UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁPRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: Fevereiro/2015 a Julho/2015( ) PARCIAL(X) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Geração de Tecnologia Enzimática para a produção de Etanol de Segunda Geração: Produção de concentrados celulolíticos a partir de fungos filamentosos para sacarificação de biomassa residual da cana-de-açúcar
Nome do Orientador: Alberdan Silva Santos
Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade: Química
Instituto/Núcleo: Ciências Exatas e Naturais - ICEN
Laboratório: Laboratório de Investigação Sistemática em Biotecnologia e Biodiversidade Molecular - LabISisBio
Título do Plano de Trabalho: Seleção e isolamento de fungos produtores de enzimas amilase, xilanase e β-glicosidase com atividades hidrolítica.
Nome do Bolsista: Letícia Cardoso dos Passos
Tipo de Bolsa: (X) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/CNPq – AF ( ) PIBIC/ PIAD
( ) PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/PIBIT( ) PIBIC/UFPA
( ) PIBIC/UFPA – AF ( ) PIBIC/ INTERIOR ( ) PIBIC/PARD
( ) PIBIC/PADRC
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INTRODUÇÃOAs enzimas são um grupo de substancias orgânicas, ou seja, macromoléculas orgânicas
que geralmente possuem característica proteica. As enzimas também são chamadas de
biocatalizadores e possuem estrutura globular proteica terciária ou quaternária. As enzimas
também são denominadas de termolábeis por mostrarem grande ligação com a temperatura na
qual está submetida. Dessa maneira, as mesmas aceleram a velocidade da reação química
tornando-as termodinamicamente favorável. A ação das enzimas ocorre a partir do sítio ativo
onde essas atuam catalisando a reação, ou seja, baixando a energia de ativação e
consequentemente aumentando a velocidade de forma que o substrato, substancia presente
inicialmente, é transformado no produto da reação. As enzimas hidrolíticas extracelulares são
aquelas que excretadas da célula do organismo vivo e que promovem hidrólise nas ligações
covalentes presentes e transformam a macromoléculas (substrato) em moléculas menores
(produtos).
Os microrganismos apresentam grande competência de excretar enzimas para o meio
reacional quando colocados sob condições especificas de temperatura, pH, agitação, fonte de
carbono ideal e outros. Os fungos filamentosos são microrganismos eucariontes, heterótrofos e
cosmopolitas que possuem alta capacidade de produção dessas enzimas e atualmente vem
sendo amplamente estudadas por oferecerem uma alternativa ambientalmente correta para
hidrólise de resíduos.
As enzimas xilanase e β-glicosidase estão na classe das hidrolases na qual realizam
hidrólise de ligações para a formação de produtos. As xilanases são hemicelulases e atuam na
degradação das cadeias laterais da xilana e que produzem xiloses, xilobioses, xilotrioses como
produtos dos quais se diferem pelas quantidades liberadas. A endo-1-4-β-xilanase é principal
enzima de despolimerização do substrato. A enzima β-glicosidase fazem parte dos grupos das
celulases, aquelas que realizam a hidrólise de material celulolítico. As celulases trabalham em
sinergismos onde as β-glicosidases clivam resíduos de celodextrinas ou celobiose gerados
pela ação inicial das endoglicanases e exoglicanases, liberando na última etapa da reação
monômeros de glicose para o meio.
Dessa forma, realizar o isolamento de fungos das sementes de andiroba e das raízes de
mandioca, constituídos de material celulolítico, para a produção dessas enzimas mostra a
grande eficiência na hidrólise de resíduos que possuam os mesmos constituintes. A busca do
aumento da produção dos concentrados enzimáticos pelas linhagens selecionadas e a
avaliação dessa produção são o foco deste trabalho no qual mostrou-se promissor e de
extrema relevância para o desenvolvimento dos processos biotecnológicos.
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JUSTIFICATIVA
A região amazônica apresenta uma grande biodiversidade de plantas e microrganismos
e por este motivo o grande potencial que apresenta a investigação sistemática na busca de
novos organismos capazes de produzir enzimas com atividades hidrolíticas é incomensurável,
e diversos trabalhos têm sido realizados na busca de tais microrganismos. Neste projeto,
pretende-se intensificar a investigação em microrganismos provenientes das sementes de
andiroba (Carapa guianensis) e da mandioca (Manihot esculenta) para a investigação e busca
de atividades mais robustas e que sejam capazes de produzir enzimas com potencial de
hidrolisar polpa de celulose . O projeto original tem parceria com o CTBE (Centro de tecnologia
do Bioetanol) que está situado em Campinas – SP, e esta parceria visa selecionar linhagens de
fungos que apresentem potencial de produção e perspectivas de estudar processos de
produção em escala piloto.
OBJETIVOS
O objetivo geral do Plano de Trabalho é realizar a produção de concentrados
enzimáticos de diversas colônias de fungose isoladas das sementes de andiroba (Carapa
guianensis) e das raízes da mandioca (Manihot esculenta), enfatizando concentrados das
enzimas xilanases e β-glicosidases que possuam o potencial de degradação de material
celulolítico e lignolítico.
MATERIAIS E MÉTODOS
A produção dos concentrados enzimáticos das linhagens selecionadas tem base nos
dados Pibic 2013/2014 os quais mostram o screening dos microrganismos selecionados da
Micoteca do Laboratório de Investigação Sistemática em Biotecnologia e Biodiversidade
Molecular (LabISisBio) e a avaliação inicial do potencial enzimático dos fungos selecionados. A
partir desses resultados, foi possível selecionar três linhagens com produção significativa:
MIBA 0300, MIBA 0769 e MIBA 0346 (codificados como Microrganismo de Interesse
Biotenológico da Amazônia – MIBA), que em diferentes condições apresentaram resultados
notáveis e promissores para a hidrólise de materiais hemicelulolítico e celulolíticos como
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mostrado no relatório parcial anterior. Dessa forma, a continuação do trabalho teve base na
reavaliação do potencial de produção dos concentrados enzimáticos das linhagens
selecionadas a fim de confirmar a produção significativa das mesmas.
Produção dos concentrados enzimáticos xilanásicos
Na produção dos concentrados da enzima xilanase foram utilizados 500mL de meio
contendo 10g/L xilano de madeira e sais inorgânicos 2g/L KH2PO4, 2g/L K2HPO4, 0,6g/L
MgSO4.7H2O, 2g/L NH4NO3, 0,5g/L CaCl2 em erlenmayer de 1000mL. A cada 24 horas foram
retiradas alíquotas de 5mL e avaliada a produção da atividade enzimática, açúcar redutor e
teor de proteína. Ao atingir a atividade máxima, 50% do meio foi filtrado e retirado e adicionado
a mesma quantidade equivalente a retirada de meio fresco. Após a troca do meio, novas
alíquotas foram retiradas até se atingir a atividade máxima novamente e os filtrados
(concentrados) foram congelados a -5oC. Para a reavaliação da produção dos concentrados
xilanásicos foram utilizados os fungos cujo o código MIBA 0769 e MIBA 0346, pois foram os
que apresentaram maior produção anteriormente. O cultivo das linhagens foi realizado em
agitação e em modo estático durante 20 dias. O cultivo em agitação foi realizado em shaker
orbitalar a 30oC e o cultivo estático mantido em mesma temperatura. É importante ressaltar que
esta reavaliação do potencial de produção foi realizada sob as mesmas condições anteriores.
Produção dos concentrados enzimáticos β-glicosidásicos
Na produção dos concentrados da enzima β-glicosidase foram utilizados 500mL de meio
contendo 10g/L de farelo de trigo e sais inorgânicos 2g/L KH2PO4, 2g/L K2HPO4, 0,6g/L
MgSO4.7H2O, 2g/L NH4NO3, 0,5g/L CaCl2.em erlenmayer de 1000mL. A cada 24 horas foram
retiradas alíquotas de 4mL e avaliada a atividade, teor de açúcar redutor e teor de proteína. Ao
atingir a atividade máxima, 50% do meio foi filtrado e retirado e adicionado a mesma
quantidade retirada de meio fresco. Após a troca do meio, novas alíquotas foram retiradas até
se atingir a atividade máxima novamente e os filtrados (concentrados) foram congelados a -
5oC. Para a reavaliação da produção dos concentrados β-glicosidásicos foram utilizados os
fungos de código MIBA 0300 e MIBA 0769, pois foram os que apresentaram resultado
significativo nas etapas anteriores. O cultivo das linhagens foi realizado em agitação e em
modo estático durante 20 dias. O cultivo em agitação foi feito em shaker orbitalar a 30 oC e o
cultivo estático mantido na mesma temperatura.
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Quantificação de atividade xilanase
A quantificação da enzima xilanase foi realizada de acordo com MENEZES, C.L.; SILVA,
I.S. e DURRANT, M.R., 2009 e MILLER, 1959.Em um tubo de 10mL foram adicionados 400µL
de extrato enzimático, 400µL de solução substrato de 0,5% de xilana em 0,05M de tampão
acetato e pH 5,0. O sistema foi agitado periodicamente para manter-se a xilana e incubado a
50º C por 30 minutos. Foram preparados dois controles: um branco do reagente e um branco
da amostra. No controle do reagente foram adicionados 400µL da solução tampão e 400µL de
solução substrato e no controle da amostra (branco da amostra) foi adicionado 400µL de
extrato enzimático e 400µL de uma solução tampão nos quais foram mantidos nas mesmas
condições.
Após a incubação, a reação foi interrompida quando se adicionou 800µL da solução de
ácido 3,5- dinitrosalicílico (DNS) e submeteu-se à fervura por 5 minutos e em seguida os tubos
foram resfriados. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro UV-Vís em 540nm.
A unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de enzima capaz
de liberar 1µmol de xilose. Quando os valores das absorbâncias das amostras lidas são
correlacionados com a equação da reta extraída de uma curva de quantificação padrão,
mostrada no gráfico 1 no qual foi construída a partir de uma solução de xilose (1g/L). Dessa
forma é possível calcular a atividade enzimática produzida pelo fungo selecionado.
Gráfico 1. Curva Padrão utilizando xilose para quantificação da enzima xilanase.Fonte: Dados da pesquisa.
Quantificação de atividade β-glicosidase
A metodologia de quantificação da enzima β-glicosidase foi realizada de acordo com
MATSUURA, M; SASAKI, J e MURAO, S., 1995.Em um tubo de 10mL adicionou-se 800μL da
solução de 1mM de PNPG diluído em tampão citrato fosfato 0,1M pH igual a 5 e foi incubado
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em uma estufa a 30ºC por 5 minutos. Após os 5 minutos, foi adicionou-se 200μL da amostra
(caldo enzimático) e incubado novamente a 30ºC por 30 minutos. Foram preparados dois
controles: um branco do reagente e um branco da amostra. No controle do reagente foram
adicionados 200µL da solução tampão e 800µL de solução substrato e no controle da amostra
(branco da amostra) foi adicionado 200µL de extrato enzimático e 800µL de uma solução
tampão nos quais foram mantidos nas mesmas condições.
Após a incubação a reação foi interrompida quando adicionou-se 1000μL de carbonato
de sódio 0,25M e pH 9,0. O resultado amarelo foi imediatamente medido a 420 nm em
espectrofotômetro UV-Vis.
A quantidade hidrolisada de PNPG foi calculada com referência na calibração da curva
de quantificação que será mostrada no gráfico 2, na qual foi feita simultaneamente e da mesma
maneira, utilizando-se 5 a 300μmol de PNP.
Gráfico 2. Curva Padrão utilizando PNP para quantificação da enzima β-glicosidase
Fonte: Dados da pesquisa.
Quantificação de açúcar redutor
Na análise de açúcar redutor foi utilizada a metodologia modificada de Miller, 1959 onde
as amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos. Em um tubo de 10mL adicionou-se
100µL do sobrenadante do caldo enzimático e adicionando-se 200 µL de água deionizada e
300µL de reagente DNS. No controle do reagente adicionou-se 300µL de água deionizada e
300µL de reagente DNS e para o controle da amostra adicionou-se 100µL da amostra e 500µL
de água deionizada.
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Os tubos foram submetidos à fervura durante 5 minutos e resfriados. Em seguida,
adicionou-se 1000µL de água deionizada. As leituras foram realizadas em espectrofotômetro
para o comprimento de onda de 540 nm.
A curva de quantificação padrão, mostrada no gráfico 3, foi construída utilizando-se
diferentes concentrações de glicose, onde a partir da equação da reta foi possível calcular o
quanto de glicose está sendo liberada para o meio durante um determinado período de tempo.
Gráfico 3. Curva Padrão utilizando glicose para quantificação açúcar redutor.Fonte: Dados da pesquisa.
Quantificação de proteína
Na quantificação de proteína foi utilizada a metodologia de Bradford, 1976. A amostra foi
transferida para um tubo de ependoff e centrifugada por 10.000 rpm por um período de 10
minutos. Em um tubo de 10mL adicionou-se 200µL do sobrenadante e adicionou-se 1800µL de
uma solução de Bradford 0,1mg.mL-1. No controle do reagente adicionou-se 200µL de água e
adicionou-se 1800µL de uma solução de Bradford 0,1mg.mL-1. Esperou-se 5 minutos de tempo
reacional e realizou-se a leitura em espectrofotômetro em 595nm.
A determinação do teor de proteína foi realizada com o auxílio da equação da reta
proveniente de uma curva de quantificação padrão, mostrada no gráfico 4, que foi construída
nas mesmas condições deste experimento utilizando como padrão BSA (albumina).
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Gráfico 4. Curva Padrão utilizando BSA para quantificação de proteína.Fonte: Dados da pesquisa.
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE XILANÁSICA E β-GLICOSIDASE
O cultivo submerso das linhagens selecionadas para a produção dos concentrados
enzimáticos foi realizado em um período de 20 dias. As análises foram realizadas em duplicata
e onde foram obtidos os valores das absorbâncias correspondentes a cada dia de cultivo.
Para cada cultivo submerso, foram realizadas em todas as amostras as análises da
atividade enzimática, açúcar redutor e proteína e a partir das absorbâncias obtidas, foi possível
realizar uma média dos valores referentes as amostras, calcular a absorbância líquida (média
das absorbâncias – branco de maior valor), o desvio padrão, a variância, a concentração
xilose, PNP, glicose e albumina liberados para o meio. Os cálculos foram realizados no
programa Excel versão 2013. As concentrações das amostras foram calculadas a partir da
equação da reta das Curvas de Quantificação Padrão construídas para cada análise como
mostrado nos gráficos anteriores. Dessa forma, foi possível calcular a atividade enzimática
(U/mL) do concentrado relacionando os valores de concentração obtido nas curvas de
quantificação de cada enzima na equação 1 mostrada abaixo. A equação foi utilizada tanto
para o cálculo da atividade enzimática β-glicosidásica quanto da atividade xilanásica.
Equação 1. Cálculo das Atividades enzimáticas xilanase e β-glicosidase.
.
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Onde, Atividade é dada em U/mL, A = absorvância líquida, ε = coeficiente angular da
equação da reta da curva de quantificação, Vt= volume total na análise (mL), Ve= volume
enzima na análise (mL), T= tempo (minutos) e Fd= fator de diluição utilizado.
Algumas amostras apresentaram a necessidade de realizar uma diluição, onde o fator
de diluição foi calculado a partir da equação 2 descrita abaixo.
Equação 2. Cálculo do Fator de diluição
Onde, Fd= fator de diluição, Vt= volume total (mL) e Ve= volume enzima (mL).
As diluições foram realizadas com proporção amostra(µL):água(µL) de 200:200,
100:300, 50:350, 25:375, e especificamente para os fungos codificados como MIBA 0346 e
MIBA 0769 houveram diluições 10:390 e 5:395.
É importante ressaltar também que durante o período de análise foi realizada a medição
de pH dos concentrados a cada dia onde foi observado que as linhagens em estudo baixaram
o pH nos três primeiros dias e o mantiveram entre 4,5 e 5,5 durante os demais dias.
RESULTADOS
PRODUÇÃO DOS CONCENTRADOS ENZIMÁTICOS DE XILANASE
A reavaliação da produção de concentrados foi realizada em um período de 20 dias
consecutivos. Observou-se que tanto para os concentrados xilanásicos quanto para os β-
glicosidásicos, a atividade enzimática aumentou de maneira significativa em relação a
avaliação inicial realizada anteriormente como descrito no relatório parcial anterior.
Atividade xilanase dos concentradosO gráfico 5 mostra a reavaliação realizada para a produção dos concentrados
enzimáticos onde houve a confirmação que as linhagens tidas sob o código MIBA 0769 e MIBA
0346 que estavam mantidas sob agitação em shaker orbitalar obtiveram atividade enzimática
igual 3.000 U/mL e 2.700 U/mL em 15 e 12 dias de cultivo respectivamente. Os cultivos que
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foram mantidos de forma estática apresentaram maior potencial apenas no último dia de
análise, no entanto os valores obtidos de atividade enzimática para essa enzima não
superaram o daqueles que foram mantidos sob agitação. Dessa forma, a reavaliação confirma
a maior susceptibilidade dos concentrados xilanásicos que foram mantidos sob agitação serem
capazes de hidrolisar resíduoes de materiais hemicelulolíticos. Gráfico 5. Atividade enzimática dos concentrados de xilanase. Fonte: Dados da pesquisa.
Proteína dos concentrados xilanásicosO teor de proteína reavaliado para os concentrados xilanásicos mostrou-se equivalente
ao aumento de atividade enzimática dos concentrados de xilanase. Os valores onde houve
decaimento significativo são caracterizados pela adição de meio fresco ao cultivo. As linhagens
tidas com os códigos MIBA 0769 e MIBA 0346 mantida sob agitação foram aquelas que
demonstraram maiores teores de proteína produzidos no meio.
Gráfico 6. Proteína dos concentrados de xilanase.
Fonte: Dados da pesquisa.
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Açúcar redutor dos concentrados de xilanase.A reavaliação da glicose liberada ao meio de cultivo é mostrado no gráfico 7 onde
confirma-se que as linhagens que foram mantidas sob agitação apresentam liberação de aúcar
para o meio nos primeiros dias de cultivo. No entanto, depois de adaptadas e com potencial de
atividade enzimática aumentando os mesmos mostraram que o açúcar roduzido ao meio foi
consumido durante os outros dias de cultivo. Em relação as linhagens que foram mantidas de
modo estático e que anteriormente mostraram valores incoerentes e contraditórios para esta
análise, nesta reavaliação foi possível detectar que o açúcar produzido no meio não é
consumido durante os dias de cultivo o que confere com a menor atividade enzimática
encontrada.
Gráfico 07. Açúcar redutor dos concentrados de xilanase.Fonte: Dados da pesquisa.
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PRODUÇÃO DOS CONCENTRADOS ENZIMÁTICOS DE β-GLICOSIDASE
A reavaliação dos concentrados da enzima β-glicosidase confirma a significância de
atividade enzimática para as linhagens que foram mantidas sob agitação em shaker orbitalar
durante os 20 dias de análise. A partir dessa reavaliação confirmou-se que a ausência do fator
agitação contribuiu para a inibição para a produção da enzima como mostrado no gráfico 8 a
seguir. A reavaliação também confirmou que apenas uma linhagem mostrou-se significativa na
hidrólise do material celulolítico.
Atividade β-glicosidase dos concentrados
Nesta reavaliação dos concentrados da enzima β-glicosidase observou-se novamente o
aumento significativo de atividade enzimática da linhagem MIBA 0300 mantida sob agitação
igual a 4,23 U/Ml após 20 dias de cultivo. Observou-se novamente que as outras linhagens
analisadas obtiveram valores semelhantes ao da avaliação inicial realizada e foram
considerados irrelevantes mesmo após 20 dias de produção. Gráfico 8. Atividade enzimática dos concentrados de β-gicosidase. Fonte: Dados da pesquisa.
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Proteína dos concentrados β-glicosidásicos
A reavaliação do teor de proteína realizada para os concentrados da enzima β-
glicosidase mostrou-se equivalente para a linhagem MIBA 0300 que obteve maior produção de
atividade enzimática durante o período de 20 dias e dessa forma obteve também o maior teor
de proteína produzido. Em relação as demais linhagens houve incoerência quando nota-se que
a atividade das mesmas foi irrelevante, mas que no entanto nas análises para o teor de
proteína os valores mostraram-se bastante significativo.
Gráfico 9. Proteína dos concentrados de β-gicosidase.Fonte: Dados da pesquisa.
Açúcar redutor dos concentrados de β-glicosidaseA reavaliação de glicose realizada para os concentrados de β-glicosidase mostra que as
linhagens mantidas sob agitação mostraram pouca liberação de açúcar para o meio de cultivo
e alto consumo durante os dias seguintes, exceto no décimo dia onde houve adição de meio
fresco ao cultivo. Em relação as linhagens mantidas sob modo estático, houve liberação de
glicose para o meio até o oitavo dia de cultivo e em seguida consumo do mesmo durante os
dias seguintes.
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Gráfico 10. Açúcar redutor dos concentrados de β-gicosidase.Fonte: Dados da pesquisa.
PUBLICAÇÕES
Ainda não foram realizadas publicações com os dados obtidos.
CONCLUSÃO
A partir dos resultados discutidos anteriormente e de acordo com a reavaliação das
análises realizada para os concentrados enzimáticos em questão conclui-se que para a alta
produção de atividade enzimática de ambas a agitação mostra-se como fator determinante
para alta produção desses concentrados.
Na reavaliação da atividade enzimática para a enzima β-glicosidase o concentrado
produzido pela linhagem MIBA 0300 mantida em agitação continua apresentando maior valor
significativo de atividade endo igual a aproximadamente 4,2 U/mL em 20 dias de cultivo
demostrando-se a capacidade de hidrólise de material celulolítico.
Na reavaliação das atividades para a enzima xilanase os concentrados das linhagens
que foram mantidos sob agitação continuaram sendo os de maior significância por
apresentarem atividade enzimática igual a aproximadamente 3.000 U/mL e 2.700 U/mL como
observado na avaliação inicial.
Sendo assim conclui-se de maneira geral que as linhagens selecionadas para
reavaliação mostraram-se coerentes a avaliação inicial realizada e onde também observou-se
probabilidade de maior produção se realizado o processo de batelada por corte por maior
período de dias. Os concentrados obtidos em questão nos quais foram reavaliados mostraram-
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se novamente promissores para a hidrólise de material residual constituído de celulose e
hemicelulose de natureza semelhante ao dos substratos utilizados nas análises, farelo de trigo
e xilano de madeira, para as enzimas β-glicosidase e xilanase.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANDREWS, J. H.; HARRYS, R. F. The ecology and geography of microorganism on plants
surfaces. Annu Rev Phytopathol. v.38:145-180, 2000.
BRADFORD, M. A rapid sensitive for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of proteín dye binding. Analytical Biochemistry, v 72, p 248-254, 1976
CARVALHO. M.L. Estudo cinético da hidrólise enzimática de cellulose de bagaço de cana-de-açúcar. Dissertação de Mestrado. Universidade de São Carlos, 2011.
COLLARES, R.N. Otimização do processo de hidrólise da mandioca “in natura” com uso de enzimas amilolíticas e pecnolítica. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de
Santa Maria, 2011.
COUGHLAN, M. P. AND HAZLEWOOD G. β-1,4-D-Xylan-degrading enzyme
systems: Biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnol. Appl. Biochem. 17, 259-289, 1993.
DAROIT, D.J. Caracterização de uma β-glicosidase de Monascus purpureus. Dissertação
de mestrado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2007.
HECK, J. X.; SOARES, L. H. B.; HERTZ, P. F.; AYUB, M. A Z. (2006), Purification and
properties of a xylanase produced by Bacillus circulans BL53 on solid-state cultivation.
Biochemical Engineering Journal, 32, 179-184.
LEHNINGER, A. L. Princípios de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo: Savier, 2006.
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MACIEL, G.M. Desenvolvimento de Bioprocesso para a produção de xilanases por fermentação no estado sólido utilizando o bagaço da cana de açúcar e farelo de soja. Dissertação de mestrado. Universidade Federal do Paraná, 2006.
MATSUURA, M; SASAKI, J e MURAO, S. Studies on β-Glucosidades from Soybeans that
hydrolyze Daidzin and Genistin: Isolation and Characterization of an Isozymeeasurement of
celulase activities. Bioscience Biotechnology&Biochemistry, 59 (9), 1623- 1627, 1995.
MILLER, G. L. “Use of dinitrosalicylle acid for determination of reducing sugar”, Anal.Chem.11,
426-428, 1959.
MOTTA, V.T. Bioquímica básica. Capítulo de Enzimas. Editora autolab. 2011.
TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. Microbiologia. 6a Ed. Editora Artmed, Rio de
Janeiro, 2002.
VALADARES, F.L. Produção e uso de enzimas derivadas do fungo Pleurotus ostreatus na hidrólise de bagaço de cana pré tratado por processo quimiomecânico. Dissertação de
Mestrado. Universidade de São Paulo, 2013.
DIFICULDADES
O fator que dificultou o desenvolvimento do trabalho foi uma inibição inicial das enzimas
pela utilização de um antibiótico. Outros fatores que contribuíram para atrasos nas análises foi
a contaminação por ácaros das linhagens que estavam em análise. Dessa forma, foi
necessário retirar as mesmas novamente da Micoteca do Laboratório onde estavam
preservadas e readaptando-as ao meio de cultivo para a produção das enzimas estudadas.
PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das
atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso.
DATA : ______/_________/________
_________________________________________ASSINATURA DO ORIENTADOR
____________________________________________ASSINATURA DO ALUNO
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FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA
O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO :
1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas?
2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho?
3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos?
4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo?
5. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório
6. Parecer Final: Aprovado ( ) Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações)Reprovado ( )
7. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) _____________Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório.
Data: _____/____/_____.
________________________________________________Assinatura do(a) Avaliador(a)
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