1
การแยกเช อจลนทรยบรสทธ และการเกบรกษา การแยกเช อบรสทธ
v เช อบรสทธ (pure culture) หมายถงเช อจลนทรยท ประกอบดวยเซลลของจลนทรยชนดเดยวกนซ งมลกษณะเหมอนกนทกประการ
Axenic culture หมายถง เช อชนดเดยวกนแตนามาจากตางท กนแลวนามาเกบรวมกน
เทคนคในการเพาะเช อใหบรสทธ (Pure culture techniques )1.ภาชนะท ใชเล ยงเช อตองไรเช อ ปลอดเช อ (Sterile)2.จะตองปองกนไมใหเกดการปนเป อน (Contamination)
การลดการปนเป อน – ถายหรอเพาะเช อในinoculation room, transfer room inoculating chamber, transfer hood, laminar flow
การถายเช อ – transfer of cultureการเพาะเช อ – inoculation, inoculateเช อท นาไปเพาะ – inoculumเทคนคการปลอดเช อ – Aseptic techniqueการถายเช อ ใช loop, needle, pipette
การแยกเช อใหบรสทธ ( Isolation of Pure Culture )
Plating method – เปนการแยกและทาใหจลนทรยแตละตวหยดการเคล อนท (immobilization) บนหรอในอาหารท ทาใหแขงดวยวน(agar) หรอ jelly 1) Streak plate (looping out ) ลาก – streak – รอยลาก การเจรญท ตดตอกน – confluent growth 2) Pour plate – serial dilution 3) Spread plate – spreader 4) Drop plate – calibrated Pasteur pipette
2
การแยกเช อบรสทธ
1. การขดเช อในจานเพาะเช อ (streak plate) เปนวธการท ใหเช อแบคทเรยท มความเขมขนมากๆ คอยๆกระจายตวออกไป หรอมความเจอจางพอท จะทาใหเซลลแตละเซลลแยกออกจากกน โดยแตละเซลลจะเจรญจนเปนโคโลนท มองเหนดวยตาเปลา
1.1 simple streakเปนการขดเช อแบบงายโดยการใช หวงเข ยเช อ (loop)
ลนไฟจนรอนแดงและท งใหเยน จากน นแตะท เช อจลนทรยท ตองการแยกใหบรสทธ โดยนามาขดบนอาหารวนแขง ลากเปนแนวกน เช อจลนทรยจะเกดการแยกของเซลลจากปรมาณหนาแนน จะเหลอนอยละจนแยกเปนโคโลนเด ยวๆ ได
Simple Streak
1.2 Cross streakการขดเช อแบบตดกน นยมใชมากในหองปฏบตการ ทาเชนเดยวกนวธ simple streak แตจะทาการขดเสนบนอาหารวนแขงตามแนวประมาณ 3-4 แนว ซ งทกคร งท ทาการขดเช อในแตละแนวตองลนไฟท loop และรอใหเยน โดยลากเช อใหตดกน (cross) กบแนวเช อท ลากผานมาแลวเลกนอย ซ งจะลากเสนจากหางไปถ จนไดโคโลนเด ยวๆแยกออกมา โดยการนาอาหารเล ยงเช อท ผานการขดเช อแลวไปบมท อณหภม เหมาะสมนาน 24-48 ชม.
3
Cross streak plate ขอแตกตางของการแยกเช อบรสทธ
2. Pour plate
ทาการเช อใหเจอจางตวอยางลงเร อย ๆ และนาไปผสมกบวนท หลอมเหลวและเยนลง (ประมาณ 50 oC) ในจานอาหารท ผานการฆ าเช อแลวเม อท งไวใหแขงและนาไปเพาะโคโลนกจะเจรญในหรอบนวน วธน นอกจากจะใชแยกเช อใหบรสทธ แลว ยงสามารถใชในการคานวณหาจานวนโดยประมาณของจลนทรยไดอกดวย
การเจอจาง 10 เทา (Ten fold serial dilution)
สารเจอจาง ทาหนาท ในการเจอจางจานวนเซลลของจลนทรยใหอย ในชวงท แหมาะสม
สารท ใชเปนสารเจอจางไดแก Nutrient Broth, 0.85 % NaCl, Peptone water เปนตน
4
วธ Pour Plate
1. เตรยมหลอดอาหาร NA ปรมาตร 15 ml ท ผานการฆ าเช อแลว2. เตรยมปเปตขนาด 1 ml ท ผานการฆ าเช อแลว3. ปเปตเช อท ผานการเจอจางอตราการเจอจาง 10-1 ปรมาตร 1.0 ml ปลอยลงในจานเพาะเช อดวยเทคนคปลอดเช อ4. เทอาหารจากหลอดอาหาร NA 15 ml ลงในจานเพาะเช อท มเช ออย แลว5. หมนจานเพาะเช อเพ อใหเช อและอาหารผสมเขากนด รอจนอาหารกลายเปนวนแขงดแลวจงคว าจานเพาะเช อ แลวนาไปบมท 35-37 oC 24-48 ช วโมง ทาซ าโดยใชเช อท ผ านการเจอจางท 10-2 แทน
Pour Plate
3. Spread plate
นาเช อท ทาใหเจอจางแลวท ความเจอจางท เหมาะสม มากระจาย (Spread) บนผวของอาหารแขง โดยใช Spreader ท ทาดวยแกว หรอโลหะ รปตว L
วธน อาจใชหาจานวนโดยประมาณของจลนทรย ไดเชนกน
ข นตอนการ Spread plate1. ปเปตตวอยางปรมาตร 0.1 มลลลตร ลงท ตาแหนงตรงกลางจานเพาะเช อ2. จมแทงแกวรปตวแอล (spreader) ในแอลกอฮอลเขมขนรอยละ 95 แลวเอยง spreader ท ขอบของบกเกอรเพ อแยกแอลกอฮอลสวนเกนออก3. นาแทงแกวเกล ย spreader ท ผานการจมแอลกอฮอลไปเผาไฟจนแอลกอฮอลไหมหมด และปลอยให spreader เยน
4. นา spreader เกล ยเช อใหท วจานจานเพาะเช อ และระมดระวงไมใหมอสมผสกบขอบดานในของจานเพาะเช อ5. จม spreader ในแอลกอฮอลเขมขนรอยละ 95 และกาจดแอลกอฮอลสวนเกนโดยใหแทงแกวสมผสกบของบกเกอร นาเผาไฟจนแอลกอฮอลไหมหมด ปลอยใหเยน และนาไปเกล ยเช อแบคทเรยจานในจานเพาะเช อท เหลอ โดยข นตอนการ Spread plate 6. กลบจานเพาะเช อใหดานท มอาหารเพาะเช ออย ดานบน แลวนาไปบมท อณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 24-48 ช วโมง
5
Spread plateSpread Plate
Pour plate
Spread plate
4. Drop plate
นาเช อท ทาใหเจอจางแลวท ความเจอจางท เหมาะสม มาหยด (Drop) บนผวของอาหารแขง โดยใช Calibrated Pasteur pipette
วธน อาจใชหาจานวนโดยประมาณของจลนทรย ไดเชนกน
6
Calibrated Pasteur pipette
Digital pipette
Drop plate
Drop plate
7
Dilution shake culture
PDA + Tartaric acid
8
Single cell isolation
- ใชกลองจลทรรศนและ capillary pipette ท ปลายเลกมากๆ ,microprobe - ด ดจลทรยจากตวอยาง มา 1 เซลล- นาไปลางเอาส งเจอปนท มขนาดเลกกวาออก โดยการถายลงในอาหารท ผานการฆาเช อหลายๆ คร ง- จลนทรยท มขนาดเลกท ตองการใชกาลงขยายเกน 100X ตองใช Micromanipulator
micromanipulator
จดสภาพใหเหมาะสมตอการเจรญ มการเตมสารท เรงการเจรญของเช อท ตองการ
Enrichment media
Membrane filtration method
กรองตวอยางและนาแผนกรองมาเล ยงบนอาหารท เหมาะสม
9
(1)
Liquid parafilm
การเททบดวยน ามน
(2)
Bath Freezer
Lyophilizer (3)
10
Lyophilization
deep freeze
Liquid nitrogen tank
(4)
(5)
Refrigerator