UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR
CURSO DE PS-GRADUAO EM BIOQUMICA
CARACTERIZAO DA PROTENA DESACOPLADORA DE PLANTA
(pUCP) DE Vigna unguiculata (L.) Walp.
FRANCISCO EDSON ALVES GARANTIZADO
FORTALEZA CE
2007
CARACTERIZAO DA PROTENA DESACOPLADORA DE PLANTA
(pUCP) DE Vigna unguiculata (L.) Walp.
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FRANCISCO EDSON ALVES GARANTIZADO
DISSERTAO SUBMETIDA COORDENAO DO CURSO DE PS-GRADUAO EM BIOQUMICA COMO REQUISITO PARCIAL PARA
OBTENO DO GRAU DE MESTRE EM BIOQUMICA.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Dirce Fernandes de Melo
FORTALEZA CE
2007
Dados Internacionais de Catalogao na PublicaoUniversidade Federal do Cear
Biblioteca de Cincias e Tecnologia
G193c Garantizado, Francisco Edson Alves.Caracterizao da protena desacopladora de planta (pUCP) de Vigna unguiculata (L.) Walp.
/ Francisco Edson Alves Garantizado. 2007.121 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertao (mestrado) Universidade Federal do Cear, Centro de Cincias, Departamento de
Bioqumica e Biologia Molecular, Programa de Ps-Graduao em Bioqumica, Fortaleza, 2007.rea de Concentrao: Bioqumica Vegetal.Orientao: Profa. Dra. Dirce Fernandes de Melo.Coorientao: Prof. Dr. Jos Hlio Costa.
1. Protenas de transporte. 2. Qumica vegetal. 3. Mitocndrias. 4 . Feijo-de-corda I. Ttulo.
CDD 574.192
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS
Fundao Cearense de Apoio Pesquisa (FUNCAP), pela concesso de bolsa de
estudos.
Ao Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular da UFC, pelo apoio e suporte na
realizao dos experimentos deste trabalho.
Esta dissertao foi feita e apresentada como parte dos requisitos necessrios
para a obteno do grau de mestre em Bioqumica, outorgado pela Universidade Federal
do Cear, encontrando-se a disposio dos interessados na Coordenao do curso.
A transcrio de qualquer trecho desta monografia ser permitida desde que seja
feita de acordo com as normas de tica cientfica.
__________________________________________
Francisco Edson Alves Garantizado
Defesa formal de Dissertao aprovada em 26 de abril de 2007 pela banca
Examinadora constituda por:
_________________________________________
Profa. Dra. Dirce Fernandes de Melo
Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular/UFC
Orientadora
__________________________________________
Jos Hlio Costa
Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular/UFC
Co-Orientador/Examinador
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Profo. Dr. Ivan de Godoy Maia
Departamento de Gentica/Unesp- So Paulo
Examinador
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................ix
LISTA DE TABELAS...................................................................................................xii
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................xiii
RESUMO........................................................................................................................xv
ABSTRACT.................................................................................................................xvii
INTRODUO.............................................................................................................01
1 Breve histrico sobre a descoberta das pUCPs.........................................................04
2 Regulao das UCPs..................................................................................................06
3 Relao entre a pUCP e a AOX.................................................................................10
4 Caracterizao bioqumica........................................................................................11
5 Relaes filogenticas e estrutura dos genes da famlia de pUCPs/UCPs................16
6 Expresso dos genes pUCPs em tecidos especficos.................................................19
7 Funo das pUCPs.....................................................................................................22
7.1 Participao das pUCPs durante amadurecimento de frutos..................................22
7.2 Controle da produo de espcies reativas do oxignio (EROS)...........................22
7.3 Resposta a estresses ambientais..............................................................................27
7.4 Termognese...........................................................................................................27
7.5 Eficincia fotossinttica..........................................................................................28
OBJETIVOS..................................................................................................................29
MATERIAL E MTODOS..........................................................................................30
1 MATERIAL VEGETAL.........................................................................................30
2 CARACTERIZAO BIOQUMICA.....................................................................31
2.1 Extrao da frao mitocondrial.............................................................................31
2.2 Determinao da protena mitocondrial.................................................................33
2.3 Ensaios polarogrficos............................................................................................33
2.4 Clculo do consumo de oxignio............................................................................34
2.5 Clculo do controle respiratrio (C.R.)..................................................................35
2.6 Clculo da relao ADP/O.....................................................................................35
2.7 Avaliao da integridade da membrana externa.....................................................36
2.8 Caracterizao da atividade da pUCP....................................................................37
3 CARACTERIZAO MOLECULAR.....................................................................37
3.1 Desenho dos primers para pUCP............................................................................37
3.2 Extrao de RNA total............................................................................................39
3.3 Quantificao e avaliao da qualidade do RNA total...........................................39
3.4 Ensaios de expresso da pUCP...............................................................................40
3.4.1 Transcrio reversa (RT).....................................................................................40
3.4.2 Reao em cadeia da DNA Polimerase (PCR)....................................................40
3.5 Eletroforese dos produtos amplificados por RT-PCR............................................44
3.6 Purificao dos produtos de RT-PCR.....................................................................44
3.7 Ligao inserto-vetor..............................................................................................45
3.8 Vetor de clonagem pCR4-TOPO............................................................................47
3.9 PCR em colnia......................................................................................................49
3.10 Mini preparao de plasmdios por lise alcalina..................................................49
3.10.1 Preparao de meios de cultura.........................................................................51
3.10.2 Solues usadas na mini preparao de plasmdios..........................................52
3.11 Sequenciamento....................................................................................................53
3.12 Alinhamento de sequncias e anlises filogenticas............................................53
3.13 Isolamento de DNA genmico.............................................................................53
3.14 Eletroforese do DNA............................................................................................54
3.15 Amplificao do(s) fragmento(s) genmico(s) codificando pUCP em V.
unguiculata .....................................................................................................................55
RESULTADOS..............................................................................................................58
CARACTERIZAO BIOQUMICA...........................................................................58
Integridade da membrana mitocondrial externa..............................................................58
Relao ADP/O e Controle Respiratrio (C.R.)..............................................................58
Caracterizao da atividade enzimtica da pUCP em Vigna unguiculata.......................61
CARACTERIZAO MOLECULAR DA pUCP EM Vigna unguiculata ...................67
Aplicao de estresse abitico em plntulas de Vigna unguiculata ...............................67
Extrao de RNA total.....................................................................................................67
Expresso de gene(s) da pUCP em folhas de Vigna unguiculata ...................................70
Clonagem e seqenciamento de gene(s) da pUCP em folhas de Vigna unguiculata .....70
Purificao d