UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2014 – 2015
Essentiële stappen in het proces van invriezen hengsten sperma
Door
Suzanne MOOREN
Promotoren: Prof. Dr. Peter Daels Literatuurstudie in het kader
Kim Roels van de Masterproef
© 2015 Suzanne Mooren
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de
juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze
masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of
verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de
masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de
masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2014 – 2015
Essentiële stappen in het proces van invriezen hengsten sperma
Door
Suzanne MOOREN
Promotoren: Prof. Dr. Peter Daels Literatuurstudie in het kader
Kim Roels van de Masterproef
© 2015 Suzanne Mooren
VOORWOORD
Als eerste wil ik graag Prof. Dr. Peter Daels en Kim Roels bedanken voor het begeleiden, nakijken en
tot een goed resultaat brengen van dit werk.
Dierenarts Rijk-Jan Pleijter wil ik graag bedanken voor de dag stage bij een hengstenhouderij. Dit
heeft het voor mij mogelijk gemaakt om het onderwerp van deze masterproef beter voor te kunnen
stellen in praktijk.
Mijn ouders, Karin van Dort & Hans Mertens, wil ik bedanken voor het nalezen van dit werk en hun al
hun steun door de jaren heen.
Als laatste wil ik dit werk opdragen aan een mogelijk toekomstig fries veulen. Het toeval heeft besloten
om mij bij een hengstenshow de gelukkige winnaar te maken van een gratis dekking. Weliswaar met
gekoeld sperma, maar dat mag de pret niet drukken.
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING…………………………………………………………………………….…………… 1
INLEIDING……………………………………………………………………….………………………… 2
1. Algemeen……………………………………………………………………………………………….. 2
1.1. Basisprincipes invriezen/ontdooien cellen………………………………………………….…. 2
1.1.1. Celmembraan…………………………………………………….………………………… 2
1.1.2. Celmetabolisme…………………………………………………………………...……….. 3
1.1.3. Osmotische stress en dehydratatie.…………………………………………….………... 3
1.1.4. Ijskristalvorming…………………………………………………………………...………... 3
1.1.5. Cryoprotectantia…………………………………………………………………...……….. 3
1.2. Invloed op de spermacel van de hengst……………………………………………………….. 4
1.2.1. Complexiteit van de spermatozoa……………………………………………………….. 4
1.2.2. Afkoelen van sperma………………………………………………………………………. 4
1.2.3. Fysico-chemische omgeving van de spermatozoa tijdens invriezen en ontdooien…. 5
1.2.4. Oxidatieve stress…………………………………………………………………………… 5
1.2.5. Premature capacitatie en acrosoom reactie…………………………………………….. 5
1.2.6. Weinig ijskristalvorming intracellulaire bij snel invriezen…………………………….… 6
1.3. Kunstmatige inseminatie met ingevroren sperma bij paarden…..………………………..… 7
1.3.1. Geschiedenis van kunstmatige inseminatie met ingevroren sperma…..…………..… 7
1.3.2. Voordelen van ingevroren sperma…..…………………..…………………..………..… 7
1.3.3. Nadelen van ingevroren sperma………….…………………..……………………….… 8
2. Collectie van het ejaculaat…………………………….………………………………….……….…. 8
2.1. Voorbereiding…………………………...……….………………………………….……….… 8
2.1.1. Dekruimte………………………………….………………………………….……….…. 8
2.1.2. Seksuele stimulatie en libido…………………………….………………….……….…. 8
2.1.3. Collectie interval van de sperma-afname…………………………….……………….. 8
2.1.4. Aandachtspunten voor en tijdens de sperma-afname…………….…………….…… 8
2.2. Sperma-afname…………………………...……….………………………………….………… 9
2.2.1. Kunstmatige vagina…………………………...……….………………………………… 9
2.2.2. Verloop van de dekking…………………………...……….………………………….… 10
2.2.3. Uitgestelde invriezing van sperma…………………………...…………………….…... 10
2.3. Beoordeling ejaculaat en spermakwaliteit…………………………...…………………….…. 10
2.3.1. Macroscopische evaluatie ejaculaat…………………………...……….……………… 10
2.3.2. Microscopische evaluatie ejaculaat…………………………...……….……….……… 11
3. Invriezingsprocedures…………………………...……….………………………………………….… 11
3.1. Testen voorafgaand aan het invriesseizoen…………………………...……….……………... 11
3.1.1. Meting van de testis…………………………...……….……………………………….….. 11
3.1.2. Testen op een geschikt invriesprotocol……………………………………………….….. 12
3.2. Verwerken ejaculaat………………………………..………………………………………….… 13
3.2.1. Verdunnen vers ejaculaat………………………………..……………..…………………. 13
3.2.2. Concentreren van het sperma………………………………..……..…………………….. 14
3.2.3. Toevoegen van cryoprotectant………………………………..………..…………………. 14
3.2.4. Verpakken………………………………..……………..…………………………………… 15
3.2.5. Koelen………………………………..……………..……………………………………….. 15
3.3. Invriezen van het sperma………………………………..……………..……………………….. 15
3.4. Ontdooien van ingevroren sperma……………………………..……………..………………... 16
3.4.1. Protocol opwarmen………………………………..……………..………………………… 16
3.4.2. Evaluatie ontdooide sperma………………………………..……………..………………. 17
4. Bewaring en transport van ingevroren sperma………………………………..……………………. 17
5. Factoren die een invloed hebben op de spermakwaliteit………………………………..………… 19
5.1. Intrinsieke factoren die de spermakwaliteit beïnvloeden…………………..………………… 19
5.1.1. Leeftijd……………………………..……………..…………………………………………. 19
5.1.2. Genetica: individuele gevoeligheid van de hengst voor het invriezingsproces……… 19
5.1.3. Seizoen……………………………..……………..…………………………..................... 19
5.2. Hygiëne……………………………..……………..……………………………………………… 20
5.2.1. Contaminatie met micro-organismen……………………………..……………………… 20
5.2.2. Hygiëne van het personeel, materiaal en laboratorium………………………………… 20
5.2.3. Hygiëne van de hengst……………………………..……………..……………… ………. 20
5.2.4. Overdraagbare ziektes met ingevroren sperma……………………………..………….. 21
5.2.5. Desinfectie van het ejaculaat……………………………..……………..………………… 21
5.3. Management……………………………..……………..………………………………………… 22
5.3.1. Stalling……………………………..……………..…………………………………………. 22
5.3.2. Bioveiligheid……………………………..……………..…………………………………… 22
5.3.3. Seksuele rust……………………………..……………..…………………………………...22
5.3.4. Intratesticulare temperatuur……………………………..……………..…………………. 22
5.3.5. Stress en effect van inspanning…………………..……………..……………………….. 23
BESPREKING……………………………..……………..………………………………………………... 24
REFERENTIELIJST……………………………..……………..…………………………………………. 25
1
SAMENVATTING
Het doel van deze masterproef is om de essentiële stappen in het proces van invriezen van
hengstensperma weer te geven. Dit betreft niet enkel het invriesproces op zich, maar ook de invloed
eromheen die belangrijk is om een goed eindresultaat te bereiken.
Het invriezen veroorzaakt schade aan de spermatozoa door de vorming van ijskristallen, verstoring
van het metabolisme, osmotische- en oxidatieve stress. Deze schade tast de vruchtbaarheid aan of
kan de cel afdoden. Tijdens het afkoelen kan er al schade optreden. Vooral tussen 19 en 8°C is de
kans groot op koude-shock en om dit te voorkomen moet er langzaam gekoeld worden. Sperma wordt
om de 48 uur afgenomen en voor een optimale kwaliteit gebeurd deze afname tijdens de eerste
dekking. Direct het ejaculaat evalueren is nodig om te berekenen hoeveel rietjes er geproduceerd
kunnen worden. Het wordt afgeraden om sperma in te vriezen als het verse sperma < 35% progressief
motiele en/of <40% morfologisch normale spermatozoa bevat. Zodra de temperatuur onder de -130°C
komt, ligt het metabolisme stil en bij bewaring aan -196°C is het sperma onbeperkt houdbaar.
Invriesprotocollen zullen de negatieve effecten tijdens invriezen zo laag mogelijk proberen te houden.
Verdunners beschermen tegen de schadelijke effecten van seminaal plasma, stabiliseren de
plasmamembraan, bevatten nutriënten en antibiotica. Centrifugatie gebeurt om de spermatozoa
concentratie te verhogen en het aandeel seminaal plasma te verlagen tot 5 à 20%. Cryoprotectantia
zorgen ervoor dat de spermatozoa het invriesproces beter overleven. Juiste verpakking, omgang,
transport en ontdooiing met het ingevroren sperma is nodig om de kwaliteit stabiel te houden.
Afhankelijk van individuele factoren van de hengst en het invriesprotocol zal maximaal 60% van de
spermatozoa het invriezen overleven. Ten slotte zijn er nog een aantal factoren die invloed hebben op
de spermakwaliteit waar men veel (management, hygiëne) of weinig (leeftijd, seizoen, genetica)
invloed op heeft.
Key words: Cryoinjury - Freezing protocol - Frozen semen - Semen quality - Stallion
2
INLEIDING
Het percentage merries die geïnsemineerd worden met bevroren sperma, verschilt tussen de
Europese landen, doch is het gebruik van ingevroren sperma in alle Europese landen proportioneel
lager dan dat van gekoeld sperma1. De individuele variatie van invriesbaarheid van hengstensperma
en de lange cyclus van de merrie belemmeren een wijdverspreid gebruik van diepvriessperma2,3.
Desalniettemin heeft ingevroren sperma in belang van de reproductie een belangrijke plaats
verworven4,5. Bevroren sperma van de hengst kan namelijk voor onbepaald lange tijd opgeslagen
worden4,5,6. Tijdens het invriezen zullen spermatozoa te maken krijgen met dehydratatie die ontstaat
door ijskristalvorming en alle daaraan gekoppelde negatieve effecten7. Veel spermatozoa zullen
beschadigd worden en zullen na ontdooiing een kortere overlevingsduur hebben3,8. Om acceptabele
drachtpercentages te bereiken is het belangrijk dat de vruchtbaarheid van het sperma optimaal is 3,8,9.
Dit kan bereikt worden met een goede kwaliteit sperma die, door op de juiste manier met het sperma
om te gaan, na het invriezen nog steeds een goede bevruchtingscapaciteit bevat. De mensen die het
sperma verwerken en dierenartsen in het bijzonder, zijn best op de hoogte van de stappen waar
spermatozoa aan onderworpen worden tijdens invriezen en de factoren die de spermakwaliteit
beïnvloeden.
Deze masterproef zal eerst de basisprincipes van invriezen van cellen, de invloed op de spermacel en
de rol van kunstmatige inseminatie bespreken. Hierna wordt ingegaan op de collectie van het
ejaculaat waar het belang van een goede voorbereiding, de stappen van sperma-afname en de
evaluatie nadien van het ejaculaat worden uitgelegd. Aan het begin van het fokseizoen of bij een
nieuwe hengst zal het sperma getest worden op verschillende parameters en kan ook getest worden
welke invriesprocedure het beste is. Bij het ontdooien, bewaren en transporteren, moet er ook strikt
aan de voorgeschreven stappen voldaan worden, anders gaat de bevruchtingscapaciteit van het
sperma sterk achteruit. Ten slotte zullen de factoren die een invloed hebben op de spermakwaliteit
besproken worden.
LITERATUURSTUDIE
1. ALGEMEEN
1.1. BASISPRINCIPES INVRIEZEN/ONTDOOIEN CELLEN
Door cellen in te vriezen worden ze blootgesteld aan aanzienlijke temperatuurverschillen die schade
kunnen veroorzaken op morfologisch en functioneel vlak10,11.
1.1.1. Celmembraan
De celmembraan ondergaat fysieke verandering tijdens het afkoelen9. Denaturatie van proteïnen komt
door een reversibele of irreversibele verstoring van de secundaire structuur bij afkoeling tussen 20 tot
0°C12. Zodra een bepaalde temperatuur (faseovergangstemperatuur) overschreden wordt, zal de
membraan van een vloeibare structuur veranderen naar een gelstructuur9,12. Deze
faseovergangstemperatuur voor cellen is afhankelijk van de hoeveelheid water die de cel bevat en van
de membraansamenstelling (verzadigde/onverzadigde fosfolipiden)12. Tijdens de afkoeling of
opwarming zullen lipiden en proteïnen zich herschikken9. Hierdoor kunnen er defecten ontstaan
tussen membraanproteïnen en de lipidenlaag die een verhoogde membraanpermeabiliteit voor ionen
creëeren12. Dit proces verzwakt de celmembraan en verlaagt het vermogen van integrale eiwitten om
de intracellulaire elektrolyten te reguleren12. Hierdoor kan er schade optreden aan de membraan en/of
3
de metabole functies waardoor na opwarmen de spermatozoa geen motiliteit meer vertonen13. Dit
fenomeen wordt “koude-shock” (“cold shock”) genoemd9,12,13.
1.1.2. Celmetabolisme
Het metabolisme van een cel is onder andere afhankelijk van de temperatuur. Een algemene regel is
dat elke temperatuurdaling van 10°C, het metabolisme van een cel voor de helft reduceert9. Voor
gekoeld sperma bij 5°C betekent dit een metabolisme van 10% van het origineel9. Het actieve
ionentransport van de membraan zal bij verlaging van de temperatuur minder efficiënt plaatsvinden12.
Zodra de temperatuur van een cel onder de -130°C komt, zijn er geen chemische reacties meer
mogelijk en ligt het metabolisme volledig stil13.
1.1.3. Osmotische stress en dehydratatie
Tijdens het invriezen, ontdooien, toevoegen en verwijderen van cryoprotectantia ondergaan cellen
grote verschillen in osmotische gradiënten, “osmotische stress” genoemd14. De extracellulaire
ijskristallen die aangroeien bij lagere temperatuur zullen een netwerk vormen waarin cellen gevangen
worden in de kanalen van hoog geconcentreerde oplossing9,11,12,15. Cellen zullen krimpen in deze
hyperosmotische omgeving omdat ze water verliezen via poriën en diffusie door de celmembraan
heen9,11,12. De periode en impact van dehydratatie wordt bepaald door de snelheid van invriezen9.
Langzaam invriezen geeft een langere blootstelling aan de steeds hoger wordende osmolariteit van
extracellulaire vloeistof. De cellen zullen een lange periode dehydrateren met cellulaire verstoring tot
gevolg. Deze vriesschade bij gevoelige cellen ten gevolg van blootstelling aan extracellulaire
hypertone vloeistof wordt oplossingseffect (“solution effect”) genoemd11. Snel invriezen leidt tot grote
drukverschillen in osmotische gradiënten aan de intra- en extracellulaire kant van de
plasmamembraan11. Dit kan schade geven aan de membraan en uiteindelijk leiden tot intracellulaire
ijsvorming11. De invriessnelheid moet dusdanig afgestemd zijn dat de cel voldoende tijd krijgt om te
krimpen, maar zonder lange blootstelling aan lethale hypertone concentraties11.
1.1.4. Ijskristalvorming
Tijdens verdere daling van de temperatuur zal er steeds meer water uit de oplossing zich omvormen
tot ijs15. Het overblijvende deel van de oplossing zal hierdoor steeds meer geconcentreerd raken15. Bij
het snel invriezen van cellen kan het intracellulaire water de cel niet op tijd verlaten12. Als het water
onder de faseovergangstemperatuur komt, zal er nucleatie (vorming van microscopisch kleine
ijskristallen onder 0°C in een oplossing119) ontstaan aan de celmembraan of celorganellen met de
vorming van uitgroeiende intracellulaire ijskristallen9,11,12. De vorming van grote ijskristallen kan direct
dodelijk zijn voor door membraanverbreking en uiteenvallen van het cytoskelet11,12. Vorming van
kleinere ijskristallen zijn niet direct dodelijk als deze de celorganellen intact laten. Bij ontdooien
kunnen ze echter gaan herkristalliseren met vorming van schadelijke grote ijskristallen11,12. Het
voorkomen van intracellulaire ijskristalisatie, door de cel langer aan dehydratatie bloot te stellen, kan
als keerzijde osmotische shock geven12. Osmotische shock is het fenomeen waarbij het eiwit
denatureert, lyse van de membraan plaats vindt en er schade optreedt aan kern en mitochondriën12.
1.1.5. Cryoprotectantia
Een cryoprotectant wordt toegevoegd met als doel de cellen te beschermen tegen vriesschade9. Een
cryoprotectant zal de dehydratatie van de celmembraan in de beginfase verlagen, betere dehydratatie
van de cel geven, de wateractiviteit verminderen en de optimale snelheid voor invriezen wijzigen12,14.
Reeds bij kamertemperatuur zullen de cryoprotectantia de conformatie van integrale eiwitten in de
plasmamembraan wijzigen12. Intracellulaire ijskristallen ontstaan al bij -10°C, maar in aanwezigheid
van cryoprotectantia zal deze temperatuur verder onder de -10°C komen te liggen15. Zodra een
4
cryoprotectant toegevoegd of verwijderd wordt, kan door de volumeveranderingen schade aan de
cellen optreden9. Wat deze stoffen allen gemeen hebben, is dat ze een laag moleculair gewicht
hebben12.
Er zijn 2 groepen cryoprotectantia:
1. penetrerend: dringen door tot in het cytoplasma van de cel7. Deze cryoprotectantia verlagen de
elektrolytenconcentratie en voorkomen dat het volume intracellulair hypertoon wordt12. Tot deze
groep behoren glycerol, methanol, ethyleen glycol, 1,2-propaandiol, butaandiol, acetamide en
dimethyl sulfoxide7.
2. niet-penetrerend: blijven extracellulair aanwezig7. Deze stimuleren de dehydratatie van de cel,
verhogen het percentage extracellulaire oplossing en beschermen tegen koude-shock7,12. Tot
deze groep behoren de suikers (raffinose, lactose), polymeren (polyvinyl pyrollidone), eigeel en
magere melk7.
1.2. INVLOED OP DE SPERMACEL VAN DE HENGST
Het vermogen van cellen om het invriesproces te weerstaan en hierbij cellulaire hoofdfuncties te
behouden, zal de kwaliteit van het ingevroren sperma bepalen10.
1.2.1. Complexiteit van de spermatozoa
Theoretische modellen voorspellen hoe spermatozoa zich gedragen tijdens het vries/ontdooiproces10.
De schattingen komen niet helemaal overeen met de werkelijkheid, omdat ze gebaseerd zijn op
volgende veronderstellingen10:
1. Een spermatozoön is een symmetrische bol tot cilinder vorm, gevuld met fysiologische
zoutoplossing.
2. De celmembraan is semipermeabel.
3. De vloeistoffen intra- en extracellulair zijn gebaseerd op ideale oplossingen.
In werkelijkheid is een spermatozoön een haploïde cel met weinig cytoplasma en organellen: enkel de
kern, acrosoom en meerdere mitochondriën, nodig voor energieproductie voor de motiliteit, zijn
duidelijk aanwezig13. Doordat de chromosomen in de kern zeer sterk gecondenseerd zijn, is er geen
transcriptie van eiwitten mogelijk. Hierdoor is de spermacel sterk afhankelijk van de omgeving om in
zijn nutriëntenvoorziening te voldoen13. Het oppervlakte van een spermacel is zeer groot in vergelijking
met zijn inhoud en de smalle cellen hebben een hoge waterpermeabiliteit van de membraan15.
De plasmamembraan is een complexe dynamische structuur van lipiden en fosfolipiden die door een
actief metabolisme in een dubbele laag gerangschikt liggen10. Zowel de interne als externe omgeving
van de spermacel staan met elkaar in contact door proteïnen die in de membraan ingebed liggen10.
Het endoplasmatisch reticulum en het golgi apparaat zijn weinig aanwezig en kunnen maar een kleine
bijdrage leveren voor membraan behoud13. Deze complexe plasmamembraan van de spermacel wordt
beïnvloed door temperatuur10. In de spermacel bevinden zich organellen en proteïnen die met elkaar
in contact staan en ook gevoelig kunnen zijn voor invriezen en ontdooien10. Middels onderzoek is
aangetoond dat een aantal van de intracellulaire signaaltransducties aangetast werden tijdens koelen
en invriezen10.
1.2.2. Afkoelen van sperma
De spermatozoa zijn gevoelig voor temperatuurwijzigingen die plaats vinden tijdens het afkoelen van
lichaamstemperatuur tot het vriespunt13. Verlagen van de temperatuur geeft een ander
distributiepatroon van vloeistoffen door de poriën en kanalen heen10. De lipiden in de
plasmamembraan zullen zich door het verlagen van de temperatuur ook anders herschikken,
waardoor de diffusie door de plasmamembraan verandert10. Van 37 tot 20°C kunnen de spermatozoa
5
snel gekoeld worden16. Tussen 19 en 8°C zijn de spermatozoa zeer gevoelig voor schade door koude-
shock, vooral als er te snel gekoeld wordt. Tussen 8 en 5°C kan er weer snel gekoeld worden16.
1.2.3. Fysico-chemische omgeving van de spermatozoa tijdens invriezen en ontdooien
Tijdens het invriezen zal door de vorming van extracellulair ijs de resterende ijsvrije oplossing steeds
meer in concentratie stijgen14. Hierdoor worden de spermatozoa blootgesteld aan hypertonische
condities14. Om het evenwicht intra- en extracellulair gelijk te houden, zal er water uit de cel
diffunderen met dehydratatie van de spermacel tot gevolg14. Tijdens het ontdooien zal dit proces
omgekeerde plaatsvinden en worden de cellen blootgesteld aan hypotone condities14. Deze hypotone
stress zal opzwelling van de spermatozoa veroorzaken. Dit fenomeen is schadelijker dan het krimpen
van de cel door dehydratatie14.
Spermatozoa zijn zeer klein en bevinden zich in een hoog visceuze oplossing tijdens het invriezen15.
Onderling zullen spermatozoa nauwelijks met elkaar in contact komen, tenzij bij zeer hoge
concentratie spermatozoa en/of lage concentratie glycerol15. De spermatozoa komen vrijwel niet direct
in contact met de vormende ijsmassa, in tegenstelling tot grotere cellen zoals oöcyten en embryo’s.
Hieruit blijkt dat de overleving zal afhangen van de reactie op de hyper- en hypotone omgeving15.
1.2.4. Oxidatieve stress
Zuurstofradicalen worden gevormd als een normaal bijproduct van een oxidatief metabolisme of
worden door cellen zoals leukocyten geproduceerd als reactie op omgevingsstimuli17. De
zuurstofradicalen spelen een belangrijke rol in het normaal functioneren van spermatozoa. Een tekort
of overmaat aan zuurstofradicalen zal echter schade veroorzaken17. In het seminaal plasma zitten
antioxidanten zoals catalase, superoxide dismutase en glutathion peroxidase die beschermen tegen
de negatieve effecten van zuurstofradicalen. Teveel verwijdering van seminaal plasma is daarom zeer
schadelijk voor de spermatozoa. De activiteit van deze antioxidanten verschilt tussen individuele
hengsten17.
Door invriezen verhoogt de concentratie zuurstofradicalen in het ejaculaat door vooral lekkage van
elektronen uit de mitochondriën van de spermatozoa17. De concentratie zuurstofradicalen zal
verhogen als het aantal beschadigde spermatozoa stijgt14,17. Een sensitieve indicator voor oxidatieve
stress is de afname van motiliteit van de spermatozoa zonder aantasting van andere parameters van
het ejaculaat17. Het middenstuk van de spermatozoa wordt namelijk door het invriezen zeer gevoelig
voor oxidatieve schade17.
1.2.5. Premature capacitatie en acrosoom reactie
Invriezen en ontdooien veroorzaken premature capacitatie en acrosoom reactie van spermatozoa en
dit zal leiden tot verlaagde vruchtbaarheid of zelfs het afsterven van de cel18.
Capacitatie van de spermatozoa is een fenomeen waarbij er tijdelijke biochemische veranderingen
optreden die in vivo de interactie met het vrouwelijk voortplantingskanaal mogelijk maakt13.
Veranderingen die optreden tijdens capacitatie zijn13:
- inactiveren decapacitatie-factoren op het oppervlakte van de spermatozoa
- veranderen van integrale proteïnen structuur
- bepaalde proteïnen uit het vrouwelijk voortplantingsstelsel opnemen in de spermatozoa
- veranderingen in lipiden opbouw van de plasmamembraan (cholesterol/fosfolipiden verhouding
verandert)
- andere ionen samenstelling (calcium, natrium en pH verhoging intracellulair)
- productie van zuurstofradicalen, verhoging van het cyclisch adenosinemonofosfaat (CAMP) en
fosforylatie van tyrosine.
6
Bij het invriezen van spermatozoa verandert de samenstelling van de plasmamembraan door verlies
van lipiden tijdens invriezen en ontdooien. Dit gebeurd ook door verlies van decapacitatie-factoren die
in het seminaal plasma zitten en verwijderd worden tijdens centrifugatie19. Deze veranderingen in de
plasmamembraan lijken op een soort gedeeltelijke capacitatie van de spermatozoa en zal ertoe leiden
dat spermatozoa minder lang overleven17,20.
De acrosoom reactie houdt een structurele en biochemische verandering in die toelaat dat de
versmelting met de oöcyt doorgaat ter hoogte van het acrosoom13. Het verlies van cholesterol uit de
membraan tijdens capacitatie is nodig om de acrosoom reactie in gang te zetten13. Door het invriezen
en ontdooien zal de acrosoom reactie vroegtijdig plaatsvinden en dit leid tot een verminderd
bevruchtingsvermogen10,13.
1.2.6. Weinig ijskristalvorming intracellulaire bij snel invriezen
Uit onderzoek is gebleken dat bij snel invriezen enkel in de staart en het middelstuk van de
spermatozoa kleine hoeveelheden intracellulaire ijskristal gevormd worden15. In het hoofd van de
spermacel zijn deze niet gevonden15. Het is niet duidelijk waarom er geen ijskristallen worden
gevormd in het hoofd van de spermatozoa van de hengst. Het kan mogelijk verklaard worden doordat
spermacellen niet in direct contact komen met het ijs. Hierdoor worden de theorieën over ijskristallen
die door poriën binnen komen of door de hoger permeabele membraan, weinig waarschijnlijk. Ook is
het mogelijk dat spermatozoa de zones missen waaraan nucleatie kan ontstaan15. De hoofdreden
voor het afsterven van ingevroren spermatozoa is de uitgebreide beschadiging van de
plasmamembraan door osmotische shock tijdens invriezen en ontdooien, en externe herkristalisatie
tijdens het opwarmen15.
Fig. 1: dwarsdoorsnedes ingevroren rietjes met spermatozoa en glycerol met bijbehorende detailopname (uit
Morris et al. 2012)15.
Foto 1a en 1b: rietje met trage invriessnelheid. Foto 1c en 1d: rietje met hoge invriessnelheid.
7
Door de vriessnelheid te verhogen wordt de tijd verlaagt dat spermatozoa aan de hypertonische conditie
blootstaan. Echter het water in de geconcentreerde oplossing is onvoldoende gemigreerd naar het extracellulaire
ijs in deze korte tijd. In foto 1d zie je hierdoor het ijs gevangen in de oplossing.
Het invriezen van sperma kan ook gebeuren aan zeer
hoge invriessnelheden (zie figuur 2). Dit proces wordt
vitrificatie genoemd15. Door de hoge intracellulaire
eiwit concentratie, uitgesproken dehydratatie en
extracellulaire ijsvorming zal de hoog
geconcentreerde oplossing een glasachtige massa
(“vitrifies”) vormen15. Deze methode wordt enkel in de
humane geneeskunde gebruikt.
Fig. 2: Hoeveelheid ijsvorming (g ijs/g totaal water) in een verdunner die gekoeld is aan verschillende
snelheden (uit Morris et al. 2007)21.
1.3. KUNSTMATIGE INSEMINATIE MET INGEVROREN SPERMA BIJ PAARDEN
1.3.1. Geschiedenis van kunstmatige inseminatie met ingevroren sperma
In 1957 is voor het eerst melding gemaakt van een levendgeboren veulen na inseminatie met
diepgevroren sperma4. Sindsdien werd hengstensperma op kleine schaal ingevroren, maar hiermee
werd slechts wisselend succes bereikt22. In de rundersector werd er veel vooruitgang geboekt met het
gebruik van ingevroren sperma, wat het onderzoek bij paarden bevorderde5,22. De originele verdunner
was een mengsel op basis van eigeel en citraat, waarin glycerol als cryoprotectant was toegevoegd5.
Aanvankelijk gebeurde de opslag van bevroren sperma in druppel-vorm op vaste koolstofdioxide van -
79°C. Na de jaren 60 werd dit vervangen door rietjes die in vloeibare stikstof van -196°C worden
bewaard5. De industriële ontwikkelingen van ingevroren sperma zijn, ondanks acceptatie door de
meeste stamboeken en de internationale opmars van de paardenfokkerij, maar langzaam op gang
gekomen1,8.
1.3.2. Voordelen van ingevroren sperma
Bevroren sperma van de hengst kan voor onbepaalde tijd opgeslagen worden in vloeibare stikstof4,5,6
Geschat wordt dat de samenstelling van spermatozoa voor 50.000 jaar gelijk blijven23. Het sperma is
steeds voorhanden, zelfs als de hengst niet beschikbaar is om te dekken of overleden is4,8,24. Via
aangepaste transportboxen kan het sperma wekenlang ingevroren blijven waardoor het wereldwijd
getransporteerd kan worden1,3,4. Men moet zich houden aan duidelijke regelgeving, maar het
genetisch aanbod aan hengsten is daardoor groter4,6,8,22. Dit is van belang bij fokprogramma’s voor
beschermde of bedreigde paardenrassen25. Bevroren sperma kan opgeslagen worden op de
verblijfplaats van de merrie, alwaar deze geïnsemineerd dient te worden3,4,6,8. Ingevroren sperma biedt
de mogelijkheid om het sperma te onderzoeken op pathogene organismen. De resultaat van de test
kan afgewacht worden omdat het sperma lang bewaren kan worden. Hierdoor vermindert de kans op
overdracht van bepaalde besmettelijke ziektes4,22.
8
1.3.3. Nadelen van ingevroren sperma
Eenmaal ontdooid heeft het sperma slechts een korte overlevingsduur, waardoor het aanbevolen is
om minder dan 12 uur vóór tot maximaal 6 uur na ovulatie te insemineren3,8. Dit vereist een frequente
opvolging van de merrie3,4,8,9,26. De drachtpercentages na inseminatie met diepvriessperma liggen
beduidend lager dan na inseminaties met gekoeld sperma4,8,9,26. De kwaliteit van het sperma na
ontdooiing is sterk variabel, doordat er tijdens hengstenkeuring niet geselecteerd wordt op
vruchtbaarheid van de hengsten in het algemeen of op invriesbaarheid van het sperma in het
bijzonder9. Door de individuele verschillen aan gevoeligheid voor invriezen, zijn er aangepaste
protocollen die per hengst de beste kwaliteit van spermatozoa na ontdooiing geven9. Inflammatoire
reactie van de geïnsemineerde merrie met ontdooide sperma is sterker dan bij inseminatie met
gekoeld sperma of natuurlijke dekking4,27.
2. COLLECTIE VAN HET EJACULAAT
Collectie van sperma met een hoge kwaliteit is zeer belangrijk voor kunstmatige inseminatie als
uitgangspunt. Soms kan het proces van sperma-afname op zichzelf al een oorzaak zijn van
verminderde vruchtbaarheid of van een lage kwaliteit sperma.
2.1. VOORBEREIDING
2.1.1. Dekruimte
De dekruimte moet functioneel genoeg ruimte hebben, hygiënisch werk toelaten, stofvrij zijn en voor
de hengst een goed libido toelaten28,29. Een goed libido toelaten wil zeggen dat er een plek om een
merrie in oestrus te plaatsen, vrij van storende geluiden, dieren of mensen28, 29. Door een gepaste
schone bedding te voorzien, feces te verwijderen, grondig te desinfecteren na elke dag van sperma-
afname en stof weg te halen, wordt de bacteriële contaminatie van het ejaculaat sterk verlaagd28,30.
Het gebruik van een bok, in plaats van een merrie, is voor routinematige collectie aan te bevelen31.
Een bok kan grondig schoongemaakt en gedesinfecteerd worden, waardoor het risico verminderd op
verspreiding van ziektes31.
2.1.2. Seksuele stimulatie en libido
Meer seksuele stimulatie van een hengst dan nodig is voor ejaculatie zal een verhoging van het
volume met zich meebrengen en een verlaging van concentratie levensvatbare spermatozoa, maar
geen verhoging van het totaal aantal spermatozoa32,33. Daarom, voor het invriezen van sperma, is het
niet aangewezen om een hengst extra seksuele stimulatie te geven32. Een slecht libido heeft zijn
weerslag op de spermakwaliteit omdat het langer duurt voordat de hengst tot erectie komt. Ook zal de
hengst meerdere dekpogingen vertonen zonder ejaculatie en zal hierdoor meer gestimuleerd moet
worden om tot ejaculatie te komen33. Dit sperma is van mindere kwaliteit na ontdooiing dan sperma
dat bij een eerste dekking binnen de 5 minuten is afgenomen33.
2.1.3. Collectie interval van de sperma afname
Het interval tussenin de collecties moet gelijk blijven zodat binnen het individu de verschillende
ejaculaties zo gelijk mogelijk blijven10,33. Het ideale interval voor een gemiddelde hengst bedraagt
ongeveer 48 uur, maar dit moet echter aangepast worden per individuele hengst10,33.
2.1.4. Aandachtspunten voor en tijdens de sperma-afname
Voor de sperma-afname is het aangeraden om de penis met warm water te wassen en erna te
drogen16. De bok moet voorafgaand aan de dekking goed schoon gemaakt en/of ingewikkeld zijn met
9
plastiek folie30. De binnenwand in de kunstmatige vagina moet schoon, droog en vrij van detergent
zijn. Het gebruik van een wegwerpbare plastic binnenvoering in een kunstmatige vagina is aan te
raden om kruiscontaminatie tussen hengsten te voorkomen, sneller werk toe te laten en vermijden van
toxiteit16,29,31. Om koude-shock te vermijden moet het opvangrecipiënt tot 37°C zijn opgewarmd34.
Omheen het recipiënt kan best ook een isolerend en lichtwerend omhulsel geplaatst worden om
schade van de spermatozoa door koude en licht te voorkomen31. Kunstmatige vagina’s bevatten een
waterreservoir waarmee de gewenste temperatuur (44°C tot 48°C), druk en diameter geregeld kunnen
worden29. Als de inwendige temperatuur hoger is dan 45°C, moet worden voorkomen dat het sperma
in contact komt met het warme oppervlakte31. Vanaf 37°C kunnen spermatozoa namelijk irreversibel
beschadigd worden en dit fenomeen wordt hitte-shock (“heat shock”) genoemd3,34.
De kunstmatige vagina moet tijdens collectie parallel met de buikwand lopen en dicht tegen de basis
van de penis worden gehouden29. Veel voorkomende problemen bij het collecteren van het ejaculaat
zijn een slechte positionering van de kunstmatige vagina tijdens de dekking, te lage bok, te lage
watertemperatuur of te hoge druk in de kunstmatige vagina voor de hengst29.
2.2. SPERMA-AFNAME
2.2.1. Kunstmatige vagina
Een kunstmatige vagina is de meest gebruikte methode voor collectie van sperma en tevens de beste
keus voor routinematige collectie. Deze collectiemethode, mits juist uitgevoerd, verhoogt de efficiëntie
van spermacollectie en laat een optimale kwaliteit van het sperma toe31.
Er zijn veel verschillende modellen op de markt, hier volgt een selectie van veel gebruikte modellen:
1. Missouri31 (Fig. 3a): Bevat een leren houder, dubbele laag binnenwand
als waterreservoir, luchtventiel, aankoppelbare rubberen laag voor
opvangen ejaculaat en glans penis steekt buiten de kunstmatige vagina.
a. Voordelen: relatief goedkoop, lichtgewicht zodra lucht erbij zit in
waterreservoir, gemakkelijk te reinigen en demonteren, weinig
kans op waterlekkage.
b. Nadeel: ejaculaat in contact met rubberen laag.
2. Colorado29.31 (Fig. 3b): Hard-plastic houder, leren handvat, 2
onafhankelijke rubberlagen voering, volledige penis van de hengst in
kunstmatige vagina.
a. Voordelen: langdurige warmte afgifte.
b. Nadeel: sperma langer in contact met warme binnenkant
kunstmatige vagina, minder makkelijk te hanteren (zwaar).
c. Aangepaste versies zijn CSU en Lane: zijn lichter en hebben een
rigide plastic handvat.
3. Nishikawa31 (Japanse model) en HarVet (Fig. 3c): aluminium houder
(Nishikawa) of hard-plastic (HarVet), enkele laag rubbervoering, directe
opvangrecipiënt aan te koppelen aan kunstmatige vagina.
a. Voordelen: lichtgewicht, gemakkelijk te demonteren en reinigen,
minimaal contact met rubberen voering.
b. Nadeel: groter risico op water lekkage (minder druk en
contaminatie ejaculaat).
4. Polish31 (Fig. 3d): kort model met open einde, aangepast Missouri- Fig. 3: Verschillende
model (afkoppelen rubberen laag) of CSU (korter gesneden). Kunstmatige vagina’s
a. Voordelen: enkel de sperma-rijke fractie opvangen. (uit Brinsko et al. 2011)31
a
b
c
d
10
In sommige kunstmatige vagina’s kan een filter geplaatst worden om het vuil en de gel uit het
ejaculaat te filteren, maar meestal zal het filteren kort na afname gedaan worden29. Het filteren van het
ejaculaat houdt een verlies van spermatozoa in omdat deze achterblijven in de gelfractie of de gelfilter
zelf. Vooral polyester filters zorgen voor een significant verlies van spermatozoa omdat deze vloeistof
opzuigen, terwijl nylon filters minder verlies geven omdat deze geen vloedstof aanzuigen29. Tijdens de
collectie van sperma gaat ongeveer 7% van het totaal aantal spermatozoa in een ejaculaat verloren35.
Het ejaculaat wordt gevormd door 6 tot 9 opeenvolgende fracties tijdens ejaculatie36. In de eerste 3
fracties bevinden zich 60 tot 80% van het totaal aantal spermatozoa31,36. Door met een open einde
kunstmatige vagina enkel deze sperma-rijke fractie op te vangen, verhoogt de concentratie
spermatozoa, vermindert de hoeveelheid seminaal plasma met de helft en verlaagt de contaminatie
met bacteriën, urine of bloed31. Contaminatie met urine of bloed treedt vaak pas op na ejaculatie van
de sperma-rijke fractie29. Deze contaminatie veroorzaakt veranderingen in pH en osmolariteit die een
negatief effect hebben op de motiliteit van het sperma37.
2.2.2. Verloop van de dekking
Gemiddeld zal een hengst ejaculeren na 6 tot 8 georganiseerde stoten vanuit de pelvis38,39. Ejaculatie
is zichtbaar aan drie tot vijf kortere stoten, knikken van de staart en voelbare pulsen van de urethra
aan de basis van de penis38. Sperma dat bij de eerste dekking afgenomen wordt binnen de 5 minuten
heeft de beste kwaliteit na ontdooiing33. Meer dan 3 dekpogingen om een ejaculaat te verkrijgen zijn af
te raden voor sperma dat ingevroren moet worden omdat het percentage levensvatbare spermatozoa
met intacte membranen veel daalt33.
2.2.3. Uitgestelde invriezing van sperma
Voor hengsten die zich niet in de buurt van een laboratorium bevinden kan als alternatief het ejaculaat
vervoerd worden naar een laboratorium met als doel het daar in te vriezen40. Het seminaal plasma
moet zo snel mogelijk verwijderd worden door centrifugatie en het sperma moet gekoeld (5°C)
opgestuurd worden41. Als het sperma volgens deze voorwaarden binnen de 18 uur verwerkt wordt,
resulteert dat in gelijke vruchtbaarheidscijfers als sperma dat na centrifugatie direct ingevroren
wordt42. Als het sperma binnen de 6 uur verwerkt wordt, is er zelfs vlak voor invriezen geen afname
van de motiliteit van de spermatozoa41.
2.3. BEOORDELING EJACULAAT EN SPERMAKWALITEIT
2.3.1. Macroscopische evaluatie ejaculaat
Evaluatie van het ejaculaat is nodig voor de verwerking van het sperma in rietjes. De inseminatiedosis
wordt gemaakt met een minimaal aantal bevruchtingscapabele spermatozoa, maar toch met een hoge
kans op bevruchting (zie figuur 4)43. Het wordt afgeraden om sperma van slechte kwaliteit in te vriezen
omdat de vruchtbaarheid na ontdooien slecht zal zijn9. De normaal kleur van sperma is grijs tot
crèmekleurig wit, afhankelijk van de spermatozoa concentratie34. Sperma
dat een afwijkende kleur vertoont moet niet gebruikt worden om in te
vriezen, bijvoorbeeld geel (urospermia) of rozerood (haemospermia)34.
De normale pH van het ejaculaat ligt tussen 7,2 tot 7,7 en een afwijking
hiervan heeft een negatief effect op de kwaliteit van het sperma34,37. Het
totaal volume van de gel-vrije fractie laat toe om het totaal aantal rietjes
te berekenen uit een ejaculaat34. Een gemiddelde warmbloed hengst
produceert 20 tot 80 ml gel-vrij ejaculaat34.
Fig.4: Theoretische relatie tussen vruchtbaarheid en inseminatiedosis (uit Watson, 2000)43
11
2.3.2. Microscopische evaluatie ejaculaat
De concentratie kan bepaald worden met een hemocytometer telkamer, “densimeter”, “nucleocounter”
of een automatische spermateller en varieert van 100 tot 500 x106 spermatozoa per ml31,34. In een
ejaculaat zitten gemiddeld 4 tot 14 x109 totaal aantal spermatozoa34.
Het percentage progressief motiele spermatozoa voor invriezen is best 60% minimaal 34. Afwijkend is
als de spermatozoa voorwaarts of achterwaarts in een cirkelende beweging draaien. Dit fenomeen is
gelinkt aan koude-shock of hitte-shock3,34. Daarom is het essentieel dat al het materiaal voorverwarmd
is op 37°C.
Omdat vers sperma snel gaat samenklonteren wordt van het verdunde ejaculaat een staal genomen
voor het percentage levensvatbare spermatozoa en de morfologie te bepalen34. Het percentage
levensvatbare spermatozoa wordt bepaald met een eosine-negrosine kleuring in een verhouding van
60:40 (ejaculaat/kleuring). Een druppel kleuring van 5 tot 6 mm aanbrengen op het draagglaasje,
gevolgd door een 3 tot 4 mm druppel verdund ejaculaat, samen mixen en uitstrijken. Na droging
worden 100 spermatozoa beoordeeld om het percentage leefbare spermatozoa te bepalen. Een
normale hengst zal minimaal 70% leefbare spermatozoa in zijn vers ejaculaat hebben34. De morfologie
van de spermacellen worden ingedeeld naar categorie (zie figuur 5)34. Om het percentage van elke
categorie te bepalen zal men minimaal 200 spermatozoa te beoordelen, zowel levend als dood34. Een
teruggeslagen abaxiaal middenstuk wordt als normaal beschouwd34.
Voor het voorspellen van de vruchtbaarheid heeft het evalueren van het ejaculaat minder belang44.
Eenmalige evaluatie (motiliteit, progressief motiele, normale morfologie spermatozoa) zal namelijk
enkel 20% van de vruchtbaarheid verklaren34. Om de vruchtbaarheid van een hengst in te schatten is
een combinatie van testen nodig om ontdooid sperma te evalueren of genoeg gegevens over
nakomelingen18.
Fig. 5: Eosine-negrosine kleuring spermatozoa
(uit Crabtree, 2010)34
fase contrast microscoop x1000.
(a) normale spermatozoa.
(b) knobbel acrosoom.
(c) onderontwikkeld hoofd.
(d) vacuoles in kern.
(e) proximale cytoplasmatische druppel.
(f) distale cytoplasmatische druppel.
(g) teruggeslagen distaal middenstuk.
(h) opgerolde staart.
3. INVRIESPROCEDURES
3.1. TESTEN VOORAFGAAND AAN HET INVRIESSEIZOEN
3.1.1. Meting van de testis
Het gewicht van het testisparenchym is goed gecorreleerd met de dagelijkse spermaproductie38. Het
gewicht van het testisparenchym kan bij levende paarden niet exact bepaald worden, maar het
testisvolume kan geschat worden met behulp van een caliper of door middel van echografie38.
Echografie geeft een nauwkeurigere schatting van het testisvolume38. De grootte van de testikels
12
variëren naar gelang het seizoen, leeftijd, ras en reproductiestatus van de hengst38. Gemiddeld zijn de
testikels 50 tot 80 mm breed, 80 tot 140 mm lang, 60 tot 70 mm hoog en weegt 150 tot 300 g bij een
volwassen warmbloedhengst38.
Met volgende formules kan het testis volume en dagelijkse sperma productie ingeschat worden38:
Testis volume = 4/3π (lengte / 2)(breedte / 2)(hoogte / 2)
= 0,5233 x hoogte x lengte x breedte
Schatting dagelijkse sperma productie = (0,024 x volume beide testikels) – 0,76
Bij een gemiddelde hengst is de totale breedte van beide testikels idealiter meer dan 9 centimeter39.
Een te klein volume of breedte van de testis betekent een lagere spermaproductie per dag, dus het
sperma van deze hengsten is minder geschikt om in te vriezen, omdat de vaste kosten van afnemen
en verwerken relatief gezien te hoog zijn ten gevolg van minder opbrengst van rietjes per ejaculaat.
Als de schatting van de dagelijkse sperma productie niet overeen komt met de werkelijke waarde
kunnen er andere problemen aan de hand zijn wat verder onderzocht vraagt38.
3.1.2. Testen op een geschikt invriesprotocol
Vriesprotocollen zijn ontwikkeld om de negatieve effecten van invriezen zo minimaal mogelijk te
houden3. Door de grote individuele variatie tussen hengsten is het aangeraden om het ejaculaat te
testen op geschiktheid voor het invriesprotocol9. Binnen een protocol kan men de verschillende
stappen experimenteel veranderen, zodat gezocht kan worden naar de methode die de hoogste
kwaliteit sperma na ontdooien geeft10. Ondanks een goed invriesprotocol zal 40 tot 50% van de
spermatozoa het invriesproces niet overleven43. Het wordt afgeraden om de hengst commercieel te
gebruiken om sperma in te vriezen als het verse sperma minder dan 35% progressief motiele en/of
<40% morfologisch normale spermatozoa bevat9. Na afname, verdunnen en centrifugeren wordt het
ejaculaat gesplitst in verschillende dosissen om in te vriezen volgens verschillende protocollen. Na
een opslagperiode van minstens 24 uur wordt het sperma ontdooid en wordt geëvalueerd welk
protocol het beste resultaat geeft9.
Fig.5: Verschillende vriesprotocollen voor invriezen van hengsten sperma (uit Sieme et al., 2008)10
13
3.2. VERWERKEN EJACULAAT
3.2.1. Verdunnen vers ejaculaat
Het ejaculaat wordt door een gelfilter gegoten om het grof vuil en de gel-fractie eruit te halen34.
Langdurig contact met het seminaal plasma moet vermeden worden, omdat het zeer nadelig is voor
de overleving van de spermatozoa. Daarom wordt binnen de 2 tot 5 minuten na afname de verwarmde
verdunner toegevoegd aan het gefilterde ejaculaat16,19,31. De verhouding van het ejaculaat ten
opzichte van de verdunner is 1:1 of het ejaculaat wordt verdund tot een gewenste aantal spermatozoa
per ml10. Verdunners op basis van eigeel of melk bevatten lipoproteïnen die de spermamembraan
stabiliseren en zo beschermen tegen koude-shock24. Metaboliseerbare substraten zoals glucose
zorgen voor nutriënten24. Verdunners dienen als chemische buffer tegen verzuring door afvalstoffen
en zorgen voor het behouden van een juiste osmolariteit. Toevoeging van een breedspectrum
antibioticum gaat de groei van micro-organismen tegen45. Veel gebruikte antibiotica in verdunners zijn
amakacine, gentamicine, streptomycine, penicilline, ticarcilline, lincomycine en polymixin30. Het minst
nadelige effect op motiliteit en de beste antimicrobiële activiteit werd gezien voor amikacine (1000
mg/ml) en penicilline (1000 IU/ml)45. Mycoplasma equigenitalium kan effectief bestreden worden met
lincomycine en gentamicine45. Taylorella equigenitalis veroorzaakt de ziekte “Contagieuze Equine
Metritis” en is zeer resistent tegen invriezen46. Echter als de verdunner antibiotica bevat is het
aangetoond dat het de kans verminderd op transmissie van T. equigenitalis via kunstmatige
inseminatie met ingevroren sperma47. Verdunners zijn van dierlijke oorsprong, dus potentiële
contaminatie kan ook van deze bron afkomstig zijn45. Tegenwoordig zijn er ook verdunners
beschikbaar die niet gebaseerd zijn op producten van dierlijke oorsprong45. Commercieel zijn er
verschillende soorten verdunners beschikbaar, zie tabel 1, of laboratoria stellen de verdunner zelf
samen48.
Tabel 1. Verschillende verdunners en hun reagentia48.
Reagens
(g/100 ml)
Kenny’s Dmitropoulos-
II
Magere
melk
sucrose
Glucose
EDTA
Citraat
EDTA
INRA-82 11%
Lactose
Magere melk 2,4 2,4
Glucose 4,9 2 3 6 0,15 5
Sucrose 5
BSA 1,5
Raffinose 0,3
Fructose 2
Na-Citraat 2 0,38 2,59 0,06
K-Citraat 0,08
Hepes 0,71
EDTA 0,37 0,37
Na-Bicarbonaat 0,12 0,12
Glycine 0,94
Sulfanilamide 0,35
Lactose 0,3 11
Eigeel 40
14
3.2.2. Concentreren van het sperma
Het centrifugeren van het verdunde ejaculaat heeft als doel de spermatozoa concentratie te verhogen
en het aandeel seminaal plasma te verlagen. Hierdoor kan de gewenste inseminatiedosis in een klein
volume verpakt worden24. Het ejaculaat wordt gecentrifugeerd met een kracht van 350 tot 700 x g aan
een periode van 10 tot 15 minuten10. Voor de spermatozoa is het essentieel dat er 5 tot 20% van het
seminaal plasma overblijft na centrifugatie of opnieuw moet toegevoegd worden19. Factoren in het
seminaal plasma zullen namelijk de gecapaciteerde spermatozoa omzetten in niet gecapaciteerde
spermatozoa2. Het vermijden van premature capacitatie zal ervoor zorgen dat spermatozoa lang
overleven17,20.
Tegenwoordig is het commercieel mogelijk om het ejaculaat aan zeer hoge snelheid te centrifugeren
(1000xg, 20min) door gedempte centrifugatie (“cushioned centrifugation”) toe te passen10. Het
voordeel van deze techniek is een grotere opbrengst van de spermatozoa en het heeft geen nadelige
effecten op de vruchtbaarheid10.
Een andere manier om seminaal plasma uit het ejaculaat te verwijderen is met behulp van een
synthetische hydrofiele membraan (“Sperm Filter, BotuPharma, Botucatu, Sao Paulo, Brazil”). In
vergelijking met centrifugatie is de “Sperm Filter” even efficiënt in het verwijderen van seminaal
plasma en geeft minder verlies van spermatozoa41.
3.2.3. Toevoegen van cryoprotectant
Een tweede verdunning vindt plaats door een verdunner met cryoprotectant toe te voegen aan het
gecentrifugeerde ejaculaat10. Commerciële verdunners zijn beschikbaar, zie tabel 2, of worden door
het laboratorium zelf samengesteld48.
Cryoprotectantia hebben verschillende voordelen waardoor spermatozoa het invriesproces kunnen
overleven12,14:
- Verminderen van de blootstelling aan osmotische stress.
- Stabiliseren van biomoleculen en celstructuren.
- Verminderen het schadelijke effecten van oxiderende stoffen.
- Vertraging van de initiële dehydratatie en verhoging van de totale dehydratatie.
- Verlagen van de temperatuur waarbij intracellulaire ijskristalvorming optreedt.
Het nadeel van cryoprotectantia is dat deze vooral in hoge concentratie, toxisch zijn voor de
spermatozoa en ze zullen de spermatozoa aan osmotische stress blootstellen12,49.
Na blootstelling aan osmotische stress zal de spermatozoa zijn volume weer terug brengen tot een
isotoon volume. Dit vermogen is mogelijk tot 900 mOsm kg-1, echter een osmolariteit van meer dan
450 mOsm kg-1 kan mogelijk de spermatozoa reeds irreversibel aantasten49. De meest gebruikte
cryoprotectantia voor bewaring van ingevroren hengstensperma zijn magere melk, eigeel en
glycerol14,49. Al meer dan 50 jaar is glycerol de meest gebruikte cryoprotectant voor ingevroren
hengstensperma10,49.
Cryoprotectantia worden opgedeeld in 2 verschillende groepen:
1. Membraanpermeabele cryoprotectantia stabiliseren de membraan en regelen de snelheid van
celdehydratatie14. Onder het vriespunt vindt normaal nauwelijks watertransport plaats bij
cellen, maar dankzij een cryoprotectant kan watertransport wel doorgaan en zorgen voor meer
dehydratatie. Zowel bij invriezen als ontdooien zal dit mechanisme voor een verhoogde
overleving van spermatozoa zorgen omdat minder intracellulaire ijskristallen zich vormen14.
2. Membraanimpermeabele cryoprotectantia zorgen dat de overgangstemperatuur van de sterk
geconcentreerde oplossing verhoogt wordt. Hierdoor zal de ingevroren spermatozoa langer
zijn stabiele structuur behouden en pas gaan smelten bij hogere temperaturen. Hierdoor zal
15
de blootstelling aan de geconcentreerde oplossing pas aanvangen bij hogere temperaturen14.
Het voordeel hiervan is dat er minder snel schade optreedt aan de spermatozoa bij
fluctuerende temperaturen tijdens transport of verplaatsing van de rietjes14.
Tabel 2. Verschillende verdunners en hun reagentia48.
Bestanddeel (ml /100) Martin French Magere melk / eigeel
Magere melk sucrose 45 92
INRA-82 45
Glucose-EDTA 25
11% Lactose 50
Eigeel 20 5 8
Equex 0,6
3.2.4. Verpakken
Om het gekoelde sperma te verpakken wordt meestal gebruik gemaakt van 0,5 ml rietjes met een
dosis van 50 tot 100 miljoen spermatozoa10,24,26. Om fluctuaties in temperatuur te vermijden is het
essentieel dat de rietjes dezelfde temperatuur hebben als het sperma10. Een rietje van 5,0 ml inhoud
wordt ook gebruikt en deze bevat ongeveer 600 tot 800 miljoen spermatozoa24. Een 0,5 ml rietje geeft
echter een uniformere invriezingssnelheid24. Een kleiner rietje van 0,25 ml wordt meestal gebruikt voor
gesext sperma. Spermatozoa in rietjes van 0,5 ml en 0,25 ml tonen na ontdooien dezelfde membraan
integriteit, echter de spermatozoa van de 0,5 ml tonen verhoogde kinetische waarden na ontdooien50.
Voor een inseminatie worden meestal 600 tot 800 miljoen spermatozoa in totaal geïnsemineerd, dus
voor 0,5 ml rietjes betekent dit 6 tot 8 rietjes per inseminatie of 1 rietje van 5,0 ml24. Andere manieren
om sperma te verpakken is in aluminiumbuizen, glazen ampullen, glascilinders en polyethylene
zakjes10. De rietjes vullen met sperma kan handmatig of met semi-automatische apparatuur gebeuren.
Om te voorkomen dat rietjes gaan barsten tijdens het invriesproces door het expanderende ijs, moet
er een luchtbel in het centrum van het rietje zitten24. Hierna worden ze hermetisch afgesloten24.
3.2.5. Koelen
Koude-shock kan voorkomen worden door de koelingsstappen gecontroleerd te laten verlopen13. Van
37 tot 20°C kunnen de spermatozoa snel gekoeld worden aan een snelheid van -2,0°C/min16,24.
Tussen 19 en 8°C zijn de spermatozoa zeer gevoelig voor schade door koude-shock16. De snelheid
van deze koelingsstap moet onder de -0,3°C/min liggen om de spermacel de tijd te geven zich aan te
passen aan de veranderende temperatuur24. Tussen 8 en 0°C kan er weer snel gekoeld worden16,24.
3.3. INVRIEZEN VAN HET SPERMA
Het koelen van rietjes kan gebeuren door deze te plaatsen in een rekje boven stikstofdampen of door
een programmeerbare stikstof vriezer24. Een programmeerbare vriezer geeft een uniformere
vriescurve en een betere levensvatbaarheid van spermatozoa na ontdooien24. De optimale
invriessnelheid zal liggen tussen de -20 en -100°C per minuut, afhankelijk van de verwerkingsmethode
en verpakking10,21. Bij een grafiek die de overlevende cellen uitzet tegen de snelheid van invriezen,
krijg je een typisch omgekeerde U-curve. De piek van de curve toont de optimale invriessnelheid
(“optimal cooling rate”) voor overleven van de cel na ontdooien (zie figuur 6)11,12,21. Een invriessnelheid
tussen -4 en -50°C/min blijkt het meest optimaal voor de motiliteit21. Bij lagere of hogere
invriessnelheden gaat de levensvatbaarheid van spermatozoa sterk achteruit21.
16
Tussen -30 en -55°C zal de sterk geconcentreerde oplossing naar een overgang van glasachtige
structuur veranderen14. Vanaf -110°C en lager bevindt al het water zich in een glasachtige structuur21.
Fig. 6: Het herstel van de motiliteit (●) en levensvatbaarheid (○) van hengsten spermatozoa na het snel ontdooien
volgens verschillende invriessnelheden (uit Morris et al., 2007)21.
3.4. ONTDOOIEN VAN INGEVROREN SPERMA
3.4.1. Protocol opwarmen
Het ontdooien van rietjes gebeurt meestal in een warmwaterbad3. Belangrijk hierbij is dat de
watertemperatuur goed in de gaten gehouden moet worden. Bij een temperatuur van 35 tot 36°C
kunnen de spermatozoa goed overleven, terwijl boven een temperatuur van 39°C de spermatozoa
snel afsterven. Voor 0,5 ml rietjes wordt meestal water van 37°C gebruikt waarin de rietjes minimaal
20 seconden verblijven3. Een manier om meerdere rietjes voor één inseminatiedosis tegelijk te
ontdooien is om alle rietjes één voor één in het 37°C warme waterbad te plaatsen. Men wacht af met
het uithalen van de rietjes totdat het laatste rietje er voor 30 seconden in heeft gelegen3. Na het
ontdooien moeten de rietjes goed afgedroogd worden omdat water zeer toxisch is voor spermatozoa3.
Hoge opwarmsnelheden zijn beter voor de overleving van spermatozoa (zie figuur 7)21. Bijvoorbeeld
het ontdooien van 0,5 ml rietjes in een warm waterbad van 75°C voor 7 seconden geeft een beter
herstel van motiliteit. Echter elke seconde langer in het water brengt irreversibele schade aan de
spermatozoa toe en is dus moeilijker veilig uit te voeren in de praktijk. De rietjes met een groter
volume van 4,0 ml of 5,0 ml worden meestal ontdooid in een waterbad van 50°C voor maximaal 45
seconden3. Rietjes met een klein volume van 0,25 ml kunnen worden ontdooid in een waterbad van
46°C voor maximaal 12 seconden50.
17
Fig.7: Het herstel van de motiliteit (●) en levensvatbaarheid (○) van hengsten spermatozoa volgens verschillende
opwarmsnelheden (uit Morris et al., 2007)21. Alle rietjes zijn ingevroren aan 10°C/min.
3.4.2. Evaluatie ontdooid sperma
De evaluatie van het sperma na ontdooiing gebeurd op dezelfde manier als de evaluatie van het verse
sperma. Alhoewel er geen standaard afspraak gemaakt is over de inseminatie dosis, wordt er meestal
een minimum criterium gehanteerd van 600 miljoen spermatozoa waarvan minimaal 30% progressief
motiel26. Hierdoor is het belangrijk dat de progressieve motiliteit na het ontdooien bepaald wordt omdat
dan de minimum dosis per rietje berekend kan worden18. Na ontdooien is het belangrijk dat de
spermatozoa vruchtbaar zijn en belangrijk hierbij zijn: een progressieve motiliteit, normaal
metabolisme, intacte celmembranen, aanwezigheid van acrosomale enzymen, intacte oppervlakte-
eiwitten en nucleoproteïnen24. Afwijkingen zoals teruggeslagen middenstukken en voorwaarts of
achterwaarts cirkelen, wijzen op koude-shock of “heat shock”. Een teruggeslagen staart wijst op
osmotische stress en een teruggeslagen abaxiaal middenstuk wordt als normaal beschouwd34.
4. BEWARING EN TRANSPORT VAN INGEVROREN SPERMA
Het bewaren van de rietjes gebeurt in opslagtanks (“cryotank”) met vloeibare stikstof van –196°C24.
Zodra er zich fluctuaties in opslagtemperatuur voordoen boven de -100°C bestaat de kans dat het
sperma beschadigd wordt en zijn vruchtbaarheid verliest3. Deze kans bestaat vooral bij het uithalen
van de rietjes voor inspectie, verplaatsing naar een transportcontainer of verplaatsen naar een
waterbad3. Daarom dient er snel gewerkt te worden en dienen de tangen, waarmee de rietjes uit de
cryotank worden gehaald, voorgekoeld te zijn23,51. Bij het overplaatsen van een rietje moet de afstand
tussen beide tanks zo klein mogelijk zijn. De bekers waarin de rietjes naar boven gehaald worden,
moeten goed gevuld zijn met vloeibare stikstof3,23. Rietjes met een klein volume van 0,25 ml zijn door
hun grotere oppervlakte ten opzichte van de inhoud zeer kwetsbaar voor hogere temperaturen en
mogen zich maximaal 3 seconden buiten de vloeibare stikstof bevinden51. In de nek van de vriestank
stijgt de temperatuur snel (zie figuur 8)51. In de regio boven de vrieslijn moet het verblijf van rietjes
zoveel mogelijk vermeden worden51. Containers worden het best opgeslagen in een schone, droge en
stofvrije omgeving zonder direct contact met een betonnen vloer, omdat de zuren uit de vloer het
aluminium zullen corroderen3,51. Regelmatig controleren van de vloeistoflijn en zorgen dat de
18
afsluitdop goed vast zit en intact is, zijn belangrijk voor het garanderen dat de spermatozoa hun
leefbaarheid behouden3,23. Zodra een container aan de buitenkant ijs begint te vormen, is dit een
teken dat er geen vacuüm meer is. De inhoud moet dan snel overgeplaatst worden naar een andere
container3. Cryotanks zijn een mogelijke bron van kruiscontaminatie als de rietjes niet goed afgesloten
zijn en in contact komen met vloeibare stikstof die micro-organismen bevat30,52. Stenotrophomonas
maltophila beïnvloedt de motiliteit van spermatozoa en kan geïsoleerd worden uit vloeibare stikstof52.
Het is daarom aangeraden om de vloeibare stikstof regelmatig te vervangen en de tanks te
desinfecteren52. Een desinfectans 15 tot 30 minuten laten inwerken en dan goed uitspoelen met steriel
water is voldoende om micro-organismen te elimineren. Desinfectans die gebruikt kunnen worden
hiervoor zijn een 10% oplossing natriumhypochloriet, 3% tot 6% oplossing waterstofperoxide of 37%
gedenatureerde alcohol52.
Fig. 8: Dwarsdoorsnede door de bovenste helft van een cryotank (uit Miller et al., 2011)51. Temperaturen (in
Fahrenheit) staan aangegeven op afstand (in inche) vanaf de top van de tank.
Als sperma in een goedgekeurd KI centrum in Europa is gecollecteerd dan mag het vrij
getransporteerd worden binnen Europa1. In België moet ingevroren sperma bestemd voor
internationaal transport, gescreend worden op “equine infectious anemia virus, equine arteritis virus en
contagieuze equine metritis”. Om ingevroren sperma te verzenden tussen landen moet de
inseminatiedosis minstens 250 miljoen progressief motiele spermatozoa bevatten waarvan minstens
35% na het ontdooien progressief motiel is gebleven4. Transport van ingevroren sperma gebeurt
meestal in een container die stikstofdampen bevat3,23. Stikstofdampcontainers absorberen de
vloeibare stikstof in een dikke laag absorberend materiaal dat rond het compartiment ligt waarin de
rietjes worden geplaatst3. In de container blijft een constante temperatuur van –190°C behouden voor
ongeveer 21 dagen3,23. Bij een langere periode van transport wordt soms een cryotank met vloeibare
stikstof gebruikt. Hier bestaat het gevaar dat door het kantelen van de container tijdens transport de
vloeibare stikstof eruit lekt3. Mocht op de plaats van aankomst een langere periode voor opslag nodig
zijn dan voorzien dan kan de container of tank bijgevuld worden met vloeibare stikstof3.
19
5. FACTOREN DIE EEN INVLOED HEBBEN OP DE SPERMAKWALITEIT
5.1. INTRINSIEKE FACTOREN DIE DE SPERMAKWALITEIT BEÏNVLOEDEN
Factoren zoals leeftijd, genetica en seizoen hebben een invloed op de spermakwaliteit, maar kunnen
niet of nauwelijks beïnvloed worden.
5.1.1. Leeftijd
De leeftijd van een hengst heeft een grote impact op de eigenschappen van zijn sperma. De
kwaliteitsparameters van het ejaculaat zijn: gelvrij volume, concentratie spermatozoa, totaal aantal
spermatozoa en afwijkende spermatozoa53. Hengsten tussen 3 en 11 jaar hebben de beste
kwaliteitsparameters53. Na 20 á 25 jaar neemt de vruchtbaarheid af als gevolg van
testikeldegeneratie33,54. Hengsten jonger dan 3 jaar hebben ten gevolge van immature
spermatogenese volgende parameters: kleiner volume ejaculaat, laagste concentratie spermacellen,
laagst totaal aantal spermatozoa, hoogste percentage aan dode en niet motiele spermatozoa en ook
het hoogste percentage spermatozoa met abnormale koppen, proximale protoplasma druppels en
afwijkende staarten53. De hoogste spermaconcentratie wordt bereikt op twaalf- en dertienjarige
leeftijd53. Het percentage abnormale koppen en abnormale staarten daalt van drie- tot negenjarige
leeftijd, waarna de abnormale koppen relatief constant blijven en de abnormale staarten geleidelijk
stijgen53.
5.1.2. Genetica: individuele gevoeligheid van hengsten voor het invriezingsproces
Het ejaculaat van hengsten vertoont een grote individuele variatie in het weerstaan van het invries- of
ontdooiingsproces10. Hengsten kunnen ingedeeld worden in “goede vriezers” (“good freezers”) en
“slechte vriezers” (“bad freezers”)26,9,55. Ongeveer 20% van de hengsten vriezen goed in, 20% van de
hengsten vriest slecht in en de overige 60% geeft acceptabele resultaten55. Inteelt kan ervoor zorgen
dat de kwaliteit van het sperma vermindert56.
5.1.3. Seizoen
In het noordelijk halfrond valt het natuurlijk dekseizoen bij het paard van april tot september57,58. Het
invriezen van hengstensperma gebeurt echter meestal van november tot februari, met andere
woorden buiten het natuurlijk dekseizoen59,60. In vergelijking met de winter wordt in de zomer en lente
een verhoogd libido, hoger volume ejaculaat en gelfractie, en gedaalde concentratie spermatozoa
teruggevonden, maar de dagelijkse spermaproductie is wel hoger60,61. Verschillende pogingen zijn
reeds ondernomen om de seizoensinvloed op de spermakwaliteit van diepvriessperma en de meest
gunstige periode om sperma in te vriezen na te gaan57,59,60,61,62,63,64,65. Deze studies leiden echter tot
verschillende aanbevelingen, doordat er verschillende parameters onderzocht werden. Zo zijn van
september tot november morfologische defecten aan de spermatozoa het laagst en de motiliteit en
levensvatbaarheid het hoogst59,63. Wanneer enkel naar de motiliteit na ontdooien van het sperma werd
gekeken, dan bleek de winter het meest optimale seizoen om sperma in te vriezen61. In maart en juni
daarentegen werden de minste verschillen tussen vers sperma en ingevroren sperma gevonden wat
betreft totale en progressieve motiliteit62. Tot slot vonden Blottner et al. (2001) geen noemenswaardig
verschil tussen ejaculaten ingevroren in mei en ejaculaten ingevroren in december60.
De seizoensinvloed zou te verklaren kunnen zijn doordat onder invloed van het circadiaans ritme de
samenstelling en hormonale samenstelling van het seminaal plasma verandert. Dit heeft op zijn beurt
een repercussie op de structuur en functionele samenstelling van het acrosoom en de
plasmamembraan van de spermacel66,67.
20
De invloed van het seizoen op spermakwaliteit na invriezen is echter beperkt. Het invriesproces zelf
en de genetica van de hengst hebben een meer doorslaggevende invloed op de invriesbaarheid van
het sperma60.
5.2. HYGIËNE
5.2.1. Contaminatie met micro-organismen
Bij contaminatie van het ejaculaat met bacteriën treedt er een zaaddodend effect op30.
Mogelijke oorzaken van infectie met micro-organismen:
- Hengst-gebonden: feces, preputium, huid, haar, respiratoire uitscheidingen, systemische of
lokale infectie van het geslachtsstelsel28,30,45.
- Omgevings-gebonden: contaminatie vindt plaats tijdens collectie, verwerken en opslagperiode.
Bronnen zijn het personeel, water, plantaardig materiaal, wasbak, riolering, lucht, ventilatie
systeem of voorwerpen28,30,45.
Een infectie is vaak intermitterend waardoor het ejaculaat ook verschillende concentraties aan micro-
organismen kan bevatten. Met het intermitterend karakter moet je rekening houden als je sperma
onderzoekt op mogelijke pathogenen28. Het is belangrijk om de risico’s op contaminatie zo laag
mogelijk te houden, anders zal de vruchtbaarheid achteruitgaan, kwaliteit van het sperma verminderen
en leefbaarheid van de spermatozoa afnemen30.
5.2.2. Hygiëne van het personeel, materiaal en het laboratorium
Door bij elke stap in het verwerkingsproces van het sperma sanitaire hygiëne na te streven, krijg je
een algehele vermindering van contaminatie30.
Voorkomen van contaminatie van het ejaculaat tijdens opslag en distributie28,30:
- Hygiënische werkwijze nastreven door het personeel.
- Zoveel mogelijk wegwerpmateriaal gebruiken
- Enkel werken met gedesinfecteerd of gesteriliseerd gebruiksmateriaal.
- Grootverpakkingen meteen verbruiken of verdelen in kleinere volumes.
- Het aangebroken pak rietjes moet op dusdanige manier bewaard worden dat er zo min mogelijk
contaminatie mogelijk is.
- De ruimte waar het ejaculaat verwerkt wordt scheiden van de dekruimte.
- Toevoeging van doelgerichte antibiotica, steriele verdunners en cryoprotectantia aan het
ejaculaat.
5.2.3. Hygiëne van de hengst
Bij de hengst is het aangeraden om de buik en de ruimte rondom het preputium schoon en droog te
houden en indien nodig bij te trimmen. Dit gezien het feit dat de hoeveelheid contaminatie van het
ejaculaat sterk gelinkt is met de verontreiniging van de hengst16,28,30. Vlak voor of tijdens de dekking
kan je het best het voorvocht niet opvangen, omdat het vaak veel bacteriën bevat30. Commensale
bacteriën op de penis, preputium en distale urethra behoren tot de normale flora. Deze flora is
onschadelijk voor de hengst en speelt een belangrijke rol in afweer tegen pathogene bacteriën39,46. Ze
verminderen onder andere de groei van de seksueel overdraagbare bacteriën Pseudomonas
aeruginosa en Klebsiella pneumoniae (type 1, 2 en 5)39. Wassen van de penis wordt daarom enkel
met warm water aanbevolen. Volgende handelingen vermijden dat infecties overgedragen worden
tussen hengsten: kunstmatige vagina reinigen na elke dekking of de plastiekfolie in de kunstmatige
vagina vervangen, de bok reinigen of beschermen met wegwerpfolie, de penis voor een dekking met
een droge doek afnemen of wassen16,29,30.
21
5.2.4. Overdraagbare ziektes met ingevroren sperma
Zelfs na het proces van invriezen en ontdooien kunnen er micro-organismen overleven in het
ejaculaat, met mogelijke overdracht van pathogene bacteriën naar de merrie28,46. De species die
meest frequent uit ontdooid sperma worden geïsoleerd zijn: Enterobacter spp., Enterococcus spp.,
Stenotrophomonas maltophila, Propionibacterium granulosum en Corynebacterium spp.. Andere
bacteriën die ook vaak uit het ontdooide ejaculaat worden geïsoleerd zijn Micrococcus spp.,
schimmels (Aspergillus spp.), gisten (Candida en Cryptococcus), Pseudomonas aeruginosa en
anaërobe bacteriën (Propionibacterium granulosum en Clostridum spp.)46. De meeste species zijn niet
pathogeen, uitgezonderd Clostridum spp en Pseudomonas aeruginosa46. Bij gevoelige merries
kunnen opportunistische bacteriën in het ejaculaat, zoals Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella
pneumoniae, Streptococcus zooepidemicus en Taylorella equigenitalis, een ontstekingsrespons
veroorzaken die tot onvruchtbaarheid kan leiden46. Wat betreft de invloed van de micro-organismen op
de spermatozoa en vruchtbaarheid is weinig bekend. Het aantal kolonie vormende eenheden per
milliliter sperma verschilt veel per individuele hengst. Het toevoegen van antibiotica aan de verdunner
is onvoldoende om contaminatie met micro-organismen tegen te gaan46.
Virussen, onder andere influenza virus, equine viraal arteritis virus, equine herpesvirus type 1 en
equine infectieuze anemie virus, kunnen persisteren in de voortplantingsorganen van de hengst
zonder een significante ontsteking te geven68. Een virus waarvan gekend is dat het de
invriesprocedure overleeft en zich verspreidt via ontdooid sperma, is het equine viraal arteritis virus69.
Fig. 9: Microbieel gewicht van de geïsoleerde bacteriën (uit Corona en Cherchi, 2009)46
5.2.5. Aanzuren van het ejaculaat
Een mogelijke methode om virussen uit het ejaculaat te elimineren is door aanzuren van het sperma45.
De meeste virussen worden namelijk geïnactiveerd bij een pH tussen 5 en 6. Voorafgaand aan het
invriezen kan men HCL toevoegen aan het verdunde ejaculaat45. Dit gebeurt in de verhouding 1:1 bij
een temperatuur van 35°C tot een pH van 5 bereikt wordt. Deze verlaagde pH wordt aanhouden voor
2 tot 5 minuten. Erna kan met NaOH de pH genormaliseerd worden. Virussen die geïnactiveerd
worden binnen 1 minuut bij een pH lager dan 6 zijn onder andere het “eastern” en “western equine
22
encephalomyelitis” en “Semliki Forest virus”45. In vitro proeven hebben uitgewezen dat een kortdurend
zuur milieu geen morfologische afwijkingen veroorzaakt45. Kortstondig aanzuren van sperma is dus
handig om zuurlabiele pathogenen uit het ejaculaat te elimineren.
5.2. MANAGEMENT
5.2.1. Stalling
Het groeperen van meerdere hengsten zonder contact met merries kan een bachelor band, zoals die
in de natuur voorkomt, nabootsen69. Een bachelor hengst heeft minder androgeenconcentratie in het
bloed, vertoont minder seksueel en agressief gedrag, vertoont afgenomen testikelgrootte en heeft een
verminderde spermakwaliteit69. Een hengst die verlaagde vruchtbaarheid en libido vertoont, zou
mogelijk baat kunnen hebben bij permanent contact met merries69.
5.2.2. Bioveiligheid
Per maand is het aanbevolen om 1% van het totaal aantal verzamelde ejaculaten te testen op
contaminatie met organismen30. Om infecties te voorkomen is het belangrijk dat hengsten
gecontroleerd worden voordat ze de faciliteit binnenkomen. Regelmatig onderzocht en test van
hengsten op mogelijke ziektes kan ook gedaan worden28. Nieuwe hengsten of zieke paarden dienen
in quarantaine geplaatst te worden28.
5.2.3. Seksuele rust
In de cauda epididymis bevindt zich 62% van de extra-gonadale spermareserve. De vas deferens
inclusief ampulla bevat 7% van de extra-gonadale spermareserve70. Bij een seksueel uitgeruste
hengst moeten de eerste twee tot vier ejaculaties niet gebruiken worden om in te vriezen26. Zelfs al
zou het sperma er onder de microscoop als goede kwaliteit uit zien26. Te lange seksuele rust kan
zorgen voor een opstapeling aan spermatozoa in de epididymis. Hier blijft het sperma zitten en zal
mettertijd afsterven als de hengst zijn reserves niet ledigt via urineren. Dagelijkse afname gedurende
een week zal zorgen voor een depletie van de extra-gonadale reserve en zodoende zal de werkelijke
spermakwaliteit zich stabiliseren32,33.
5.2.4. Intratesticulaire temperatuur
De thermoregulatie van de testis is afhankelijk van warmte uitwisseling via het counter current
mechanisme van de plexus pampiniformus, contractie en relaxatie van de musculus cremaster en
tunica dartos, warmte straling op het scrotale oppervlak en de zweetklier activiteit71,72. Normale
temperatuur intra testiculair is 35°C71. Een verhoogde testiculaire temperatuur is schadelijk voor de
spermatogenese en geeft degeneratie van de testis door hypoxie73,74. Een verhoogde intratesticulaire
temperatuur kan verschillende oorzaken hebben, waaronder koorts, abdominale of inguinale testis,
trauma, ontsteking van de testis, scrotum of epididymis, oedeem, bloeding, dermatitis, torsie van de
testis en hoge omgevingstemperatuur71,72,73,74. Primaire en secundaire spermatocyten zijn gevoeliger
voor de schadelijke effecten van verhoogde temperatuur dan de spermatogonia in de testis en de
spermatozoa in de epididymis73. Het duurt ongeveer 60 dagen voordat de waarden in het ejaculaat
weer normaal zijn geworden na een temperatuursverhoging van één tot twee dagen73. Slechts 25 tot
40 dagen na de temperatuursverhoging worden de nadelige effecten waargenomen namelijk
verminderde motiliteit, afwijkende morfologie, laagste concentratie spermatozoa en totaal aantal
spermatozoa (zie figuur 10)73. Mocht een hengst een vermoedelijke periode van verhoogde
intratesticulaire temperatuur hebben meegemaakt en hij wordt gekeurd in de 25 tot 60 dagen na deze
periode, dan is de evaluatie niet een weerspiegeling van de werkelijke kwaliteit van het sperma. Het is
aan te raden om de hengst dan te herkeurd na een of twee maanden.
23
Fig. 10: Regressie analyse van spermatozoa van: a) progressief motiel, b) percentage morfologisch normaal, c)
concentratie, d) totaal aantal (uit Freidman et al., 1991)73.
De x-as geeft het aantal dagen weer ná de periode van verhoogde intra-testiculaire temperatuur.
De rechte lijn in het midden van de grafiek geeft het normale niveau aan vóór de verhoogde intra-testiculaire
temperatuur.
De gestippelde lijn geeft het gemiddelde van de groep hengsten weer die 24 uur lang op dag 0 een verhoogde
intra-testiculaire temperatuur hebben ondergaan.
De vaste lijn geeft het gemiddelde van de groep hengsten weer die 48 uur lang op dag 0 een verhoogde intra-
testiculaire temperatuur hebben ondergaan.
5.2.5. Stress en effect van inspanning
Drie weken na de start van een stressvolle periode neemt de spermakwaliteit af van zowel vers als
diepvriessperma en drie weken na het beëindigen van de stress verbetert deze weer75. Dit negatief
effect zou het gevolg kunnen zijn van verhoogde corticosteroïdenspiegels of van een verhoogde
lichaamstemperatuur75. Tijdens het voortplantingsseizoen worden veel fokhengsten getraind76. Een
dagelijkse matige inspanning heeft geen effect op de spermakwaliteit76. Intensieve inspanning
daarentegen, vooral wanneer uitgevoerd in een warme omgeving, kan mogelijk de testiculaire
temperatuur inwendig verhogen en zo de spermatogenese aantasten72. Hengsten die tijdens het
fokseizoen deelnamen aan de racen, vertoonden nochtans geen gedaalde fertiliteit77. In deze studie
zijn helaas geen gegevens van ingevroren sperma meegenomen. Uit een andere studie is gebleken
dat Duitse warmbloed hengsten, die uitgebracht worden in de dressuur- of springsport, veranderingen
in de hormoonspiegels vertonen77. Deze veranderingen in hormoonconcentraties hadden geen effect
op de spermakwaliteit.
a
b
c
d
24
BESPREKING
Het proces van invriezen is in het begin een serendipiteit geweest: bij toeval is ontdekt dat glycerol
zorgt voor een betere overleving van spermatozoa. Het onderzoek hierna is meer door “trial-error”
gevorderd. Tegenwoordig zijn de onderzoeken gericht op cel- en molecuulniveau om een betere
voorspelling te maken hoe een vriesproces de spermacel beïnvloedt. Hierdoor kunnen meer gerichte
protocollen ontworpen worden. Desondanks komt de theorie niet altijd overeen met de werkelijkheid.
Tussen laboratoria onderling en tussen verschillende landen is er geen uniformiteit van het proces van
invriezen48. Dit maakt het moeilijk om onderzoeken te vergelijken met elkaar en ook om de
betrouwbaarheid van de resultaten in te schatten. Het is dus belangrijk dat laboratoria internationaal
streven naar gestandaardiseerde protocollen. Het zorgvuldig noteren van resultaten en
vruchtbaarheidscijfers is nodig om genoeg data te verzamelen waarop onderzoek kan gebeuren.
Onderzoek wordt ook belemmerd door het laag aantal gedekte merries per hengst waardoor er geen
betrouwbare resultaten worden verkregen. Ook zijn er weinig financiële middelen beschikbaar om
onderzoeken te stimuleren.
Rasverschillen, klimatologische omstandigheden en management spelen een grote rol in de kwaliteit
van het sperma. Deze verschil tussen landen maakt het zeer moeilijk om onderzoeken te extrapoleren
naar een ander land omdat de factoren verschillen. Daarnaast bestaat er individueel ook een groot
verschil in gevoeligheid van het sperma voor het invriesproces. Om toch een breed aanbod van
hengsten te kunnen aanbieden zijn er meerdere protocollen nodig. Hierdoor is het zeer moeilijk om
een uniform standaardprotocol te maken. Meerdere gestandaardiseerde protocollen vast leggen zal
ervoor zorgen dat internationale onderzoeken beter met elkaar vergeleken kunnen worden, terwijl de
hengsten voor hun intrinsieke factoren tegemoet worden gekomen.
Eenmaal een gekozen protocol wordt toegepast houd men zich hieraan. Met andere woorden, zodra
men aan het gefilterde ejaculaat een verdunner toevoegt tot en met het rietje in de vloeibare
stikstofcontainer, zit je aan die specifieke stappen van het protocol vast en gaat men ervanuit dat de
kwaliteit iedere keer constant zal zijn. Echter het tegendeel is waar, een moment van onoplettendheid
kan zeer nefaste gevolgen hebben voor de kwaliteit van de spermatozoa. Men moet er constant van
bewust zijn dat de minste afwijking negatieve gevolgen heeft voor de vruchtbaarheid.
Ook heerst er bij de dierenartsen en eigenaren de opvatting dat ingevroren sperma van minder
kwaliteit is. Als men echter zorgvuldig omgaat met het sperma en de merrie juist begeleid, worden er
acceptabele vruchtbaarheidscijfers bereikt met ingevroren sperma. Mocht het eenmaal zover komen
dat gekoeld sperma en ingevroren sperma op één lijn staan, dan zal ingevroren sperma zeker de
voorkeur hebben vanwege zijn onbepaalde houdbaarheid.
Vanaf de voorbereiding voor sperma-afname tot en met het ontdooien van de rietjes zijn een aantal
essentiële stappen die op de spermatozoa een grote impact hebben. Bij elke stap gaan er
spermatozoa verloren en het is de taak om dit verlies zo minimaal mogelijk te houden.
25
REFERENTIELIJST
1. Aurich J., Aurich C. (2006). Developments in European horse breeding and consequences for
veterinarians in equine reproduction. Reproduction of Domestic Animals 41, 275–279.
2. Aurich J.E., Kühne A., Hoppe H., Aurich C. (1996). Seminal plasma affects membrane integrity
and motility of equine spermatozoa after cryopreservation. Theriogenology 46, 791-7.
3. Paul R., Loomis P.R., Squires E.L. (2005). Frozen semen management in equine breeding
programs. Theriogenology 64, 480–491.
4. Miller C.D. (2008). Optimizing the use of frozen–thawed equine semen. Theriogenology 70, 463–
468.
5. Foote R.H. (2002). The history of artificial insemination: selected notes and notables. Journal of
animal science 80, 1-10.
6. Squires E.L. (2009). Changes in equine reproduction: have they been good or bad for the horse
industry. Journal of Equine Veterinary Science 29, 268-273.
7. Holt W.V. (2000). Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science 62, 3–
22.
8. Loomis P.R. (2001). The equine frozen semen industry. Animal Reproduction Science 68, 191-
200.
9. Loomis P.R., Graham J.K. (2008). Commercial semen freezing: Individual male variation in
cryosurvival and the response of stallion sperm to customized freezing protocols. Animal
Reproduction Science 105, 119–128.
10. Sieme H., Harrison R.A., Petrunkina A.M. (2008). Cryobiological determinants of frozen semen
quality, with special reference to stallion. Animal Reproduction Science 107, 276-292.
11. Petrunkina A.M. (2007). Fundamental aspects of gametes cryobiology. Journal of Reproductive
Medicine and Endocrinology 4, 78–92.
12. Zhmakin A.I. (2008). Physical aspects of cryobiology. Uspekhi Fizicheskikh Nauk 51, 231-252.
13. Medeiro C.M.O., Forell F., Oliveira A.T.D., Rodrigues J.L. (2002). Current status of sperm
cryopreservation: why isn’t it better?. Theriogenology 57, 327-344.
14. Oldenhof H., Gojowsky M., Wang S., Henke S., Yu C., Rohn K., Wolkers W.F., Sieme H. (2013).
Osmotic stress and membrane phase changes during freezing of stallion sperm: mode of action of
cryoprotective agents. Biology of Reproduction 88, 1–11.
15. Morris G.J., Acton E., Murray B.J., Fonseca F. (2012). Freezing injury: the special case of the
sperm cell. Cryobiology 64, 71–80.
16. Katila T. (1997). Procedures for handling fresh stallion semen. Theriogenology 46,1217-1227.
17. Ball B.A. (2008).Oxidative stress, osmotic stress and apoptosis: Impacts on sperm function and
preservation in the horse. Animal Reproduction Science 107, 257–267.
18. Katila T. (2001). In vitro evaluation of frozen–thawed stallion semen: a review. Acta Veterinaria
Scandinavica 42, 199–217.
19. Moore A.I., Squires E.L., Graham J.K. (2005). Effect of seminal plasma on the cryopreservation of
equine spermatozoa. Theriogenology 63, 2372–2381.
20. Vidament M. (2005). French field results (1985–2005) on factors affecting fertility of frozen stallion
semen. Animal Reproduction Science 89, 115–136.
21. Morris G.J., Faszer K., Green J.E., Draper D., Grout B.W.W., Fonseca F. (2007). Rapidly cooled
horse spermatozoa: loss of viability is due to osmotic imbalance during thawing, not intracellular
ice formation. Theriogenology 68, 804–812.
22. Aurich J.A. (2012). Artificial insemination in horses - More than a century of practice and research.
Journal of Equine Veterinary Science 32, 458-463.
26
23. Squires E.L. (2013). Semen cryopreservation - challenges and perspectives. Revista Brasileira de
Reprodução Animal 37, 136-139.
24. Steven P., Brinsko S., Terry L., Blanchard T., Dickson D., Varner D., Schumacher J., Charles C.,
Love C., Hinrichs K., Hartman D.L. (2011). Semen Preservation. Manual of Equine Reproduction,
3rd Edition. Mosby Elsevier, Missouri. 207-227.
25. Smits K., Hoogewijs M., Woelders H., Daels P., Van Soom A. (2012). Breeding or assisted
reproduction? Relevance of the horse model applied to the conservation of endangered equids.
Reproduction of domestic animals 47, 239–248.
26. Sanchez R., Gomez I., Samper J.C. (2009). Artificial insemination with frozen semen. Equine
Breeding Management and Artificial Insemination, 2nd Edition. Saunders, Philadelphia. 175–183.
27. Troedsson M.H.T., Liu I.K.M., Crabo B.G. (1998). Sperm transport and survival in the mare.
Theriogenology 50, 807-818.
28. Thibier M., Guerin B. (2000). Hygienic aspects of storage and use of semen for artificial
insemination. Animal Reproduction Science 62, 233–251.
29. Hurtgen J.P. (2009). Semen collection in stallions. Artificial insemination. Equine Breeding
Management and Artificial Insemination, 2nd Edition. Saunders, Philadelphia. 33-39.
30. Althouse G.C. (2008). Sanitary procedures for the production of extended semen. Reproduction of
domestic animals 43, 374–378.
31. Brinsko S.P., Blanchard T.L., Varner D.D., Schumacher J., Love C.C., Hinrichs K., Hartman D.L.
(2011). Semen Collection and Artificial Insemination with Fresh Semen. Manual of Equine
Reproduction, 3rd Edition. Mosby Elsevier, Missouri. 160-175.
32. Ionata L.M., Anderson T.M., Pickett B.W., Heird J.C., Squires E.L. (1991). Effect of supplementary
sexual preparation on semen characteristics of stallions. Theriogenology 36, 923-937.
33. Sieme H., Katila T., Klug E. (2004). Effect of semen collection practices on sperm characteristics
before and after storage and on fertility of stallions. Theriogenology 61, 769–784.
34. Crabtree J. (2010). Prebreeding examination of the stallion 2. Semen collection and evaluation. In
Practice 32, 58–63.
35. Côté M.A., Blum K.M., Burd M.A. (2011). Sources of spermatozoa loss during collection and
artificial insemination of horses. Animal Reproduction Science 126, 207– 210.
36. Kareskoski M., Katila T. (2008). Components of stallion seminal plasma and the effects of seminal
plasma on sperm longevity. Animal Reproduction Science 107, 249–256.
37. Griggers S., Paccamonti D.L., Thompson R.A., Eilts B.E. (2001). The effects of pH, osmolarity and
urine contamination on equine spermatozoal motility. Theriogenology 56, 613-622.
38. Chenier T.S. (2009). Anatomy and physical examination of the stallion. Equine Breeding
Management and Artificial Insemination, 2nd Edition. Saunders, Philadelphia.1-16.
39. Crabtree J. (2010). Prebreeding examination of the stallion 1. Physical examination. In Practice
32, 22–28.
40. Crockett E.C., Graham J.K., Bruemmer J.E., Squires E.L. (2001). Effect of cooling of equine
spermatozoa before freezing on post-thaw motility: preliminary results. Theriogenology 55, 793-
803.
41. Neto C.R., Monteiro G.A., Soares R.F., Pedrazzi C., Dell’aqua J.A., Papa F.O., Castro-Chaves
M.M., Alvarenga M.A. (2013). New seminal plasma removal method for freezing stallion semen.
Theriogenology 79, 1120–1123.
42. Backman T., Bruemmer J.E., Graham J.K., Squires E.L. (2004). Pregnancy rates of mares
inseminated with semen cooled for 18 hours and then frozen Journal of Animal Science 82, 690-
694.
27
43. Watson P.F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal
Reproduction Science 60, 481–492.
44. Kuisma P., Andersson M., Koskinen E., Katila T. (2006). Fertility of frozen–thawed stallion semen
cannot be predicted by the currently used laboratory methods. Acta Veterinaria Scandinavica 48,
1-8.
45. Bielanski A. (2007). Disinfection procedures for controlling microorganisms in the semen and
embryos of humans and farm animals. Theriogenology 68, 1–22.
46. Corona A., Cherchi R. (2009). Microbial quality of equine frozen semen. Animal Reproduction
Science 115, 103–109.
47. Klein C., Donahue J.M., Sells S.F., Squires E.L., Timoney P.J., Troedsson M.H.T. (2010).
Antibiotic-containing semen extender reduces the risk of transmission of CEM. Animal
Reproduction Science 121, 222–223.
48. Samper J.C., Morris C.A. (1998). Current methods for stallion semen cryopreservation: a survey.
Theriogenology 49, 895–903.
49. Hoffmann N., Oldenhof H., Morandini C., Rohn K., Sieme H. (2011). Optimal concentrations of
cryoprotective agents for semen from stallions that are classified ‘good’ or ‘poor’ for freezing.
Animal Reproduction Science 125, 112– 118.
50. Maziero R.R.D.M., Guasti P.N., Monteiro G.A., Avanzi B.R., Hartwig F.P., Lisboa F.P., Martin I.,
Papa F.A. (2013). Evaluation of sperm kinetics and plasma membrane integrity of frozen equine
semen in different storage volumes and freezing conditions. Journal of equine veterinary science
33, 165 -168.
51. Miller H., Lock S., Busch D., Brace B. (2011). Semen storage and handling. Proceedings, Applied
Reproductive Strategies in Beef Cattle 9, 227-229.
52. Bielanski A. (2012). A review of the risk of contamination of semen and embryos during
cryopreservation and measures to limit cross-contamination during banking to prevent disease
transmission in ET practices. Theriogenology 77, 467–482.
53. Dowsett K.F., Knott L.M. (1996). The influence of age and breed on stallion semen.
Theriogenology 46, 397-412.
54. Katila T., Nivola K., Reilas T., Sairanen J., Peltonen T., Virtala A.M. (2010). Factors affecting
reproductive performance of horses. Pferdeheilkunde 26, 6-9.
55. Vidament M., Dupree A.M., Julienne P., Evian A., Noue P., Palmer E. (1997). Equine frozen
semen: freezability and fertility field results. Theriogenology 48, 907–917.
56. Eldik P., Waaij E.H., Ducro B., Kooper A.W., Stout T.A.E., Colenbrander B. (2006). Possible
negative effects of inbreeding on semen quality in Shetland pony stallions. Theriogenology 65,
1159-1170.
57. Gamboa S., Rodrigues A.S., Henriques L., Batista C., Ramalho-Santos J. (2010). Seasonal
functional relevance of sperm characteristics in equine spermatozoa. Theriogenology 73, 950–
958.
58. Nagy P., Guillaume D., Daels P. (2000). Seasonality in mares. Animal Reproduction Science 60,
245–262.
59. Janett F., Thun R., Bettschen S., Burger D., Hässig M. (2003). Seasonal changes of semen
quality and freezability in Franches-Montagnes stallions. Animal Reproduction Science 77, 213–
221.
60. Blottner S., Warnke C., Tuchscherer A., Heinen V., Torner H. (2001). Morphological and functional
changes of stallion spermatozoa after cryopreservation during breeding and non-breeding season.
Animal Reproduction Science 65, 75–88.
28
61. Magistrini M., Chanteloube P., Palmer E. (1987). Influence of season and frequency of ejaculation
on production of stallion semen for freezing. Journal of Reproduction and Fertility 35, 127–133.
62. Wrencha N., Pintob C.R.F., Klinefelter G.R., Dixc D.J., Flowersa W.L., Farin C.E. (2010). Effect of
season on fresh and cryopreserved stallion semen. Animal Reproduction Science 119, 219–227.
63. Janett F., Thun R., Niederer K., Burger D., Hässig M. (2003). Seasonal changes of semen quality
and freezability in the warmblood stallion. Theriogenology 60, 453–461.
64. Mantovani R., Bailoni L. (2011). Energy and protein allowances and requirements in stallions
during the breeding season, comparing different nutritional systems. Journal of Animal Science
89, 2113-2122.
65. Schmid-Lausigk Y., Aurich C. (2014). Influences of a diet supplemented with linseed oil and
antioxidants on quality of equine semen after cooling and cryopreservation during winter.
Theriogenology 81, 966–973.
66. Johnson L., Thompson D.L. (1987). Effect of seasonal changes in Leydig cell number on the
volume of smooth endoplasmic reticulum in Leydig cells and intratesticular testosterone content in
stallion. Journal of Reproduction and Fertility 81, 227-232.
67. Hoffmann B., Landeck A. (1999). Testicular endocrine function, seasonality and semen quality of
the stallion. Animal Reproduction Science 57, 89–98.
68. Edwards J.F. (2008). Pathologic conditions of the stallion reproductive tract. Animal Reproduction
Science 107, 197–207.
69. Burger D., Wedekind C., Wespi B., Imboden I., Meinecke-Tillmann S., Sieme H. (2012). The
Potential Effects of Social Interactions on Reproductive Efficiency of Stallions. Journal of Equine
Veterinary Science 32, 455-457.
70. Amann R.P., Thompson D.L., Squires E.L., Pickett B.W. (1979). Effects of age and frequency of
ejaculation on sperm production and extragonadal sperm reserves in stallions. Journal of
Reproduction and Fertility 27, 1-6.
71. Neto C.R., Monteiro G.A., Delfiol D.J.Z., Farras M.C., Dell'aqua J.A., Papa F.O., Alvarenga M.A.
(2013). The relationships between scrotal surface temperature, age and sperm quality in stallions.
Livestock Science 157, 358–363.
72. Staempfli S., Janett F., Burger D., Kündig H., Imboden I., Hässig M., Thun R. (2006). Effect of
exercise and suspensory on scrotal surface temperature in the stallion. Theriogenology 66, 2120–
2126.
73. Freidman R., Scott M., Heath S.E., Hughes J.P., Daels P.F., Tran T.Q. (1991). The effects of
increase testicular temperature on spermatogenesis in the stallion. Journal of Reproduction and
Fertility 44, 127-134.
74. Ball B.A. (2008). Diagnostic methods for evaluation of stallion subfertility: a review. Journal of
Equine Veterinary Science 28, 650-665.
75. Janett F., Burkhardt C., Burger D., Imboden I., Hässig M., Thun R. (2006). Influence of repeated
treadmill exercise on quality and freezability of stallion semen. Theriogenology 65, 1737–1749.
76. Mawyer J.D., Cavinder C.A., Vogelsang M.M., Sigler D.H., Love C.C., Brinsko S.P., Blanchard
T.L., Varner D.D., Arnold C.E., Teague S., Gordon R.K. (2012). Thermoregulation of the testicle in
response to exercise and subsequent effects on semen characteristics of stallions. Journal of
animal science 90, 2532–2539.
77. Sairanena J., Katila T., Virtala A.M., Ojala M. (2011). Effects of racing on equine fertility. Animal
Reproduction Science 124, 73–84.