO et al.,
2003, PORTO et al., 2004, CAVALCANTI et al., 2007). Se o solvente está em
grandes quantidades, comparando a alimentação, o gradiente de concentração
99
do soluto é favorável à transferência de massa. O hold up representa a
quantidade de solvente disponível no extrator para extrair o soluto da
alimentação (GIRALDO-ZUNINGA et al., 2006).
Com o aumento da concentração dos componentes do sistema (massas
molares do PEG maiores, neste caso), valores menores foram observados para
a fração retida da fase dispersa para todos os sistemas estudados. Dados
similares foram observados por Venâncio et al. (1995) e Porto et al. (2000).
A análise estatística dos resultados para o hold up foi realizada, mas
nenhuma variável independente foi significativa. Verifica-se na Tabela 5.3, que
os ensaios realizados com maiores massas molares do polímero,
apresentaram menores valores para o parâmetro hold up.
Avaliando os resultados dos experimentos realizados neste estudo foi
possível selecionar uma composição do SDFA para dar continuidade aos
estudos de extração contínua da ascorbato oxidase em coluna de discos
rotativos perfurados.
5.4.2. Planejamento utilizando a extração contínua com a coluna de discos perfurados rotativos para avaliação dos parâmetros operacionais
Para melhor compreensão de como ocorre a influência dos parâmetros
operacionais da coluna de discos perfurados rotativos (PRDC) foi realizado um
planejamento fatorial completo (22) que avaliou a velocidade de rotação dos
discos e a velocidade de fluxo da fase dispersa (Tabela 5.2). Após a extração
foram avaliados o coeficiente de transferência de massa, a eficiência de
separação, a recuperação da atividade enzimática, o coeficiente de partição, o
fator de purificação e o “Hold up”.
A composição do sistema, selecionada nos estudos prévios das
extrações em fluxo contínuo, foi: massa molar do PEG 20.000 (g/mol),
concentração do PEG 10%, concentração de citrato 25%.
A Figura 5.8 apresenta os resultados obtidos da extração contínua da
ascorbato oxidase (ensaio 4 da Tabela 5.4). Pode-se verificar aumento
crescente (de 0,08 mg/mL para 0,15 mg/mL) da quantidade de proteína
transferida da fase rica em sal para fase rica em PEG até o final da extração. O
mesmo comportamento ocorreu em relação à atividade enzimática.
100
Inversamente, ocorre diminuição tanto da proteína como da atividade
enzimática na fase sal.
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40 50 60 700,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
AT salAT pegPT salPT peg
Ativ
idad
e To
tal (
U/m
L)P
roteínas Totais (mg/m
L)
Tempo (min)
Figura 5.8: Comportamento de extração da ascorbato oxidase em PRDC em
função do tempo. Proteína total residual na fase sal ou contínua (rafinado) (-♦-), Proteína total na fase PEG ou dispersa (- -), Atividade total residual na fase sal ( ), Atividade total na fase PEG ( ). Extração conduzida com sistemas PEG 20000/citrato (20% e 15% m/m) e pH 6,0, 23°C±2°C.
Os resultados obtidos da segunda parte do planejamento experimental
com a coluna de discos rotativos perfurados foram resumidamente
apresentados na Tabela 5.4. A eficiência na extração foi avaliada no tempo 30
min, no qual o processo estava no estado estacionário ou equilíbrio.
101
Tabela 5.4 - Resultados do planejamento fatorial completo (22) da extração contínua da ascorbato oxidase em PRDC utilizando PEG/Citrato.
ensaios
V.
discos
(rpm)
V. fase
dispersa
(mL/min)
K Y (%) AP KDa
(min-1)
Es
(%) H
1 35 1 7,70 136,3 2,00 0,010 73,4 0,256
2 140 1 7,34 257,6 2,13 0,018 73,3 0,302
3 35 3 3,03 166,3 2,24 0,005 55,0 0,324
4 140 3 16,08 216,4 2,20 0,018 96,8 0,362
5 (C) 80 2 1,82 150,9 2,71 0,059 26,9 0,382
6 (C) 80 2 3,91 168,9 2,29 0,040 53,7 0,400
7 (C) 80 2 4,59 120,5 3,10 0,037 22,7 0,290
8 (C) 80 2 3,12 169,3 1,17 0,047 71,7 0,254
Observa-se na Tabela 5.4, que a enzima particionou para a fase
dispersa rica em PEG em todos os experimentos. Os estudos anteriormente
realizados indicaram que a composição do sistema selecionada apresentou
uma partição preferencial para a fase polimérica.
A análise estatística dos resultados foi realizada e proporcionou avaliar
cada variável resposta estudada separadamente, bem como a interação entre
elas.
Para o coeficiente de partição (K) foi observado que o efeito da
velocidade dos discos foi significativo, apresentando um valor positivo (Figura
5.9). Este efeito indicou que a maior velocidade dos discos proporcionou
maiores valores do coeficiente de partição da ascorbato oxidase. Também foi
verificado que a interação positiva entre a velocidade dos discos e a velocidade
da fase dispersa foi significativa com nível de confiança de 95%.
102
1,710
5,324
5,629
p=,05
Efeito estimado (valor Absoluto)
(2)Velocidade da f ase dispersa
(1)Velocidade dos discos
1*2
Figura 5.9: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-
resposta o coeficiente de partição da ascorbato oxidase na fase dispersa do sistema de duas fases aquosas.
Esta interação significa que a maior velocidade de rotação dos discos
(140rpm) e a maior velocidade de fluxo da fase dispersa (3mL/min) foram as
condições que favoreceram a partição da enzima para a fase dispersa, rica em
PEG. Estas condições correspondem ao ensaio 4 (K=16,08), nos demais
experimentos a enzima também particionou preferencialmente para a fase
PEG.
Uma maior velocidade dos discos e velocidade da fase dispersa
favoreceram o aumento do coeficiente de partição principalmente devido a dois
fatores: o aumento da velocidade dos discos favoreceu uma maior partição das
moléculas para a fase polimérica, devido ao aumento da superfície de contato
entre as fases, provocada pela agitação. A maior velocidade de entrada da fase
dispersa favoreceu uma maior partição da enzima devido ao aumento da
quantidade de fase polimérica ou extratora dentro da coluna (SARUBBO et al.,
2003).
A análise estatística para o aumento de pureza (AP) foi realizada, mas
103
nenhuma variável independente apresentou efeito significativo. Observando a
Tabela 5.4 foi possível constatar que os melhores fatores de purificação
estavam presentes nos ensaios correspondentes aos pontos centrais
(AP=2,71; 2,29 e 3,10), com exceção do ensaio 8, que apresentou um
desempenho abaixo da média (1,17). As condições utilizadas nestes ensaios
foram velocidade dos discos 80rpm e velocidade de fase dispersa 2mL/min, o
que confirmou os resultados obtidos em estudos prévios da extração contínua,
apenas com um pequeno incremento nos valores do aumento de pureza.
Cavalcanti et al. (2007) observaram que o aumento da velocidade da
fase dispersa (VD) aumentou o fator de purificação da toxina alfa de Clostridium
perfringens, e o maior valor deste parâmetro (2,4) foi obtido a 3mL/min. Por
outro lado, Porto et al., (2004) estudaram a extração contínua da ascorbato
oxidase em PRDC usando SDFA PEG/fosfato, observaram que o aumento da
velocidade da fase dispersa diminuiu o aumento de pureza e que a
VD=1mL/min foi a melhor velocidade de fluxo para a purificação da enzima.
Além disso, obtiveram um elevado fator de purificação 34,3, que foi muito
superior ao obtido nos resultados deste trabalho. Esta grande variação
observada pode ser devido às diferentes características dos componentes do
sistema.
Os fenômenos que ocorrem durante a extração contínua foram
explicados avaliando a velocidade de rotação dos discos e a velocidade da
fase dispersa em separado, mas as justificativas, de cada variável, são muito
semelhantes para todos os parâmetros (“hold up”, coeficiente de transferência
de massa e eficiência de separação) estudados.
Quando duas fases imiscíveis estão em contato na extração contínua
em contra-corrente, o tamanho e a quantidade de gotas da fase dispersa
(PEG), que surgem na zona de contato, são governadas principalmente pela
velocidade de agitação dos discos. Uma baixa velocidade resulta em grandes
gotas, proporcionando pequenas áreas interfaciais e baixas transferências de
massa. Uma alta velocidade de rotação permite a formação de pequenas gotas
esféricas, levando altas taxas de transferência de massa devido ao aumento da
área interfacial, consequentemente aumentando a purificação na fase extratora
(SARUBBO, 2000; PORTO et al., 1997, 2000 e 2004; CAVALCANTI et al
2007).
104
Em sistema de extração líquido-líquido, o aumento da agitação,
inicialmente causa um aumento da área interfacial (pela diminuição no tamanho
das gotas) e assim, aumenta a taxa de transferência de massa. Porém, isso
não ocorre indefinidamente devido a três fenômenos: (1) existe um limite para o
aumento da área interfacial que pode ser obtida. (2) abaixo de certo tamanho
de gotas, estas começam a se comportar como esferas rígidas sem circulação
pelo lento processo de difusão molecular. (3) após certo ponto, o aumento na
agitação pode começar a suprimir a interação gota-gota, reduzindo a mistura
na fase dispersa e também a taxa de transferência de massa. Há, portanto, um
grau ótimo de agitação que fornece a taxa de transferência de massa máxima
(SARUBBO, 2000).
Os artigos da literatura relataram que o aumento na velocidade da fase
dispersa diminui o tamanho da gota, embora este aumento provoque o
aumento do número de gotas, resultando no aumento de diversos parâmetros
operacionais, como “hold up” (VENÂNCIO; TEIXIEIRA, 1995; PORTO et al.,
1999; GIRALDO-ZUNIGA et al., 2006; CAVALCANTI et al., 2007), coeficiente
de transferência de massa (SARUBBO, 2000).
A Figura 5.10 apresenta a recuperação da enzima na fase PEG, e foi
verificado que a velocidade dos discos apresentou efeito significativo com valor
positivo. Este comportamento foi semelhante ao descrito para o coeficiente de
partição, ou seja, quanto maior a velocidade dos discos, melhor recuperação
da enzima ocorreu na fase polimérica. O maior valor obtido para a recuperação
da ascorbato oxidase na fase PEG foi 257%. Valores de recuperação acima de
100% são explicados pelo fato de serem calculados baseados na atividade
enzimática, e esta foi influenciada pela presença de inibidores, como o
caroteno, presentes no extrato enzimático.
105
-0,245
-1,552
3,738
p=0,05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
(2)Velocidade da f ase dispersa
1*2
(1)Velocidade dos discos
Figura 5.10: Gráfico de Pareto dos efeitos principais, tendo como variável-resposta a recuperação da ascorbato oxidase na fase dispersa do sistema de duas fases aquosas.
Foram realizadas análises estatísticas para o parâmetro “hold up”, mas
nenhuma variável apresentou efeito significativo porque não houve mudanças
significativas nos valores deste parâmetro. Observando a Tabela 5.4, nota-se
que os menores valores de “hold up” foram obtidos com as menores
velocidades rotacionais dos discos (35rpm). Estes resultados diferiram dos
obtidos por Cavalcanti et al. (2007). Os autores apresentaram resultados
sugerindo que uma menor velocidade rotacional dos discos favoreceu o
aumento do “hold up”, que por definição, representa a quantidade de fase
extratora capaz de retirar a biomolécula da fase contínua.
Maiores velocidades de fluxo da fase dispersa favoreceram o “hold up”,
isto foi devido à diminuição do tamanho das gotas e aumento do numero de
gotas. Este resultado está de acordo com os observados em PRDC usando
SDFA PEG/fosfato para extração contínua de toxina alfa (CAVALCANTI et al.,
2007), citocromo b5 (PORTO et al., 1997) e albumina bovina sérica (BSA)
106
(PORTO et al., 2004), bem como usando PEG-POLICAJU para extração
contínua de BSA (SARUBBO et al., 2004).
Nenhuma das variáveis foi significativa para o coeficiente de
transferência de massa e o melhor resultado obtido para este parâmetro foi
0,059 (min-1). Estes resultados corroboram com os obtidos por Porto et al.
(2004) para ascorbato oxidase, em PRDC com sistema PEG/fosfato, utilizando
a mesma velocidade da fase dispersa (2mL/min).
Estudos de purificação da toxina alfa em PRDC, mostraram que o
coeficiente de transferência de massa aumentou de forma progressiva com a
velocidade rotacional do disco e alcançou o valor máximo (KDa = 2.71.10-3 min -
1) a 140rpm (CAVALCANTI et al., 2007). Este resultado sugere que um
aumento na agitação pode ser necessário para ultrapassar a viscosidade da
fase extratora e aumentar a transferência de massa. Esta observação está de
acordo com os resultados obtidos por Porto et al. (1997), quando investigaram
a extração contínua do citocromo b5 em PRDC com SDFA PEG/fosfato.
O aumento do coeficiente de transferência de massa foi esperado a
partir da utilização de VD crescentes, como resultado da diminuição do
tamanho da gota por causa da alta velocidade usada e consequentemente
maior área de transferência de massa (CAVALCANTI et al., 2007). Entretanto,
como apresentado na Tabela 5.4, o KDa diminuiu com o aumento da VD,
apresentando melhores valores com a velocidade intermediária (2mL/min),
referentes aos experimentos do ponto central.
Para a eficiência de separação nenhuma variável apresentou efeito
significante e o melhor resultado obtido para este parâmetro (96,8%)
corresponde ao sistema com velocidade rotacional dos discos 140rpm e
velocidade da fase dispersa 3mL/min. A eficiência de separação apresentou o
mesmo perfil que o coeficiente de partição. De acordo com Porto et al., (2004),
este comportamento pode ser devido ao efeito contrário exercido por este
parâmetro com a diminuição do tamanho da gota e o aumento do número de
gotas, em conseqüência do aumento da taxa de fluxo da fase dispersa.
Após a análise dos resultados apresentados, verificamos que os
sistemas referentes ao ponto central foram aqueles que proporcionaram melhor
desempenho em extrair por processo contínuo PRDC, utilizando sistemas de
duas fases aquosas. Os resultados em valores médios foram: coeficiente de
107
partição de 3,36 ± 1,19, recuperação de 152% ± 23%, aumento de pureza de
2,31 ± 0,83, coeficiente de transferência de massa 0,045 ± 0,004, eficiência de
separação de 43,7% ± 12% e Hold up de 0,33 ± 0,07. A melhor condição
operacional selecionada neste estudo para a extração da ascorbato oxidase na
PRDC, foi obtida com a velocidade de rotação dos discos de 80rpm e
velocidade da fase dispersa de 2mL/min.
5.5. CONCLUSÃO
Os resultados apresentados e discutidos neste estudo demonstraram
que a extração contínua com PRDC pode ser utilizada como uma técnica
promissora para purificar ascorbato oxidase em sistema PEG/citrato. A
principal vantagem do método de extração em coluna é que as fases separam
facilmente e rapidamente, sem a necessidade de centrifugação. Além disso, o
processo é simples e fácil de operar em modo contínuo.
108
CONCLUSÕES
• O sistema PEG/Citrato provou ser capaz de purificar ascorbato oxidase de
Cucurbita maxima em modo descontínuo. Os planejamentos sucessivos
utilizados selecionaram as variáveis que influenciaram a purificação da
enzima. O melhor resultado foi coeficiente de partição 1,7, recuperação
91% e aumento de pureza 3,1 vezes
• Os valores dos parâmetros termodinâmicos foram estimados para a enzima
e revelaram a termoestabilidade desta preparação enzimática para futuras
aplicações.
• A enzima parcialmente purificada com SDFA apresenta características
semelhantes àquelas do extrato bruto, tendo pH e temperatura ótimos para
a atividade enzimática iguais, mas a enzima pré-purificada foi menos
estável.
• Os resultados mostraram que a velocidade de rotação dos discos
influenciou fortemente o desempenho da PRDC, e que o coeficiente de
partição e a recuperação aumentaram com este parâmetro. Estas respostas
estudadas apresentaram melhor desempenho com a maior velocidade
rotacional dos discos.
• A melhor condição operacional selecionada neste estudo para a extração
da ascorbato oxidase na PRDC, foi obtida com a velocidade de rotação dos
discos de 80rpm e velocidade da fase dispersa de 2mL/min.
• Os resultados apresentados demonstraram o potencial uso do sistema de
duas fases aquosas PEG/citrato utilizando PRDC para purificação contínua
da ascorbato oxidase de Cucurbita maxima.
109
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ANEXOS
125
Anexo 1 – Normas para a Defesa da Tese
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOFaculdade de Ciências Farmacêuticas
Secretaria de Pós-Graduação
Informações para os Membros de Bancas Julgadoras de
Mestrado/Doutorado
1. O candidato fará uma apresentação oral do seu trabalho, com duração máxima de trinta minutos.
2. Os membros da banca farão a argüição oral. Cada examinador
disporá, no máximo, de trinta minutos para argüir o candidato, exclusivamente sobre o tema do trabalho apresentado, e o candidato disporá de trinta minutos para sua resposta.
2.1 Com a devida anuência das partes (examinador e candidato), é
facultada a argüição na forma de diálogo em até sessenta minutos por examinador.
3. A sessão de defesa será aberta ao público. 4. Terminada a argüição por todos os membros da banca, a mesma
se reunirá reservadamente e expressará na ata (relatório de defesa) a aprovação ou reprovação do candidato, baseando-se no trabalho escrito e na argüição.
4.1 Caso algum membro da banca reprove o candidato, a Comissão
Julgadora deverá emitir um parecer a ser escrito em campo exclusivamente indicado na ata.
4.2 Será considerado aprovado o aluno que obtiver aprovação por unanimidade ou pela maioria da banca.
5. Dúvidas poderão ser esclarecidas junto à Secretaria de Pós-
Graduação: [email protected], (11) 3091 3621.
São Paulo, 18 de março de 2005.
Profa. Dra. Bernadette D. G. M. Franco Presidente da CPG/FCF/USP
Av. Prof. Lineu Prestes, 580, Bloco 13 A - Cidade Universitária - CEP 05508-900 - São Paulo - SP
Fone: (11) 3091 3621 - Fax (11) 3091 3141 – e-mail: [email protected]
126
Anexo 2 – Artigo Publicado