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Utilisation du Cryo-SEM pour l’étude du fonctionnement hydraulique des plantes
Hervé Cochard, Christian Bodet UMR-PIAF, INRA, Clermont-Ferrand
3èmes Journées de formation du Réseau des Centres Commun de Microscopie
Université de Rouen- Maison de l’université3 et 4 Juin 2004
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Le Cryo-SEM en qqes mots:• SEM classique (Philips SEM 505)• Étage cryogénique T < -80°C (Hexland CT 100)
– Observation – Métallisation
• En dessous du point de sublimation de la glace• Observation d’échantillons hydratés mais congelés
• Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation (méthode directe)
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Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal
Photos: C BodetÉpiderme d’une feuille
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Photos: C BodetCoupe d’une feuille (cryo-fracture)
Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal
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Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal
Anatomie d’une aiguille de Pin
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Circulation des sèves dans l’arbre
CO2
Sève élaboréeRiche en sucresDescendantePhloème
H2O
Sève bruteEauAscendanteXylème
Croissancede l’arbre
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Deux phénomènes à mettre en évidence
Présence de bulles d’air dans les vaisseaux
conducteurs (embolie) NormalCollapsé
Déformation de la paroi des vaisseaux (collapse)
From: Piquemal et al 1998
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Observation du xylème au SEMÉchantillons prélevés et déshydratés
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Observation du xylème au cryo-SEMRisques de sublimation de la glace
(cryo-décapage ou métallisation)
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Betula platyphylla, Utsumi et al 1998
Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons prélevés puis congelés
LN2
Cryo-fracture
Cryo-microtome
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La nombre de vaisseaux embolisés dépend du point d’observation
No
mb
re d
e v
ais
seau
x e
mb
olis
és
Distance à la coupemillimètres
Pétiole de Noyer
Tyree, Cochard, Cruiziat PCE 2003.
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Circulation de la sève bruteÉvaporation
Sol : Eau diluée
Xylème: Tubes Parois rigides
Feuilles: Surface poreuse
Feuilles :Pompe
aspirante
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Un système vasculaire sous tension (dépression)
Sol : Eau diluée
• La sève brute est aspirée par dépression
• La « pompe aspirante » se désamorce
• L’appareil vasculaire s’embolise
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Photo: C Bodet, INRA-PIAF
L’appareil vasculaire est constitué de conduits de dimensions
variables mais finies
vaisseau
Terminaison de vaisseau
La sève se retire sur toute la longueur des vaisseaux
Perturbation du contenu des vaisseaux lors du prélèvement des échantillons
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Cochard et al Plant Physiol 2000
Cryo-SEM
LN2
Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons congelés sur l’arbre puis prélevés
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Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons congelés sur l’arbre puis prélevés
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-0.7 MPa
10 µ
m
>-0.03 MPa!
-0.7 MPa
Le paradoxe du Cryo-SEM
Les mesures de tension de sève sont-elles erronées ?
Les observations au cryo-SEM sont-elles erronées ?
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Cryo-SEM
LN2
Importance du mode préparatoire des échantillons
Water
Échantillons recoupés sous eau puis congelés
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Solar Time
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0
5
10
15
20
25
30
Solar Time
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0
5
10
15
20
25
30
0
5
10
15
20
25
30
Per
cent
em
bolis
ed v
esse
ls
Per
cent
loss
con
duct
ance
Water
LN2
+
Variations journalières d’embolie dans un pétiole de noyer
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Vitesse de congélation des échantillons par LN2
LN2
T,°C
Artéfact de congélation
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Collapsus des Collapsus des paroisparois
Étude des phénomènes de collapse
LN2Cochard et al, Plant Physiol 2004
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Mise en évidence du phénomène de collapse par cryo-SEM dans des
aiguilles de Pinus cembra
Aiguille bien hydratée
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Pinus cembra -4 MPa
Aiguille fortement déshydratée
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Pinus cembra -4.6 MPa
Aiguille très fortement déshydratée
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Eau 2 min
Importance du mode préparatoire des échantillons
LN2
LN2
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Conclusions
• Pour le xylème: la fiabilité des observations est très dépendante de la préparation des échantillons.
• Possibilités d’artéfacts et d’interprétations erronées des observations.– Embolie : recouper sous eau– Collapse : ne pas recouper sous eau !
• Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation ?