UNIVERSITA’DI PISA
Dipartimento di Farmacia
Corso di Laurea specialistica in Farmacia
Antagonisti del recettore dell’Orexina: nuovi agenti
terapeutici per il trattamento dell’insonnia
Candidata:
Priscilla Bonotti
Relatori:
Prof.ssa Sabrina Taliani
Dott.ssa Silvia Salerno
Anno Accademico 2014-2015
INDICE
Pag
Premessa _____________________________________________ 1
Introduzione___________________________________________ 15
Antagonisti dell’Orexina__________________________________ 35
Agonisti dell’Orexina____________________________________ 84
Conclusioni____________________________________________ 95
Bibliografia____________________________________________ 97
1
PREMESSA
Gli esseri viventi passano circa un terzo della loro vita a dormire; il sonno
fisiologico è un processo biologico attivo regolato dalla sostanza reticolare
ascendente e dal sistema limbico ed è suddiviso in due stadi: (1) il sonno ortodosso
o sincronizzato (NREM, Non-Rapid-Eye-Movement), il quale è suddiviso a sua
volta in quattro fasi caratterizzate da un aumento progressivo del numero di onde
di bassa frequenza e di alto voltaggio; (2) il sonno paradosso o desincronizzato
(REM, Rapid-Eye-Movement), in cui l’attività EEG è simile a quella dello stato di
veglia, caratterizzato da onde di elevata frequenza e di basso voltaggio. Il sonno
REM nell’uomo corrisponde all’attività onirica, quindi al sogno, che è essenziale
per il recupero dell’attività cerebrale. Durante il sonno si ha un’alternanza regolare
di fasi NREM e REM: dopo l’addormentamento il soggetto passa pian piano dallo
stadio 1 del sonno NREM allo stadio 4, poi ritorna fino allo stadio 3 o al 2 perciò
tra i 70 e i 90 minuti dopo l’addormentamento si verifica la prima fase di sonno
REM che dura circa 15 minuti e, alla fine di questa fase, si conclude il primo ciclo
che dura circa 80-100 minuti. Dopo il primo ciclo se ne susseguono altri di durata
costante dove il sonno REM aumenta in durata e gli stadi 3 e 4 si fanno più brevi.
Le fasi del sonno variano circa 5 volte durante una notte di riposo di circa 8 ore e il
sonno NREM costituisce circa il 70-75 % del sonno totale, il sonno REM circa il
25-30%. Il sonno NREM precede sempre il sonno REM quindi il sonno inizia
sempre con la fase NREM.
È stato stimato che il 50% degli adulti negli Stati Uniti (circa 120 milioni di persone
secondo il censimento 2010) non riposa bene almeno un paio di notti a settimana.[1]
Solo il 3-10% dei pazienti soddisfa le linee guida del Diagnostic and Statistical
Manual of the American Psychiatric Association (DSM-APA) per la diagnosi
dell’insonnia primaria, ma i disturbi del sonno sono una delle lamentele più
frequenti riscontrate nella pratica clinica. [2]
2
I DISTURBI DEL SONNO
I disturbi del sonno comprendono quattro categorie di disturbi (disturbi primari del
sonno, disturbi del sonno correlati ad un altro disturbo mentale, disturbo del sonno
dovuto ad una condizione medica generale, disturbo del sonno indotto da sostanze)
organizzati in base alla presunta eziologia.
I disturbi primari del sonno riguardano principalmente :
dissonnie (anomalie della quantità, della qualità o del ritmo del sonno)
parasonnie (comportamenti anomali o eventi fisiopatologici che si presen-
tano durante il sonno, sia in specifiche fasi che nei passaggi sonno-veglia)
Dissonnie (tabella 1)
Questi disturbi ostacolano l'individuo dal prendere sonno o ne provocano il
risveglio precoce. Sono caratterizzate da qualità, quantità od orari disfunzionali del
sonno. Le persone che ne soffrono lamentano difficoltà ad addormentarsi, rimanere
addormentati, veglia notturna, o combinazioni di questi sintomi. Fattori scatenanti
comuni, a volte di disturbi transitori, possono essere lo stress, l'assunzione di
sostanze psicotrope, l'abitudine del riposo diurno ed altri.
Tra le dissonnie ritroviamo:
Insonnia primaria: sembra essere un fattore di rischio, o un sintomo precoce
di conseguenti disturbi dell’umore, dell’ansia o dell’abuso di sostanze
Ipersonnia primaria: episodio maggiore di sonno compreso tra le 8-12 ore,
associato a sonnolenza diurna con frequenti addormentamenti e difficoltà al
risveglio. Vi è un’associazione con i disturbi dell’umore e con l’abuso di
sostanze, tipicamente stimolanti
Narcolessia: ripetuti attacchi irresistibili di sonno ristoratore, cataplessia e
intromissioni di elementi di sonno REM nella transizione tra sonno e veglia.
Il 20-40% è associato ad allucinazioni ipnagogiche o ipnopompiche. Nel
40% dei casi si possono identificare un disturbo mentale concomitante o una
3
storia di disturbi mentali: disturbi dell’umore, disturbi d’ansia, disturbi cor-
relati a sostanze
Disturbo del sonno correlato alla respirazione
Disturbo del ritmo circadiano del sonno
Tabella 1.
DISSONNIE
INSONNIA PRIMARIA
Tipo Durata
Insonnia iniziale Insonnia occasionale
Insonnia centrale Insonnia transitoria
Insonnia terminale Insonnia cronica
IPERSONNIA
Ipersonnia idiopatica
Ipersonnia-Bulimia Sindrome di Kleine-Levin.
NARCOLESSIA
DISTURBO DEL SONNO CORRELATO ALLA RESPIRAZIONE
DISTURBO DEL RITMO CIRCADIANO DEL SONNO
Insonnia primaria
L’insonnia è definita come uno stato di diminuita durata del sonno, una sensazione
soggettiva di non avere tratto un adeguato beneficio dal sonno perché breve o poco
riposante. Ci sono vari tipi di insonnia che possono essere classificati come:
insonnia iniziale quando esiste una difficoltà nell’addormentamento;
insonnia centrale quando il sonno è interrotto da risvegli frequenti;
insonnia terminale quando il risveglio mattutino è precoce.
Si classifica anche la durata dell’insonnia e quindi è possibile distinguere:
insonnia occasionale che dura pochi giorni ed è causata da particolari fattori
come ansia, stati di malattia, cambiamento del fuso orario;
insonnia transitoria quando il disturbo si prolunga fino a tre settimane, è
causata da stress acuto in soggetti che non hanno problemi di sonno;
4
insonnia cronica quando il disturbo persiste nel tempo a causa di fattori di
natura psicopatologica, alcol, farmaci, turbe psichiatriche.
I fattori che influenzano la quantità e qualità del sonno sono di varia natura: a volte
l’origine dell’insonnia può essere dovuta ad una sola causa, altre volte a più cause.
I meccanismi del sonno possono essere influenzati da fattori psicologici quali
tensione emotiva, problemi familiari ed economici, che causano stress ed ansia nel
soggetto; talvolta l’insonnia può essere causata dalla presenza di fattori ambientali,
legati ad esempio all’altitudine o alla sindrome del jet lag.
Si parla di insonnia primaria quando il disturbo si manifesta in un soggetto sano, di
insonnia secondaria quando l’alterazione del sonno è dovuta a particolari patologie.
L’insonnia provoca ripercussioni sull’efficienza e sul benessere dell’individuo quali
diminuzione della concentrazione, problemi di memoria, irritabilità e stanchezza
causando una diminuzione delle difese immunitarie, provocando maggiore
suscettibilità verso malattie ed infezioni.
I farmaci generalmente usati per curare l’insonnia appartengono alla classe delle
benzodiazepine (Bzd) o dei simil-benzodiazepinici come ad esempio lormetazepam,
triazolam, eszopiclone, zolpidem. Le Bzd ansiolitiche funzionano nella prima fase
del sonno, quelle ipnotiche nella fase intermedia e finale. Il nitrazepam, lorazepam,
flunitrazepam, flurazepam sono ipnotici. La somministrazione di farmaci
ansiolitici/sedativi ed antidepressivi è indicata per trattare l’insonnia cronica, di
grave entità, accompagnata da disturbi psicologici che ostacolano non solo il sonno,
ma anche la vita sociale del soggetto che ne è affetto. Anche se i sintomi
dell’insonnia dopo pochi giorni dall’assunzione spariscono, è sconsigliata
l’interruzione brusca ed improvvisa del trattamento che, infatti, potrebbe provocare
il tipico effetto di rimbalzo, con ricadute accompagnate talvolta da sintomi più gravi
del disturbo precedente.
Nel sonno indotto dagli ipnotici, cioè nel sonno farmacologico, il profilo del sonno
fisiologico viene alterato. Quasi tutti gli ipnotici provocano un REM-deficit
determinato dalla riduzione della fase REM, che comporta un effetto rebound, in
cui la fase REM dura più a lungo del solito provocando un sonno agitato, incubi e
quindi insonnia. Un farmaco ipnotico ideale dovrebbe avere certe proprietà come
5
ad esempio la rapidità di assorbimento e di effetto, selettività recettoriale per i
recettori del SNC, indurre un sonno simile a quello fisiologico, mantenere il sonno
per un periodo adeguato, tale da garantire una copertura notturna, assenza di
metaboliti, assenza di assopimento, non perdere di efficacia se somministrato
ripetutamente, non accumularsi nell’organismo, non essere pericoloso in
sovradosaggio, non causare insonnia da rebound, non causare apnea notturna, non
creare dipendenza psicofisica e non avere effetti collaterali sulle funzioni cognitive
e di memoria.
I più nuovi agenti non-benzodiazepinici, Zopiclone, Zolpidem, e Zaleplon (detti
farmaci Z) hanno un’azione ipnosedativa comparabile a quella delle Bzd, ma
presentano proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche specifiche. Questi tre
agenti Z condividono tutti una breve emivita plasmatica e durata di azione limitata.
Inoltre questi agenti interagiscono preferenzialmente con i recettori omega-1
(effetto sedativo), mentre le Bzd interagiscono anche con i recettori omega-2 (effetti
avversi sulla performance cognitiva e sulla memoria). Zaleplon è caratterizzato da
un’emivita ultra-corta (approssimativamente 1 ora); Zolpidem e Zopiclone hanno
emivita più lunga (rispettivamente circa 2.4 e 5 ore). Queste proprietà, assieme al
basso rischio di effetto residuo, possono spiegare le limitate influenze negative degli
ipnotico-sedativi non-benzodiazepinici sulla performance diurna. Le attività
psicomotorie e le capacità mnemoniche appaiono essere meglio preservate dai
farmaci non-benzodiazepinici rispetto alle Bzd. Quando presenti, i deficit cognitivi
coincidono, quasi esclusivamente, con la concentrazione plasmatica di picco. In
particolare il disturbo cognitivo può emergere nelle prime ore dopo la
somministrazione del farmaco, mentre i test psicomotori e mnemonici eseguiti 7-8
ore più tardi (per esempio alla mattina) generalmente non risultano alterati in modo
rilevante. Come per le Bzd, i tre farmaci Z non-benzodiazepinici devono essere
impiegati per un limitato periodo, anche in condizioni patologiche croniche. [3]
La terapia cognitivo comportamentale (CBT) è attualmente considerata a livello
internazionale uno dei più affidabili ed efficaci modelli per la comprensione ed il
trattamento dei disturbi psicopatologici. La teoria di fondo sottolinea l’importanza
delle distorsioni cognitive e della rappresentazione soggettiva della realtà
nell’origine e nel mantenimento dei disturbi emotivi e comportamentali; ciò implica
6
che non sarebbero gli eventi a creare e a mantenere i problemi psicologici, emotivi
e comportamentali, ma questi verrebbero piuttosto influenzati dalle strutture e
costruzioni cognitive dell’individuo. La CBT si propone di aiutare i pazienti ad
individuare i pensieri ricorrenti e gli schemi disfunzionali di ragionamento e
d’interpretazione della realtà al fine di sostituirli con convinzioni più funzionali.
Essa ha assunto il ruolo di trattamento di elezione per i disturbi dell’ansia, è
scientificamente fondata; infatti, ha mostrato risultati simili agli psicofarmaci nel
trattamento della depressione e dei disturbi dell’ansia ed assai più utile per evitare
le ricadute. Il terapeuta lavora insieme al paziente per stabilire gli obiettivi della
terapia, formulando una diagnosi e concordando con il paziente un piano di
trattamento adatto alle sue esigenze e si preoccupa in seguito di verificare i
progressi, in modo tale da controllare se gli scopi sono stati raggiunti. È una terapia
a breve termine, di solito varia dai quattro ai dodici mesi, a seconda del caso;
problemi psicologici più gravi, che richiedono tempi più prolungati di cura,
traggono vantaggio dall’uso integrato della terapia cognitiva, degli psicofarmaci e
di altri trattamenti.
Ipersonnia primaria
L'ipersonnia può essere causata da un'eredità genetica, da un trauma cranico (nella
forma post-traumatica), da diversi disordini psicologici quali la depressione e da
eventi clinici come in caso di uremia e fibromialgia. L'ipersonnia può anche essere
dovuta ad altri disordini come la narcolessia o la sindrome metabolica
La diffusione di tale disturbo è stata calcolata nel 5% della popolazione generale;
altri studi non si allontanano da questa stima ponendo un range dal 4 al 6%.
Fra i sintomi e i segni clinici correlati ritroviamo irritazione, allucinazioni, perdita
di memoria, ansia, disorientamento, senso di fatica sia fisica che mentale.
Si possono avere due tipi di ipersonnia primaria:
Ipersonnia idiopatica;
Ipersonnia-Bulimia Sindrome di Kleine-Levin.
7
Ipersonnia idiopatica
Caratterizzata da un sonno notturno di buona qualità che può avere una durata
normale (meno di 10 ore per notte) o eccessivamente lunga (più di 10 ore per notte)
e, a dispetto di ciò, da una eccessiva sonnolenza diurna, che si concretizza in
sonnellini diurni di durata eccessivamente lunga (più di una o due ore) e non
ristoratori.
Ipersonnia-Bulimia Sindrome di Kleine-Levin.
Condizione rara caratterizzata da attacchi ciclici di iperfagia seguiti da giorni in
cui non si riesce a dormire; nel resto del tempo il sonno e le condizioni risultano
normali; è più frequente nei giovani.
Narcolessia
La narcolessia è un disturbo che causa periodi di estrema sonnolenza diurna e, in
certi casi, anche debolezza muscolare. La maggior parte dei pazienti narcolettici
non riesce a dormire bene di notte, alcuni malati si addormentano all’improvviso,
anche mentre stanno parlando, mangiando o dedicandosi ad altre attività. La
narcolessia può inoltre causare cataplessia, la quale provoca una perdita improvvisa
di tono muscolare durante la veglia; la debolezza muscolare può colpire tutto il
corpo, o solo alcune zone. Chi soffre di narcolessia spesso entra troppo velocemente
nella fase REM e si sveglia durante quella fase, perciò può avere sogni vividi mentre
si addormenta e si sveglia, in quanto i sogni si verificano durante la fase REM; in
questa fase i muscoli normalmente si rilassano impedendo di muoverci, e si sogna
come se vivessimo davvero i nostri sogni. I pazienti narcolettici hanno carenza di
ipocretina, una sostanza chimica presente nel cervello, che serve per stimolare la
veglia. I ricercatori ritengono che la carenza sia dovuta a diversi fattori concomitanti,
tra cui fattori ereditari, infezioni, lesioni cerebrali, patologie autoimmuni. Alcune
ricerche indicano che le tossine ambientali come metalli pesanti, pesticidi,
diserbanti e fumo potrebbero essere fattori scatenanti della narcolessia. Per la
narcolessia non esiste alcuna cura, tuttavia i farmaci, le modifiche dello stile di vita
e altre terapie sono in grado di alleviare diversi sintomi. Per affrontare la narcolessia
8
si può ricorrere a uno o più farmaci, tra cui stimolanti, per alleviare la sonnolenza
diurna ed aumentare la vigilanza, farmaci che aiutano a compensare la carenza di
ipocretina, antidepressivi per prevenire la cataplessia, le allucinazioni e la paralisi
del sonno; sono invece da evitare i farmaci antistaminici, cioè che sopprimono
l’azione dell’istamina, la sostanza presente nel sangue che aiuta a rimanere vigili.
Un’altra terapia potrebbe essere la fototerapia per mantenere un ritmo sonno-veglia
regolare: durante questa terapia, il paziente si espone per circa 30 minuti alla luce
di una lampada speciale in modo tale da sentirsi meno assonnato alla mattina.
Disturbo del sonno correlato alla respirazione
La sindrome delle apnee ostruttive morfeiche (OSAs) è una delle patologie del
sonno più frequenti (4% della popolazione) ed è caratterizzata da importante
russamento e dalla comparsa durante il sonno di numerosi episodi di ostruzione
delle vie aeree superiori con conseguente interruzione del flusso aereo;
generalmente sono i parenti o i conviventi del soggetto che riferiscono di percepire
delle interruzioni del respiro durante la notte ma talvolta anche i pazienti raccontano
episodi di risveglio improvviso con sensazione di soffocamento. Tali apnee
determinano alterazioni respiratorie e cardiocircolatorie e compromettono la
funzione ipnica con conseguente sonnolenza diurna e riduzione delle performances
durante la veglia. Tra gli elementi caratteristici di questa patologia vi sono inoltre
la cefalea e la secchezza delle fauci al risveglio, la nicturia. Nell’adulto tale
sindrome si associa ad un’importante morbilità e mortalità cardiovascolare e
cerebrovascolare, senza contare il fatto che può rendersi responsabile della
comparsa o dell’aggravamento di uno stato di ipertensione arteriosa (il 30 % dei
pazienti ipertesi sono apnoici ed il 50 % dei pazienti affetti da OSAs sono ipertesi).
La sindrome sembra inoltre aumentare il rischio di infarto del miocardio, di
insufficienza cardiaca e di disturbi vascolari cerebrali, e la mortalità è nettamente
più elevata nei pazienti con più di 20 apnee per ora di sonno. Inoltre, a causa dei
problemi di vigilanza diurna, il rischio di incidenti stradali, professionali e
domestici è valutato di 7-10 volte più elevato in questi pazienti rispetto ai controlli
sani.
9
Il trattamento è fortemente correlato alla gravità del quadro clinico, alla costituzione
del paziente ed alle cause (malformazioni anatomiche dell’oro-faringe,
ipotiroidismo, acromegalia), qualora siano identificabili; infatti, ai pazienti obesi è
primariamente indicato un dimagrimento, oltre che il decubito laterale, e non supino
durante il sonno, in caso di apnee-posizione dipendenti; l’astensione dal tabacco,
dagli alcolici e dalle Bdz viene inoltre normalmente consigliata, in quanto fattori
aggravanti la sindrome. L’uvulo-palato-plastica, tecnica chirurgica
otorinolaringoiatrica può essere utile in casi specifici (russamento importante ed
apnee su base anatomica). Il trattamento a tutt’oggi di scelta dell’OSAs di tipo
ostruttivo è la respirazione notturna in pressione positiva continua (CPAP); il
principio si basa sull’utilizzo di una maschera nasale con cui si applica una
pressione positiva a livello delle vie aeree superiori mentre il paziente continua a
respirare normalmente nottetempo. Questa pressione agisce come “sostegno
pneumatico” interno che impedisce il collasso e la chiusura inspiratoria delle vie
aeree a livello faringeo, responsabili delle apnee-ipopnee ostruttive.
Disturbo del ritmo circadiano del sonno
Le patologie del ritmo circadiano possono originare da un’alterazione del pace
maker endogeno (sindrome da fase di sonno ritardata, sindrome da fase di sonno
anticipata, sindrome ipernictemerale) o da cause esterne (sindrome da jet-lag,
sindrome da turnismo).
Parassonnie (tabella 2)
Le diverse forme di parasonnia vengono classificate in base alla loro occorrenza
durante le diverse fasi del sonno:
Parasonnie del sonno NREM (disordini dell’arousal)
Parasonnie solitamente associate al sonno REM
Altre parasonnie
Parasonnie del sonno NREM (disordini dell’arousal)
Rappresentano un gruppo di manifestazioni motorie complesse che si verificano
10
durante il sonno NREM, soprattutto durante la fase di “sonno profondo” che appare
maggiormente rappresentato nella prima parte della notte. Per tale motivo, queste
manifestazioni si verificano più frequentemente entro 1-2 ore
dall’addormentamento. Un episodio mediamente dura qualche minuto ma la sua
durata può essere molto variabile: da qualche secondo fino anche a 30 minuti.
Tabella 2.
PARASONNIE
PARASONNIE DEL SONNO NREM
(DISORDINI DELL’AROUSAL)
Risvegli confusionali
Sonnambulismo
Terrori notturni
PARASONNIE SOLITAMENTE
ASSOCIATE AL SONNO REM
Disturbo comportamentale in fase
REM (REM sleep behavior disorder,
RBD)
Paralisi del sonno
Incubi notturni
ALTRE PARASONNIE
Enuresi notturna
Groaning (catathrenia)
Sindrome della testa che esplode
(“Exploding head syndrome”)
Allucinazioni ipnagogiche o
ipnopompiche
Sleep-related eating disorder
(SRED)
Solitamente le parasonnie del sonno NREM insorgono in età infantile
(probabilmente per l’alta rappresentazione del sonno profondo durante tale fase
della vita) e tendono a ridursi o scomparire con l’età adulta.
Spesso esiste una familiarità per tali episodi, che possono essere scatenati da alcuni
fattori quali la deprivazione di sonno, cicli sonno-veglia irregolari, febbre,
11
infezioni, alcol, alcuni farmaci e altri disturbi del sonno tra cui le apnee notturne.
Spesso i pazienti non conservano alcun ricordo degli episodi stessi, le cui
caratteristiche cliniche possono essere molto eterogenee. Si distinguono 3 differenti
tipi di manifestazioni (che si possono verificare anche nello stesso soggetto) che,
secondo le interpretazioni più recenti, rappresentano un continuum dello stesso
fenomeno, con diversi gradi di complessità:
Risvegli confusionali
Sonnambulismo
Terrori notturni
Per quanto riguarda la diagnosi, solitamente questa viene posta unicamente in base
alla raccolta di una descrizione dettagliata degli episodi, senza la necessità di
ulteriori indagini. Il primo passo nella gestione di tali episodi consiste nel
rassicurare i pazienti e i suoi familiari circa la natura e l’evoluzione benigne delle
manifestazioni. Spesso non è necessario intraprendere una terapia farmacologica
che viene riservata solamente ai casi in cui le manifestazioni appaiono
particolarmente frequenti, violente o sono causa di sonnolenza diurna. Occorre
tuttavia informare il paziente e i familiari circa il rischio di traumi anche importanti
che si possono verificare durante gli episodi, consigliando di intraprendere misure
di sicurezza.
Parasonnie solitamente associate al sonno REM
Sono manifestazioni motorie complesse che si verificano durante il sonno REM
Disturbo comportamentale in fase REM (REM sleep behavior disorder,
RBD)
Il disturbo comportamentale in sonno REM (RBD) si contraddistingue per la perdita
della fisiologica atonia muscolare. Per tale motivo, durante gli episodi, i pazienti
presentano una eccessiva attività motoria, spesso caratterizzata da comportamenti
bruschi e possono compiere azioni violente, che comportano un alto rischio di
traumi sia per il paziente che per chi gli sta vicino. La loro durata solitamente è
compresa tra 2 e 10 minuti e la frequenza può essere molto varia: da episodi
12
settimanali o mensili a plurinotturni (4-5/notte). L’RBD colpisce più
frequentemente il sesso maschile e solitamente insorge in età adulta-anziana (60-70
anni). Se ne riconosce una forma idiopatica (60% casi) mentre nel 40% si può
associare ad alcune patologie neurodegenerative, come Parkinson, Atrofia
Multisistemica e alcune forme di demenza. La diagnosi di RBD viene formulata
sulla base delle caratteristiche degli episodi riportate dal paziente e dal partner di
letto. Esistono trattamenti farmacologici (ad es. con Clonazepam) che risultano
molto efficaci nella riduzione (in intensità o frequenza) o completa scomparsa di
tali manifestazioni.
Paralisi del sonno
Consistono nell’incapacità di svolgere qualsiasi attività motoria volontaria,
nonostante il soggetto sia completamente cosciente. Possono essere accompagnate
da allucinazioni uditive o visive e possono durare da pochi secondi a parecchi
minuti, causando spesso intensa ansia nel soggetto che le vive. Si possono risolvere
spontaneamente o in seguito a stimolazioni sensoriali. Possono essere favorite da
un ritmo sonno-veglia irregolare e dalla deprivazione di sonno. Si verificano
frequentemente in soggetti senza altri disturbi del sonno, oppure possono
rappresentare uno dei sintomi della narcolessia.
Incubi notturni
Consistono in sogni paurosi, a contenuto negativo, spesso di lunga durata;
frequentemente tali sogni inducono il risveglio del soggetto che ne mantiene un
vivido ricordo. Sono frequenti nei bambini oppure nei pazienti con “disturbo post-
traumatico da stress”. Possono essere favoriti dalla febbre oppure dalla brusca
sospensione di alcol o di farmaci che riducono il sonno REM (anfetamine, alcuni
antidepressivi e Bdz). Queste condizioni, infatti, potrebbero portare ad un brusco e
significativo incremento della rappresentazione del sonno REM, favorendo il
verificarsi di incubi.
13
Altre parasonnie
Enuresi notturna
Consiste in episodi ricorrenti (almeno 2 notti alla settimana) di perdita involontaria
e completa di urina durante il sonno in soggetti di età superiore ai 5 anni. Il
trattamento consiste in un approccio comportamentale (evitare l’assunzione di
liquidi prima di coricarsi; non ritardare la minzione e facilitare l’atto minzionale;
allenare il pavimento pelvico con esercizi di attivazione e rilasciamento; utilizzare
sistemi di allarme che si attivano quando si verifica un’emissione incontrollata di
urina con una suoneria che sveglia il bambino) o farmacologico (desmopressina).
Groaning (catathrenia)
Consiste nell’emissione di un vocalizzo monotono durante un’espirazione
prolungata associata a bradipnea (riduzione della frequenza respiratoria). Gli
episodi, che hanno una durata variabile di circa 2-20 secondi, si verificano più
frequentemente in corso di sonno REM. La causa appare ancora sconosciuta ed,
attualmente, non esiste un trattamento. Sono stati descritti casi in associazione con
le apnee notturne e solo alcuni si sono risolti con il trattamento ventilatorio notturno.
E’ importante tuttavia distinguere tali manifestazioni da episodi di russamento.
Sindrome della testa che esplode (“Exploding head syndrome”)
E’ caratterizzata dalla percezione di un suono spesso molto intenso, simile ad
un’esplosione o ad uno scoppio, che si verifica soprattutto durante la fase di
addormentamento, determinando spesso un risveglio improvviso. Il suono
percepito, seppur molto violento, non è mai accompagnato da dolore. Attualmente
non esiste una spiegazione univoca di tali fenomeni così come una terapia efficace
(alcuni casi descritti sono stati trattati con calcio-antagonisti).
Allucinazioni ipnagogiche o ipnopompiche
Esperienze vivide, simili al sogno, spesso a contenuto bizzarro o terrifico, che si
verificano all’addormentamento (“ipnagogiche”) o in seguito ad un risveglio
14
(“ipnopompiche”). Durante gli attacchi le sensazioni fantastiche possono venire
scambiate per reali. Nella maggior parte dei casi si tratta di allucinazioni visive, ma
possono essere anche uditive, tattili, gustative o olfattive. Possono associarsi alle
paralisi del sonno e, come queste, si verificano frequentemente in soggetti senza
altri disturbi del sonno oppure possono rappresentare uno dei sintomi della
narcolessia.
Sleep-related eating disorder (SRED)
Consiste in episodi ripetuti durante il sonno di ingestione compulsiva di cibi o
bevande; spesso il livello di coscienza durante gli episodi appare nullo o parziale,
così come frequentemente il paziente al risveglio non conserva alcun ricordo
dell’accaduto. La SRED si può associare ad altri disturbi del sonno (disordini
dell’arousal, sindrome delle gambe senza riposo, apnee notturne, narcolessia) e può
essere scatenata dall’assunzione di alcuni farmaci (Bdz, zolpidem, litio) o dalla
brusca sospensione dell’assunzione di alcol. Tale sindrome deve essere distinta da
altre forme di comportamenti alimentari in sonno come la “Night Eating
Syndrome”, caratterizzata da iperfagia (alimentazione eccessiva) serale e notturna,
anoressia (mancanza di appetito) mattutina e insonnia. Esistono diversi farmaci
efficaci nel trattamento della SRED (codeina, clonazepam, antidepressivi
serotoninergici, topiramato).
15
INTRODUZIONE
L’insonnia è definita come la difficoltà ad iniziare o a mantenere il sonno, oppure
avere un sonno non ristoratore; si può presentare in assenza di un altro disturbo
(insonnia primaria) o in concomitanza con una condizione patologica, problemi di
abuso di sostanze, o altri stimoli causali.
Qualunque sia la causa, l’insonnia ha un altissimo costo sociale dovuto al tempo di
lavoro perso, così come al rischio di aumento di incidenti e di malattie accessorie.
Uno studio effettuato negli Stati Uniti a metà degli anni ’90 ha stimato che il costo
diretto di assenteismo e perdita di produttività fosse di circa 40 miliardi all'anno,
mentre i costi indiretti dovuti ad un aumento dei tassi di incidenti e a malattie cor-
relate all’insonnia fosse nel range di 92-107 miliardi di dollari.[4] Uno studio più
recente effettuato in Quebec nel 2009 ha confermato questi risultati, con un costo
totale di circa 5 miliardi all’anno attribuibile a assenteismo, perdita di produttività,
aumento degli infortuni e tassi di malattia.[5] Visto il costo, e tenendo in conside-
razione la salute dei pazienti, risulta evidente quanto sia necessario disporre di un
trattamento terapeutico sicuro ed efficace per l’insonnia.
Così come la diagnosi dei disturbi del sonno è piuttosto complessa per la difficoltà
nell’identificare le cause che portano a questa condizione, allo stesso modo le
terapie possono essere altrettanto complesse. Alcuni medici preferiscono un
intervento non farmaceutico, in forma di terapia cognitivo-comportamentale (CBT).
Questo trattamento implica uno stretto contatto tra il paziente e gli operatori sanitari,
in modo da identificare la causa del disturbo e poi procedere ad una rieducazione
comportamentale. [6] Spesso si ricorre ad altre strategie, compresa la diminuzione
del periodo dedicato al sonno, modifiche di igiene durante il sonno, ed il controllo
dello stimolo che spesso producono effetti benefici sui ritmo del sonno dei pazienti.
Uno svantaggio di questa terapia è che il paziente debba rimanere in CBT per
settimane o mesi prima di ottenere i risultati sperati. Ciò richiede alti livelli di
compliance del paziente ed uno contatto con il medico molto più stretto rispetto a
quello necessario quando si intraprende una terapia farmacologica.
Quando si ricorre a trattamenti farmacologici, i modulatori non benzodiazepinici
del recettore GABAA, quali zolpidem e eszopiclone, sono considerati farmaci di
16
elezione per il trattamento dell’insonnia.[7] Questi farmaci esercitano i loro effetti
attraverso il potenziamento del principale neurotrasmettitore inibitorio, l’acido
gamma-aminobutirrico (GABA), che si traduce in una depressione del sistema
nervoso centrale (CNS), facilitando il sonno.[8,9] Questi farmaci hanno una breve
durata d’azione per cui risultano più efficaci nell’indurre il sonno, piuttosto che nel
mantenerlo. Questo problema è stato affrontato sviluppando formulazioni a rilascio
controllato, o cercando di identificare altri farmaci con caratteristiche
farmacocinetiche diverse; tuttavia, la generale depressione del sistema nervoso
centrale che si produce, comporta nei pazienti problemi di sicurezza [10] [aumento
delle parasonnie notturne (sonnambulismo,11 appetito,12), aumento degli incidenti
alla guida legati alla sonnolenza il giorno dopo.] [13,14]
Questi eventi hanno fatto sì che nel 2013 la US-FDA ha chiesto di abbassare i
dosaggi per tutti i farmaci ipnotici sedativi, a causa dell'impatto della sonnolenza
del giorno successivo sugli incidenti stradali.[15,16] Infine, nel trattamento con
zolpidem sono stati notati effetti di tolleranza e insonnia di rimbalzo, il che ha
portato alla raccomandazione di un suo uso intermittente per brevi periodi di tempo
per pazienti insonni.[9 ]
Considerato l’elevato numero di pazienti affetti da insonnia e visti i limiti delle
opzioni di trattamento ad oggi in uso, sarebbe auspicabile lo sviluppo di nuove
strategie terapeutiche per il trattamento di questo disturbo.
17
IDENTIFICAZIONE DEL SISTEMA DELL’OREXINA E LEGAME
GENETICO CON IL CICLO SONNO/VEGLIA
Scoperta e Nomenclatura dei componenti delle vie di segnale delle Orexine
L'opportunità di studiare i disturbi legati al sonno da un punto di vista alternativo si
è presentata alla ribalta scientifica nel 1998.
In quell’anno i neuropeptidi dell’orexina sono stati descritti, contemporaneamente
da due gruppi di ricerca diversi, utilizzando distinti approcci molecolari e
biochimici, ancora prima che fosse scoperta l’associazione genetica con la
narcolessia. Dall’mRNA proveniente dall’ipotalamo di ratto, de Lecea et al. hanno
identificato, clonato e sequenziato una trascrizione di 569-nucleotidi codificando
un prepropeptide di 130 aminoacidi con sequenza simile a quella della secretina, un
ormone intestinale coinvolto nella osmoregolazione. A causa della sua espressione
limitata nel SNC ai grandi corpi cellulari dell’area ipotalamica laterale dorsale, e
della sua somiglianza sequenziale con la famiglia delle incretine (ormoni peptidici),
il gene è stato chiamato ipocretina (Hcrt). Studi di immunoistochimica hanno
confermato la formazione, da siti di rottura proteolitici, dei due peptidi presenti nei
corpi cellulari e nelle fibre efferenti, e uno dei peptidi prodotto sinteticamente è
risultato in grado di suscitare correnti depolarizzanti in colture primarie di neuroni
ipotalamici [17]. In un tentativo di "deorfanizzare" un gruppo di recettori accoppiati
a proteine G, un altro gruppo di ricerca [18] ha identificato un recettore in grado di
mediare la corrente del Ca2+ in estratti di cervello di ratto. La purificazione, il
sequenziamento, e la valutazione dell'attività biologica derivante da questo
recettore, ha rivelato una sequenza che codificava un precursore peptidico che poi
veniva trasformato in due peptidi correlati. Poiché l’mRNA era espresso
nell'ipotalamo laterale (LH), un'area implicata nella regolazione dell’alimentazione
[19], e poiché la somministrazione intraventricolare di entrambi i peptidi era capace
di modulare l’assunzione di cibo in modo dose-dipendente, i peptidi sono stati
denominati orexina-A e B (OX-A e OX-B) dalla parola greca “orexis”, che significa
appetito. Questi recettori deorfanizzati sono stati identificati come recettori
dell’orexina 1 e dell’orexina 2 (OX1R e OX2R) (18). Questi risultati hanno
stimolato la ricerca di molti gruppi di ricercatori, al fine di meglio chiarire il ruolo
18
di questi fattori di segnalazione nel controllo dell'appetito [20], dell' omeostasi
energetica [21], e del metabolismo [22]. Le scoperte successive del collegamento
genetico alla narcolessia ed il ruolo predominante dell’orexina nel risveglio [24]
hanno tuttavia sollevato la possibilità che la fame indotta dall’orexina, osservata in
modelli preclinici, poteva costituire l’effetto secondario di un aumento della veglia
[25], alimentando il dibattito sulla nomenclatura di questo sistema.
La risoluzione al dibattito della nomenclatura è stata quella di denominare il gene e
l’mRNA ”ipocretina” (Abbreviazione umana: HCRT; roditore: Hcrt) e chiamare il
peptide precursore ed i peptidi elaborati con il termine “orexina” (Orexina A, Ox-
A, Orexina B, Ox-B), tabella 3.
Tabella 3.
Lo stesso vale per i due recettori accoppiati a proteine G per questi peptidi; i geni
HCRTR1 e HCRTR2 (Hcrtr1 e Hcrtr2 nei roditori) codificano rispettivamente per i
recettori OX1R ed OX2R. Sebbene questa nomenclatura possa creare confusione
per i non esperti nel campo, essa tuttavia tiene conto dell'identificazione del gene
dell’mRNA dell’ipocretina attraverso approcci di biologia molecolare, [17] della
scoperta biochimica dei peptidi dell’orexina e dei loro recettori accoppiati a
proteina-G.[18]. Queste denominazioni distinte di prodotti genetici e proteinici
sono tuttora una questione di necessità pratica. HCRT, HCRTR1, e HCRTR2 sono
ora i termini riconosciuti per i geni, riportati in tutti i database genetici, tra cui
GenBank e HUGO. Per quanto riguarda le proteine relative all’orexina, la
nomenclatura formale dell'International Union of Basic and Clinical
PharmacologyNomenclature Committee denomina "OX-A" e "OX-B" i ligandi
farmacologici dei recettori "OX1" e "OX2", rispettivamente. La letteratura biologica
utilizza principalmente la denominazione "orexina", con riferimenti anche
19
all’"ipocretina". Tuttavia il termine "orexina" è usato molto di più sia nella chimica
che nella letteratura brevettuale che si è ampliata notevolmente negli ultimi 15 anni,
man mano che il potenziale terapeutico della modulazione del sistema dell’orexina
è risultato sempre più evidente (figura 1).
Figura 1.
Sebbene i primi brevetti siano stati depositati per derivati dell’orexina e
successivamente per le sonde molecolari (ad esempio, microarray e probe o primer
di reazione a catena della polimerasi), i brevetti relativi ai composti sono divenuti
più rilevanti grazie al crescente interesse nello sviluppo di small molecules quali
potenziali farmaci. Come si vede nella figura 1, il numero di brevetti riguardanti
solo l’"orexina" ha superato di gran lunga quelli della sola "ipocretina" fin dal 1999,
l’anno in cui c’è stato il collegamento genetico con la narcolessia. Al valore del
picco del numero dei brevetti depositati nel 2009, solo 6 su un totale di 965
menzionavano soltanto l’"ipocretina", mentre 866 riguardavano esclusivamente
l’"orexina" e 93 entrambi. Queste cifre dimostrano che le designazioni orexina e
recettore orexinico sono le denominazioni farmacologiche più accettate.
Entrambi i neuropeptidi OX-A e OX-B derivano dallo stesso precursore prepro-
orexina codificata dal gene HCRT. La struttura e l'organizzazione del gene
ipocretina risulta in gran parte conservata attraverso l'evoluzione. In tutti i vertebrati
esaminati, il gene è composto da due esoni con lo splicing dell’introne che rientra
nella porzione iniziale della struttura aperta codificante la sequenza di segnali
secretori (figura 2).
20
Figura 2. La produzione di orexina-A (OX-A) e orexina-B (OX-B) dal gene HCRT
e dal peptide prepro-orexina e valori di binding nei confronti di OX1R e OX2R.
I geni HCRT provenienti da molti organismi, compresi i pesci teleostei, aviaria, e
alcuni mammiferi, si trovano all'interno di cromosomi che con i geni vicini
potrebbero conservare la loro funzione attraverso l'evoluzione [26].
L'organizzazione del precursore peptidico prepro-orexina e la sequenza dei ligandi
maturi di OX-A e OX-B, derivati da esso, sono altamente conservati. Il peptide
umano prepro-orexina da 131 aminoacidi è costituito da sequenze quasi contigue
che codificano la sequenza del segnale secretore (OX-A di 33 aminoacidi e OX-B
di 28 aminoacidi [27], e questa organizzazione, con le sequenze del sito cleavage,
sono esattamente conservate tra tutti gli organismi vertebrati esaminati, compresi
rana, pollo e pesce. Questo include una concomitante scissione "Glicina-base-base”
e siti di ammidazione C-terminali Gly-Lys-Arg, separando le sequenze OX-A e OX-
B, e quella Gly-Arg-Arg che termina la sequenza OX-B [26]. Tra i mammiferi, la
sequenza del ligando maturo OX-A è interamente conservata tra tutte le specie
esaminate e contiene due ponti disolfuro, uno formato dalle cisteine 6 e 12 e un
altro dai residui di cisteina 7 e 14. Questi quattro residui sono anche conservati al
100% dall’uomo fino agli anfibi [26]. L’OX-A maturo viene ulteriormente
21
modificato dopo la traslazione con un acido piroglutammico N-terminale [18]. Le
sequenze di OX-B nei mammiferi, d'altra parte, sono molto ben conservate, ma
hanno due punti di differenziazione: un residuo di serina a livello del secondo
amminoacido nei roditori, canini e bovini, è sostituito da una prolina nella sequenza
umana, e una serina nella posizione 18 viene sostituita da un’asparagina nei roditori
[26]. La diversità di sequenza al di là del segnale secretore confermano l’importanza
funzionale di queste regioni definite. Inoltre, OX-A e OX-B condividono similarità
di sequenza l’una con l’altra, e per questo sono ligandi per entrambi i recettori OX1
e OX2, seppure con affinità diverse. A questo proposito, è opportuno notare che le
sequenze OX-A e OX-B nei mammiferi sono identiche nella porzione C-terminale
dei peptidi maturi, inclusa la sequenza dei 9 aminoacidi Gly-Asn-His-Ala-Ala-Gly-
Ile-Leu-Thr. Esse condividono anche sequenze Arg-Leu e Leu-Leu distanziate di
due amminoacidi l’una dall’altra e i tre amminoacidi N-terminali delle nove
posizioni conservate sopra menzionate, suggerendo che questi residui possono
esistere alla superficie di una struttura secondaria ad alpha–elica [18,26]. Poiché
entrambi i peptidi hanno affinità misurabili per entrambi i recettori OX1 e OX2,
queste osservazioni indicano che questi residui sono essenziali per un’interazione
col recettore dell’orexina. L’OX-A umana ha quasi uguale attività su entrambi i
recettori dell’orexina, con affinità di legame del ligando (IC50) di 20 nM e 38 nM
rispettivamente per OX1R e OX2R, e valori di EC50 rispettivamente di 30 nM e 34
nM nei saggi di mobilitazione del [Ca2+]i in cellule trasfettate per esprimere OX1R
e OX2R umani (figura 2) [18]. L’OX-B, tuttavia, ha un’attività notevolmente
inferiore nei confronti di OX1R con un IC50 di 420 nm e EC50 per [Ca2+]i di 2500
nM. È più selettivo per OX2R, con una IC50 di 36 nM e EC50 di 60 nM [18]. Questa
selettività di OX-B per OX2R è stata utilizzata per interpretare i relativi ruoli di
OX1R e OX2R nelle funzioni biologiche, perché le risposte differenziali alla
microiniezione di questi peptidi in regioni cerebrali indicano la funzione di OX1R,
mentre risposte simili per entrambi i peptidi potrebbero suggerire la funzione di
OX2R. La funzione del recettore, tuttavia, è dimostrata solo con antagonisti del
recettore dell’orexina altamente selettivi e/o genetici.
22
Recettore dell’Orexina 1.
I recettori delle Orexine 1 e 2 sono stati trovati attraverso tutte le specie dei
mammiferi, e le regioni centrali di queste proteine sono altamente conservate. La
maggiore diversità si verifica tra le sequenze di OX1R del ratto e dell’umano, ma
anche queste proteine sono identiche per il 91% e omologhe per 93% (tabella 4).
Tabella 4.
Come visto nella struttura di OX1R, basata su un modello di omologia recettoriale
beta2-adrenergico (figura 3A), la maggior parte dei residui divergenti si trovano nel
grande loop citoplasmatico tra le eliche transmembrana cinque e sei. Alcuni residui
all'interno dei loop, delle porzioni transmembrana, e della tasca di legame del
ligando divergono nelle sequenze di ratto, cane e umano, e questi cambiamenti sono
in gran parte omologhi. L'eccezione è una mutazione da Arg a His al residuo 205
compreso tra il secondo loop extracellulare tra le eliche transmembrana quattro e
cinque nella sequenza del cane, cosa che potrebbe influenzare il legame del ligando
e l’attività dell’antagonista. Le differenze nelle sequenze di OX1R del cane rispetto
a quelle dell’uomo e dei roditori, potrebbero risultare interessanti data la differenza
nei fenotipi basati su interruzioni nella via di segnale dell’orexina in queste specie.
23
Figura 3.
Il troncamento di OX2R nel cane risulta in un fenotipo narcolettico accompagnato
da cataplessia [27], mentre l'eliminazione del gene Hcrt o di entrambi i recettori per
l’orexina nei topi [28] e la perdita del neurone dell’orexina in soggetti narcolettici
umani è associata con questo fenotipo [29]. Il cambiamento da Arg a His in OX1R
del cane, tuttavia, non sembra influenzare l’attivazione del ligando o l'attività di due
diversi antagonisti duali dei recettori dell’orexina [2(R,5R)-5-{[(5-fluoropiridin-2-
il)ossi]metil}-2-metilpiperidin-1-il][5-metil-2-(pirimidin-2-il)fenil]metanone
(MK-6096) e il DORA-22, verso il OX1R del cane [30], indicando che qualsiasi
differenza nella funzione biologica di questo recettore nei cani potrebbe non essere
dovuta a differenze nell’attività del recettore, ma potrebbe essere spiegato con
variazioni di espressione differenziale o regionale.
24
Recettore dell’Orexina 2.
Le sequenze di OX2R dei mammiferi mostrano una conservazione ancora maggiore
tra le specie (tabella 5), cosa che è probabilmente una conseguenza del suo ruolo
principale nel mediare gli effetti dell’orexina sullo stato di eccitazione e di veglia.
Tabella 5.
Allo stesso modo di OX1R, la massima divergenza tra le sequenze di ratto, cane, e
umano si verifica all'interno del loop citoplasmatico tra le eliche transmembrana
cinque e sei (figura 3B), suggerendo che queste posizioni non sono critiche per la
trasduzione del segnale di attivazione o per un segnale successivo della proteina G.
All'interno delle regioni transmembrana e della regione del legame del ligando, si
osservano soltanto sostituzioni di aminoacido conservato. La posizione più
divergente sembra essere situata nel secondo loop extracellulare tra le eliche
transmembrana quattro e cinque dove si trova un residuo Phe al posto di Leu nelle
sequenze di ratto e cane. Sebbene questo cambiamento rappresenti una sostituzione
da un residuo aromatico a uno alifatico, entrambi sono idrofobi. Tra le regioni di
OX2R che rimangono invariate nelle sequenze di umano, cane, e ratto ci sono quelle
critiche per l'interazione con i peptidi OX-A e OX-B, come pure con small
molecules antagoniste del recettore. La tasca di legame del ligando è formata da
un’interfaccia tra le eliche transmembrana, in profondità all'interno della porzione
extracellulare di entrambi i recettori. Come indicato da studi funzionali, le small
molecules antagoniste descritte in letteratura agiscono in modo ortosterico, in
quanto competono per il legame con residui critici per l'interazione del peptide
endogeno. Il terzo dominio transmembrana sembra essere il più critico, visto che
25
rappresenta la zona dove il cambio della sequenza di OX2R rispetto a OX1R varia
le proprietà di legame del ligando. [31] La porzione extracellulare del terzo dominio
transmembrana contiene anche Gln134 e Thr135, residui essenziali rispettivamente
per l’interazione con il ligando peptidico e con le small molecole [32]. È da notare
che la sostituzione di Thr135 con un’alanina in OX2R, che corrisponde all’Ala135
in OX1R, ostacola notevolmente il legame delle small molecules, ma induce un
piccolo aumento dell'attività verso OX-B [32]. Anche altri residui contenuti nelle
porzioni extracellulari dei domini transmembrana 6 e 7 contribuiscono alla
formazione del sito di legame delle small molecules[ 32].
Dal punto di vista dell’evoluzione, i OX2R sembrano essere una aggiunta più antica
alla classe B dei recettori accoppiati a proteine G, rispetto a OX1R, che invece
sembrano derivare da una più recente duplicazione del gene [26]. I geni Hcrtr1
codificanti i OX1R non sono stati identificati al di fuori della classe dei mammiferi
(figura 4), il che suggerisce che queste proteine rappresenti siano coinvolte nel
perfezionamento del sonno, nel controllo della veglia o potenzialmente in altre
funzioni comportamentali uniche nei mammiferi.
Figura 4.
Utilizzando le sequenze dei recettori umani per l’orexina nelle ricerche BLASTP,
sono state identificate proteine che mostravano similitudine con questi recettori,
26
compresi i recettori FF1 e 2 (recettori NPFF1 e 2), i recettori per la sostanza K,
GPR83, i recettori per il neuropeptide Y, e i recettori del peptide QRF (recettore
QRFP, anche conosciuto come GPR103). Sebbene i recettori NPFF1 e 2
condividano un maggior numero di aminoacidi nelle identiche posizioni con OX2R
(31 e 33%) rispetto al recettore QRFP (27%), i recettori QRFP hanno un maggior
numero di posizioni di aminoacidi conservati o simili. Quando i recettori QRFP e
NPFF sono inclusi nell’analisi filogenetica, sono i recettori QRFP ad essere risultati
più simili ai recettori per l’orexina (figura 4). Questa analogia di sequenza e la
mancanza di identità, suggerisce che i recettori QRFP si sono discostati dai recettori
per l’orexina prima dei recettori NPFF, ma hanno acquisito una selettività tale da
mantenere una sequenza omologa. Dopo somministarzione centrale ligandi per il
recettore QRFP sono stati segnalati effetti quali aumenti di eccitazione e di attività
locomotoria, aumenti nell’alimentazione, regolazione del bilancio energetico,
modulazione delle risposte al dolore [33,34], funzioni molto simili a quelle
dell’orexina.
Vie di segnale della Proteina G del Recettore dell’Orexina.
L’attivazione di OX1R e OX2R da parte dell’orexina provoca un’attivazione delle
cellule bersaglio, e in genere si riflette in un aumento intracellulare di livelli di Ca2+
e di eccitazione postsinaptica che può durare diversi minuti [18,53, 42,35]. Sono
state anche evidenziate la modulazione presinaptica del rilascio di
neurotrasmettitore e la modulazione postsinaptica delle risposte ad altri
neurotrasmettitori, in particolare per OX2R, le cui vie di segnale cellulare sembrano
diverse. Le vie di segnale intracellulari specifiche a cui ciascuno di questi recettori
partecipa probabilmente dipendono dall’espressione cellulare e dalla localizzazione
subcellulare (ad esempio, presinaptica rispetto alla postsinaptica) di altri
componenti di segnalazione, come il secondo-messaggero. Gli studi eseguiti sia in
neuroni primari nativi e in sistemi cellulari che esprimono i recettori dell’orexina
ricombinanti, indicano che questi recettori accoppiati a proteine G aumentano il
Ca2+ intracellulare attraverso l’attivazione Gq/11 [36,37]. Pare che entrambi i
recettori dell’orexina agiscano principalmente attraverso Gq/11, ma qualche prova
27
suggerisce che entrambi i recettori siano anche in grado di modulare i livelli ciclici
di nucleotidi attraverso Gas e Gai/o, anche se il loro effetto intracellulare
predominante è quello di aumentare il livello intracellulare di Ca2+ [38,37]. Il
meccanismo diretto attraverso il quale Gaq/11 induce i livelli di Ca2+ nelle cellule
responsive all’orexina è l’attivazione della fosfolipasi C (PLC), che innesca la
liberazione di inositolo-1,4,5-trifosfato (IP3) e il rilascio di Ca2+ dai depositi
intracellulari attraverso i recettori IP3 [39]. Tuttavia, la piena risposta del Ca2+
mediata da OX2R richiede Ca2+ extracellulare attraverso i canali per i cationi non-
voltaggio-dipendenti, che potenziano la risposta della PLC [36,41] o tramite i canali
di tipo L e N del Ca2+ [40]. Un altro lavoro ha suggerito un meccanismo attraverso
il quale il diacilglicerolo, liberato da PLC, potrebbe direttamente attivare i recettori
quali potenziali canali responsabili dell’afflusso di Ca2+ [41]. La capacità di OX2R
di aumentare il Ca2+ intracellulare, come pure di regolare i livelli di cAMP, permette
ai segnali dell’orexina di modulare sia il rilascio presinaptico di neurotrasmettitori
che la risposta postsinaptica ad altri trasmettitori. L’orexina può regolare il rilascio
presinaptico di serotonina, GABA o glutammato [42]. Postsinapticamente nella
VTA, le risposte Ca+2-indotte dall’orexina possono indurre cambiamenti di lunga
durata nell’espressione del recettore N-metil-D-aspartato, potenziando in tal modo
la risposta di questi neuroni per diverse ore. I neuroni dell’orexina rilasciano anche
dinorfina, che attenua i potenziali post-sinaptici inibitori, un effetto che in definitiva
potenzia l’attivazione post-sinaptica indotta dall’orexina nei neuroni dei nuclei
tuberomammillari (TMN) [43]. Questo effetto sinergico dei neuropeptidi potrebbe
fornire una spiegazione per l'obesità più pronunciata e per fenotipi di deregolazione
REM di modelli animali in cui OX2R e i neuroni che secernono orexina sono
geneticamente ablati, rispetto agli animali Hcrt-knockout che hanno una mutazione
nel gene codificante il peptide prepro-orexina [44].
Neuroni dell’Orexina quale componente chiave nelle vie di regolazione del
sonno
L'identificazione di geni mutanti hcrtr2 codificanti versioni tronche di OX2R
responsabili della narcolessia canina trasmessa geneticamente [27] e la descrizione
del fenotipo narcolettico di topi Hcrt-knockout, [45] hanno avviato approfondite
28
indagini sui meccanismi attraverso i quali le orexine promuovono la veglia e il
controllo dello stato di vigilanza. Questi risultati hanno anche portato a focalizzare
gli sforzi per lo sviluppo di small molecules antagoniste per valutare la funzione dei
recettori dell’orexina nel sonno e per convalidare questi recettori quali target per lo
sviluppo di terapie farmacologiche.
Vie di regolazione neurologiche del sonno
L'identificazione dei neuropeptidi dell’orexina ed i loro recettori ha ampliato la
comprensione del network di vie neuronali coinvolte nell'interazione tra il sonno ed
i centri che stimolano l’eccitazione, e come queste aree interagiscono per
controllare lo stato di veglia. L’influenza predominante che favorisce il sonno nel
cervello è fornita dal nucleo preottico ventrolaterale (VLPO) e dalle aree preottiche
mediane adiacenti. I neuroni del VLPO sono per lo più attivi durante il sonno
NREM, parzialmente attivi durante il sonno REM, e silenti durante la veglia. Questi
mandano proiezioni inibitorie per promuovere l'eccitazione delle aree, tra cui i
nuclei tuberomammillari (TMN), i nuclei laterodorsali ed i nuclei tegmentali
pedunculopontini (LDT, PPT), il locus ceruleus (LC), i nuclei del rafe dorsale (DR),
l’area ventrale tegmentale (VTA) [46,47] ed, in particolare, i neuroni orexinergici
dell’LH. Questa influenza inibitoria è mediata principalmente dal GABA. Infatti, è
stato ipotizzato che il potenziamento dei segnali del GABA dal VLPO potesse
essere alla base del meccanismo d'azione dei farmaci che inducono il sonno
attualmente in commercio (ad esempio, zolpidem ed eszopiclone) [47]. I neuroni
che secernono orexina dall’LH si proiettano verso i nuclei del tronco cerebrale
coinvolti nella promozione dell’eccitazione (figura 5).
29
Figura 5.
L’attività di questi nuclei, tra cui il TMN, LDT/PPT, DR e LC, dipende dal bilancio
dell’influenza imposta da entrambi i segnali inibitori provenienti dal VLPO e quelli
eccitatori forniti dall’orexina. In definitiva, l'integrazione di questi segnali
determina lo stato di veglia e quello comportamentale. Una primaria proiezione
orexinergica viene inviata ai TMN, che preferenzialmente esprimono OX2R rispetto
a OX1R [49]. I neuroni TMN si proiettano ampiamente alla corteccia prefrontale
(PFC), talamo, e altre strutture sottocorticali e sono normalmente attivi durante la
veglia e progressivamente meno attivi durante il sonno NREM e REM. Essi
rappresentano la fonte primaria di neuroni istaminergici (HA) nel cervello, ed
agonisti e antagonisti per i recettori HA rispettivamente promuovono e attenuano lo
stato di veglia [50]. L’up-regulation di questa attività istaminergica è alla base del
meccanismo di una nuova classe di farmaci che promuovono il risveglio mediante
inibizione dei recettori H3 dell'istamina, contrastando così i ridotti livelli di HA
osservati nei soggetti narcolettici [27,47]. I neuroni dell’orexina inviano anche
proiezioni ai nuclei colinergici tegmentali (LDT e PPT), come pure ai neuroni LC
noradrenergici ed ai DR serotoninergici. I OX1R sono principalmente espressi nel
30
LC, mentre entrambi i recettori dell’orexina sono rilevabili nel LDT, PPT, e DR
(figura 5) [49]. Insieme ad influenze che promuovono l’eccitazione, queste aree del
tronco cerebrale sono anche responsabili in modo particolare dell’alternanza fra lo
stato di veglia e l’inizio e fine del sonno REM. Le influenze dell’orexina sui neuroni
del LDT e PPT regolano anche l’atonia muscolare che accompagna il sonno REM,
attraverso gli effetti sia diretti che indiretti sui neuroni ventromediali del midollo,
che a loro volta inibiscono i motoneuroni spinali attraverso le proiezioni del GABA
[46, 47].
Le orexine A e B promuovono il risveglio e modulano lo stato di veglia.
Le Orexine forniscono un segnale di eccitazione che è sia necessario che sufficiente
per la normale regolazione del ciclo sonno/veglia. Nel corso del ciclo circadiano
delle 24 ore, i cambiamenti nello stato di veglia sono concomitanti alle oscillazioni
dei livelli dell’orexina. In modelli di animali notturni, i livelli di orexina aumentano
durante le ore notturne, con un picco tardivo nella fase attiva, mentre nei primati, i
livelli di OX-A nel CSF si accumulano nelle ore diurne, con un picco appena prima
della fase di oscurità [52]. L’OX-A somministrata (tramite iniezione
intracerebroventricolare) ai ratti determina un aumento dell'attività locomotoria,
della cura di sé e della veglia, mentre il tempo medio trascorso nelle fasi NREM e
REM del sonno è ridotto. Questi effetti sono maggiori quando l’OX-A è
somministrata durante la fase inattiva, quando i livelli di orexina endogena sono al
minimo e a stento rilevabili, rispetto a quando viene applicata durante periodi di
veglia, come ci si aspetterebbe da un segnale di eccitazione [53]. L’OX-A promuove
anche il risveglio nei topi con una selezionata ablazione genetica dei neuroni
orexigenici. In questo caso, i livelli di veglia e di soppressione del sonno NREM e
REM in animali mutati superano quelli osservati negli animali wild-type trattati allo
stesso modo [24], indicando che i componenti di segnalazione dell’orexina a valle,
tra cui anche i recettori dell’orexina, sono intatti e sono up-regolati in questi mutati
e che il solo neuropeptide è sufficiente come segnale di veglia. Risultati simili sono
stati riscontrati in cani narcolettici dove l’OX-A risulta efficace in un fenotipo di
cataplessia e ipersonnolenza, in un animale che possiede una mutazione nel gene
Hcrt codificante la prepro-orexina, ma non ha alcun effetto su cani con mutazioni
31
del gene per OX2R [54]. È sufficiente l’attivazione artificiale di neuroni secernenti
orexina per stimolare l'eccitazione. In un interessante set di esperimenti,
Adamantidis et al. (2007) [55] e successivamente Carter et al. (2009) [56], hanno
utilizzato topi in cui l’espressione del canale della rodopsina 2 è regolata dal
promotore Hcrt, in modo tale che i neuroni contenenti orexina potessero essere
stimolati con la luce per mezzo di fibre ottiche. L’attivazione dei neuroni orexigeni
nel LH di questi topi induceva transizioni dal sonno NREM o REM ad uno stato di
veglia [55], ma a fronte di un aumento di induzione al sonno causata da una
privazione del sonno, questi effetti che promuovono la veglia come pure
l'attivazione orexina-dipendente dei neuroni TMN e LC sono risultati minori,
indicando che le influenze omeostatiche convergono a valle dell’attivazione del
neurone dell’orexina [56].
Modulazione delle vie di segnale dell’Orexina
In generale, il tempo e la durata del sonno e della veglia sono regolati da due fattori
differenti: il ciclo circadiano che allinea i tempi fisiologici dell’organismo e il
comportamento dovuto ai fattori temporali ambientali quotidiani, e lo stimolo
omeostatico al sonno che allinea le proprietà ristoratrici del riposo con i bisogni
fisiologici ed energetici. Il pacemaker circadiano endogeno risiede nei nuclei
soprachiasmatici (SCN) dell'ipotalamo, e controlla i cicli giornalieri di veglia,
attività locomotoria, motilità intestinale, e la tempistica del sonno anche in assenza
di stimoli esterni, come cambiamenti dell'illuminazione ambientale è [57]. Quando
coltivati in coltura, i neuroni del SCN in sé hanno periodi di attività elettrica di circa
24 h. L'attività del SCN viene influenzata principalmente dall'ambiente, da stimoli
di illuminazione ambientale [58]. Lo stimolo proveniente dal SCN nei confronti del
sistema del sonno è veicolato attraverso la zona ventrale subparaventricolare verso
il nucleo dorso mediale dell'ipotalamo (DMH). Da qui il DMH si protende verso i
neuroni VLPO tramite proiezioni GABA inibitorie e invia le connessioni eccitatorie
all’orexina contenente i neuroni LH . Il DMH, che è in gran parte attivo durante la
veglia , riceve anche gli input relativi all'appetito, all’alimentazione, alla
temperatura corporea, tale che certi livelli di regolazione omeostatica possono
verificarsi a questo livello. Insieme, il DSM e il VLPO coordinano l'attività dei
32
neuroni dell’orexina per regolare l'eccitazione in linea con gli stimoli ambientali
circadiani. Il meccanismo specifico attraverso il quale lo stimolo omeostatico verso
il sonno viene mediato è meno chiaro, tuttavia, si pensa che sia associato
all'omeostasi energetica e alla necessità di risparmiare energia metabolica. Il
bisogno di sonno si accumula con la veglia, così che lo stimolo al sonno si accumula
con la mancanza di sonno. L’evidenza che i neuroni dell’orexina sono un sito di
integrazione per influenze omeostatiche risiede nelle osservazioni che il cell firing
(aumento di energia) dell’orexina è aumentato dall’applicazione diretta di
acetilcolina, glutammato, e di grelina e diminuita dalla leptina, glucosio,
noradrenalina, 5-HT, e GABA [59]. Un candidato adatto a questa regolazione è
l’adenosina, perché durante la veglia prolungata, l’ATP è degradato ad ADP, AMP,
ed, infine, a adenosina, che si accumula nelle parti del cervello [60]. I neuroni
dell’orexina esprimono i recettori A1 dell’adenosina, e l'applicazione
dell'antagonista A1R dell’adenosina, l’1,3,-dipropil-8-fenilxantina, nell’LH
aumenta la veglia e sopprime sia il sonno REM che NREM [61]. La microinfusione
dell’agonista A2A dell’adenosina, il 2-[p-(2-carbossieti)fenil-etilammino]-5’-N-
etilcarbossammidoadenosina (CGS21680), nello striato ventrale promuove il sonno
e attenua la produzione di c-Fos in cellule produttrici di orexina, suggerendo non
solo che l’effetto promotore del sonno tipico dell’adenosina può essere agevolato
da un cell firing orexinergico ridotto, ma anche che la segnalazione orexinergica
non è necessariamente il meccanismo esclusivo per la promozione del sonno
mediato dall’adenosina [62]. Anche fattori di rilascio della corticotropina (CRF) e
dopamina sembrano modulare l'influenza dell’orexina sulla veglia. La segnalazione
CRF in risposta allo stress rappresenta una possibile interazione con il sistema
dell’orexina ed il sonno, perché gli elevati livelli di ormone sono associati al
risveglio, e la somministrazione intracerebroventricolare del CRF induce la veglia
e l’attività locomotoria [27]. Qualsiasi interazione con la via di segnale del CRF,
tuttavia, appare essere a monte dell’orexina, perché l’eccitazione indotta
dall’orexina persiste nei recettori CRF knockout, così come in presenza di
antagonisti del recettore CRF [63]. Di recente sono emerse anche prove relative alla
modulazione dei segnali dell’orexina nell’eccitazione e nello stato di veglia
prodotte dalla dopamina [27]. Nei topi knockout carenti del peptide orexina,
33
l’attivazione del recettore farmacologico D1 fa diminuire gli attacchi di sonno
rispetto agli animali wild-type. Viceversa, l'ipersonnolenza di questi animali è
aggravata dall’antagonismo del D1, mentre il modulatore del recettore D2 ha un
effetto scarso o quasi nullo sull’eccitazione[64]. Attacchi di cataplessia, tuttavia,
sono interessati dall’attività del recettore D2; l’attivazione e l’inibizione
farmacologica del D2 sono associate rispettivamente a sostanziali aumenti e
diminuzioni nell’arresto comportamentale [64]. Questi ulteriori studi illustrano
l'esistenza di percorsi distinti per il controllo dell’eccitazione e la regolazione dello
stato di veglia, nonché del coinvolgimento del sottotipo recettoriale della dopamina.
In conclusione, raccogliendo le varie evidenze sperimentali a riguardo, è stato
possibile definire il ruolo delle orexine nelle vie di segnale del ciclo sonno/veglia
(figura 6).
La validazione genetica del sistema dell’orexina dai topi ai cani agli esseri umani
per il potenziale trattamento dei disturbi del sonno ha attratto rapidamente
l'attenzione dell'industria farmaceutica. Poco dopo le pubblicazioni sulla
narcolessia umana nel 2000, sono uscite le prime pubblicazioni riguardanti: (i) la
frammentazione dei peptidi orexinici [65,66] per l’ottenimento di nuovi agonisti
come potenziale trattamento per la narcolessia; (ii) lo sviluppo delle prime small
molecules antagonisti del recettore per il trattamento dei disturbi del sonno come
l'insonnia.[67,68]
34
Figura 6. Vie di segnale associate all’orexina. NE = noradrenergici; 5-HT =
serotoninergici; Ach = colinergici; DA = dopaminergico; HA = istaminergico; NAc
= nucleo accumbens.
35
ANTAGONISTI DELL’OREXINA
La scoperta, la caratterizzazione, e l'associazione genetica del sistema dell’orexina
con il ciclo sonno/veglia e l’ipotesi per altre potenziali indicazioni ha stimolato
un’intensa attività nel settore industriale tra il 1999 e il 2007, con l'obiettivo di
scoprire nuovi antagonisti di orexina. In questo breve periodo, sono state depositate
più di 50 domande di brevetto da parte di numerose aziende che hanno cercato di
identificare piccole molecole antagoniste, da impiegare come strumenti per studiare
la farmacologia del recettore. [69] Da notare che i ricercatori della SmithKline
Beecham (ora GlaxoSmithKline, GSK) erano coautori nelle prime comunicazioni
della scoperta del sistema dell’orexina nel 1998.
Nei primi anni del 2000, sono sorte alcune questioni sull’argomento durante la
progettazione di nuovi farmaci. In primo luogo, anche se i GPCR sono
generalmente ritenuti altamente interessanti quali target farmacologici, potrebbero
essere studiati al fine di identificare nuovi leads antagonisti dell’orexina?
In secondo luogo, quale tipo di antagonista dell’orexina sarebbe il più efficace per
il trattamento dell'insonnia: OX1R selettivo (l-SORA), OX2R selettivo (2-SORA),
o antagonisti duali dei recettori dell’orexina (DORA)? Infine, le piccole molecole
antagoniste potrebbero essere utilizzate per un efficace trattamento dell'insonnia?
Questa tesi cercherà di fornire delle prospettive in merito e possibili risposte a
queste domande.
Nella figura 7 sono riportate alcune piccole molecole, antagoniste dell’orexina con
diversi profili di selettività, scoperte prima del 2007.
36
Figura 7. Esempi di ligandi 1-SORA, 2-SORA, e DORA.
Come indicato in precedenza, la GSK ha mostrato un notevole interesse per
l’orexina come target per la scoperta di farmaci. Infatti, il team della GSK ha
pubblicato per primo un documento sugli antagonisti dell’orexina, nel quale si
descrive la scoperta di una serie di uree 1,3-biariliche come molecole lead l-
SORA.[70,71] Questi risultati sono stati ottenuti utilizzando vari tipi di saggi:
(HTS), (FLIPR), su cellule CHO che esprimono OX1R e OX2R e misurando
l'inibizione del rilascio di calcio intracellulare indotto da orexina. Questo saggio
(potenze espresse in valori di IC50 o pKB), insieme a saggi di binding con
radioligando (potenze espresse in valori Ki), sono i saggi principali utilizzati nello
studio di modulatori del sistema dell’orexina.
Da notare che gli antagonisti selettivi dei recettori dell’orexina sono definiti quei
composti che mostrano una selettività maggiore di 20 per OX1R o OX2R, misurata
attraverso FLIPR o mediante saggi di binding, mentre si definiscono antagonisti
duali molecole che mostrano una selettività minore di 20 verso i due sottotipi
recettoriali [72]. L’ottimizzazione dell’hit iniziale ha portato alla scoperta di l-
SORA 1 (SB-334867), una piccola molecola potente, selettiva, e che è in grado di
superare la barriera ematoencefalica. Nonostante il composto 1 non mostrasse
37
biodisponibilità orale, ha dimostrato, attraverso la somministrazione periferica, una
notevole inversione del comportamento indotto da orexina-A senza indurre
notevole sedazione nei ratti.[73]
Questi strumenti hanno gettato le basi per ulteriori scoperte da parte di altri gruppi
di ricerca.
I ligandi 2-SORA sono stati scoperti poco dopo 1-SORA da scienziati della Johnson
& Johnson (J&J), Merck e Actelion. 2-SORA 4 (JNJ-1037049) assomiglia a 1-
SORA 1 e 2 in quanto presenta anch’esso un gruppo centrale ureidico.[74] Questo
studio rappresenta un esempio di switching farmacologico nel campo dell’orexina,
da 1-SORA a 2-SORA, pur mantenendo il nucleo centrale comune. Il termine
switching farmacologico nel campo dell’orexina è definito in un recente lavoro [75]
come un passaggio da un profilo di selettività ad un altro (DORA, 1-SORA, 2-
SORA), ottenuto mediante piccole modifiche su uno stesso scaffold centrale.
Il composto 4 è risultato molto potente su OX2R, con una pKB di 8.3, una selettività
600 volte maggiore rispetto a OX1R, e alti livelli di selettività rispetto ad altri target.
Dopo diversi anni, è stato riportato che questo ligando 2-SORA è efficace nel
modulare il sonno nel ratto, come evidenziato da misurazioni
elettroencefalografiche (EEG), dopo somministrazione periferica (IP,
intraperitoneale). [76] Questo è il primo esempio di efficacia in vivo di un ligando
2-SORA.
Gruppi di ricercatori della Merck e Actelion hanno identificato altre serie di ligandi
2-SORA, tra cui la tetraidroisochinolina 5 e il derivato sulfonamidico della glicina
6 (EMPA), dimostrando notevole diversità strutturale nell’ambito degli antagonisti
dell’orexina.[77,78]. I gruppi di ricerca della Merck e Actelion hanno descritto
anche diverse serie interessanti di DORA come il chinazolinone triciclico 7, [79] la
bis-ammide della prolina 8, [80] e la sulfonammide della glicina 9.[81] Da notare
che DORA 8 e 9 possono essere considerati eccellenti esempi di switching
farmacologico a partire rispettivamente da 1-SORA 3 e 2-SORA 6. DORA 8 ha
dimostrato un'efficacia dose-dipendente nel saggio di iperlocomozione orexina-A
indotta, dopo somministrazione periferica. Sia DORA 8 che 9 hanno dimostrato
efficacia nella modulazione del sonno nei ratti dopo somministrazione orale, anche
se ad alte dosi, rispettivamente di 100mg/kg e 300mg/kg. Questi composti sono stati
38
in grado di ridurre il risveglio attivo e di aumentare il sonno REM (movimento
rapido degli occhi) e NREM (movimento degli occhi non rapido) durante la fase
attiva dei ratti, con efficacia comparabile a quella riscontrata con 2-SORA 4. In
sostanza, la scoperta di molti differenti chemiotipi con vari profili di selettività
suggerisce che il sistema dell’orexina è altamente druggable. Anche se non ottimale,
l'efficacia in vivo dimostrata da 2-SORA e DORA, e la mancanza di efficacia per
1-SORA, suggerisce che le prime due classi di antagonisti dell’orexina hanno un
potenziale quali nuovi agenti terapeutici per il trattamento dell'insonnia.
CANDIDATI CLINICI DORA DELLA ACTELION
Actelion Pharmaceuticals, Ltd. è stata una delle prime aziende a mostrare notevole
interesse nel campo dell’orexina, in virtù della scoperta degli antagonisti, come 2-
SORA 6 e DORA 7 e 9 (figura 7). Mediante studi HTS si è inoltre identificata una
serie di antagonisti a struttura tetraidroisochinolina (THIQ), strutturalmente simili
a 2-SORA 5 (figura 7), che la Merck ha scoperto nello stesso periodo. Diversamente
da 2-SORA 5, il composto lead della Actelion 10 ha mostrato un profilo 1-SORA,
con una selettività funzionale di 68-volte (saggio FLIPR) rispetto a OX2R, come
mostrato in figura 4.[82]
39
Figura 8. Strategia per lo sviluppo di DORA 15: il primo DORA a raggiungere
sperimentazione clinica per il trattamento dell'insonnia.
Sulla base della struttura del composto lead 10, sforzi chimici paralleli sono stati
condotti al fine di modificare alcuni gruppi funzionali per sviluppare nuovi derivati.
Modifiche della porzione ammidica hanno permesso un notevole aumento della
potenza su entrambi i recettori, come per l’ammide del metossindano 11. Piccole
modifiche della struttura della dimetossi-THIQ, hanno permesso un significativo
aumento di potenza e selettività nei confronti di OX1R, come per 12.
Complessivamente, è evidente che piccole modifiche strutturali potevano portare
ad ampie oscillazioni nel profilo di selettività. Ulteriori studi SAR (relazioni
struttura-attività) sui DORA hanno condotto alla modifica dell’anello aromatico
della catena laterale legata alla scaffold THQ, come la sostituzione della funzione
3,4-dimetossifenil con il sistema 3,4-diclorofenilico, che ha fornito il composto 13,
40
con un profilo DORA. Il team di Actelion ha poi ampliato queste SAR iniziali con
varie tornate di sintesi parallele, ottenendo, in ultima analisi, attraverso la
trasposizione della funzione benzilammidica aromatica, la THIQ fenilglicina 14,
che è risultata ben tollerata e ha mantenuto un profilo eccellente di tipo DORA. In
seguito, alcuni lead come DORA 14, sono stati ulteriormente modificati al fine di
ottimizzare la potenza, le proprietà fisico-chimiche, la farmacocinetica e l'efficacia
in vivo in modelli preclinici di sonno. Questi sforzi hanno portato all’ottenimento
del composto 15, un DORA molto potente con proprietà appropriate per una
ulteriore caratterizzazione.
Il team di Actelion ha pubblicato un articolo nel 2007 sulla rivista Nature Medicine
dove descrive la caratterizzazione clinica e preclinica di DORA 15 (ACT-078573;
almorexant) in modelli di sonno di roditori e cani e in soggetti umani in buona
salute.[83] Questo antagonista dell’orexina è uno dei composti più potenti riportati
al momento, con un IC50 su OX1R di 13 nM e su OX2R di 8 nM e un profilo di
selettività eccellente nei confronti di un vasto pannello di GPCR, canali ionici, ed
enzimi (Figura 9).
Figura 9. Caratterizzazione preclinica di DORA 15.
41
DORA 15 presenta una elevata percentuale di legame alle proteine nel roditore; la
concentrazione cerebrale di composto libero è proporzionale alla quantità
plasmatica di composto non legato, e questo suggerisce un'adeguata penetrazione
nel cervello. In particolare, DORA 15 era moderatamente biodisponibile nel ratto e
nel cane e ciò ha consentito la valutazione dell’efficacia del sonno. Somministrando
DORA 15 ai ratti, per via orale durante il loro periodo attivo del sonno, si è potuto
osservare la sua efficacia dose-dipendente sul sonno mediante EEG e EMG
(elettromiografia): si evidenzia una diminuita efficienza sul risveglio attivo
(efficienza=normalizzata per un determinato periodo di tempo, in questo caso 12 h)
ed un aumento dell’efficienza REM e NREM (>30 mg/kg) in proporzione al sonno
fisiologico normale.[84] La Tabella 6 mostra i dati che rappresentano il profilo di
efficacia di DORA sul sonno del topo, con significativi incrementi nella durata delle
fasi NREM e REM, come pure riduzioni nel tempo di passaggio da una fase all’altra
del sonno. Questo profilo EEG è stato confrontato con l’effetto di zolpidem nei topi
(100 mg/kg, Ambien) e sono state notate differenze nella proporzione
dell’efficienza REM. Zolpidem riduceva significamente l’efficienza REM, il che
costituiva la prima prova di differenziazione tra antagonismo dell’orexina e la
modulazione del GABAA, per quanto riguarda l’andamento del sonno.
Tabella 6. Caratteristiche del sonno di ratto dopo somministrazione orale di DORA
15 a ratti maschi Wistar.
42
Oltre alle differenze strutturali del sonno, le differenze farmacologiche tra gli
antagonisti dell’orexina ed i modulatori del GABA sono state studiate da altri
gruppi di ricerca, evidenziando margini terapeutici preclinici più ampi per gli
antagonisti dell’orexina sulla cognizione.[85]
In uno studio condotto su cani beagle, la somministrazione di DORA 15 ha
determinato una diminuzione dose-dipendente nel grado di mobilità valutato
attraverso un video per monitorare le posture durante il sonno ed il tempo trascorso
in stato di veglia tranquilla. Questi effetti risultano statisticamente significativi alla
dose di 100 mg/kg, ed è stato osservato che l'ingresso di una persona familiare
durante il corso dell'esperimento non provoca una cataplessia stimolo-indotta, cosa
che si osserva spesso nei cani narcolettici. Questa è stata la prima indicazione che
l'antagonismo farmacologico del sistema dell’orexina con piccole molecole poteva
ridurre la veglia nei non roditori. Nei soggetti maschi sani, la somministrazione
orale di DORA 15 ha portato ad una minore vigilanza come registrato dalla scala
analogica visiva (VAS) Bond-Ladder, a dosi superiori o uguali a 400 mg. Le
registrazioni EEG di questi pazienti hanno anche indicato l'insorgenza del sonno in
fase 2 (NREM) a dosi di 200 mg di DORA 15. Questi studi sono stati i primi a
dimostrare l'efficacia preclinica sul sonno in soggetti umani; un risultato
fondamentale in questo campo. Sulla base di questi dati, DORA 15 è stato
sottoposto agli studi clinici più avanzati per il trattamento dell'insonnia.
Una recente pubblicazione del team Actelion descrive il metabolismo, la
distribuzione, e l'escrezione di una forma radiomarcata di DORA 15.[86,87] Dopo
somministrazione orale di 200 mg a sei volontari sani di sesso maschile, DORA 15
viene ampiamente metabolizzato, generando 47 metaboliti in vivo (21 nel plasma),
di cui quattro sono i composti principali, come illustrato nella figura 10. Dei quattro
principali metaboliti, l’isochinolinio 16 potrebbe essere considerato direttamente
elettrofilo ed i metaboliti fenolici 18 e 19 potrebbero generare intermedi elettrofili
sottoforma di orto-chinoni o para-chinoni metilati attraverso un’ulteriore
ossidazione. La concentrazione assoluta di ciascuno di questi metaboliti è risultata
paragonabile al composto di partenza DORA 15, e questo potrebbe rappresentare
un rischio per la tossicità idiosincratica per la cattura di nucleofili biologicamente
rilevanti. Questi risultati clinici sul metabolismo potrebbero aver contribuito alla
43
fine dello sviluppo clinico di DORA 15 a causa di "aumenti transitori frequenti degli
enzimi epatici", come recentemente riportato.[88]
Figura 10. I principali metaboliti identificati dopo la somministrazione di una dose
di 200 mg di DORA 15 a volontari umani.
Inoltre è stato valutato che la biodisponibilità orale di DORA 15 nei soggetti umani
è circa l’11%, probabilmente a causa dell’elevato metabolismo di primo passaggio.
Nel loro insieme, il profilo metabolico e la biodisponibilità orale di DORA 15 ha
fornito ulteriori opportunità per l'ottimizzazione del composto. Tuttavia, la scoperta,
e la caratterizzazione preclinica e clinica di DORA 15 hanno rappresentato un
importante passo avanti nel campo dell’orexina.
Dopo la scoperta di DORA 15, i ricercatori di Actelion hanno studiato ulteriori serie
di antagonisti dell’orexina, da ottimizzare per l’ottenimento di candidati clinici.
Una recente pubblicazione ha descritto l'identificazione e lo sviluppo di una serie
strutturalmente distinta di composti DORA, sviluppata sulla base del lead
solfonammidico della prolina 20 (Figura 11).[89]
44
Figura 11. Strategia per lo sviluppo di DORA 22: un derivato DORA
strutturalmente originale candidato allo sviluppo clinico per il trattamento
dell’insonnia.
Questa struttura lead, relativamente compatta, ha dimostrato un'eccellente potenza
funzionale su entrambi i recettori dell’orexina, paragonabile a DORA 15,
un'adeguata penetrazione cerebrale, ma una elevata clearance microsomiale sia nel
ratto che nell’uomo. La presenza di un gruppo tiofenico alogenato e di un’anilide
ariltiometilica non sono risultate ottimali rispetto al potenziale di bioattivazione e
al metabolismo, quindi i ricercatori di Actelion hanno utilizzato un approccio SAR
per ottimizzare DORA 20, procedendo alla sostituzione di tali gruppi. L’inserimento
di un sostituente 4-metossifenilico in DORA 21 come isostero del gruppo
bromotiofenico, ha mostrato lo svantaggio di produrre una moderata attività
45
inibitoria del CYP3A4 (IC50=8 M). Modificando variamente la porzione anilidica
si è arrivati alla sottostruttura 3,5-dimetilfenilica in DORA 22, che mantiene la
potenza dell’orexina e presenta una minore attività inibitoria del CYP3A4(IC50=15
M). Sono stati eseguiti ampi studi SAR per ottimizzare ulteriormente le proprietà
di DORA 22, ma non è stato possibile trovare nessuna modifica che offrisse un
ulteriore miglioramento del profilo di inibizione di CYP3A4. Quindi, questa
molecola è stata avanzata per ulteriori studi in vivo. DORA 22 ha mostrato
un’eccellente specificità per l’attività su orexina, risultando inattiva, a dosi inferiori
a 10 M, su un ampio panel di 124 target (Figura 12).
Figura 12. Caratterizzazione preclinica di DORA 22. (a) mL/min/kg.
DORA 22 si lega in alta percentuale alle proteine plasmatiche e mantriene la
permeazione nel sistema nervoso centrale del composto lead iniziale.
L'eliminazione del bromotiofene nella molecola lead DORA 20 ha determinato un
miglioramento dei parametri farmacocinetici in vitro (clearance microsomiale) e in
vivo, anche se si deve notare che i metaboliti dell'anilina possono rappresentare un
rischio di bioattivazione nello sviluppo clinico.[90] DORA 22 ha mostrato moderata
clearance e biodisponibilità orale nel ratto e nel cane, nonchè un'emivita accettabile
per un agente per il trattamento dell'insonnia (circa 2 h). Questo DORA ottimizzato
46
è stato caratterizzato in esperimenti EEG orali e ha determinato riduzioni
significative nella veglia attiva e aumenti della fase NREM e REM del sonno, a dosi
di 100 mg/kg e 100 mg/die (circa 10 mg/kg per un cane di 10 kg) rispettivamente
nel ratto e nel cane. Sulla base di questa caratterizzazione, DORA 22 (ACT-462206)
è in fase avanzata di sperimentazione clinica.
ANTAGONISTI DELL’OREXINA E UN CANDIDATO CLINICO DORA DELLA
GSK.
La GSK ha svolto un ruolo chiave nella ricerca in questo campo fin dall’inizio.
Mentre la pubblicazione che descrive la scoperta di DORA 28 (SB-649868) è
apparsa nel 2011,[91] nella letteratura brevettuale questa era già stata in parte
descritta qualche anno prima.[92] Come altre società, la GSK ha effettuato uno
screening su una libreria in-house di piccole molecole alla ricerca di interessanti
punti di partenza per la medicinal chemistry. Diversi derivati della piperidina 23
con struttura ammidica hanno mostrato attività antagonista funzionale su entrambi
i recettori dell’orexina (figura 13), ed il composto 24 è un esempio di composto
lead, con una efficacia di antagonista a concentrazioni nell’ordine del nanomolare.
47
Figura 13. Strategia per lo sviluppo di DORA 28: un candidato clinico DORA
altamente potente e biodisponibile per os.
Visto che la piperidina è una struttura privilegiata in medicinal chemistry,[93]
questo lead ha rappresentato un ottimo punto di partenza dal punto di vista chimico.
Uno screening iniziale di ammidi variamente sostituite ha rivelato che il gruppo
orto-biarilico, come in 25, fornisce un significativo aumento della potenza sia verso
OX1R che OX2R, producendo antagonisti funzionali con efficacia a concentrazioni
nanomolari. È interessante notare che questo gruppo orto-biaril/bieterociclo
scoperto nei primi anni del 2000 è poi diventato un elemento chiave per le SAR per
molti studi successivi sull’orexina. Sebbene molto potente, DORA 25 ha mostrato
una clearance elevata in incubazioni microsomiali. Il gruppo della GSK ha
attribuito questo alla natura altamente lipofila del composto lead e/o alla labilità del
48
gruppo etereo. Nel tentativo di sostituire la funzione etereo, sono stati studiati
linkers di tipo carbonilico, ureidico, e ammidico, identificando la bis-ammide S-26
come antagonista di entrambi i recettori dell’orexina a concentrazioni nell’ordine
del sub-nanomolare, con una migliore stabilità microsomiale. Dal composto lead
DORA 26, sono stati intrapresi due studi paralleli al fine di ridurre la lipofilia data
dal biarile della piperidina e per sostituire l’anello aromatico di destra (struttura
generale 27). Un ampio studio ha portato ad identificare il gruppo 2-aril-5-
metiltiazolico come il sostituente isostero capace di conferire il miglior equilibrio
di potenza, selettività, e migliorate proprietà fisico-chimiche. Un secondo studio
dell’eterociclico ha portato alla sostituzione dell'anello fluorofenilico in 26 con un
benzofurano; si è ottenuto il composto 28, un DORA molto potente a bassa
clearance microsomiale nel ratto e nel cane. DORA 28 ha dimostrato una potenza
nell’ordine del subnanomolare nei confronti di entrambi i recettori dell’orexina,
eccellenti livelli di selettività rispetto ad altri target, binding elevato per le proteine
nel ratto, e moderata permeazione nel cervello (figura 14).
Figura 14. Caratterizzazione preclinica di DORA 28. TST=tempo totale del sonno.
49
Sebbene il rapporto di distribuzione del composto nel cervello rispetto al sangue sia
basso in questo caso, i livelli nel sangue (5.3%) rispetto a quelli nel plasma (l.4%)
indicano un'adeguata permeazione cerebrale. Questo composto ha dimostrato una
moderata clearance nel plasma, breve emivita, ed eccellente biodisponibilità nel
ratto, il che supporta la risultante efficacia. Somministrato per via orale, DORA 28
è stato in grado di invertire il comportamento usuale indotto dall’orexina-A nel ratto
(un saggio simile a quello di locomozione indotta dall’orexina-A effettuato per
DORA 8, figura 7) alla dose di 3 mg/kg. A dosi orali leggermente superiori di 10
mg/kg, DORA 28 è stato in grado di aumentare in modo significativo le fasi REM
e NREM e il tempo totale del sonno (TST) in ratti telemetrizzati e liberi di muoversi
durante la fase attiva. Questi risultati danno le stesse indicazioni, ma sono più
significativi rispetto a quelli ottenuti per DORA 15 e 22, probabilmente a causa di
una maggiore potenza di questo antagonista dell’orexina. Quindi, DORA 28 è stato
scelto per un’ulteriore caratterizzazione verso gli studi clinici.
La presenza di un benzofurano 2,3-non sostituito in DORA 28 ha fatto discutere
sulla possibilità di una bioattivazione analoga a quella di DORA 15 (figura 14),
sebbene con un diverso decorso meccanicistico. La GSK ha pubblicato uno studio
sul metabolismo del farmaco in soggetti umani sani nello stesso anno in cui ha
pubblicato lo sviluppo di DORA 28, facendo chiarezza su questo aspetto.[94] In
questo studio si è monitorato il metabolismo di una dose orale di 30 mg di DORA
28 radiomarcato in otto soggetti. Sorprendentemente, l'emivita apparente di
radioattività (39 h) ha superato significativamente l'emivita della molecola
originaria (5 h), suggerendo la formazione di metaboliti di lunga emivita (figura 15).
Gli Autori riportano che DORA 28 viene ampiamente metabolizzato in vivo
fornendo due principali metaboliti identificati negli estratti di plasma, e cioè 31 e
32, rispettivamente alla concentrazione presenti di 11% e 2% rispetto alla dose
radioattiva. La presenza di questi metaboliti suggerisce che l'ossidazione del nucleo
benzofuranico rappresenta la via metabolica principale per DORA 28, e il
meccanismo di formazione di 31 e 32 può essere razionalizzato attraverso
l’epossido 29 e l’aldeide 30. La presenza dell’epossido 29 è stata confermata tramite
esperimenti di trapping con glutatione (GSH), dimostrando così che nucleofili
biologicamente importanti potrebbero essere efficacemente intrappolati da questi
50
intermedi. Secondo la letteratura intermedi come 29 e 30 potrebbero aumentare il
potenziale di tossicità idiosincrasica; tuttavia, la bassa dose terapeutica di DORA
28 prevista (~20 mg) potrebbe ridurre questo inconveniente.[86] L'efficacia sul
sonno dei derivati DORA è impressionante, anche se il rischio di bioattivazione
preclinica per DORA 15 e 28 ha offerto ulteriori opportunità di ottimizzazione di
questa classe.[95]
Figura 15. Principali metaboliti identificati dopo la somministrazione di DORA 28
(30 mg) a volontari umani. Le strutture in parentesi rappresentano ipotetici
intermedi metabolici.
CANDIDATI CLINICI DORA DELLA MERCK
Un gruppo della Merck ha intrapreso la progettazione di composti DORA all'inizio
del 2005 passando in rassegna tutta la letteratura relativa all’orexina ed effettuando
un HTS mediante saggi funzionali FLIPR sia su OX1R che OX2R. Questo ha
portato all’identificazione della piperidina 33 che ha mostrato potenza significativa
51
nei confronti di entrambi i recettori, ma inappropriate proprietà fisico-chimiche.
Modifiche del nucleo della benzammide, della piperidina, e di una parte del sistema
eterociclico hanno permesso di ottenere composti come la diamina lineare 34 che
ha mostrato potenza eccellente, buona permeazione nel cervello, ed efficacia in vivo
in studi sul sonno di ratto dopo somministrazione periferica (figura 16).[96]
Purtroppo, le proprietà farmacocinetiche di queste diammine lineari non potevano
essere ottimizzate per soddisfare i criteri di sviluppo, a causa di un intenso
metabolismo ossidativo, soprattutto sui sostituenti N-alchilici. Parte della strategia
volta a limitare i problemi di metabolismo ad opera di CYP, si è focalizzata sulla
reintroduzione di nuovi cicli condensati rispetto alla struttura della diammina
lineare, per proteggere queste posizioni dal metabolismo con l'ulteriore vantaggio
di ridurre la libera rotazione dei legami.[94] Sono stati studiati più di due dozzine
di diversi composti ciclici condensati, ma il sistema di maggior successo è risultato
l'anello diazepanico a sette termini, presente nel composto 35.
52
Figura 16. Strategia per lo sviluppo di DORA 39: un candidato clinico DORA
potente e biodisponibile per os.
La struttura di 35 ha permesso di indagare le SAR a livello sia dell’eterociclo che
dell’ammide mediante un approccio di sintesi parallela, e la struttura diazepanica
36 ha mostrato di possedere una eccellente combinazione di potenza funzionale e
proprietà fisico-chimiche su entrambi i recettori. (cLogP=3.1 per 36, 4.5 per 35).[97]
In seguito a ulteriori studi, la Merck ha scoperto che 36 possedeva una permeazione
53
nel cervello accettabile, senza usufruire del meccanismo di trasporto mediato della
glicoproteina-P (Pgp), una eccellente permeabilità cellulare, una alta selettività per
i recettori dell’orexina (attraverso lo screening Panlabs), e una frazione libera
misurabile che ha portato a livelli significativi di esposizione del composto nel CSF.
Dopo somministrazione orale alla dose di 100 mg/kg, 36 ha diminuito il periodo in
cui i ratti rimanevano in uno stato di veglia attiva, e ha incrementato la durata del
sonno NREM e REM. Quindi, il composto 36 è stato indicato come un candidato
promettente per lo sviluppo; comunque, la sua farmacocinetica sfavorevole ed il
suo potenziale di bioattivazione, hanno ostacolato l’ulteriore avanzamento del
composto come tale nello sviluppo clinico, e hanno spinto la Merck a perfezionare
questi aspetti.
Nel tentativo di comprendere meglio il destino metabolico di 36, sono stati effettuati
una serie di studi tra cui gli studi di farmacocinetica endovenosa e orale (ratto e
cane), l’incubazione microsomiale con l’identificazione del metabolita (ratto, cane
e umano con e senza semicarbazide), uno studio nel coledoco cannulato con
infusione nella vena portale/cefalica (cane), e studi di binding covalente (ratti e
umani). La Merck ha ottenuto molti risultati importanti da questi studi che hanno
influito sulla strategia di ottimizzazione del lead: (l) il cane era una delle specie più
adatte all'ottimizzazione della farmacocinetica rispetto al ratto, vista la somiglianza
con il metabolismo umano; (2) nonostante la bassa clearance plasmatica nel cane,
il composto 36 subiva un ulteriore significativo metabolismo di primo passaggio
che limitava la biodisponibilità; (3) sorprendentemente sono stati rivelati elevati
livelli di binding covalente, indicando che si verifica un metabolismo ossidativo di
36 a dare un metabolita reattivo; (4) in realtà si verificavano livelli significativi di
metabolismo ossidativo attraverso tutta la molecola compresa, l’ossidazione del
gruppo metilico del tolile, sul nucleo diazepanico e sulla chinazolina; (5)
incubazioni microsomiali contenenti semicarbazide hanno intrappolato degli
intermedi suggerendo che, probabilmente, una via metabolica era l'ossidazione di
uno dei gruppi metilenici adiacenti ad un atomo di azoto. In sintesi, è stato
ipotizzato che l’eliminazione del gruppo tolilico, il blocco delle posizioni del nucleo
adiacenti agli atomi di azoto, e modifiche sull’eterociclo potessero migliorare la
farmacocinetica e ridurre la bioattivazione di 36.
54
Durante lo studio sintetico iniziale del derivato diazepanico, le analisi degli spettri
NMR hanno indicato che questi composti non solo esistevano in molteplici
conformazioni a bassa energia in soluzione, ma che alcune di queste conformazioni
davano significativi shift di risonanza protonica a campi più alti, probabilmente a
causa di una schermatura isotropica intramolecolare. Una analisi dettagliata di 36 e
di un suo analogo strettamente correlato con varie tecniche NMR ha rivelato che
l'energia più bassa era relativa alla conformazione in cui le due funzioni aromatiche
esistevano in una disposizione -stacking, il che comportato complessivamente una
conformazione a ferro di cavallo o a U, che quindi rappresenta la conformazione
più popolata, Figura 16. Studi computazionali condotti su 36 hanno supportato
questa ipotesi e l'analisi ai raggi X sul cristallo ha rivelato che la conformazione a
bassa energia di 36 allo stato solido è proprio quella a U. Queste osservazioni hanno
portato la Merck ad ipotizzare che un motivo per cui i diazepani mostravano una
potenza rilevante poteva risiedere nel fatto che questa conformazione a bassa
energia sia simile alla conformazione di binding con il recettore, di modo che i
diazepani non subiscono alcuna diminuzione di entropia nell’assumere la
conformazione bioattiva. Per provare questo, sono stati sintetizzati e saggiati per
valutare la loro capacità di legare OX1R e OX2R, l’analogo macrociclico 41, ed il
suo precursore non ciclico 40.[98] Come illustrato nella figura 17, i derivati ciclico
e non ciclico hanno mostrato potenza molto simile nel legare i recettori,
supportando l'ipotesi che la conformazione ad U rappresenta la conformazione
bioattiva.
Figura 17. Struttura e potenza di legame dell’analogo macrociclico di 36 (41) e del
suo precursore non ciclico (40).
55
Attenendosi all'ipotesi della conformazione bioattiva a forma di U, il gruppo di
ricerca ha iniziato a progettare nuovi composti con scaffold diazepanico
caratterizzati da un anello centrale opportunamente modificato in modo tale da
favorire la conformazione a U. Questa strategia avrebbe potuto non solo condurre
a composti più potenti e biodisponibili a causa di una flessibilità molecolare ridotta,
ma potrebbe anche bloccare o ridurre l'accesso a siti di metabolismo e la potenziale
bioattivazione osservata per il composto 36.
Analoghi “a ponte” come il 37 (figura 16) esistono in una conformazione a U a
bassa energia e mostrano una modesta potenza funzionale per l’orexina; tuttavia,
l’aumento di lipofilia (LogP>3.4) dovuto all'aggiunta di un ponte a due carboni
influenza negativamente le proprietà fisicochimiche, e questo ha determinato a una
ridotta efficacia negli esperimenti sul sonno dei ratti.[99] Al contrario, l'analogo
metildiazepanico 38 possiede lipofilia simile (LogP=3.0) a 36 e mantiene
un’eccellente efficacia sul sonno del ratto. Il composto 38, contenente la
fluorochinazolina e la demetil triazolofenil ammide, risulta dagli sforzi di
ottimizzare la farmacocinetica nel cane dei composti della serie metildiazepanica.
Esso ha mostrato adeguate clearance e biodisponibilità nel cane (Cl=5.2 mL/min/kg;
F=37%) e un profilo complessivo eccellente, che include un’efficacia negli
esperimenti sul sonno del ratto ad una dose orale 10 volte inferiore rispetto a quella
del composto 36 (10 mg/Kg). Questo gruppo di ricerca ha anche sviluppato e
utilizzato un saggio per valutare il potenziale di bioattivazione, incubando i
composti nei microsomi epatici del ratto e umani in presenza di glutatione e
valutando la formazione di addotti rispetto ad uno standard interno. Purtroppo, la
capacità di bioattivazione di 36 non è stata attenuata dalle modifiche strutturali che
hanno portato al composto 38, come si può riscontrare dal rapporto tra l'area sotto i
picchi di tutti gli addotti GSH rispetto allo standard interno (rapporto GSH/IS=3.3
per 38). Un'attenta analisi dei dati HRMS di 38 ha rivelato che il maggiore addotto
GSH non presentava più l'atomo di fluoro, e aveva guadagnato un atomo di
ossigeno, suggerendo che non era il nucleo centrale, ma piuttosto l’eterociclo
pendente il sito più probabile di attivazione elettrofila. La figura 18 illustra il
possibile meccanismo (attraverso l’epossido 43) ed il maggiore addotto formatosi
(44) durante l'incubazione di 38 (sottostruttura della chinazolina 42) nei microsomi
56
sia di ratto che umani in presenza di GSH.
Figura 18. Probabile struttura e meccanismo di formazione dell’addotto covalente
relativo all’incubazione di 38 in presenza di glutatione (GSH).
Sulla base di questi studi relativi al meccanismo di bioattivazione, il gruppo di
ricerca ha rivolto l'attenzione verso nuove funzioni eterocicliche al fine di limitare
l’attivazione metabolica. Sono stati così studiati nuovi eterocicli, e si è scoperto che
analoghi diazepanici che incorporavano la funzione benzossazolica possedevano
eccellente farmacocinetica nel cane, ma non mostravano la potenza degli eterocicli
6,6-fusi, come le chinazoline. La combinazione dell’aggiunta di un atomo di cloro
in posizione 5 del benzossazolo e l’inserimento del gruppo metilico del tolile
sull’ammide triazolofenilica, ha portato all’ottenimento di 39, un composto potente,
con farmacocinetica favorevole in ratti e cani e, sorprendentemente, con una
minima formazione di addotti GSH (rapporto GSH/IS=0.1; riduzione del 97% in
38), il che indicava la minimizzazione del percorso di bioattivazione per 38 (figura
19).
57
Figura 19. Caratterizzazione preclinica di DORA 39. (a) mL/min/kg; (b) Saggio di
occupazione di OX2R.
L’ulteriore caratterizzazione di 39 ha indicato un chiaro profilo off-target, una
elevata capacità di penetrazione nel cervello, una alta occupazione di OX2R in un
modello umanizzato di topo, ed una eccellente efficacia in esperimenti effettuati sul
sonno di ratto e di cane, rispetto ai precedenti analoghi nelle serie precednti,[100]
così come proprietà farmaceutiche e un profilo di sicurezza favorevole allo sviluppo
clinico. Il composto 39 è entrato in fase di sviluppo clinico come MK-4305,[101]
in seguito chiamato suvorexant.
Dopo molti tentativi falliti, alla fine è stata ottenuta la struttura a raggi X di una
singola molecola del composto 39 ed ha mostrato che la conformazione nello stato
solido era in realtà una forma estesa.[102] Questo era in contrasto con la
conformazione ad U che guidava gli sforzi di ottimizzazione; inoltre, anche l’analisi
NMR del composto 39 ha suggerito che le conformazioni predominanti in soluzione
erano estese. Un’ampia analisi computazionale dei derivati diazepanici inclusi il 38
e il 39 ha dimostrato che, nonostante la bassa energia, la conformazione potrebbe
variare da U ad estesa in base ai sostituenti nonché ai metodi di calcolo utilizzati;
58
in ogni caso, una conformazione a U è subito disponibile con energia minima di
circa 1-2 kcal/mol. Il gruppo di ricerca ha quindi ipotizzato che un lieve
cambiamento nella struttura a partire dall’eterociclo chinazolinico 6,6-fuso (ad
esempio, 36 e 38) per ottenere quello ossazolico 5,6-fuso in 39, ha leggermente
alterato il profilo energetico in modo che la conformazione estesa è risultata la
conformazione ad energia più bassa. Tuttavia, la potenza di 39 indica che, in seguito
al legame con i recettori dell’orexina, l'aumento dell’entalpia di legame colma
qualsiasi piccola diminuzione di entropia dovuta ad un cambiamento nella
conformazione a bassa energia.
È stata recentemente identificata una struttura a raggi X di DORA 39 in una forma
stabilizzata di OX2R e dimostra che la forma legata è effettivamente una
conformazione a U, come era stato correttamente previsto.[103] La figura 20 mostra
l'ottimale sovrapposizione della conformazione legata del composto 39 e la forma
a U a bassa energia come calcolato dall’analisi originale. Come è evidente, le
conformazioni prevista e osservata sono quasi identiche, validando così l'ipotesi che
il team ha seguito nel progettare il composto 39. Nella figura 21 possiamo vedere
DORA 39 legato nella struttura cristallina recentemente riportata.
Figura 20. Sovrapposizione delle due strutture (a più bassa energia e ligando-legata)
ai raggi X di DORA 39.
59
Figura 21. Struttura ai raggi X di 39 legato a OX2R.[103]
Nel 2011 è stata descritta una seconda classe di potenti molecole DORA da parte
dei ricercatori della Merck. Queste molecole possiedono un nucleo
carbossammidico piperidinico 2,5-trans-disostituito stereochimicamente definito,
che conferisce un’eccellente affinità per OX1R e OX2R. Gli studi preliminari sono
iniziati con il composto noto 33 che mostrava una buona potenza ma inappropriata
farmacocinetica preclinica e proprietà fisico-chimiche (vedi anche figura 16). Lo
spostamento del sostituente etossifenilico dalla posizione 2 alla posizione 3
dell'anello della piperidina (da 33 a 45), comporta una perdita di potenza di più di
40 volte per entrambi i sottotipi di recettori (figura 22). Questa perdita di potenza è
avvenuta nonostante il fatto che il composto 45 mantenesse la stessa distanza
atomica tra l’azoto della piperidina e l’ossigeno dell'etere arilico. In effetti, studi
precedenti avevano indicato che la piperidina ciclica non era essenziale per la
potenza, e che composti lineari come il 46 avevano una significativa affinità
recettoriale. Composti lineari come il 46 soffrivano di elevata clearance intrinseca
e proprietà fisico-chimiche non appropriate.
Sono state effettuate analisi conformazionali più dettagliate per razionalizzare la
potenza dei composti 33, 45 e 46. Lo stato fondamentale a più bassa energia previsto
per il composto 33 ha il sostituente in posizione 2 orientato assialmente rispetto
60
all’anello per evitare la sfavorevole tensione 1,3-allilica tra questo sostituente e
l’atomo di azoto ibridizzato sp2 della piperidina (figura 22). Studi computazionali
condotti su 33 hanno indicato una preferenza stereoelettronica per il sostituente in
2 nell’adottare un orientamento assiale che permetta ai due anelli arilici di essere
coplanari, mimando la conformazione bioattiva di DORA 39 (figure 20 e 21).
Tuttavia, lo spostamento del sostituente dalla posizione 2 (33) alla posizione 3
dell'anello piperidinico (45) attenua la tensione del sistema 1,3-allilico e permette a
questo sostituente di adottare un orientamento equatoriale più stabile. Quindi, la
conformazione bioattiva ad U era una conformazione ad alta energia, e questo
probabilmente spiega la perdita in potenza di più di 40 volte passando da 33 a 45.
Il gruppo della Merck ha valutato una strategia per indurre un orientamento assiale
del sostituente alchilico in 3 tramite l’inserimento di un metile in entrambe le
posizioni adiacenti all’atomo di azoto ibridizzato sp2 della piperidina. Questo
gruppo metilico potrebbe adottare in modo preferenziale un orientamento assiale e
guidare anche il sostituente in posizione 3 in una disposizione assiale, purché i due
sostituenti siano in trans sull'anello della piperidina. Il composto 47, ulteriormente
modificato a partire da 45 con sostituzioni sulla carbossamide e sull’etere arilico
mirate a migliorare la potenza, è stato selezionato come template per l'inserimento
dei sostituenti metilici sul nucleo. L’inserimento di un gruppo metilico in posizione
2 in 47 ha fornito i diastereoisomeri cis e trans (48 e 49, rispettivamente) che
possono essere ulteriormente caratterizzati rispetto all’affinità di legame e alla
preferenza conformazionale.
61
Figura 22. Strategia per lo sviluppo di DORA 50: un potente candidato clinico
DORA.
62
L'isomero cis (48) ha una potenza due volte inferiore rispetto a quella di 47, e questo
è in accordo con l'ipotesi iniziale. Al contrario, il diastereoisomero trans di DORA
49 è molto più potente, con un guadagno di affinità di binding di 20 e 90 volte,
rispettivamente per OX1R e OX2R. La metilazione in 2 determina un
miglioramento maggiore in potenza rispetto all'alternativa metilazione in 6, per
ulteriori studi di ottimizzazione si sono basati su questo nucleo disostituito della
piperidina.
Altri studi si sono concentrati sulla progettazione di molecole correlate a DORA 49,
ma dotate di migliori proprietà fisico-chimiche, farmacocinetiche più favorevoli, e
promettente attività in vivo. Da questi studi, il gruppo di ricerca ha individuato il
composto 50, un potente DORA con buona solubilità e biodisponibilità sia nei ratti
che nei cani (figura 23).
Figura 23. Caratterizzazione preclinica di DORA 50. (a) mL/min/kg; (b) Saggio di
occupazione di OX2R.
Studi di 1H-NMR a bassa temperatura hanno rivelato che il conformero più
abbondante in soluzione ha l'anello piperidinico in una conformazione a sedia con
la disposizione del sostituente trans-diassiale. Un'unica struttura a raggi X per 50
ha confermato la disposizione trans-diassiale della piperidina 2,5-disostituita e
differisce dalla conformazione in soluzione solo per la rotazione del legame
ammidico. [104]
63
DORA 50 ha mostrato negli studi preclinici una farmacocinetica favorevole,
possiede un chiaro profilo accessorio, una elevata capacità di penetrazione nel
cervello, una eccellente occupazione di OX2R negli esperimenti di topo umanizzato,
e favorisce un sonno dose-dipendente sia nei ratti che nei cani (figura 23).[105]
Inoltre, il composto 50 possiede proprietà farmaceutiche favorevoli e un profilo di
tossicità preclinica a sostegno dello sviluppo clinico. Il composto 50 è entrato nello
sviluppo clinico come MK-6096 e successivamente è stato denominato
filorexant.[104] DORA 50 è risultato più potente di suvorexant negli studi preclinici
di EEG e può raggiungere livelli più elevati di occupazione del recettore OX2R a
concentrazioni plasmatiche inferiori, presumibilmente a causa di concentrazioni
plasmatiche in vivo più elevate.
SWITCHING FARMACOLOGICO DAI DORA AI SORA.
La scoperta di molteplici candidati clinici DORA ha fornito una notevole quantità
di SAR relative alla selettività tra OX1R e OX2R. In alcuni casi, piccoli
cambiamenti nella struttura producono effetti drammatici sulla potenza verso i due
recettori (per esempio composti 10 e 11, figura 8,). Una necessità critica per la
ricerca nel campo dell’orexina è stata l'identificazione di ligandi DORA, 2-SORA,
e 1-SORA di alta qualità, che potessero essere utilizzati per delineare una
farmacologia preclinica e clinica specifica dei recettori. Molte strutture diverse per
ciascuna classe di antagonisti dell’orexina sono state identificate attraverso cicli di
screening, progettazione, ottimizzazione (figura 7), ma solo pochi ligandi SORA
sono stati ben caratterizzati in ambiente clinico e preclinico. L’identificazione di
piccole molecole DORA con profilo preclinico adatto ad una ulteriore valutazione
clinica ha suggerito che una strategia di switching farmacologico da DORA a
SORA, basato sulle SAR, potrebbe risultare utile per sviluppo di molecole di alta
qualità con profilo farmacologico paragonabile a quello dei candidati clinici
esistenti.
La figura 24 illustra molti esempi recenti di studi in cui candidati clinici DORA, o
loro stretti analoghi, sono stati utilizzati come lead per la sviluppo di composti
SORA. Ricercatori della Actelion sono stati in grado di delineare una SAR fine sul
64
candidato clinico DORA 15 che ha consentito di sviluppare dei composti SORA-1
molto potenti (figura 24A). Combinando l’accorciamento del linker feniletilico di
un atomo, con la modifica della sostituzione sull’anello aromatico e la conversione
dell’ammide da metilica ad isopropilica, si è ottenuto 1-SORA 51 (ACT-335827),
che, di fatto, mantiene la potenza per OX1R, ma è 70 volte più selettivo nei
confronti di OX2R.[106] Il composto 51 è risultato capace di penetrante nel cervello,
biodisponibile per via orale, altamente selettivo su un vasto panel di bersagli
molecolari, e provoca un effetto ansiolitico nel ratto dopo somministrazione orale.
È importante sottolineare che gli effetti ansiolitici di 1-SORA 51 non sono
accompagnati da una diminuzione della veglia come ci si aspetterebbe da un DORA;
che questa molecola potrebbe quindi rappresentare uno interessante punto di
partenza per ulteriori studi di farmacologia.
Altri due esempi di switching farmacologico condotti da Merck sono illustrati nella
figura 24B,C. In uno studio, DORA 38 non è stato utilizzato solo come struttura
lead per lo sviluppo del candidato clinico DORA 39, ma anche come utile scaffold
per investigare la selettività. Visto gli alti livelli di bioattivazione osservati
nell’incubazione microsomiale di DORA 38, si è pensato di sostituire la chinazolina
con nuclei isosterici. L’impiego della pirimidina ha fornito il composto 2-SORA 52
che possiede una potenza per OX2R simile a DORA 38, ma ha una selettività 200
volte maggiore verso OX1R.[107] Dopo somministrazione orale, il composto 52
risulta efficace nel sonno dei topi, in modo paragonabile ai DORA della serie
diazepanica. Una strategia simile a quella riportata nella figura 24A ha condotto allo
sviluppo composti SORA a partire dai DORA della serie piperidinica (figura 23),
come mostrato nella figura 24C.[108] La rimozione di un atomo di carbonio dal
linker di DORA 50 e modifiche dell’eterociclo terminale ha portato
all’identificazione di 2-SORA 53, molto potente, biodisponibile per via orale,
efficace nel sonno del ratto.
Sorprendentemente, combinando la modifica del nucleo centrale a
difluoropiperidina e l’inserimento di una chinolina isomera il profilo di selettività
si sposta verso un 1-SORA molto potente 54. Ciò rappresenta un eccellente esempio
di come si riesca ad ottenere composti con diversi profili di selettività a partire da
uno stesso nucleo. Questi esempi sono interessanti dal punto di vista preclinico,
65
anche se l'utilizzo mirato della strategia di shift farmacologico per la progettazione
di candidati clinici nel campo dell’orexina è piuttosto raro.
Nella prossima sezione si descriverà un esempio di shift farmacologico che ha
consentito lo sviluppo di un candidato clinico per il trattamento dell'insonnia.
Figura 24. Esempi di switching farmacologico da DORA a SORA.
66
SWITCHING FARMACOLOGICO: CANDIDATO CLINICO 2-SORA DELLA
MERCK.
La studio della selettività nella serie piperidinica descritto nella figura 20C aveva
anche portato allo sviluppo di due analoghi chinolinici isomeri con un profilo di
selettività notevolmente diverso. I composti 55 e 56 nella figura 25 differiscono
solo per la posizione di un atomo di azoto del sistema eterociclico; tuttavia, i loro
profili di selettività funzionale differiscono di oltre 200 volte.
Figura 25. Strategia per lo sviluppo di 2-SORA 60: un potente candidato clinico 2-
SORA.
Come è illustrato dalla figura 24, le strategie di semplificazione strutturale degli
eterociclici hanno avuto successo nell'identificazione di SORA molto potenti. A tal
fine, il team Merck ha studiato la semplificazione dell’anello chinolinico fuso,
tenendo in considerazione gli aspetti relativi alla bioattivazione derivanti dalle
67
ricerche nella serie diazepanica, sviluppando la metilpiridina 57 che perde 50 volte
in potenza verso OX2R, rispetto al suo analogo chinolinico. Sorprendentemente, un
analogo metilpiridinico di DORA 56 molto simile 58 mantiene l’antagonismo
funzionale per OX2R, epresenta una selettività 49 volte superiore rispetto a OX1R,
mettendo in evidenza una SAR incredibilmente sottile per quel che riguarda la
selettività per i sottotipi recettoriali dell’orexina. Una grande varietà di sostituzioni
sono state esplorate per il gruppo metile, ottenendo la 4-ciano-2-piridina 59, con
una potenza paragonabile per OX2R ed una maggiore selettività funzionale (290
volte) verso OX1R. Oltre alla potenza e selettività, 2-SORA 59 possiede una
moderata lipofilia (log D=3.0), elevata solubilità cinetica (148 mM a pH=7), e bassa
clearance in incubazioni microsomiali umane, indicando buone proprietà
farmaceutiche. Purtroppo, il composto 59 ha mostrato una bassa biodisponibilità
orale nel ratto e nel cane (% F<20), che ha ostacolato il suo ulteriore sviluppo. Una
libreria di ammidi è stata quindi studiata per identificare altri candidati che
presentassero una migliore biodisponibilità orale. L'ammide pirimidin-biarilica 60,
analoga a DORA 50 (figura 23), ha mostrato un eccellente profilo 2-SORA con
proprietà farmaceutiche simili al 2-SORA 59 (logD=2.9, solubilità cinetica=148
mM, clearance microsomiale=17 mL/min/kg), una alta solubilità della base libera
di 0.25 mg/ml, a pH=7.4. Quindi, il 2-SORA 60 è stato scelto per una valutazione
più approfondita.
68
Figura 26. Caratterizzazione preclinica di 2-SORA 60. (a) mL/min/kg.
2-SORA 60 ha mostrato una eccellente selettività verso un’ampia gamma di
bersagli, un’alta permeabilità passiva, e nessuna suscettibilità verso Pgp (figura 26).
Il composto 60 non è né un inibitore né un induttore delle isoforme enzimatiche
CYP, e questo comporta un basso rischio di interazioni cliniche farmacologiche
farmaco-farmaco. Questo composto possiede una clearance moderata, breve
emivita, ed elevata biodisponibilità nel ratto e nel cane. Questo spettro di proprietà
si traduce in una ottima efficacia sul sonno del ratto e del cane. Dopo
somministrazione orale di 1 mg/kg di 2-SORA 60 ai ratti durante la fase attiva, si
sono osservate significative riduzioni nella veglia attiva e un concomitante aumento
del sonno NREM e REM, effetti paragonabili a quelli dei DORA. Effetti analoghi
si sono osservati nel cane dopo somministrazione di dosi di 0.05 mg/kg, anche se
con questo dosaggio il sonno REM è stato meno modificato. Va osservato che dosi
più elevate di 60 nei cani hanno fatto effettivamente aumentare significativamente
il sonno REM. Sulla base di questi dati, 2-SORA 60 è stato selezionato per
un'ulteriore valutazione clinica, indicato con la sigla MK-8133.[109] Per quel che
sappiamo, la scoperta di 2-SORA 60 rappresenta ad oggi il primo tentativo di shift
69
farmacologico che ha consentito di ottenere un antagonista dell’orexina quale
candidato clinico.
CANDIDATI CLINICI 2-SORA DELLA MERCK
I ricercatori della Merck hanno studiato una serie 2-SORA a struttura
triarilammidica, identificata mediante strategia HTS. Il composto 61 ha mostrato
una promettente potenza funzionale per OX2R (53 nM, analoga a quella del
candidato clinico DORA 39, Figura 27) e una moderata selettività verso OX1R.[110]
Figura 27. Strategia per lo sviluppo di 2-SORA 66: il primo 2-SORA a raggiungere
la valutazione clinica per il trattamento dell’insonnia.
70
La struttura modulare del composto lead ha permesso una rapida sintesi di una
libreria di analoghi (anelli A e D) per esplorare le SAR relativamente alla potenza
e alla selettività, culminando nella scoperta del 2-SORA 62. Questo composto è
risultato molto potente per OX2R, biodisponibile per via orale sia nel ratto (%F=55)
che nel cane (%F=37), e selettivo (più di 100 volte) rispetto ad un ampio pannl
target. Queste proprietà hanno spinto ad una valutazione della sua efficacia orale
sulla fase attiva del sonno nei ratti: 62 si è mostrato capace di produrre riduzioni
nella veglia attiva e aumenti di sonno NREM e REM, in modo analogo ai precedenti
2-SORA e DORA. Tuttavia, un aspetto da considerare è il grado di selettività del
lead (26x verso OX1R) che poteva produrre un significativo antagonismo di OX1R
durante l'esperimento in vivo; quindi, il successivo obiettivo di ottimizzazione è
stato quello di migliorare la selettività. Tre ulteriori problemi sono stati evidenziati
per il composto 62: una potente inibizione reversibile del CYP3A4 (IC50=300nM),
la suscettibilità Pgp (nel ratto e nell’uomo), e la possibilità di bioattivazione tramite
la formazione di intermedi del metide dell’orto o del para-chinone derivati
dall’attivazione metabolica della porzione dimetossifenilica.
Sorprendentemente, la presenza dell’anello-C piridinico regioisomero nel
composto 63 ha determinato un aumento notevole dell’inibizione reversibile del
CYP3A4 con un IC50 di 38 µM, mantenendo il profilo di potenza e di moderata
selettività di 62. Nonostante questo miglioramento del profilo, il composto 2-SORA
63 soffriva ancora di una lipofilia relativamente elevata (logD=3.2) e alta
percentuale di legame con le proteine del plasma umano (99.5%). Una valutazione
delle SAR relative all’anello-A ha rivelato che la sostituzione della porzione 3,5-
dimetil fenilica con un sostituente 3-metil-5-piridinico (64) forniva un composto
con simili potenza e selettività, e produceva un notevole miglioramento delle
proprietà fisiche (logD=1.5; legame con le proteine plasmatiche del 62%). Questi
miglioramenti erano in parte compensati da una significativa suscettibilità per la
glicoproteina umana con un rapporto di efflusso di 4 (rapporto substrato≥3), una
caratteristica non proprio ottinale per molecole dirette verso bersagli molecolari del
CNS.[111] La riduzione della basicità dell’anello-A mediante sostituzione del
metile con il cloro ha condotto a 65, un non-substrato Pgp (rapporto umano=1.7),
con una migliore selettività rispetto a OX1R. Purtroppo, nel test microsomiale di
71
bioattivazione (vedi la sezione del DORA 39, figura 18) sono stati osservati
significativi livelli di addotti di GSH per il 2-SORA 65, probabilmente a causa
dell’attivazione metabolica della porzione dimetossifenilica. Per migliorare questo
aspetto, si è condotto un ampio studio relativo alla sostituzione del gruppo
dimetossifenilico con altre porzioni eterocicliche, e l’inserimento di un atomo di
azoto nell’anello-D del 2-SORA 66 è risultato strategico nel ridurre dell'85% la
formazione di addotti di GSH in incubazioni microsomiali umane. Il 2-SORA 66
mantiene la potenza per OX2R, la biodisponibilità orale, produce una limitata
inibizione reversibile del CYP3A4 (IC50=28 µM), mostra eccellenti proprietà
fisiche (logD=1.8), e una migliore selettività verso OX1R (99 volte). Sulla base di
questi dati, il 2-SORA 66 è stato scelto per un’ulteriore caratterizzazione.
Il 2-SORA 66 ha mostrato alta selettività verso un panel dei più comuni target, una
significativa frazione libera nel plasma, moderata clearance e biodisponibilità orale
nelle specie utilizzate per la valutazione in vivo del suo profilo farmacologico 2-
SORA (figura 28).
Figura 28. Caratterizzazione preclinica di 2-SORA 66. (a) mL/min/kg; (b) saggio
di occupazione di OX2R umanizzato.
72
In un esperimento di occupazione di OX2R umanizzato nei ratti, il composto 66 ha
mostrato il 90% di occupazione ad una concentrazione plasmatica di 695 nM e una
concentrazione di CSF di 52 nM. La capacità di legame per OX2R e OX1R e la
potenza funzionale di 2-SORA 66, si sono rivelati consistenti tra topo, ratto, cane,
scimmia, e linee cellulari umane, sostenendo la possibilità di una chiara efficacia di
questo ligando 2-SORA. Dopo somministrazione orale di 66 a topi (100 mg/kg),
ratti (20 mg/kg), cani beagle (l mg/kg), e scimmie rhesus (10 mg/kg), si osservano
riduzioni immediate e significative nella veglia attiva e concomitanti aumenti di
sonno NREM e sonno REM in tutti gli esperimenti. La valutazione della
concentrazione di 66 libero in ogni esperimento ha indicato una occupazione molto
alta di OX2R e un bassissimo antagonismo OX1R. Questi studi rappresentano la
prima valutazione riportata in letteratura relativa all’efficacia trasversale nelle
specie per un 2-SORA. Infine, 2-SORA 66 risulta molto ben tollerato in studi di
sicurezza sul topo e sul cane commisurati. Questa serie di dati ha sostenuto
l'avanzamento di 2-SORA 66 come candidato preclinico per il trattamento
dell’insonnia, e 2-SORA 66 è ad oggi indicato con la sigla MK-1064.[112]
Due questioni sono poi emerse durante lo sviluppo preclinico del composto.
Innanzitutto, la valutazione della forma farmaceutica del sale ha rivelato una
notevole quantità di prodotto derivante dall’idrolisi del gruppo ammidico a pH
basso (circa 2), e questo ha richiesto necessariamente, per gli studi clinici, l’utilizzo
della base libera di 2-SORA 66 in una dispersione stabilizzata amorfa. In secondo
luogo, anche se il composto 66 non era risultato né un potente inibitore reversibile
né un induttore di enzimi del CYP, l’osservazione di una moderata inibizione
tempo-dipendente del CYP3A4 (TDI) ha evidenziato un rischio di interazioni
cliniche farmacologiche. A causa di queste questioni, si è compiuto un ulteriore
sforzo di ottimizzazione per identificare un altro candidato clinico 2-SORA nella
serie triarilammidica.
Il team di chimica farmaceutica ha ipotizzato che la protonazione dell’anello-C
della piridina poteva contribuire all’attivazione del vicino gruppo carbonilico
ammidico, aumentando la suscettibilità dell’ammide all’idrolisi. Lo studio di una
serie di anelli-C non basici ha rivelato che un cambiamento da piridina a fenile è
73
stato in grado di conferire stabilità completa a pH basso per 24 ore, supportando
l’ipotesi meccanicistica (figura 29).
Figura 29. Strategia per lo sviluppo di 2-SORA 69: un candidato clinico 2-SORA.
Sfortunatamente, molti analoghi C-fenilici mostravano scarse proprietà fisiche e
solubilità, ma l'inserimento di un anello-A 3-metil-5-piridinico ha condotto a 2-
SORA 67 con eccellente stabilità a pH basso e una adeguata solubilità a pH=7 (61
µM ). Queste modifiche relative agli anelli A e C hanno aumentato in modo
significativo la clearance nel cane (Cl=27 mL/min/kg), rispetto a 66 (15
mL/min/kg), per cui si sono avviate una serie di modifiche all’anello-B con
l'obiettivo di migliorare il profilo farmacocinetico di 67. La B-isonicotinamide
regioisomera in 68 è stata in grado di mantenere la potenza per OX2R, la selettività,
la stabilità a pH=2, e ha ridotto la clearance nel cane a 15 mL/min/kg. Purtroppo, la
valutazione TDI di 2-SORA 68 non ha evidenziato alcun miglioramento rispetto a
66 (Kinact/Ki=0.012 min-1 µM-1) con un Kinact/Ki=0.013 min-1 µM-1. Lo studio
dell’anello-C nella serie B-isonicotinammidica ha condotto al derivato C-2-2-
tiazolico 69, isostero del C-fenilico. Per quest’ultimo composto, studi TDI hanno
mostrato una significativa riduzione del rischio TDI con una Kinact/Ki=0.012 min-1
µM-1=0.004 min-1/µM-1 e, molto importante, mantenendo la stabilità a pH basso.
74
La stabilità a bassi valori di pH per 2-SORA 69 è probabilmente dovuta alla natura
non basica del residuo 2-tiazolico, pKa calcolata=0.3 (contro 3.2 per il derivato C-
piridinico). Questi dati indicano il composto 2-SORA 69 quale ottimo candidato per
una caratterizzazione supplementare.
2-SORA 69 mantiene l’eccellente profilo off-target del suo predecessore, mostra
una adeguata frazione libera sia nel cane che nel ratto, e appropriata occupazione di
OX2R umanizzato nel ratto (figura 30).
Figura 30. Caratterizzazione preclinica di 2-SORA 69. (a) mL/min/kg; (b) saggio
di occupazione di OX2R umanizzato.
Il composto 69 ha mostrato da bassa a moderata clearance e breve emivita nel cane
e nel ratto, nonché biodisponibilità accettabile in entrambe le specie. Studi di EEG
dopo somministrazione orale nel ratto e nel cane, hanno confermato l'efficacia nel
produrre a basse dosi un sonno potente, simile a quello prodotto da 2-SORA 66.
Studi preclinici di sicurezza in un protocollo simile a quello usato per 2-SORA 66,
hanno sostenuto l’avanzamento del composto 2-SORA 69 nello sviluppo clinico,
con la sigla MK-3697.[113]
75
CONFRONTO DEI CANDIDATI CLINICI DORA E 2-SORA
Otto antagonisti dell’orexina sono stati sottoposti agli studi clinici sull’uomo e
almeno quattro di essi hanno completato i test di efficacia della fase II: DORA 15
(figura 9), DORA 28 (figura 14), DORA 39 (figura 19), e DORA 50 (figura 23).
Questi composti Dora hanno tutti determinato un effetto dose-dipendente in termini
di efficienza del sonno, con diversi livelli di efficacia nel ridurre il tempo di
instaurarsi del sonno (latenza verso un sonno persistente, LPS) e nell'aumentare il
mantenimento del sonno (periodi di veglia dopo l’avvio del sonno; WASO). Lo
sviluppo clinico di DORA 15 e di DORA 28 è stato interrotto, mentre DORA 39 è
stato approvato negli Stati Uniti e in Giappone.[114] DORA 50 ha completato gli
studi di fase II ed è stato studiato anche per altre indicazioni neurologiche.[115]
Sono stati intrapresi studi per lo sviluppo clinico anche per altri composti DORA
(Actelion, DORA 22, figura 8; Eisai, vide infra), e per due antagonisti selettivi per
OX2R (Merck, 2-SORA 66, figura 28; Janssen, vide infra).
Actelion è stata la prima azienda farmaceutica a riportare i dati clinici umani per
una molecola DORA e a stabilire che l’antagonismo del sistema dell’orexina
potrebbe fornire un beneficio terapeutico per il trattamento dei disturbi del sonno.
DORA 15 (almorexant) è stato inizialmente studiato in un protocollo sperimentale,
in maschi sani a dosi crescenti da 1 mg a 1000 mg, e confrontato con lo zolpidem,
per quanto riguarda il profilo farmacodinamico e la segnalazione di effetti
indesiderati.[116] Questo studio ha evidenziato che DORA 15 un Tmax breve (0.7-
2.3 h) ed un profilo PK bifasico. L'emivita di eliminazione varia da 13.1 a 19.0 ore
e aumenta con la dose. Non sono stati osservati effetti collaterali relativamente a
cataplessia o narcolessia, ed la modulazione legata al farmaco relativa ai movimenti
di oscillazione del corpo e ai movimenti oculari regolari sono generalmente inferiori
a quelli prodotti dallo zolpidem. DORA 15 è generalmente ben tollerato nei
volontari sani, con segnalazioni di sonnolenza, vertigini, disturbi dell’attenzione, e
fatica che si verificano con maggior frequenza a dosi superiori a 200 mg. Non sono
stati osservati effetti correlati al farmaco su peso corporeo, elettrocardiogramma,
valori clinici di laboratorio, e altri segni vitali. Le valutazioni farmacodinamiche
includevano una scala visuale analogica (VAS) per lo stato di veglia soggettiva,
76
cosa che ha indicato riduzioni dose-dipendenti nello stato di veglia a 400 mg e 1000
mg. La vigilanza soggettiva ritorna allo stato di base dopo circa 6 ore con una
singola dose da 400 mg e dopo circa 10 ore con una dose da 1000 mg. Gli Autori
riportano che la grandezza assoluta di questo risultato è simile a quello ottenuto con
lo zolpidem (10 mg), con un effetto più sostenuto sulla vigilanza.
Sulla base dei dati incoraggianti ottenuti nella fase I in volontari sani, DORA 15 è
stato promosso agli studi di fase II, dove è stato valutato in 161 pazienti, maschi e
femmine, affetti da insonnia primaria, a dosi di 50-400 mg in confronto con un
placebo.[117] Il parametro primario valutato in questo studio è stata l'efficienza del
sonno (SE), misurata mediante polisonnografia (PSG), insieme ad altri parametri
secondari come LPS, WASO, sicurezza e tollerabilità. Si sono osservati un aumento
significativo in termini di efficienza del sonno e tempo totale di sonno (TST) dopo
somministrazione di una singola dose di almorexant di 200mg e 400 mg. DORA 15
è risultato capace di ridurre il tempo di esordio del sonno alla dose più elevata ed
di diminuire il WASO a 200 mg e 400 mg, con una buona tollerabilità (tabella 7).
Tabella 7. Parametri principali del sonno oggettivo (relativi al placebo) in seguito
a somministrazione di una singola dose di DORA 15 a pazienti con insonnia
primaria.
Sulla base dei risultati favorevoli della fase II, DORA 15 è stato promosso agli studi
di fase III in pazienti affetti da insonnia cronica, e nel 2008 la GlaxoSmithKline ha
stipulato un accordo di collaborazione con Actelion per sviluppare insieme DORA
15.[118] Nel gennaio 2011, la Actelion ha annunciato che lo sviluppo clinico di
DORA 15 è stato interrotto a causa di problemi di sicurezza
clinica,[119]successivamente identificati come aumenti poco frequenti e transitori
degli enzimi epatici.
77
L’antagonista duale dei recettori dell’orexina di GlaxoSmithKline, DORA 28
(figura 14), è stato testato in sette studi clinici (sei di fase I e una fase II).[120] Negli
studi iniziali a dose singola crescente, DORA 28 è stato ben tollerato a dosi di 10-
80 mg.[121] L’emivita plasmatica varia da 4 a 7 h con rapido assorbimento. DORA
28 è stato somministrato a tre gruppi di volontari sani per valutare gli effetti del
farmaco su sicurezza, farmacocinetica, su EEG con dosaggio diurno e per valutare
i parametri oggettivi del sonno tramite PSG in seguito a somministrazione serale.
Gli effetti di DORA 28 sulla induzione del sonno e il suo manutenimento sono state
valutati in volontari sani a dosi di 30 mg e 60 mg. Miglioramenti statisticamente
significativi rispetto al placebo su TST sono stati osservati a 30 e 60 mg. DORA 28
ha anche ridotto sia LPS che WASO ad entrambi i dosaggi. Nessuna delle due dosi
ha compromesso la capacità cognitiva, come rilevato dal digit symbol substitution
test (DSST) eseguito nella mattina seguente alla somministrazione serale del
farmaco.
Nel 2007, GSK ha annunciato la promozione di DORA 28 ai test clinici di fase 2.
DORA 28 è stato studiato in uno studio di efficacia multidose di fase II su 52
pazienti di sesso maschile, che avevano soddisfatto i criteri per una diagnosi di
insonnia primaria.[122] Il farmaco è stato somministrato per due notti consecutive,
90 minuti prima di coricarsi, e gli effetti di induzione del sonno sono stati misurati
tramite PSG e confrontati con quelli di un placebo. DORA 28 ha determinato
significativi aumenti dose-dipendenti di SE e TST, mentre ha ridotto LPS e WASO
(tabella 8). Il farmaco è ben tollerato e gli effetti sono descritti dagli autori come
paragonabili all'effetto ipnotico prodotto dalle benzodiazepine, dai modulatori del
GABA non benzodiazepinici, sedativi e antidepressivi. I più comuni eventi avversi
riportati in questo studio sono stati mal di testa, secchezza della bocca, e
nasofaringite.
78
Tabella 8. Effetti sui parametri del sonno dopo somministrazione di DORA 28 a
maschi insonni (media di due notti consecutive) rispetto al placebo.
Ulteriori studi clinici di interazione tra un farmaci hanno rivelato che DORA 28 è
capace di aumentare l'esposizione di simvastatina, se co-somministrata. Con una
dose di 30 mg di DORA 28, l’esposizione plasmatica totale di simvastatina aumenta
più di 6 volte, dopo 15 giorni consecutivi di co-somministrazione (vedi rif 121). In
accordo con queste osservazioni, DORA 28 è risultato un potente inibitore del
CYP3A4 in vitro. Nel 2007 gli studi clinici di fase II di DORA 28 sono stati
interrotti a causa della segnalazione di una non specificata tossicità preclinica.[123]
Il primo antagonista dell’orexina candidato clinico della Merck, DORA 39
(suvorexant), è entrato nella fase di sviluppo clinico nel 2007. Negli studi di fase I,
DORA 39 è stato ben tollerato in volontari sani, con picchi plasmatici dopo 1.5-4
ore ed un’emivita plasmatica di 8-14 ore.[124] La mattina seguente ad una
somministrazione serale, non si osserva sedazione residua a dosi di 10 mg e 50 mg,
mentre queste stesse dosi producono aumenti dose-dipendenti nel SE complessivo
e riduzioni di WASO e LPS. I risultati dello studio di fase II hanno dimostrato che
DORA 39 risulta più efficace del placebo nel migliorare SE la prima notte di
trattamento, nonché alla fine delle 4 settimane nei pazienti con insonnia primaria
(tabelle 9 e 10).[125]
79
Tabella 9. Effetti sui parametri del sonno (relativi al placebo) dopo la
somministrazione di DORA 39 a pazienti insonni alla prima notte di trattamento.
Tabella 10. Effetti sui parametri del sonno (relativi al placebo) dopo la
somministrazione di DORA 39 a pazienti insonni alla notte 28 di trattamento
Si sono osservati miglioramenti nella SE a tutti i dosaggi (10, 20, 40, e 80 mg).
DORA 39 ha anche mostrato risultati favorevoli nei punti terminali secondari di un
WASO ridotto a tutti i dosaggi e ha ridotto LPS a dosi di 40 e 80 mg. In questi
studi, DORA 39 è stato ben tollerato, e l'evento avverso più comune segnalato è
stata la sonnolenza, in modo dipendente dal dosaggio. Non è stata rilevata insonnia
di rimbalzo o effetto post-sbornia dopo 4 settimane di dosaggio. Test cognitivi
standard (DSST e DSCT) effettuati 9 ore dopo la somministrazione, non hanno
evidenziato effetti residui del giorno dopo al termine di 4 settimane di trattamento.
Nel 2010, la Merck ha annunciato che DORA 39 era entrato in tre sperimentazioni
di fase III. Due studi cardine hanno reclutato oltre 2000 pazienti, non anziani e
anziani, paragonando il suvorexant a due livelli di dosaggio con il placebo per una
durata di 3 mesi.[126] L’ efficacia è stata valutata alla prima settimana, al primo
mese, e al terzo mese 3 su parametri quali, WASO e LPS tramite PSG, tempo totale
80
di sonno e inizio dell’ora del sonno riferiti dai pazienti. In questi studi gli effetti del
placebo sono stati confrontati con una dose alta (40 mg e 30 mg rispettivamente per
non anziani ed anziani) e una dose bassa (20 e 15 mg rispettivamente per non
anziani e anziani) di DORA 39. Le differenze medie rispetto al placebo nei
parametri di PSG per i gruppi ad alto dosaggio, negli studi 1 e 2 sono riportati nella
tabella 6. DORA 39 ha determinato beneficio nel ridurre il tempo di insorgenza del
sonno e ha migliorato il mantenimento del sonno a tutti gli intervalli di tempo testati,
con l’unica eccezione del parametro LPS al terzo mese.
Tabella 11. Efficacia di DORA 39 su pazienti insonni alle alte dosi di 40/30 mg
nell’arco di 3 mesi.
Le differenze medie nei parametri PSG per i gruppi a basso dosaggio per le prove
1 e 2 rispetto al placebo sono riassunti nella tabella 12.
Tabella 12. Efficacia di Suvorexant in pazienti insonni alla dose bassa di 20/15 mg
nell’arco di 3 mesi.
Anche per quanto riguarda i parametri soggettivi di insorgenza di sonno e di
mantenimento del sonno si sono osservati miglioramenti significativi rispetto al
placebo, e i pazienti hanno riportato un miglioramento di percezione della qualità
del sonno e nella sensazione di riposo al mattino. Le dosi più elevate di DORA 39
sembrano essere più efficaci rispetto alle dosi più basse; tuttavia, le dosi non sono
81
state confrontate direttamente. In questi studi, DORA 39 è stato ben tollerato e
l’incidenza degli eventi avversi sono generalmente paragonabili tra i gruppi trattati
con suvorexant e placebo. L'effetto indesiderato più comune segnalato per DORA
39 è stata la sonnolenza del giorno successivo , che tende ad essere maggiore alle
alte dosi.
DORA 39 è stato sottoposto ad un terzo studio di fase 3, nel quale sono state valutate
la sicurezza e l'efficacia alle dosi di 40/30 mg (per non anziani e anziani) in pazienti
nell’arco di un anno.[127] In questo studio, DORA 39 è risultato generalmente
sicuro e ben tollerato, e l'evento avverso segnalato più comune è stata la sonnolenza.
L'efficacia di DORA 39 si è mantenuta per la durata dell’anno di studio, in termini
di TST soggettivo e LPS soggettivo, senza una prova evidente di tolleranza. Sulla
base della totalità dei dati clinici raccolti, la Food and Drug Administration ha
approvato l'uso di di suvorexant alledosi più basse, 5, 10, 15 e 20 mg, in accordo
con la norma dell'agenzia che prevede di utilizzare le dosi efficaci più basse per i
farmaci per l’insonnia.[128,129]
La Merck ha intrapreso lo sviluppo clinico per un secondo candidato DORA,
DORA 50 (filorexant). Dati clinici dettagliati per DORA 50 non sono ancora stati
pubblicati, anche se sono stati presentati in diversi convegni scientifici.[130] È
interessante notare che DORA 50 è stato studiato per indicazioni che vanno oltre il
trattamento dell’insonnia primaria, tra cui la profilassi dell’emicrania, la nevralgia
posterpetica, e come terapia aggiuntiva per i disturbi depressivi maggiori.[131]
DORA 50 è stato studiato a livello di singola dose (10 mg) in 120 pazienti con
frequenti episodi di emicrania.[132] In questo studio, DORA 50 è stato
somministrato prima di andare a dormire e non ha mostrato efficacia su alcuna
emicrania o cefalea. L’efficacia di DORA 50 per le altre indicazioni non è stata
ancora pubblicata.
Altre due molecole DORA sono entrate nella fase degli studi clinici sull’uomo. Uno
studio a dose singola crescente con DORA 22 (figura 12) è stato effettuato su
volontari sani, in confronto sia con il placebo che con gruppi di controllo trattati
con DORA 15.[133] DORA 22 è stato studiato in un intervallo di dose ampia (5-
1500 mg) mediante vari test di farmacodinamica. DORA 22 è stato ben tollerato, e
gli eventi avversi più comuni segnalati sono stati sonnolenza, affaticamento e
82
disturbi dell'attenzione a dosi più elevate. Il Tmax per DORA 22 varia da 1.5 a 4
ore, con una tendenza a un Tmax più lungo a dosi più elevate. L'emivita plasmatica
è di circa 10 ore e varia con la dose. Come si è visto con almorexant, dosi crescenti
di DORA 22 riducono la vigilanza soggettiva (VAS), con l’effetto massimo
osservato a 1000 mg. Questo effetto farmacodinamico massimo per DORA 22 a
1000 mg è paragonabile all'effetto di DORA 15 a 400 mg, usato in questo studio
come controllo positivo. Gli autori sottolineano che il profilo farmacocinetico per
DORA 22 a 400 mg non è l'ideale per un induttore del sonno, dato l'assorbimento
ritardato osservato per questo farmaco.
I dati clinici provenienti da Eisai per DORA 71 (E2006, figura 31) sono riportati in
una pubblicazione in corso di stampa.[134,135] DORA 71 è un DORA potente ed
è stato studiato a dosi di 1, 2.5, 5, 10, 15, e 25 mg, in uno studio di fase II, sulla
base del parametro SE primario per 15 giorni, in confronto con un placebo. DORA
71 è risultato capace di migliorare l'efficienza del sonno a tutti i dosaggi, e di ridurre
sia LPS che WASO a tutte le dosi maggiori di 2.5 mg. I più comuni eventi avversi
correlati al trattamento sono stati: sonnolenza, cefalea, e, meno frequentemente,
paralisi del sonno. Solo il gruppo di dosaggio a 25 mg ha mostrato un aumento
statisticamente significativo della sonnolenza nel giorno successivo. Anche se dati
di farmacodinamica sono stati ricavati da studi su volontari sani e su pazienti, dati
di farmacocinetica umana (Tmax, T1/2) non sono stati resi noti. Sulla base dei dati
di fase II, Eisai Co. ha annunciato l'intenzione di promuovere DORA 71 alla fase
III.
Due composti 2-SORA sono stati sottoposti a studi clinici umani. 2-SORA 66
(figura 28) è stato il primo 2-SORA sottoposto a studi clinici. Il composto 66 è stato
studiato su volontari sani a un dosaggio compreso tra 5mg e 250 mg, al fine di
valutarne la sicurezza, la tollerabilità e il profilo farmacodinamico.[136] Dopo
somministrazione orale, 2-SORA 66 ha evidenziato un T1/2 breve (1.6-4.0 h) con
un rapido Tmax (l-2 h). 2-SORA 66 ha ridotto, in modo dose-dipendente, lo stato
di allerta, come misurato dalla VAS, fornendo un picco di diminuzione a 100 mg.
2-SORA 66 è stato ulteriormente valutato in uno studio PSG in soggetti sani a dosi
singole di 50, 120, e 250 mg, in confronto con un placebo. Tutte le dosi sono
risultate capaci di aumentare SE e LPS, mentre solo le due dosi più elevate hanno
83
prodotto effetti significativi sul WASO rispetto al placebo. Tutte le dosi hanno
determinato un aumento di TST, senza modificare le proporzioni REM/NREM nei
soggetti sani, in modo simile agli effetti osservati con DORA nei soggetti sani.[137]
Un secondo 2-SORA, JNJ-42847922 (2-SORA 73, figura 31), è stato sviluppato
dalla Janssen Pharmaceuticals.[138] Interessante è notare che questo antagonista
dell’orexina è stato valutato in uno studio PSG in pazienti con disturbo depressivo
maggiore in uno studio di fase 2, ma i dati clinici di questa molecola non sono stati
ancora divulgati.
Figura 31. Molecole più rappresentative sviluppate da aziende impegnate nello
sviluppo clinici o preclinici degli antagonisti dell’orexina.
84
PROGETTAZIONE E SINTESI DI AGONISTI SELETTIVI NON
PEPTIDICI DEL RECETTORE 2 DELL’OREXINA
Come abbiamo già ampiamente decsritto nell’introduzione, le Orexine (orexina A
e B, note anche come ipocretina 1 e 2) sono una coppia di neuropeptidi ipotalamici
originariamente identificati come ligandi endogeni per due recettori accoppiati a
proteine G, il recettore 1 dell’orexina (OX1R) ed il recettore 2 dell’orexina
(OX2R);[18] entrambe derivano dal singolo peptide precursore preproorexina,
definito anche preproipocretina. [17,18]. L’Orexina A, un peptide costituito da 33
residui peptidici con due ponti disolfurici intramolecolari, con un residuo C-
terminale ammidico ed un residuo N-terminale di piroglutamato, mostra elevata
potenza per entrambi i recettori OX1R e OX2R; l’Orexina B, un peptide di 28
aminoacidi, con un residuo C-terminale lineare ammidico, presenta una selettività
per OX2R di circa 10 volte maggiore rispetto a OX1R.
Il ruolo essenziale del sistema orexina nella regolazione del sonno e della veglia è
stato inizialmente dimostrato verificando che sia cani carenti di OX2R [27] che topi
knockout carenti di preproorexina [45] presentano entrambi sintomi molto simili a
disturbi del sonno quali narcolessia/cataplessia. La narcolessia/cataplessia è una
malattia neurologica cronica caratterizzata da sintomi legati al sonno N-REM, come
l'eccessiva sonnolenza diurna e "attacchi di sonno", e da sintomi collegati al sonno
REM che includono la cataplessia (improvvisa perdita bilaterale del tono
muscolare spesso causato da una forte emozione), allucinazioni ipnagogiche, e
paralisi del sonno. [139] Mentre i topi che mancano di entrambi OX1R/OX2R
mostrano un marcato fenotipo narcolettico che è indistinguibile da quello osservato
nei topi carenti di preproorexina, i topi OX2R-null presentano un fenotipo di
narcolessia un po’ meno marcato. [140] Inoltre, topi OX1R-null non mostrano un
apprezzabile fenotipo relativo al sonno/veglia [141] suggerendo che è OX2R,
piuttosto che OX1R a svolgere un ruolo predominante nella regolazione del
sonno/veglia, ed un segnale OX2R mediato intatto è sufficiente a prevenire i
sintomi della narcolessia/cataplessia. L'importanza dei segnali di OX2R nella
regolazione del sonno/veglia è stato dimostrato anche farmacologicamente dalla
scoperta che antagonisti selettivi per OX2R o duali per OX1R/OX2R inducono il
85
sonno, mentre antagonisti OX1R selettivi sono in gran parte privi di effetti sul sonno.
[142]
Inoltre, la stragrande maggioranza (>90%) dei pazienti umani affetti da
narcolessia/cataplessia non presenta livelli rilevabili di peptidi orexinici nel fluido
cerebrospinale. [143,144] La mancanza di orexina nei pazienti con narcolessia è
dovuta ad una perdita, altamente selettiva, di neuroni che producono orexina
nell'ipotalamo laterale [145,146] e questo è probabilmente causato da un
meccanismo autoimmune. [147] Queste scoperte indicano che la
narcolessia/cataplessia umana è essenzialmente una sindrome dovuta alla mancanza
di orexina e implica che la sostituzione dei segnali dell’orexina (soprattutto quelli
di OX2R) può rappresentare un approccio terapeutico meccanicistico per tale
disturbo. In verità, il ripristino, per via genetica o farmacologica, dei livelli di
peptidi orexinici migliora effettivamente il fenotipo narcolessia/cataplessia in un
modello di topo in cui i neuroni per orexina vengono asportati geneticamente, e
questo costituisce il razionale per una terapia sostitutiva a base di orexina.
[24,148,149]Tuttavia, dal momento che i peptidi orexinici non penetrano
sufficientemente la barriera emato-encefalica, [54,150] sarebbe difficile utilizzare
gli stessi neuropeptidi come farmaci.
Si potrebbe supporre che gli agonisti del recettore OX2R potrebbero risultare utili
non solo per la terapia farmacologica meccanicistica della narcolessia/cataplessia,
ma anche per altre condizioni patologiche caratterizzate da eccessiva sonnolenza,
dal momento che è ben noto che le orexine, a livello centrale, inducono
efficacemente la veglia. [24,151,152] Sebbene il ruolo dei pathways dell’orexina
endogena nella narcolessia senza cataplessia (narcolessia di tipo 2) non sia ancora
del tutto chiaro, [153] agonisti per OX2R potrebbero risultare utili anche in questa
condizione. Inoltre, agonisti per OX2R potrebbero essere potenzialmente utili nella
prevenzione e nel trattamento dell'obesità e della sindrome metabolica, poiché è
stato recentemente riportato che un potenziamento genetico o farmacologico dei
segnali OX2R ha effetti nettamente-negativi sull’omeostasi del peso corporeo e
previene l’obesità indotta da una dieta ricca di grassi nei topi. [154] Del resto è stato
anche riportato che pazienti umani con narcolessia hanno un indice di massa
corporea più elevato e sono più inclini alla sindrome metabolica rispetto ad
86
individui di controllo di pari età. [155,156]
Sulla base di queste osservazioni, Nagahara et al. [157] hanno avviato uno studio
volto allo sviluppo di piccole molecole quali agonisti non peptidici per i recettori
dell’orexina. È stato intrapreso lo screening di una libreria di circa 250000 composti
druglike per valutarne l’attività agonista OX2R ed in seguito si è intrapreso uno
studio sistematico di medicinal chemistry dei composti "hit" ottenuti dallo
screening iniziale.
Si è iniziato con lo screening della Universal Chemical Library [158] Particolare
attenzione è stata posta al gruppo sulfonammidico del composto hit 1, costituito da
due anelli aromatici (A e B) collegati tra loro da un linker (figura 32).
Il composto 1 è stato modificato a dare in derivati solfonammidici terziari, definiti
composti di tipo I, figura 1. Tuttavia, nessuno dei derivati ottenuti ha mostrato
attività, e questo ha portato a sintetizzare le solfonammidi secondarie 2-6, definite
come composti di tipo II; i composti 2-4 hanno mostrato debole attività agonista
OX2R nel saggio NFAT-luciferasi, ma non sono risultati efficaci nel saggio
dell’influsso di calcio. Questi risultati hanno suggerito che il protone sul gruppo
sulfammidico secondario potrebbe avere un ruolo importante per ottenere l’attività
agonista. Inoltre, la conversione della funzione 1,2-fenilendiamminica del
composto 4 nelle funzioni 1,3- e 1,4-fenilendiamminica (composti 5 e 6), ha portato
ad un notevole miglioramento nell’attività. Sostituendo il gruppo isopropilico
sull’anello-A del derivato più attivo 5 con un gruppo fenilico ed rimuovendo il
gruppo metilico, si ottiene il composto 7 che ha mostrato maggiore attività (attività
NFAT-luciferasi del 41% (efficacia a 10 M), influsso di calcio del 48% (efficacia
a 10 M)), come mostrato nella tabella 13.
87
Figura 32 Approccio di drug design dal composto hit 1 al composto lead 5.
Infine, dopo aver esaminato la posizione del sostituente R1 sul gruppo arilico (Ar)
del composto 7, è risultato che il sostituente in posizione 3 favoriva maggiormente
l’attività agonista per OX2R rispetto alle posizioni 2 o 4. Quindi è stata studiata
l'introduzione di altri gruppi funzionali, indicati con R1, nella posizione 3 del
gruppo arilico (tabella 13).
Dall’analisi dei risultati è emerso che in molti casi è stata ulteriormente aumentata
l’efficacia per OX2R sia nel saggio NFAT-luciferasi che nell’influsso di calcio. Il
valore di EC50 del composto 8 con il gruppo metossilico è risultato di 0.800 M.
Allo stesso tempo, l’introduzione di un gruppo estereo o del fluoro ha determinato
una diminuzione dell’attività (composti 9 e 14). È interessante notare che
l'introduzione dei gruppi ammidici ha notevolmente aumentato sia la potenza che
l’efficacia, ed anche il gruppo 3-piridilico ha aumentato l'attività (composti 10-12 e
15).
Successivamente, l’attenzione è stata rivolta al composto 11, con il gruppo
dimetilammidico, che ha mostrato la più alta attività tra quelli riportati nella tabella
14 ed è stato ipotizzato di modificare l’anello B di questo composto.
88
Tabella 14. Relazioni struttura-attività tra il sostituente Ar sull’anello A e l’attività
sul flusso di calcio mediata da OX2R in saggi in vitro.
aIl valore è la media di n=5. Emax espressa come percentuale di massima OXA. bEfficacia a 10 M. cEfficacia a 1 M.
L'introduzione del sostituente R2 sull’anello B ha permesso di modificare
notevolmente la potenza e l’efficacia come indicato nella tabella 15. La rimozione
del gruppo metossilico sull’anello B del composto 11 porta ad una significativa
perdita sia di potenza che di efficacia nei confronti di OX2R (composto 22: EC50≥10
M per OX2R.). Cambiando la posizione del gruppo metossilico dalla posizione 2
89
alla posizione 3 dell’anello B, determina un leggero aumento di potenza e selettività,
ma non di efficacia (composto 23, EC50=0.033 M, Emax=54% per OX2R). D'altra
parte, la sostituzione del gruppo metossilico in posizione 4 porta ad una
diminuzione di 20 volte della potenza (composto 24, EC50=1.047 M, Emax=94%
per OX2R). L’introduzione di un gruppo metilico in posizione 2 risulta in una
diminuzione di potenza (composto 25, EC50=0.800 M, Emax=85% per OX2R),
mentre un gruppo metilico in posizione 3 porta ad un aumento sia di potenza che di
efficacia (composto 26, EC50=0.023 M, Emax=98% per OX2R). L’introduzione di
un atomo di cloro in posizione 2 o 3 ha dato risultati analoghi a quelli ottenuti con
il gruppo metossilico (composti 27 e 28). I composti 11, 23, 26, 27 e 28 hanno
mostrato non solo una potente attività ma anche alta selettività per OX2R rispetto a
OX1R (tabella 15). In cellule CHO che sovraesprimono hOX1R e cellule HEK-293
che sovraesprimono hOX2R, il composto 26 spiazza la [125I]-orexina-A in modo
concentrazione dipendente: il 26 si lega a hOX2R e hOX1R con una Ki
rispettivamente di 0.14 M e 0.77 M.
Tabella 15. Relazioni struttura-attività tra il sostituente R2 dell’anello B e l’effetto
sul flusso di calcio mediata da OX2R in saggi in vitro
Quindi, il gruppo solfonammidico di 26 è stato convertito in un gruppo
carbossammidico nel composto 29, allo scopo di esaminare l'importanza della
90
funzione solfonammidica per l'attività agonista verso OX2R. Sorprendentemente, il
derivato carbossammidico 29 è risultato inattivo sia verso OX1R che verso OX2R,
a sostegno dell’ipotesi che la funzione solfonammidica è uno dei più importanti
elementi strutturali per l'attività agonista OX2R (figura 33).
Figura 33. Strutture del derivato solfonammidico 26 e del derivato
carbossammidico 29.
Recentemente, [159] è stata risolta a 2.5 Å la struttura cristallina a raggi X del
recettore OX2R umano legato all’antagonista duale dell’orexina, il suvorexant.
[160,161]Con l'utilizzo di questa struttura a raggi X, è stato studiato il binding mode
del composto 26 con OX2R utilizzando studi di docking molecolare. Il binding
mode risultante per 26 (figura 34) suggerisce che il gruppo dimetilcarbamoilico del
composto 26 si trova in profondità nel sito di legame di OX2R, e il suo gruppo
carbonilico forma un legame ad idrogeno con N324 (elica transmembrana 5, TM5).
Il composto 26 utilizza anche un atomo di azoto della funzione etilenediamminica
per formare un ulteriore legame ad idrogeno con il gruppo carbonilico della catena
principale di C210 (TM3). Il gruppo bifenilico di 26 si colloca nella tasca idrofobica
costituita da V138 (TM3), F227 (TM5), Y317 (TM6), I320 (TM6), e V353 (TM7)
91
per instaurare interazioni idrofobiche. Il gruppo sulfonilammidico di 26 si trova in
prossimità di T111 (TM2), H350 (TM7), e Y354 (TM7). È interessante notare che
26 orienta i due ossigeni del gruppo sulfonilammidico rispettivamente verso i
gruppi ossidrilici di T111 (TM2) e Y354 (TM7), e l'anello imidazolico di H350
(TM7). Il gruppo sulfonilammidico di 26 può formare legami ad idrogeno anche
durante i cambiamenti strutturali connessi con l'attivazione del recettore.
Figura 34. Binding mode del composto 26 con OX2R determinata mediante
docking. Le interazioni di legame ad idrogeno sono indicate da linee tratteggiate
rosse.
Questo può spiegare il motivo per cui il derivato carbossammidico 29 è risultato
inattivo, considerando la direzione dell’ossigeno che è diversa tra i gruppi
carbossammidico e solfonilammidico. Il residuo T111 (TM2) di OX2R è mutato a
Ser in OX1R. Questa mutazione potrebbe essere correlata alla alta selettività per
OX2R dei composti nella tabella 16. I gruppi benzenici nelle porzioni intermedie e
92
terminali di 26 instaurano anche interazioni idrofobiche con V114 (TM2), W120
(ECL1), I130 (TM3), Y343 (TM7) e F346 (TM7). Questo può spiegare anche
perchè i composti 23, 26, e 28 con un gruppo sostituente in posizione 3 possiedono
una potente attività, visto che è presente un ampio spazio in direzione della
posizione 3 per ospitare il gruppo sostituente. La figura 34 confronta il binding
mode di suvorexant e di 26 con OX2R. Come riportato in letteratura, [160] il
suvorexant adotta una conformazione a ferro di cavallo -stacked per dirigere il suo
anello a sette termini verso TM5 e TM6 di OX2R.
Figura 35 Sovrapposizione di suvorexant (verde) e del composto 26 (viola) nel sito
di binding di OX2R.
Si pensa che questo binding mode sia responsabile dell'attività antagonista OX2R di
suvorexant, poichè l'anello a sette termini sembra ostacolare i movimenti interni di
TM5 e di TM6 rispetto al resto dei TM, che rappresentano un innesco generale per
l'attivazione di GPCR. Al contrario, 26 si lega a OX2R con una conformazione
estesa, ed è stata evidenziata anche qualche tolleranza spaziale tra 26 e TM5 e TM6
di OX2R. Pertanto, si potrebbe considerare che il legame di 26 a OX2R possa
93
consentire i movimenti interni di TM5 e di TM6, e questo conferirebbe a 26 una
attività agonista per OX2R.
Nella tabella 16, il composto più potente è il 3-metil derivato 26, il composto più
selettivo per OX2R è il 3-metossi derivato 23. Inoltre, i composti 11 e 22-28 (tabella
16) sono scarsamente solubili in acqua, cosa che ha comportato difficoltà nel
confermare l’attività in vivo, anche se tutti i composti hanno mostrato attività e
potenze soddisfacenti in vitro.
Pertanto, si è pensato di introdurre un gruppo 2-dimetilamminico sull'anello B,
ottenendo il derivato più polare 30 (figura 37), che è stato poi convertito nel sale
dicloridrato 31, che potrebbe essere sciolto in soluzione salina a 1.3M.
Figura 37 Strutture di 30 e del suo sale dicloridrato idrosolubile 31.
Per valutare l'effetto farmacologico di 31 in vivo, questo è stato somministrato per
via intracerebroventricolare ed è stato osservato l'effetto sugli stati di sonno/veglia,
registrando EEG/EMG in topi C57BL/6J. Il composto 31 ha favorito uno stato di
veglia in modo dose-dipendente (figura 38). 260 nmol di 31 aumentano il tempo
della veglia di 53 minuti, analogamente a quanto osservato con 3.0 nmol di orexina
A (58 min). Al contrario, 31 non aumenta la veglia nei topi double knockout carenti
di OX1R/OX2R (DKO), dimostrando che gli effetti di 31 necessitano dei recettori
orexina come previsto.
94
Figura 38 Effetto dell’iniezione intracerebroventricolare di 31 sugli stati sonno-
veglia in topi wild-type e topi DKO.
95
CONCLUSIONI E PROSPETTIVE FUTURE
I disturbi del sonno sono una delle patologie più frequenti riscontrate nella pratica
clinica.
L’insonnia è definita come la difficoltà ad iniziare o a mantenere il sonno, oppure
avere un sonno non ristoratore; si può presentare in assenza di un altro disturbo
(insonnia primaria) o in concomitanza con una condizione patologica, problemi di
abuso di sostanze, o altri stimoli causali.
Qualunque sia l’eziologia, l’insonnia ha un altissimo costo sociale dovuto al tempo
di lavoro perso, così come al rischio di aumento di incidenti e di malattie accessorie.
Tra i trattamenti farmacologici attualmente in uso, i modulatori non
benzodiazepinici del recettore GABAA, quali zolpidem e eszopiclone, sono
considerati i farmaci di elezione per il trattamento dell’insonnia. Questi farmaci
esercitano i loro effetti attraverso il potenziamento del principale neurotrasmettitore
inibitorio del sistema nervoso centrale, l’acido gamma-aminobutirrico (GABA), e
questo si traduce in una depressione centrale generalizzata, facilitando il sonno. In
ogni caso, questi farmaci hanno una breve durata d’azione, per cui risultano più
efficaci nell’indurre il sonno, piuttosto che nel mantenerlo.
Considerato l’elevato numero di pazienti affetti da insonnia e visti i limiti delle
opzioni di trattamento ad oggi in uso, sarebbe auspicabile lo sviluppo di nuove
strategie terapeutiche per il trattamento di questo disturbo.
L'opportunità di studiare i disturbi legati al sonno da un punto di vista alternativo si
è presentata nella letteratura scientifica nel 1998, anno in cui sono stati descritti per
la prima volta i neuropeptidi dell’orexina, contemporaneamente da due gruppi di
ricerca diversi, utilizzando distinti approcci molecolari e biochimici, e ancora prima
che fosse scoperta la loro associazione genetica con la narcolessia.
Le Orexine (orexina A e B, note anche come ipocretina 1 e 2) sono una coppia di
neuropeptidi ipotalamici originariamente identificati come ligandi endogeni per due
recettori accoppiati a proteine G, il recettore 1 dell’orexina (OX1R) ed il recettore
2 dell’orexina (OX2R); entrambe derivano dal singolo peptide precursore
preproorexina, definito anche preproipocretina. L’Orexina A, un peptide costituito
da 33 residui peptidici con due ponti disolfuro intramolecolari, con un residuo C-
96
terminale ammidico ed un residuo N-terminale di piroglutamato, mostra elevata
potenza per entrambi i recettori OX1R e OX2R; l’Orexina B, un peptide di 28
aminoacidi, con un residuo C-terminale lineare ammidico, presenta invece una
selettività per OX2R di circa 10 volte rispetto a OX1R.
La scoperta, la caratterizzazione, e l'associazione genetica del sistema dell’orexina
con il ciclo sonno/veglia e l’ipotesi per altre potenziali indicazioni ha stimolato
un’intensa attività nel settore industriale tra il 1999 e il 2007, con l'obiettivo di
scoprire nuovi antagonisti dell’orexina. In particolare, le ricerche di Medicinal
Chemistry nel campo degli antagonisti dell’orexina nel corso degli ultimi 17 anni
hanno portato alla formulazione di oltre 200 domande di brevetto da parte di 15
aziende farmaceutiche, lo sviluppo di 11 candidati clinici, e l'approvazione da parte
della FDA del Belsomra (suvorexant, DORA 39), il primo antagonista dell’orexina
entrato in commercio per il trattamento dell’insonnia.
Il livello di interesse per gli antagonisti dell’orexina rimane tutt’ora alto dal
momento che alcune aziende sono attive in studi clinici o in programmi preclinici
incentrati sul trattamento dell'insonnia. Gli sforzi futuri in questo senso potrebbero
andare oltre l'insonnia, con i derivati 1-SORA (antagonisti selettivi del recettore
OX1R) che hanno dimostrato efficacia preclinica in modelli di ansia, e i 2-SORA
(antagonisti selettivi del recettore OX2R) e i DORA (antagonisti duali dei recettori
OX1R/OX2R) che hanno dimostrato efficacia in modelli preclinici di dipendenza e
ricaduta.
D’altro canto, prove genetiche e farmacologiche hanno indicato che gli agonisti dei
recettori dell’orexina, soprattutto agonisti OX2R, potrebbero risultare utili per un
approccio terapeutico meccanicistico dei disturbi del sonno quali
narcolessia/cataplessia. In questo ambito è stato recentemente avviato uno studio
per scoprire ed ottimizzare piccole molecole agonisti non peptidici dei recettori
dell’orexina, che ha fornito risultati utili per l’ulteriore progettazione di nuovi
agonisti.
97
BIBLIOGRAFIA
[1] Gershell, L. Insomnia market. Nat. Rev. Drug Discovery 2006, 5, 15−16.
[2] Riemann, D.; Spiegelhalder, K.; Feige, B.; Voderholzer, U.; Berger, M.; Perlis,
M.; Nissen, C. The hyperarousal model of insomnia: A review of the concept and
its evidence. Sleep Med. Rev. 2010, 14, 19−31.
[3]Terzano MG Rossi M; Palomba V; Smerieri A; Parrino L et al, New drugs for
insomnia: comparative tolerability of zopiclone, zolpidem and zaleplon Drug
Safety (2003), 26(4), 61-82
[4] Stoller, M. K. Economic effects of insomnia. Clin. Ther. 1994, 16, 873−897.
[5] Daley, M.; Morin, C. M.; LeBlanc, M.; Gregoire, J.-P.; Savard, J. The economic
burden of insomnia: Direct and indirect costs for individuals with insomnia
syndrome, insomnia symptoms, and good sleepers. Sleep 2009, 32, 55−64.
[6] Riemann, D.; Perlis, M. L. The treatments of chronic insomnia: A review of
benzodiazepine receptor agonists and psychological and behavioral therapies. Sleep
Med. Rev. 2009, 13, 205−214.
[7] Nutt, D. J.; Stahl, S. M. Searching for the perfect sleep: The continuing
evaluation of GABAA receptor modulators as hypnotics. J. Psychopharmacol. 2010,
24, 1601−1612.
[8] Dockhorn, R. J.; Dockhorn, D. W. Zolpidem in the treatment of short-term
insomnia: A randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. Clin.
Neuropharmacol. 1996, 19, 333−340.
[9] MacFarlane, J.; Morin, C. M.; Montplaisir, J. Hypnotics in insomnia: The
experience of zolpidem. Clin. Ther. 2014, 36, 1676−1701.
[10] Toner, L. C.; Tsambiras, B. M.; Catalano, G.; Catalano, M. C.; Cooper, D. S.
Central nervous system side effects associated with zolpidem treatment. Clin.
Neuropharmacol. 2000, 23, 54−58.
[11] Yang, W.; Dollear, M.; Muthukrishnan, S. R. One rare side effect of zolpidem
− sleepwalking: a case report. Arch. Phys. Med. Rehabil. 2005, 86, 1265−1266.
[12] Yun, C.-H.; Kim, H.; Park, S.-H. Sleep-related eating as a side effect of drugs
for insomnia. In Handbook of Nutrition, Diet, And Sleep; Preedy, V. R., Patel, V.
B., Le, L.-A., Eds.; Wageningen Academic Publishers: Wageningen, The
98
Netherlands, 2013; Vol. 3, 389−398.
[13] Gunja, N. In the Zzz zone: The effects of Z-drugs on human performance and
driving. J. Med. Toxicol. 2013, 9, 163−171.
[14] Farkas, R. H.; Unger, E. F.; Temple, R. Zolpidem and driving impairment −
Identifying persons at risk. N. Engl. J. Med. 2013, 369, 689−691.
[15] FDA Requests Label Change for All Sleep Disorder Drug Products; US Food
and Drug Administration: Silver Spring, MD, 2007; March 14, 2007;
http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/
PressAnnouncements/2007/ucm108868.htm.
[16] (a) FDA Approves New Label Changes and Dosing for Zolpidem Products and
a Recommendation to Avoid Driving the Day after Using Ambien CR; US Food
and Drug Administration: Silver Spring, MD, May 14, 2013;
http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/ucm352085. htm; (b) : Risk of Next-
Morning Impairment after Use of Insomnia Drugs; FDA Requires Lower
Recommended Doses for Certain Drugs Containing Zolpidem (Ambien, Ambien
DR, Edluar, and Zolpimist); US Food and Drug Administration: Silver Spring, MD,
January 10, 2013; http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/ucm334033.htm.
[17] De Lecea L, Kilduff TS, Peyron C, Gao X, Foye PE, Danielson PE, Fukuhara
C, Battenberg EL, Gautvik VT, Bartlett FS 2nd, et al. (1998) The hypocretins:
[18] Sakurai T, Amemiya A, Ishii M, Matsuzaki I, Chemelli RM, Tanaka H,
Williams SC, Richardson JA, Kozlowski GP, Wilson S, et al. (1998) Orexins and
orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled
receptors that regulate feeding behavior. Cell 92:573–585.
[19] Bernardis LL and Bellinger LL (1996) The lateral hypothalamic area revisited:
ingestive behavior. Neurosci Biobehav Rev 20:189–287.
[20] Edwards CM, Abusnana S, Sunter D, Murphy KG, Ghatei MA, and Bloom SR
(1999) The effect of the orexins on food intake: comparison with neuropeptide Y,
melaninconcentrating hormone and galanin. J Endocrinol 160:R7–R12.
[21] Beck B and Richy S (1999) Hypothalamic hypocretin/orexin and neuropeptide
Y: divergent interaction with energy depletion and leptin. Biochem Biophys Res
Commun 258:119–122.
99
[22] Lubkin M and Stricker-Krongrad A (1998) Independent feeding and metabolic
actions of orexins in mice. Biochem Biophys Res Commun 253:241–245.
[23] Nisoli E, Carruba MO, Valerio A, and Borsani G (1998) Hypocretins or
hyporexins? Nat Med 4:645.
[24] Mieda M, Willie JT, Hara J, Sinton CM, Sakurai T, and YanagisawaM (2004)
Orexin peptides prevent cataplexy and improve wakefulness in an orexin neuron-
ablated model of narcolepsy in mice. Proc Natl Acad Sci USA 101:4649–4654.
[25] Ida T, Nakahara K, Katayama T, Murakami N, and Nakazato M (1999) Effect
of lateral cerebroventricular injection of the appetite-stimulating neuropeptide,
orexin and neuropeptide Y, on the various behavioral activities of rats. Brain Res
821:526–529.
[26] Wong KK, Ng SY, Lee LT, Ng HK, and Chow BK (2011) Orexins and their
receptors from fish to mammals: a comparative approach. Gen Comp Endocrinol
171:124–130.
[27] Lin L, Faraco J, Li R, Kadotani H, Rogers W, Lin X, Qiu X, de Jong PJ, Nishino
S, and Mignot E (1999) The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a
mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2 gene. Cell 98:365–376.
[28] Scammell TE, Willie JT, Guilleminault C, Siegel JM, and International
Working Group on Rodent Models of Narcolepsy (2009) A consensus definition of
cataplexy in mouse models of narcolepsy. Sleep 32:111–116.
[29] Nishino S, Okuro M, Kotorii N, Anegawa E, Ishimaru Y, Matsumura M, and
Kanbayashi T (2010) Hypocretin/orexin and narcolepsy: new basic and clinical
insights. Acta Physiol (Oxf) 198:209–222.
[30] Winrow CJ, Gotter AL, Cox CD, Doran SM, Tannenbaum PL, Breslin MJ,
Garson SL, Fox SV, Harrell CM, Stevens J, et al. (2011) Promotion of sleep by
suvorexant-a novel dual orexin receptor antagonist. J Neurogenet 25:52–61.
[31] Putula J, Turunen PM, Johansson L, Na¨sman J, Ra R, Korhonen L, and
Kukkonen JP (2011) Orexin/hypocretin receptor chimaeras reveal structural
features important for orexin peptide distinction. FEBS Lett 585:1368–1374.
100
[32] Tran DT, Bonaventure P, Hack M, Mirzadegan T, Dvorak C, Letavic M,
Carruthers N, Lovenberg T, and Sutton SW (2011) Chimeric, mutant orexin
receptors show key interactions between orexin receptors, peptides and antagonists.
Eur J Pharmacol 667:120–128.
[33] Thuau R, Guilhaudis L, Se´galas-Milazzo I, Chartrel N, Oulyadi H, Boivin S,
Fournier A, Leprince J, Davoust D, and Vaudry H (2005) Structural studies on
26RFa, a novel human RFamide-related peptide with orexigenic activity. Peptides
26:779–789.
[34] Yamamoto T, Miyazaki R, and Yamada T (2009) Intracerebroventricular
administration of 26RFa produces an analgesic effect in the rat formalin test.
Peptides 30:1683–1688.
[35] Arrigoni E, Mochizuki T, and Scammell TE (2010) Activation of the basal
forebrain by the orexin/hypocretin neurones. Acta Physiol (Oxf) 198:223–235.
[36] Lund PE, Shariatmadari R, Uustare A, Detheux M, Parmentier M, Kukkonen
JP, and Akerman KE (2000) The orexin OX1 receptor activates a novel Ca2+ influx
pathway necessary for coupling to phospholipase C. J Biol Chem 275:30806–30812.
[37] Zhu Y, Miwa Y, Yamanaka A, Yada T, Shibahara M, Abe Y, Sakurai T, and Goto
K (2003) Orexin receptor type-1 couples exclusively to pertussis toxin-insensitive
G-proteins, while orexin receptor type-2 couples to both pertussis toxin-sensitive
and -insensitive G-proteins. J Pharmacol Sci 92:259–266.
[38] Karteris E, Randeva HS, Grammatopoulos DK, Jaffe RB, and Hillhouse EW
(2001) Expression and coupling characteristics of the CRH and orexin type 2
receptors in human fetal adrenals. J Clin Endocrinol Metab 86:4512–4519.
[39] Smart D, Jerman JC, Brough SJ, Rushton SL, Murdock PR, Jewitt F,
Elshourbagy NA, Ellis CE, Middlemiss DN, and Brown F (1999) Characterization
of recombinant human orexin receptor pharmacology in a Chinese hamster ovary
cell-line using FLIPR. Br J Pharmacol 128:1–3.
[40] Uramura K, Funahashi H, Muroya S, Shioda S, Takigawa M, and Yada T (2001)
Orexin-a activates phospholipase C- and protein kinase C-mediated Ca2+ signaling
signaling in dopamine neurons of the ventral tegmental area. Neuroreport 12:1885–
101
1889.
[41] Larsson KP, Peltonen HM, Bart G, Louhivuori LM, Penttonen A, Antikainen
M, Kukkonen JP, and Akerman KE (2005) Orexin-A-induced Ca2+ entry: evidence
for involvement of trpc channels and protein kinase C regulation. J Biol Chem 280:
1771–1781.
[42] Van Den Pol AN, Patrylo PR, Ghosh PK, and Gao XB (2001) Lateral
hypothalamus: early developmental expression and response to hypocretin (orexin).
J Comp Neurol 433:349–363.
[43] Eriksson KS, Sergeeva OA, Selbach O, and Haas HL (2004) Orexin
(hypocretin)/ dynorphin neurons control GABAergic inputs to tuberomammillary
neurons. Eur J Neurosci 19:1278–1284.
[44] Hara J, Yanagisawa M, and Sakurai T (2005) Difference in obesity phenotype
between orexin-knockout mice and orexin neuron-deficient mice with same genetic
background and environmental conditions. Neurosci Lett 380:239–242.
[45] Chemelli RM, Willie JT, Sinton CM, Elmquist JK, Scammell T, Lee C,
Richardson JA, Williams SC, Xiong Y, Kisanuki Y, et al. (1999) Narcolepsy in
orexin knockout mice: molecular genetics of sleep regulation. Cell 98:437–451.
[46] Saper CB, Fuller PM, Pedersen NP, Lu J, and Scammell TE (2010) Sleep state
switching. Neuron 68:1023–1042.
[47] España RA and Scammell TE (2011) Sleep neurobiology from a clinical
perspective.
Sleep 34:845–858.
[48] Yoshida K, McCormack S, Espan˜a RA, Crocker A, and Scammell TE (2006)
Afferents to the orexin neurons of the rat brain. J Comp Neurol 494:845–861.
[49] Trivedi P, Yu H, MacNeil DJ, Van der Ploeg LH, and Guan XM (1998)
Distribution of orexin receptor mRNA in the rat brain. FEBS Lett 438:71–75.
[50] Monti JM, Pellejero T, and Jantos H (1986) Effects of H1- and H2-histamine
102
receptor agonists and antagonists on sleep and wakefulness in the rat. J Neural
Transm 66:1–11.
[51] Mochizuki T and Scammell TE (2003) Orexin/hypocretin: wired for
wakefulness. Curr Biol 13:R563–R564.
[52] Zeitzer JM, Buckmaster CL, Parker KJ, Hauck CM, Lyons DM, and Mignot E
(2003) Circadian and homeostatic regulation of hypocretin in a primate model:
implications for the consolidation of wakefulness. J Neurosci 23:3555–3560.
[53] Piper DC, Upton N, Smith MI, and Hunter AJ (2000) The novel brain
neuropeptide, orexin-A, modulates the sleep-wake cycle of rats. Eur J Neurosci
12:726–730.
[54] Fujiki N, Yoshida Y, Ripley B, Mignot E, and Nishino S (2003) Effects of IV
and ICV hypocretin-1 (orexin A) in hypocretin receptor-2 gene mutated narcoleptic
dogs and IV hypocretin-1 replacement therapy in a hypocretin-ligand-deficient
narcoleptic dog. Sleep 26:953–959.
[55] Adamantidis AR, Zhang F, Aravanis AM, Deisseroth K, and de Lecea L (2007)
Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin
neurons. Nature 450:420–424.
[56] Carter ME, Adamantidis A, Ohtsu H, Deisseroth K, and de Lecea L (2009)
Sleep homeostasis modulates hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. J
Neurosci 29:10939–10949.
[57] Huang W, Ramsey KM, Marcheva B, and Bass J (2011) Circadian rhythms,
sleep, and metabolism. J Clin Invest 121:2133–2141.
[58] Klein DC, Moore RY, and Reppert SM (1991) Suprachiasmatic Nucleus: The
Mind’s Clock. Oxford University Press, New York, NY.
[59] Burdakov D (2004) Electrical signaling in central orexin/hypocretin circuits:
tuning arousal and appetite to fit the environment. Neuroscientist 10:286–29
[60] Porkka-Heiskanen T, Strecker RE, and McCarley RW (2000) Brain site-
specificity of extracellular adenosine concentration changes during sleep
deprivation and spontaneous sleep: an in vivo microdialysis study. Neuroscience
103
99:507–517.
[61] Thakkar MM, Engemann SC, Walsh KM, and Sahota PK (2008) Adenosine
and the homeostatic control of sleep: effects of A1 receptor blockade in the
perifornical lateral hypothalamus on sleep-wakefulness. Neuroscience 153:875–
880.
[62] Satoh S, Matsumura H, Kanbayashi T, Yoshida Y, Urakami T, Nakajima T,
Kimura N, Nishino S, and Yoneda H (2006) Expression pattern of FOS in orexin
neurons during sleep induced by an adenosine A(2A) receptor agonist. Behav Brain
Res 170:277–286.
[63] Fenzl T, Romanowski CP, Flachskamm C, Deussing JM, and Kimura M (2011)
Wake-promoting effects of orexin: Its independent actions against the background
of an impaired corticotropine-releasing hormone receptor system. Behav Brain Res
222:43–50.
[64] Burgess CR, Tse G, Gillis L, and Peever JH (2010) Dopaminergic regulation
of sleep and cataplexy in a murine model of narcolepsy. Sleep 33:1295–1304.
hypothalamus-specific peptides with neuroexcitatory activity. Proc Natl Acad Sci
USA 95:322–327.
[65] Asahi, S .; Egashira, S.-I .; Matsuda, M .; Iwaasa, H .; Kanatani, A; Ohkubo,
M .; Ihara, M .; Sakurai, R .; Morishima, H. studi di relazione struttura-attività sul
romanzo del neuropeptide dell’orexina. Peptide Sci. 1999, 36, 37-40.
[66] Asahi, S .; Egashira, S.-I .; Matsuda, M .; Iwaasa, H .; Kanatani, A; Ohkubo,
M .; Ihara, M .; Morishima, H. Sviluppo di un orexina-2 agonista selettivo [Ala11,
D-Leuls] orexina-B. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003 13, 111-113.
[67] Chen, Q .; de Lecea, L .; Hu, Z .; Gao, D. sistema orexina/ ipocretina: Un ruolo
sempre più importante in neuropsichiatria. Med. Res. Rev. 2015, 35, 152-197.
[68] Sakurai, T .; Mieda, M. Connessione della produzione dei neuroni-orexina:
Interfaccia di sistemi di emozioni, omeostasi energetica e l'eccitazione. Trends
Pharmacol. Sci. 2011, 32, 451-462
[69] Scifinder search using “orexin antagonists” and limiting references to patent
filings in March 2015.
104
[70] Porter, R. A.; Chan, W. N.; Coulton, S.; Johns, A.; Hadley, M. S.; Widdowson,
D.; Jerman, J. C.; Brough, S. J.; Coldwell, M.; Smart, D.; Jewitt, F.; Jeffrey, P.;
Austin, N. 1,3-Biarylureas as selective nonpeptide antagonists of the orexin-1
receptor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 1907−1910.
[71] Smart, D.; Sabido-David, C.; Brough, S. J.; Jewitt, F.; Johns, A.; Porter, R. A.;
Jerman, J. C. SB-334867: The first selective orexin-1 receptor antagonist. Br. J.
Pharmacol. 2001, 132, 1179−1182.
[72] The convention of utilizing >20× selectivity as a determinant of DORA versus
SORA profile was initiated to simplify the narrative within the field. This
convention is not reflective of underlying pharmacology. Please see: Roecker, A. J.;
Coleman, P. J. Orexin receptor antagonists: Medicinal chemistry and therapeutic
potential. Curr. Top. Med. Chem. 2008, 8, 977−987.
[73] Duxon, M. S.; Stretton, J.; Starr, K.; Jones, D. N. C.; Holland, V.; Riley, G.;
Jerman, J.; Brough, S.; Smart, D.; Johns, A.; Chan, W.; Porter, R. A.; Upton, N.
Evidence that orexin-A-evoked grooming in the rat is mediated by orexin-1 (OX1)
receptors, with downstream 5-HT2C receptor involvement. Psychopharmacology
2001, 153, 203−209.
[74] McAtee, L. C.; Sutton, S. W.; Rudolph, D. A.; Li, X.; Aluisio, L. E.; Phuong,
V. K.; Dvorak, C. A.; Lovenberg, T. W.; Carruthers, N. I.; Jones, T. K. Novel
substituted 4-phenyl-[1,3]dioxanes: Potent and selective orexin receptor 2 (OX2R)
antagonists. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 4225−4229.
[75] Roecker A. J. Cox C. D, and Coleman P. J. Orexin Receptor Antagonists: New
Therapeutic Agents for the Treatment of Insomnia J. Med. Chem., 2016, 59 (2),
504–530
[76] Fraser, I.; Aluisio, L.; Yun, S.; Shelton, J.; Lord, B.; Sutton, S.; Jiang, X.;
Dvorak, C.; Dugovic, C.; Bonaventure, P.; Carruthers, N.; Lovenberg, T. In vivo
neurochemical characterization of a selective orexin-2 receptor antagonist. Society
for Neuroscience Meeting, San Diego, CA, November 13−17, 2010, poster 167.17.
[77] Hirose, M.; Egashira, S.-I.; Goto, Y.; Hashihayata, T.; Ohtake, N.; Iwaasa, H.;
Hata, M.; Fukami, T.; Kanatani, A.; Yamada, K. N-acyl 6,7-dimethoxy-1,2,3,4-
tetrahydroisoquinoline: The first orexin-2 receptor selective non-peptidic
antagonist. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003,
105
13, 4497−4499.
[78] Aissaoui, H.; Clozel, M.; Weller, T.; Koberstein, R.; Sifferlen, T.; Fischli, W.
Sulfonylamino-acetic acid derivatives. WO 2004033418, April 22, 2004.
[79] Aissaoui, H.; Clozel, M.; Fischli, W.; Koberstein, R.; Sifferlen, T.; Weller, T.
7,8,9,10-tetrahydro-6H-azepino-6,7,8,9-tetrahydro-pyrido and 2,3-dihydro-2H-
pyrrolo[2,1-B]-quinazolinone derivatives. WO 2004004733, January 15, 2004.
[80] Bergman, J. M.; Roecker, A. J.; Mercer, S. P.; Bednar, R. A.; Reiss, D. R.;
Ransom, R. W.; Meacham Harrell, C. M.; Pettibone, D. J.; Lemaire, W.; Murphy,
K. L.; Li, C.; Prueksaritanont, T.; Winrow, C. J.; Renger, J. J.; Koblan, K. S.;
Hartman, G. D.; Coleman, P. J. Proline bisamides
as potent dual orexin receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18,
1425−1430.
[81] Aissaoui, H.; Koberstein, R.; Zumbrunn, C.; Gatfield, J.; Brisbare-Roch, C.;
Jenck, F.; Treiber, A.; Boss, C. N-glycinesulfonamides as potent dual orexin
1/orexin 2 receptor antagonists.
Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 5729−5733.
[82] Koberstein, R.; Aissaoui, H.; Bur, D.; Clozel, M.; Fischli, W.; Jenck, F.;
Mueller, C.; Nayler, O.; Sifferlen, T.; Treiber, A.; Weller, T. Tetrahydroisoquinolines
as orexin receptor antagonists: Strategies for lead optimization by solution-phase
chemistry. Chimia 2003, 57, 270−275.
[83] Brisbare-Roch, C.; Dingemanse, J.; Koberstein, R.; Hoever, P.; Aissaoui, H.;
Flores, S.; Mueller, C.; Nayler, O.; van Gerven, J.; de Haas, S. L.; Hess, P.; Qiu, C.;
Buchmann, S.; Scherz, M.; Weller, T.; Fischli, W.; Clozel, M.; Jenck, F. Promotion
of sleep by targeting the orexin system in rats, dogs, and humans. Nat. Med. 2007,
13, 150−155.
[84] The sleep efficacy quoted in all figures is the minimum efficacious dose
reported in the primary literature in all species. This comparative method was
selected due to the variety of methods utilized to depict sleep efficacy in the
literature.
[85] Uslaner, J. M.; Tye, S. J.; Eddins, D. M.; Wang, X.; Fox, S. V.; Savitz, A. T.;
Binns, J.; Cannon, C. E.; Garson, S. L.; Yao, L.; Hodgson, R.; Stevens, J.; Bowlby,
M. R.; Tannenbaum, P. L.; Brunner, J.; Mcdonald, T. P.; Gotter, A. L.; Kuduk, S. D.;
106
Coleman, P. J.; Winrow,
C. J.; Renger, J. J. Orexin receptor antagonists differ from standard sleep drugs by
promoting sleep at doses that do not disrupt cognition. Sci. Transl. Med. 2013, 5,
179ra44.
[86] Stepan, A. F.; Walker, D. P.; Bauman, J.; Price, D. A.; Baillie, T. A.; Kalgutkar,
A. S.; Aleo, M. D. Structural alert/reactive metabolite concept as applied in
medicinal chemistry to mitigate the risk of idiosyncratic drug toxicitiy: A
perspective based on the critical examination of trends in the top 200 drugs
marketed in the United States. Chem. Res. Toxicol. 2011, 24, 1345−1410.
[87] Dingemanse, J.; Hoever, P.; Hoch, M.; Treiber, A.; Wagner- Redeker, W.;
Miraval, T.; Hopfgartner, G.; Shakeri-Nejad, K. Elucidation of the metabolic
pathways and the resulting multiple metabolites of almorexant, a dual orexin
receptor antagonist, in humans. Drug Metab. Dispos. 2013, 41, 1046−1059.
[88] Hoch, M.; van Gorsel, H.; van Gerven, J.; Dingemanse, J. Entryinto- humans
study with ACT-462206, a novel dual orexin receptor antagonist, comparing its
pharmacodynamics with almorexant. J. Clin. Pharmacol. 2014, 54, 979−986.
[89] Boss, C.; Roch-Brisbare, C.; Steiner, M. A.; Treiber, A.; Dietrich, H.; Jenck, F.;
von Raumer, M.; Sifferlen, T.; Brotschi, C.; Heidmann, B.; Williams, J. T.; Aissaoui,
H.; Siegrist, R.; Gatfield, J. Structureactivity relationship, biological, and
pharmacological characterization of the proline sulfonamide ACT-462206: A potent,
brain-penetrant dual orexin 1/orexin 2 receptor antagonist. ChemMedChem 2014,
9, 2486−2496.
[90] Stachulski, A. V.; Baillie, T. A.; Park, B. K.; Obach, R. S.; Dalvie, K.; Williams,
D. P.; Srivastava, A.; Regan, S. L.; Antoine, D. J.; Goldring, C. E. P.; Chia, A. J. L.;
Kitteringham, N. R.; Randle, L. E.; Callan, H.; Castrejon, J. L.; Farrell, J.; Naisbitt,
D. J.; Lennard, M. S.
The generation, detection, and effects of reactive drug metabolites. Med. Res. Rev.
2013, 33, 985−1080.
[91] Di Fabio, R.; Pellacani, A.; Faedo, S.; Roth, A.; Piccoli, L.; Gerrard, P.; Porter,
R. A.; Johnson, C. N.; Thewlis, K.; Donati, D.; Stasi, L.; Spada, S.; Stemp, G.; Nash,
D.; Branch, C.; Kindon, L.;
Massagrande, M.; Poffe, A.; Braggio, S.; Chiarparin, E.; Marchioro, C.; Ratti, E.;
107
Corsi, M. Discovery process and pharmacological characterization of a novel dual
orexin 1 and orexin 2 receptor antagonist useful for treatment of sleep disorders.
Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21,
5562−5567.
[92] Branch, C. L.; Johnson, C. N.; Stemp, G.; Thewlis, K. Preparation of
piperidines as orexin receptor antagonists. WO 2001096302, December 20, 2001.
[93] Vitaku, E.; Smith, D. T.; Njardarson, J. T. Analysis of the structural diversity,
substitution patterns, and frequency of nitrogen heterocycles among U.S. FDA
approved pharmaceuticals. J. Med. Chem. 2014, 57, 10257−10274.
[94] Renzulli, C.; Nash, M.; Wright, M.; Thomas, S.; Zamuner, S.; Pellegatti, M.;
Bettica, P.; Boyle, G. Disposition and metabolism of [14C]SB-649868, and orexin
1 and 2 receptor antagonist, in humans. Drug Met. Dispos. 2011, 39, 215−227.
[95] No active clinical investigations are available for SB-649868 on
clinicaltrials.gov. Search performed on May 22, 2015.
[96] Coleman, P. J.; Cox, C. D.; Roecker, A. J. Discovery of dual orexin receptor
antagonists (DORAs) for the treatment of insomnia. Curr. Top. Med. Chem. 2011,
11, 696−725.
[97] Whitman, D. B.; Cox, C. D.; Breslin, M. J.; Brashear, K. M.; Schreier, J. D.;
Bogusky, M. J.; Bednar, R. A.; Lemaire, W.; Bruno, J. G.; Hartman, G. D.; Reiss,
D. R.; Harrell, C. M.; Kraus, R. L.; Li, Y.; Garson, S. L.; Doran, S. M.;
Prueksaritanont, T.; Li, C.; Winrow, C. J.; Koblan, K. S.; Renger, J. J.; Coleman, P.
J. Discovery of a potent, CNSpenetrant orexin receptor antagonist based on an N,N-
disubstituted- 1,4-diazepane scaffold that promotes sleep in rats. ChemMedChem
2009, 4, 1069−1074.
[98] Cox, C. D.; McGaughey, G. B.; Bogusky, M. J.; Whitman, D. B.; Ball, R. G.;
Winrow, C. J.; Renger, J. J.; Coleman, P. J. Conformational analysis of N,N-
disubstituted-1,4-diazepane orexin receptor antagonists and implications for
receptor binding. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009,
19, 2997−3001.
[99] Coleman, P. J.; Schreier, J. D.; Roecker, A. J.; Mercer, S. P.; McGaughey, G.
B.; Cox, C. D.; Hartman, G. D.; Harrell, C. M.; Reiss, D. R.; Doran, S. M.; Garson,
S. L.; Anderson, W. B.; Tang, C.; Prueksaritanont, T.; Winrow, C. J.; Renger, J. J.
108
Discovery of 3,9- diazabicyclo[4.2.1]nonanes as potent dual orexin receptor
antagonists with sleep-promoting activity in the rat. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010,
20, 4201−4205.
[100] Winrow, C. J.; Gotter, A. L.; Cox, C. D.; Doran, S. M.; Tannenbaum, P. L.;
Breslin, M. J.; Garson, S. L.; Fox, S. V.; Harrell, C. M.; Stevens, J.; Reiss, D. R.;
Cui, D.; Coleman, P. J.; Renger, J. J. Promotion of sleep by suvorexant − a novel
dual orexin receptor antagonist. J. Neurogenet. 2011, 25, 52−61.
[101] Cox, C. D.; Breslin, M. J.; Whitman, D. B.; Schreier, J. D.; McGaughey, G.
B.; Bogusky, M. J.; Roecker, A. J.; Mercer, S. P.; Bednar, R. A.; Lemaire, W.; Bruno,
J. G.; Reiss, D. R.; Harrell, C. M.; Murphy, K. L.; Garson, S. L.; Doran, S. M.;
Prueksaritanont, T.; Anderson, W. B.; Tang, C.; Roller, S.; Cabalu, T. D.; Cui, D.;
Hartman, G. D.; Young, S. D.; Koblan, K. S.; Winrow, C. J.; Renger, J. J.; Coleman,
P. J. Discovery of the dual orexin receptor antagonist [(7R)- 4-(5-chloro-1,3-
benzoxazol-2-yl)-7-methyl-1,4-diazepan-1-yl][5-methyl-2-(2H-1,2,3-triazol-2-
yl)phenyl]methanone (MK-4305) for the treatment of insomnia. J. Med. Chem.
2010, 53, 5320−5332.
[102] McGaughey, G.; Bayly, C. I.; Cox, C. D.; Schreier, J. D.; Breslin, M. J.;
Bogusky, M. J.; Pitzenberger, S.; Ball, R.; Coleman, P. J. Shaping suvorexant:
Application of experimental and theoretical methods for driving synthetic designs.
J. Comput.-Aided Mol. Des. 2014, 28, 5−12.
[103] Yin, J.; Mobarec, J. C.; Kolb, P.; Rosenbaum, D. M. Crystal structure of the
human OX2 orexin receptor bound to the insomnia drug suvorexant. Nature 2015,
519, 247−250 The PDB accession number for the crystal structure is 4RNB..
[104] Coleman, P. J.; Schreier, J. D.; Cox, C. D.; Breslin, M. J.; Whitman, D. B.;
Bogusky, M. J.; McGaughey, G. B.; Bednar, R. A.; Lemaire, W.; Doran, S. M.; Fox,
S. V.; Garson, S. L.; Gotter, A. L.; Harrell, C. M.; Reiss, D. R.; Cabalu, T. D.; Cui,
D.; Prueksaritanont, T.; Stevens, J.; Tannenbaum, P. L.; Ball, R. G.; Stellabott, J.;
Young, S. D.; Hartman, G. D.; Winrow, C. J.; Renger, J. J. Discovery of [2R,5R)-
5-{{(5-fluoropyridin-2-yl)oxy]methyl}-2-methylpiperidin-1-yl][5- methyl-2-
(pyrimidin-2-yl)phenyl]methanone (MK-6096): A dual orexin receptor antagonists
with potent sleep-promoting properties. ChemMedChem 2012, 7, 415−424.
[105] Winrow, C. J.; Gotter, A. L.; Cox, C. D.; Tannenbaum, P. L.; Garson, S. L.;
109
Doran, S. M.; Breslin, M. J.; Schreier, J. D.; Fox, S. V.; Harrell, C. M.; Stevens, J.;
Reiss, D. R.; Cui, D.; Coleman, P. J.; Renger, J. J. Pharmacological characterization
of MK-6096 − A dual orexin receptor antagonist for insomnia. Neuropharmacology
2012, 62, 978−987.
[106] Steiner, M. A.; Gatfield, J.; Brisbare-Roch, C.; Dietrich, H.; Treiber, A.; Jenck,
F.; Boss, C. Discovery and characterization of ACT- 335827, an orally available,
brain penetrant orexin receptor type 1 selective antagonist. ChemMedChem 2013,
8, 898−903.
[107] Roecker, A. J.; Mercer, S. P.; Bergman, J. M.; Gilbert, K. F.; Kuduk, S. D.;
Harrell, C. M.; Garson, S. L.; Fox, S. V.; Gotter, A. L.; Tannenbaum, P. L.;
Prueksaritanont, T.; Cabalu, T. D.; Cui, D.; Lemaire, W.; Winrow, C. J.; Renger, J.
J.; Coleman, P. J. Discovery of diazepane amide DORAs and 2-SORAs enabled by
exploration of isosteric quinazoline replacements. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015,
DOI: 10.1016/j.bmcl.2014.12.081.
[108] Raheem, I. T.; Breslin, M. J.; Bruno, J.; Cabalu, T. D.; Cooke, A.; Cox, C. D.;
Cui, D.; Garson, S.; Gotter, A. L.; Fox, S. V.; Harrell, C. M.; Kuduk, S. D.; Lemaire,
W.; Prueksaritanont, T.; Renger, J. J.; Stump, C.; Tannenbaum, P. L.; Williams, P.
D.; Winrow, C. D.; Coleman, P. J. Discovery of piperidine ethers as selective orexin
receptor antagonists (SORAs) inspired by filorexant. Bioorg. Med. Chem. Lett.
2015, 25, 444−450.
[109] Kuduk, S. D.; Skudlarek, J. W.; DiMarco, C. N.; Bruno, J. G.; Pausch, M. A.;
O’Brien, J. A.; Cabalu, T. D.; Stevens, J.; Brunner, J.; Tannenbaum, P. L.; Garson,
S. L.; Savitz, A. T.; Harrell, C. M.; Gotter, A. L.; Winrow, C. J.; Renger, J. J.;
Coleman, P. J. Identification of MK- 8133: An orexin-2 selective receptor
antagonist with suitable development properties. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015,
25, 2488− 2492.
[110] Mercer, S. P.; Roecker, A. J.; Garson, S.; Reiss, D. R.; Harrell, C. M.; Murphy,
K. L.; Bruno, J. G.; Bednar, R. A.; Lemaire, W.; Cui, D.; Cabalu, T. D.; Tang, C.;
Prueksaritanont, T.; Hartman, G. D.; Young, S. D.; Winrow, C. J.; Renger, J. J.;
Coleman, P. J. Discovery of 2,5- diarylnicotinamides as selective orexin-2 receptor
antagonists (2- SORAs). Bioorg. Med. Chem. Lett. 2013, 23, 6620−6624.
[111] Di, L.; Rong, H.; Feng, B. Demystifying brain penetration in central nervous
110
system drug discovery. J. Med. Chem. 2013, 56, 2−12.
[112] Roecker, A. J.; Mercer, S. P.; Schreier, J. D.; Cox, C. D.; Fraley, M. E.; Steen,
J. T.; Lemaire, W.; Bruno, J. G.; Harrell, C. M.; Garson, S. L.; Gotter, A. L.; Fox, S.
V.; Stevens, J.; Tannenbaum, P. L.; Prueksaritanont, T.; Cabalu, T. D.; Cui, D.;
Stellabott, J.; Hartman, G. D.; Young, S. D.; Winrow, C. J.; Renger, J. J.; Coleman,
P. J. Discovery of 5″-chloro-N-[(5,6-dimethoxypyridin-2-yl)methyl]-2,2′:5′,3″-
terpyridine- 3′-carboxamide (MK-1064): A selective orexin-2 receptor
antagonist (2-SORA) for the treatment of insomnia. ChemMedChem 2014, 9,
311−322.
[113] Roecker, A. J.; Reger, T. S.; Mattern, M. C.; Mercer, S. P.; Bergman, J. M.;
Schreier, J. D.; Cube, R. V.; Cox, C. D.; Li, D.; Lemaire, W.; Bruno, J. G.; Harrell,
C. M.; Garson, S. L.; Gotter, A. L.; Fox, S. V.; Stevens, J.; Tannenbaum, P. L.;
Prueksaritanont, T.; Cabalu, T. D.; Cui, D.; Stellabott, J.; Hartman, G. D.; Young, S.
D.; Winrow, C. J.; Renger, J. J.; Coleman, P. J. Discovery of MK-3697: A selective
orexin 2 receptor antagonist (2-SORA) for the treatment of insomnia.
Bioorg. Med. Chem. Lett. 2014, 24, 4884−4890.
[114] Actelion and GSK Discontinue Clinical Development of Almorexant;
Actelion Pharmaceuticals Ltd.: Allschwil, Switzerland, January 28, 2011;
http://www1.actelion.com/en/our-company/newsand-
events.page?newsId=1483135 (accessed July 27, 2015).
[115] Polysomnography study of MK6096 in patients with primary insomnia
(6096−011). ClinicalTrials.gov; U.S. National Institutes of Health: Bethesda, MD,
2009; https://clinicaltrials.gov/ct2/ results?term=MK-6096&Search=Search
(accessed July 27, 2015).
[116] Hoever, P.; de Haas, S.; Winkler, J.; Schoemaker, R. C.; Chiossi, E.; van
Gerven, J.; Dingemanse, J. Orexin receptor antagonism, a new sleep-promoting
paradigm: An ascending single-dose study with almorexant. Clin. Pharmacol. Ther.
2010, 87, 593−600.
[117] Hoever, P.; Dorffner, G.; Benes, H.; Penzel, T.; Danker-Hopfe, H.; Barbanoj,
M. J.; Pillar, G.; Saletu, B.; Polo, O.; Kunz, D.; Zeitlhofer, J.; Berg, S.; Partinen,
M.; Bassetti, C. L.; Hogl, B.; Ebrahim, I. O.; Holsboer-Trachsler, E.; Bengtsson, H.;
Peker, Y.; Hemmeter, U.-M.; Chiossi, E.; Hajak, G.; Dingemanse, J. Orexin receptor
111
antagonism, a new sleep-enabling paradigm: A proof-of-concept clinical trial. Clin.
Pharmacol. Ther. 2012, 91, 975−985.
[118] Actelion and GlaxoSmithKline Enter Into Exclusive Collaboration to Realise
the Full Potential of Almorexant in Sleep Disorders and Beyond; Drugs.com,
http://www.drugs.com/news/actelion-glaxosmithklineenter-into-exclusive-
collaboration-realise-full-potential-almorexantsleep- 8394.html (accessed July 27,
2015).
[119] The clinical development of almorexant was discontinued on January 28, 201 .
Actelion and GSK Discontinue Clinical Development of Almorexant; Actelion
Pharmaceuticals, Ltd.: Allschwil, January 28, 2011;
http://www1.actelion.com/en/our-company/news-and-events.
page?newsId=1483135 (accessed July 27, 2015).
[120] SB649868 . ClinicalTrials.go; U.S. National Institutes of Health: Bethesda,
MD; https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term= SB649868&Search=Search
(accessed July 27, 2015).
[121] Bettica, P.; Nucci, G.; Pyke, C.; Squassante, L.; Zamuner, S.; Ratti, E.;
Gomeni, R.; Alexander, R. Phase I studies on the safety, tolerability,
pharmacokinetics and pharmacodynamics of SB-649868, a novel dual orexin
receptor antagonist. J. Psychopharmacol. 2012, 26, 1058−1070.
[122] Bettica, P.; Squassante, L.; Zamuner, S.; Nucci, G.; Danker- Hopfe, H.; Ratti,
E. The orexin antagonist SB-649868 promotes and maintains sleep in men with
primary insomnia. Sleep 2012, 8, 1097− 1104.
[123] Ratti, E. GlaxoSmithKline: Investor Update . 2007.
[124] Sun, H.; Kennedy, W. P.; Wilbraham, D.; Lewis, N.; Calder, N.; Li, X.; Ma,
J.; Yee, K. L.; Ermlich, S.; Mangin, E.; Lines, C.; Rosen, L.; Chodakewitz, J.;
Murphy, G. M. Effects of suvorexant, an orexin receptor antagonist, on sleep
parameters measured by polysomnography
in healthy men. Sleep 2013, 36, 259−267.
[125] Herring, W. J.; Snyder, E.; Budd, K.; Hutzelmann, J.; Snavely, D.; Liu, K.;
Lines, C.; Roth, T.; Michelson, D. Orexin receptor antagonism for treatment of
insomnia: A randomized clinical trial of suvorexant. Neurology 2012, 79,
2265−2274.
112
[126] Herring, W. J.; Connor, K. M.; Ivgy-May, N.; Snyder, E.; Liu, K.; Snavely, D.
B.; Krystal, A. D.; Walsh, J. K.; Benca, R. M.; Rosenberg, R.; Sangal, R. B.; Budd,
K.; Hutzelmann, J.; Leibensperger, H.; Froman, S.; Lines, C.; Roth, T.; Michelson,
D. Suvorexant in patients with insomnia: Results from two 3-month randomized
controlled clinical trials. Biol. Psychiatry 2014, 10.1016/j.biopsych.2014.10.003.
[127] Michelson, D.; Snyder, E.; Paradis, E.; Chengan-Liu, M.; Snavely, D. B.;
Hutzelmann, J.; Walsh, J. K.; Krystal, A. D.; Benca, R. M.; Cohn, M.; Lines, C.;
Roth, T.; Herring, W. J. Safety and efficacy of suvorexant during 1-year treatment
of insomnia with subsequent abrupt treatment discontinuation: a phase 3
randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet Neurol. 2014, 13,
461−471.
[128] FDA Approves New Type of Sleep Drug, Belsomra; U.S. Food and Drug
Administration: Silver Spring, MD, August 13, 2014;
http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/ Press
Announcements/ucm409950.htm (accessed July 27, 2015).
[129] Belsomra Highlights of Prescribing Information; Merck & Co., Inc.:
Whitehouse Station, NJ, 2014; https://www.merck.com/
product/usa/pi_circulars/b/belsomra/belsomra_pi.pdf (accessed July
27, 2015).
[130] Sun, H.; Brown, K.; Calder, N.; Li, X.; Yee, K.; Perlstein, I.; Wilbraham, D.;
Rosen, L.; Chodakewitz, J.; Wagner, J.; Murphy, M. G. MK-6096, a dual orexin
receptor antagonist, enhances sleep onset and maintenance as measured by PSG in
healthy male subjects. Sleep Biol. Rhythms 2011, 9, 334.
[131] Search on MK-6096 . ClinicalTrails.gov; U.S. National Institutes of Health:
Silver Spring, MD; https://clinicaltrials.gov/ct2/ results?term=MK-
6096&Search=Search (accessed July 27, 2015).
[132] Chabi, A.; Zhang, Y.; Jackson, S.; Cady, R.; Lines, C.; Herring, W. J.; Connor,
K. M.; Michelson, D. Randomized controlled trial of the orexin receptor antagonist
filorexant for migraine prophylaxis. Cephalalgia 2015, 35, 379−388.
[133] Hoch, M.; van Gorsel, H.; van Gerven, J.; Dingemanse, J. Entryinto- humans
study with ACT-462206, a novel dual orexin receptor antagonist, comparing its
pharmacodynamics with almorexant. J. Clin. Pharmacol. 2014, 54, 979−986.
113
[134] Terauchi, T. Discovery of a novel and potent dual orexin 1/ orexin 2 receptor
antagonist, E2006, for the treatment of sleep disorders. 249th ACS National
Meeting and Exposition, Denver, CO, March 22−26, 2015, MEDI-24.
[135] This manuscript was published concomitant with the submission of this
perspective: Yoshida, Y.; Naoe, Y.; Terauchi, T.; Ozaki, F.; Doko, T.; Takemura, A.;
Tanaka, T.; Sorimachi, K.; Beuckmann, C. T.; Suzuki, M.; Ueno, T.; Ozaki, S.;
Yonaga, M. Discovery of (1R,2S)-2-{[(2,4-dimethylpyrimidin-5-yl)oxy]methyl}-
2-(3-fluorophenyl)-N-(5-fluoropyridin-2 yl)cyclopropanecarboxamide (E2006): A
potent and efficacious oral orexin receptor antagonist. J.
Med. Chem. 2015, 58, 4648−4664.
[136] Coleman, P. J.; Cox, C. D.; Breslin, M. J.; Schreier, J. D.; Roecker, A. J.;
Whitman, D. B.; Mercer, S. M.; Tannenbaum, P. L.; Gotter, A. L.; Garson, S. L.;
Fox, S. V.; Harrell, C. M.; Stevens, J.; Doran, S. M.; Reiss, D. R.; Lemaire, W.;
Bruno, J. J.; Cabalu, T. D.; Cui, D.; Prueksaritanont, T.; Young, S. D.; Hartman, G.
D.; Winrow, C. J.; Renger, J. J. Discovery and characterization of OX2R/OX1R and
OX2R antagonists for the treatment of sleep disorders. 248th ACS National
Meeting and Exposition, San Francisco, CA, August 10−14, 2014, MEDI-334.
[137] Preclinical DORA/2-SORA efficacy differentiation remains a controversial
topic. For details on the controversy, see: (a) Moriarty, S. R.; Revel, F. G.; Malherbe,
P.; Moreau, J.-L.; Valladao, D.; Wettstein, J. G.; Kilduff, T. S.; Borroni, E. Dual
hypocretin receptor antagonism is more effective for sleep promotion than
antagonism of either receptor alone. PLoS One 2012, 7, e39131. (b) Dugovic, C.;
Shelton, J. E.; Yun, S.; Bonaventure, P.; Shireman, B. T.; Lovenberg, T. W. Orexin-
1
receptor blockade dysregulates REM sleep in the presence of orexin-2 receptor
antagonism. Front. Neurosci. 2014, 8, doi: 10.3389/ fnins.2014.00028.
[138] (a) Letavic, M. A.; Bonaventure, P.; Ly, K. S.; Aguilar, Z.; Aluisio, L.;
Carruthers, N. I.; Chaplan, S.; Dugovic, C.; Halter, R.; Kudriakova, T.; Lord, B.;
Lovenberg, T. W.; Kramer, M.; Morton, K. L.; Ndifor, A.; Rizzolio, M.; Shah, C.;
Shelton, J. Shoblock, J.; Sutton, S. Discovery of JNJ-42847922, a selective orexin-
2 antagonist for the treatment of insomnia disorder. 249th ACS National Meeting
and Exposition, Denver, CO, March 22−26, 2015, MEDI-244. (b) This manuscript
114
was published concomitant with the submission of this perspective: Letavic, M. A.;
Bonaventure, P.; Carruthers, N. I.; Dugovic, C.; Koudriakova, T.; Lord, B.;
Lovenberg, T. W.; Ly, K. S.; Mani, N. S.; Nepomuceno, D.; Pippel, D. J.; Rizzolio,
M.; Shelton, J. E.; Shah, C. R.; Shireman, B. T.; Young, L. K.; Yun, S. Novel
octahydropyrrolo[3,4-c]pyrroles are selective orexin-2 antagonists: SAR leading to
a clinical candidate. J. Med. Chem. 2015, 58, 5620− 5636.
[139] Dauvilliers, Y.; Arnulf, I.; Mignot, E. Narcolepsy with cataplexy. Lancet 2007,
369, 499−511.
[140] Willie, J. T.; Chemelli, R. M.; Sinton, C. M.; Tokita, S.; Williams, S. C.;
Kisanuki, Y. Y.; Marcus, J. N.; Lee, C.; Elmquist, J. K.; Kohlmeier, K. A.; Leonard,
C. S.; Richardson, J. A.; Hammer, R. E.; Yanagisawa, M. Distinct narcolepsy
syndromes in orexin receptor 2 and orexin null mice: molecular genetic dissection
of non-REM and REM sleep regulatory processes. Neuron 2003, 38, 715−730.
[141] Hasegawa, E.; Yanagisawa, M.; Sakurai, T.; Mieda, M. Orexin neurons
suppress narcolepsy via 2 distinct efferent pathways. J. Clin. Invest. 2014, 124,
604−616.
[142] (a) Boss, C.; Roch, C. Recent trends in orexin research 2010−2015. Bioorg.
Med. Chem. Lett. 2015, 25, 2875−2887. (b) Lebold, T. P.; Bonaventure, P.;
Shireman, B. T. Selective orexin receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Lett.
2013, 23, 4761−4769. (c) Boss, C.; Brisbare-Roch, C.; Jenck, F. Biomedical
application of orexin/hypocretin receptor ligands in neuroscience. J. Med. Chem.
2009, 52,891−903.
[143] Nishino, S.; Ripley, B.; Overeem, S.; Lammers, G. J.; Mignot, E. Hypocretin
(orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet 2000,355, 39−40.
[144] Kubota, H.; Kanbayashi, T.; Tanabe, Y.; Ito, M.; Takanashi, J.; Kohno, Y.;
Shimizu, T. Decreased cerebrospinal fluid hypocretin-1 levels near the onset of
narcolepsy in 2 prepubertal children. Sleep 2003, 26, 555−557.
[145] Peyron, C.; Faraco, J.; Rogers, W.; Ripley, B.; Overeem, S.; Charnay, Y.;
Nevsimalova, S.; Aldrich, M.; Reynolds, D.; Albin, R.; Li, R.; Hungs, M.;
Pedrazzoli, M.; Padigaru, M.; Kucherlapati, M.; Fan, J.; Maki, R.; Lammers, G. J.;
Bouras, C.; Kucherlapati, R.; Nishino, S.; Mignot, E. A mutation in a case of early
onset narcolepsy and a generalized absence of hypocretin peptides in
115
humannarcoleptic brains. Nat. Med. 2000, 6, 991−997.
[146] Thannickal, T. C.; Moore, R. Y.; Nienhuis, R.; Ramanathan, L.; Gulyani, S.;
Aldrich, M.; Cornford, M.; Siegel, J. M. Reduced number of hypocretin neurons in
human narcolepsy. Neuron 2000, 27, 469−474.
[147] Mahlios, J.; De la Herran-Arita, A. K.; Mignot, E. The autoimmune basis of
narcolepsy. Curr. Opin. Neurobiol. 2013, 23, 767−773.
[148]Liu, M.; Thankachan, S.; Kaur, S.; Begum, S.; Blanco-Centurion, C.; Sakurai,
T.; Yanagisawa, M.; Neve, R.; Shiromani, P. J. Orexin (hypocretin) gene transfer
diminishes narcoleptic sleep behavior in mice. Eur. J. Neurosci. 2008, 28,
1382−1393.
[149] Blanco-Centurion, C.; Liu, M.; Konadhode, R.; Pelluru, D.; Shiromani, P. J.
Effects of orexin gene transfer in the dorsolateral pons in orexin knockout mice.
Sleep 2013, 36, 31−40. Journal of Medicinal Chemistry Featured Article
[150] Kastin, A. J.; Akerstrom, V. Orexin A but not orexin B rapidly enters brain
from blood by simple diffusion. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999, 289, 219−223.
[151] Vogel, V.; Sanchez, C.; Jennum, P. EEG measurements by means of
radiotelemetry after intracerebroventricular (ICV) cannulation in rodents. J.
Neurosci. Methods 2002, 118, 89−96.
[152] Mieda, M.; Hasegawa, E.; Kisanuki, Y. Y.; Sinton, C. M.; Yanagisawa, M.;
Sakurai, T. Differential roles of orexin receptor-1 and −2 in the regulation of non-
REM and REM sleep. J. Neurosci. 2011, 31, 6518−6526.
[153] Andlauer, O.; Moore, H., 4th; Hong, S. C.; Dauvilliers, Y.; Kanbayashi, T.;
Nishino, S.; Han, F.; Silber, M. H.; Rico, T.; Einen, M.;Kornum, B. R.; Jennum, P.;
Knudsen, S.; Nevsimalova, S.; Poli, F.; Plazzi, G.; Mignot, R. Predictores of
hypocretin (orexin) deficiency in narcolepsy without cataplexy. Sleep 2012, 35,
1247−1255F.
[154] Funato, H.; Tsai, A. L.; Willie, J. T.; Kisanuki, Y.; Williams, S. C.; Sakurai,
T.; Yanagisawa, M. Enhanced orexin receptor-2 signaling prevents diet-induced
obesity and improves leptin sensitivity. Cell Metab. 2009, 9, 64−76.
[155] Nishino, S.; Ripley, B.; Overeem, S.; Nevsimalova, S.; Lammers, G. J.;
Vankova, J.; Okun, M.; Rogers, W.; Brooks, S.; Mignot, E. Low cerebrospinal fluid
hypocretin (Orexin) and altered energy homeostasis in humannarcolepsy. Ann.
116
Neurol. 2001, 50, 381−388.
[156] Nishino, S. Clinical and neurobiological aspects of narcolepsy. Sleep Med.
2007, 8, 373−399.
[157] Nagahara, Takashi; Saitoh, Tsuyoshi; Kutsumura, Noriki; Irukayama-To-
mobe, Yoko; Ogawa, Yasuhiro; Kuroda, Daisuke; Gouda, Hiroaki; Kumagai, Hide-
toshi; Fujii, Hideaki; Yanagisawa, Masashi; Masashi Yanagisawa and Nagase Hi-
roshi Design and Synthesis of Non-Peptide, Selective Orexin Receptor 2 Agonists,
J. Med. Chem. 2015, 58(20), 7931-7937
[158] Pieper, A. A.; Xie, S.; Capota, E.; Estill, S. J.; Zhong, J.; Long, J. M.; Becker,
G. L.; Huntington, P.; Goldman, S. E.; Shen, C. H.; Capota, M.; Britt, J. K.; Kotti,
T.; Ure, K.; Brat, D. J.; Williams, N. S.; MacMillan, K. S.; Naidoo, J.; Melito, L.;
Hsieh, J.; De Brabander, J.; Ready, J. M.; McKnight, S. L. Discovery of a
proneurogenic, neuroprotective chemical. Cell 2010, 142, 39−51.
[159] Yin, J.; Mobarec, J. C.; Kolb, P.; Rosenbaum, D. M. Crystal structure of the
human OX2 orexin receptor bound to the insomnia drug suvorexant. Nature 2015,
519, 247−250.
[160] Cox, C. D.; Breslin, M. J.; Whitman, D. B.; Schreier, J. D.; McGaughey, G.
B.; Bogusky, M. J.; Roecker, A. J.; Mercer, S. P.; Bednar, R. A.; Lemaire, W.; Bruno,
J. G.; Reiss, D. R.; Harrell, C. M.; Murphy, K. L.; Garson, S. L.; Doran, S. M.;
Prueksaritanont, T.; Anderson, W. B.; Tang, C.; Roller, S.; Cabalu, T. D.; Cui, D.;
Hartman, G. D.; Young, S. D.; Koblan, K. S.; Winrow, C. J.; Renger, J. J.; Coleman,
P. J. Discovery of the dual orexin receptor antagonist [(7R)-4-(5-chloro-1,3-
benzoxazol-2-yl)-7-methyl-1,4-diazepan-1-yl][5-methyl-2-(2H-1,2,3-triazol-2-
yl)phenyl]methanon (MK-4305) for the treatment of insomnia. J. Med. Chem. 2010,
53, 5320−5332.
[161] Winrow, C. J.; Gotter, A. L.; Cox, C. D.; Doran, S. M.; Tannenbaum, P. L.;
Breslin, M. J.; Garson, S. L.; Fox, S. V.; Harrell, C. M.; Stevens, J.; Reiss, D. R.;
Cui, D.; Coleman, P. J.; Renger, J. J. Promotion of sleep by suvorexant − A novel
dual orexin receptor antagonist. J. Neurogenet. 2011, 25, 52−61.