FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische analyses
VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION
Analysemethode
Méthode d’analyse
DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR
(I-MET 039)
Bevestiging volgens ISO norm 6579 : 2002 “Microbiology of food and animal
feeding stuffs – Horizontal method for the detection of Salmonella spp.”
Techniek
Technique
PCR
Matrix / matrixgroep
Matrice / Groupe de
matrices
Categorie 1, 2, 3 en 4 (zie ISO 19036)
Datum laatste aanpassing /
Date du dernière adaption
21/12/2012
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische analyses
Overzicht van de prestatiekenmerken :
detectielimiet ≤ 5 cfu / 25 g of 25 ml
De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180
De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn voor de betreffende matrices/parameters:
Deelnemen aan een ringtest met het bekomen van goede resultaten.
Behalen van een detectielimiet van 10 cfu /swabs of /25 g
Historiek validatiedossier:
Versie Herziening
door / datum
Reden Wijzigingen
1 EH/ 12-12 Samenvoegen dossier 2008, 2009
volgens de nieuwe template en
procedure P180
Dossier aanvullen met extra
gegevens en foto’s
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 1/42
VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION
Analysemethode
Méthode d’analyse
DETECTIE VAN SALMONELLA SPP. MET PCR
(I-MET 039)
Bevestiging volgens ISO norm 6579 : 2002 “Microbiology of food and animal
feeding stuffs – Horizontal method for the detection of Salmonella spp.”
Techniek
Technique
PCR
Isolatie - bevestiging
Matrix / matrixgroep
Matrice / Groupe de
matrices
Categorie 1, 2,3 en 4 (zie ISO 19036)
Type validatie
Type de validation
Verificatie
Verantwoordelijke (Naam
en functie)
Responsable
(Nom et fonction)
Elly Harnie
Sectieverantwoordelijke biologische analyses
Opgesteld door
Rédaction par
Naam – Nom: Elly Harnie
Functie - Fonction:
Sectieverantwoordelijke biologische
analyses
Datum - Date: 21-12-2012
Handtekeningen - Signatures: get.
Medewerkers
(Naam en functie)
Collaborateurs
(Nom et fonction)
Analisten microbiologie:
K. De Greif, L. Stas, S. Vanbiesbrouck, A. Van Beversluys, C. De Schepper, M. De Mits, C.
Focquet, H. Van Remoortel, S. De Cocker
Periode van validatie
Période de validation
Start - Début:
Einde - Fin:
De validatie van de PCR methode werd uitgevoerd in 2008, 2009. Dit document bevat
een samenvatting van de validatietesten als gevolg van de nieuwe rapport-template
en procedure.
Methode goedgekeurd en
geschikt bevonden door
Méthode approuvée et jugé
convenable pour la routine
par
Naam – Nom: Ronny Martens
Functie - Fonction: QAM
Datum - Date: 21-12-2012
Handtekeningen - Signatures: get.
Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure
LAB 00 P 180.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 2/42
Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB
P 00 180.
VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION ................................................................................. 1
VALIDATIEPARAMETERS / MATRICES / CRITERIA .................................................................................. 4
VALIDATIEDOSSIER PCR METHODE .......................................................................................................... 4
1 INLEIDING ................................................................................................................................................ 4
2 OPLEIDING EXTERN ............................................................................................................................... 5
3 VALIDATIEPROEVEN ............................................................................................................................. 5
3.1 VALIDATIEPROEF 1: PROEFMONSTERS IN HET LABO GEMBLOUX ...................................................................... 6
3.1.1 Werkwijze ...................................................................................................................................... 6
3.1.2 Resultaten ...................................................................................................................................... 6
3.1.3 Besluit ........................................................................................................................................... 6
3.2 VALIDATIEPROEF 2: BPW + BCR(’S) EN PROEFMONSTERS ............................................................................ 7
3.2.1 Werkwijze ...................................................................................................................................... 7
3.2.2 Resultaten ...................................................................................................................................... 7
3.3 VALIDATIEPROEF 3: MELK + 1 BCR EN PROEFMONSTERS .............................................................................. 8
3.3.1 Werkwijze ...................................................................................................................................... 8
3.3.2 Resultaten ...................................................................................................................................... 8
3.3.3 Besluit ........................................................................................................................................... 9
3.4 VALIDATIEPROEF 4: CATEGORIE 1,3,4 + 1 BCR EN PROEFMONSTERS ............................................................ 10
3.4.1 Werkwijze .................................................................................................................................... 10
3.4.2 Resultaten .................................................................................................................................... 10
3.4.3 Besluit ......................................................................................................................................... 11
3.5 VALIDATIEPROEF 5: RAEMAB (RINGTEST) .................................................................................................. 12
3.5.1 Werkwijze .................................................................................................................................... 12
3.5.2 Resultaten .................................................................................................................................... 12
3.5.3 Besluit ......................................................................................................................................... 12
3.6 VALIDATIEPROEF 6: CATEGORIE 2,4 + 2 BCR’S EN PROEFMONSTERS ............................................................ 12
3.6.1 Werkwijze .................................................................................................................................... 12
3.6.2 Resultaten .................................................................................................................................... 13
3.6.3 Besluit ......................................................................................................................................... 14
3.7 VALIDATIEPROEF 7: CATEGORIE 2,3,4 + 2 BCR’S EN PROEFMONSTERS .......................................................... 14
3.7.1 Werkwijze .................................................................................................................................... 14
3.7.2 Resultaten .................................................................................................................................... 14
3.7.3 Besluit ......................................................................................................................................... 16
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 3/42
3.8 SAMENVATTING BESMETTE MONSTERS PROEVEN 2, 3, 4, 6 EN 7...................................................................... 16
3.9 VALIDATIEPROEF 8: DETECTIELIMIET IN GEHAKT ........................................................................................ 19
3.9.1 Werkwijze .................................................................................................................................... 19
3.9.2 Resultaten .................................................................................................................................... 19
3.9.3 Besluit ......................................................................................................................................... 21
3.10 VALIDATIEPROEF 9: PROEFMONSTERS ...................................................................................................... 21
3.10.1 Werkwijze .................................................................................................................................... 21
3.10.2 Resultaten .................................................................................................................................... 21
3.10.3 Besluit ......................................................................................................................................... 23
3.11 VALIDATIEPROEF 10: DETECTIELIMIET VAN S. TYPHIMURIUM EN S. ENTERITIDIS IN VLEES EN GEHAKT ................ 23
3.11.1 Bepalen niveau opkweek referentiestam .......................................................................................... 23
3.11.2 Besmetten gehakt/vlees met S. Typhimurium en S. Enteritidis ........................................................... 24
3.12 VALIDATIEPROEF 11: RESULTATEN SDC ................................................................................................... 26
3.12.1 Resultaten reeks 1 SDC ................................................................................................................. 26
3.12.2 Resultaten reeks 2 SDC ................................................................................................................. 27
3.12.3 Resultaten reeks 3 SDC ................................................................................................................. 28
4 ALGEMEEN BESLUIT ............................................................................................................................ 29
5 FOTO’S VAN DE METHODE .................................................................................................................. 38
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 4/42
Validatieparameters / matrices / criteria
Matrices :
- categorie 1: vloeistoffen en poeders (bijvoorbeeld melk )
- categorie 2: gemengde vaste stoffen (bijvoorbeeld gemalen vlees)
- categorie 3: kleine (of zeer kleine) vaste stoffen (bijvoorbeeld geraspte wortelen)
- categorie 4: overige vaste stoffen (bijvoorbeeld vlees, kaas)
Volgende parameters werden bepaald :
- Detectielimiet
Criteria:
- Detectielimiet ≤ 10 cfu/25 g of 25 ml
Gebruikte referenties : referentiemonster V.W.A., BCR (CRM)
Ringtest noodzakelijk
Validatiedossier PCR methode
1 Inleiding
Dit dossier is het verwerkte validatiedossier van de bepaling van Salmonella spp. met PCR. De
oorspronkelijke validatie werd uitgevoerd in 2008, 2009. Voorheen werd de klassieke methode uitgevoerd.
Naar analogie met het labo Gembloux werd ook in ons labo gekozen voor het ‘easy protocol’ van Biorad om
te valideren.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 5/42
2 Opleiding extern
Een overzichtstabel van gevolgde externe opleidingen is aanwezig in onderstaande tabel.
Organisator Datum Plaats Aard Personen
Opleiding Biorad 2007 Biorad theorie + praktijk K. Orye (KO)
Ulg + FAVV 28/04/08 FAVV Brussel theorie K. De Greif (KDG)
L. Stas (LS)
E. Harnie (EH)
Opleiding labo
Gembloux
06/08/08 Labo Gembloux praktijk K. De Greif E. Harnie
Opleiding Biorad 26/08/08 Labo Melle theorie +
demonstratie
praktijk
K. De Greif
S. Vanbiesbrouck (SV)
L. Stas
K. Orye
E. Harnie
Opleiding Biorad 04/11/08 Labo Melle theorie +
demonstratie
praktijk
S. De Cocker (SDC)
M. De Mits (MDM)
C. De Schepper (CDS)
A. Van Beversluys (AVB)
Intern werden de mensen opgeleid tijdens de validatietesten (zie verder).
Zowel KDG als SV hebben ervaringen met (real-time) PCR uit vorige werkervaring en/of stage.
3 Validatieproeven
De validatie bestond uit de analyse van proefmonsters, besmette monsters, referentiestammen en
ringstalen.
De detectielimiet werd bepaald door aangekochte monsters te besmetten en te analyseren op detectielimiet
(< 10 cfu/25g of ml). Volgende categorieën werden besmet en geanalyseerd:
- categorie 1: vloeistoffen en poeders (bijvoorbeeld melk )
- categorie 2: gemengde vaste stoffen (bijvoorbeeld gemalen vlees)
- categorie 3: kleine (of zeer kleine) vaste stoffen (bijvoorbeeld geraspte wortelen)
- categorie 4: overige vaste stoffen (bijvoorbeeld vlees, kaas)
Ook werden stalen parallel volgens de ISO norm geanalyseerd.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 6/42
Er werd deelgenomen aan een ringanalyse Raemab in oktober 2008.
3.1 Validatieproef 1: proefmonsters in het labo Gembloux
3.1.1 Werkwijze
In het labo van Gembloux werden een aantal stalen door KDG en EH onder begeleiding (06/08/08)
geanalyseerd.
3.1.2 Resultaten
De resultaten zijn aanwezig in onderstaande tabel. De PCR plaat werd afgedekt met caps.
Tabel 1 Resultaten validatieproef 1
Monsternummer Aard Categorie Resultaat PCR Resultaat ISO
08310129 worst 2 + + (S. Paratyphi B)
08310127 worst 2 + + (S. Paratyphi B)
08310131 worst 2 + + (S. Paratyphi B)
08310130 worst 2 + + (S. Paratyphi B)
08310863 separatorvlees 2 - -
08310864 separatorvlees 2 - -
08320090 roomijs 2 - -
08320059 babyvoeding 4 - -
08320080 radijzen 4 - -
08320053 kip 4 - -
blanco steriel water - - niet uitgevoerd
referentie referentiemonster* - + +
Aantal stalen 10
* S. Enteritidis.
3.1.3 Besluit
De resultaten met PCR en volgens de ISO methode kwamen overeen.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 7/42
3.2 Validatieproef 2: BPW + BCR(’s) en proefmonsters
3.2.1 Werkwijze
In een tweede proef werden door KDG, SV en KO een aantal stalen geanalyseerd. Ook werden 1 en 2
BCR’s (respectievelijk 5 en 10 cfu’s Salmonella Typhimurium) toegevoegd aan gebufferd peptonwater.
De PCR plaat werd afgesloten met caps.
3.2.2 Resultaten
De PCR werd uitgevoerd op 24/09/08. Een overzicht is aanwezig in onderstaande tabel.
Tabel 2 Resultaten validatieproef 2
Monsternummer Aard Categorie Resultaat PCR Resultaat ISO
BPW+ 1 BCR referentie - + niet uitgevoerd
BPW + 2 BCR referentie - + niet uitgevoerd
08381291 ham 4 - -
08381547 worst 2 - -
08381319 schaaldieren 4 - -
08381629 chocomousse 2 - -
08381868 swabs 4 - -
08381869 swabs 4 - -
08381870 swabs 4 - -
08381871 swabs 4 - -
08381872 swabs 4 - -
08381900 weekdieren 4 - -
blanco steriel water - - niet uitgevoerd
referentie - - + +
Aantal stalen 10
3.2.2.1 Besluit
De resultaten op PCR en volgens de ISO methode kwamen overeen.
Zowel 1 als 2 BCR’s werden teruggevonden.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 8/42
3.3 Validatieproef 3: melk + 1 BCR en proefmonsters
3.3.1 Werkwijze
In een tweede reeks werden door SV, LS en EH een aantal stalen geanalyseerd. Ook werd melk besmet met
1 BCR en met 2 BCR’s. Deze besmette stalen werden zowel door SV, LS als EH geanalyseerd.
3.3.2 Resultaten
De PCR werd uitgevoerd op 01/10/08. De resultaten zijn aanwezig in onderstaande tabel. De PCR plaat
werd afgedekt met folie.
Tabel 3 Resultaten validatieproef 3
Monsternummer Analist Aard Categorie Resultaat
PCR
Resultaat
ISO
08391961 SV ham 4 - -
08391965 worst 2 - -
08391969 weekdieren 4 - -
08391974 schaaldieren 4 - -
08391998 schaaldiersalade 2 - -
08391997 schaaldiersalade 2 - -
08392090 swabs 4 - -
08392091 swabs 4 - -
08392092 swabs 4 - -
08392093 swabs 4 - -
08392094 swabs 4 - -
blanco steriel water - - niet uitgevoerd
Melk + 1 BCR melk 1 + niet uitgevoerd
Melk + 2 BCR melk 1 + niet uitgevoerd
Referentiestam* - - + +
08391859 LS eiproduct poeder 1 - -
08391861 eiproduct poeder 1 + -
08391964 eiproduct poeder 1 - -
08391966 worst 2 - -
08391970 worst 2 - -
08391973 ham 4 + -
08392051 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Llandof)
08392052 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Anatum)
08392053 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Montevideo)
08392054 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Llandof)
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 9/42
08392055 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Montevideo)
Melk + 1 BCR melk 1 + niet uitgevoerd
Melk + 2 BCR melk 1 + niet uitgevoerd
Referentiestam* melk 1 + +
Melk + 1 BCR EH melk 1 + niet uitgevoerd
Melk + 2 BCR melk 1 + niet uitgevoerd
Referentiestam* - - + +
08391961 ham 4 - -
08391998 schaaldiersalade 2 - -
Aantal stalen 22 + 2 in duplo
* S. Typhimurium
Het PCR signaal van het monster 08391861 stijgt pas na 45 cycli in FAM. Dit gaat over een zwak positief
staal dat volgens de ISO methode niet werd bevestigd.
Dit werd besproken met Biorad op 04/11/08: stalen die pas na 45 cycli positief zijn, zijn twijfelgevallen.
Het PCR signaal van het monster 08391973 is duidelijk positief terwijl het volgens de ISO methode niet werd
teruggevonden.
Bij de GGO groep in het labo is opgevallen dat het afdichten van een PCR plaat met folie problemen van
uitdamping kan geven op vooral de ‘H’-lijn. In deze reeks bevonden zich een negatief staal (08392091), de
negatieve PCR controle (NC) en een positief monster (08392052) op deze lijn. Deze 3 PCR reacties gaven
geen problemen (juiste curves, juiste resultaten).
Verschillende stammen van Salmonella werden in deze reeks met PCR teruggevonden.
3.3.3 Besluit
De resultaten op PCR en volgens de ISO methode kwamen niet overeen voor 2 monsters. Er wordt verwacht
dat de PCR methode gevoeliger is dan de ISO methode.
Zowel 1 als 2 BCR’s in melk werden teruggevonden zodat de detectielimiet < 10 cfu/25 ml.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 10/42
3.4 Validatieproef 4: categorie 1,3,4 + 1 BCR en proefmonsters
3.4.1 Werkwijze
In een volgende reeks werden door SV en KDG telkens 2 producten per categorie besmet met 1 BCR (= 5
cfu) en geanalyseerd (uitzondering: categorie 1: zie validatieproef 3).
3.4.2 Resultaten
PCR werd door SV en KDG uitgevoerd op 08/10/08. De resultaten zijn aanwezig in onderstaande tabel. De
PCR plaat werd afgedicht met folie.
Tabel 4 Resultaten validatieproef 4
Monsternummer Analist Aard Categorie Resultaat
PCR
Resultaat
ISO
1a KDG groentemix + BCR 3 + niet uitgevoerd
1b groentemix + BCR 3 + niet uitgevoerd
2a kaas + BCR 4 - niet uitgevoerd
2b kaas + BCR 4 + niet uitgevoerd
3a gehakt + BCR 2 - niet uitgevoerd
3b gehakt + BCR 2 - niet uitgevoerd
4a vlees + BCR 4 - niet uitgevoerd
4b vlees + BCR 4 - niet uitgevoerd
3a blanco gehakt blanco 2 - niet uitgevoerd
3b blanco gehakt blanco 2 - niet uitgevoerd
4a blanco vlees blanco 4 - niet uitgevoerd
4b blanco vlees blanco 4 - niet uitgevoerd
08401342 kaas 4 - -
08401530 vacht 4 + + (S. Senftenberg)
08401531 vacht 4 - -
08401532 vacht 4 + + (S. Virchow)
08401533 vacht 4 - -
1a SV groentemix + BCR 3 + niet uitgevoerd
1b groentemix + BCR 3 + niet uitgevoerd
2a kaas + BCR 4 - niet uitgevoerd
2b kaas + BCR 4 + niet uitgevoerd
3a gehakt + BCR 2 + niet uitgevoerd
3b gehakt + BCR 2 - niet uitgevoerd
4a vlees + BCR 4 - niet uitgevoerd
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 11/42
4b vlees + BCR 4 - niet uitgevoerd
1a blanco groentemix blanco 3 - niet uitgevoerd
1b blanco groentemix blanco 3 - niet uitgevoerd
2a blanco kaas blanco 4 - niet uitgevoerd
2b blanco kaas blanco 4 - niet uitgevoerd
08401534 vacht 4 - -
08401559 vloeibaar eiproduct 1 - -
08401679 volledige vogels 4 - +
08401751 kant en klaar product 4 - -
Referentiestam* - - + +
Blanco steriel water - - niet uitgevoerd
Aantal stalen 9
* S. Typhimurium
Het monster 08401679 werd volgens de ISO norm als positief teruggevonden, maar niet met de PCR
methode. Het gaat over een monster vel, genomen van kippenkarkassen. Er kon geen verklaring gevonden
worden (het staal bevond zich niet op de ‘H’-lijn, normale HEX-curve,…).
Verschillende stammen van Salmonella werden in deze reeks met PCR teruggevonden.
De versneden groenten werden zowel door SV als KDG als positief teruggevonden met toevoeging van 1
BCR. Vlees werd door niemand teruggevonden. Voor het gehakt en de kaas werden sommige besmette
monsters teruggevonden. Dit kan erop wijzen dat de detectielimiet voor de methode hoger is dan 5 cfu.
In deze test werden geen stalen op de ‘H’-lijn meegenomen.
3.4.3 Besluit
De resultaten met PCR en volgens de ISO methode kwamen niet allemaal overeen: 1 staal werd niet met
PCR teruggevonden.
Niet alle besmette monsters werden teruggevonden zodat deze producten in een volgende proef (zie 3.6)
opnieuw werden besmet maar nu met 2 BCR’s.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 12/42
3.5 Validatieproef 5: Raemab (ringtest)
3.5.1 Werkwijze
De 5 melkpoeder stalen van Raemab werden door SV geanalyseerd met PCR en volgens de ISO methode.
3.5.2 Resultaten
De test werd uitgevoerd op 16/10/08. De resultaten zijn aanwezig in de onderstaande tabel. De PCR plaat
werd afgedicht met folie.
Tabel 5 Resultaten Raemab
Monsternummer Analist Aard Categorie Resultaat PCR Resultaat ISO
08420244 SV melkpoeder 1 - -
08420245 + +
08420246 - -
08420247 - -
08420248 - -
Referentiestam - - + +
blanco steriel water - - niet uitgevoerd
Er werden geen stalen geanalyseerd op de ‘H’-lijn.
3.5.3 Besluit
De resultaten met PCR en volgens de ISO norm kwamen overeen.
Volgens de organisator was Salmonella Anatum aanwezig in monster 08420245. Dit komt overeen met onze
resultaten.
3.6 Validatieproef 6: categorie 2,4 + 2 BCR’s en proefmonsters
3.6.1 Werkwijze
Er werden opnieuw monsters aangekocht om te besmetten en te analyseren. Deze keer werden 2 BCR’s (=
10 cfu) toegevoegd.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 13/42
3.6.2 Resultaten
PCR werd door SV uitgevoerd op 29/10/08. De resultaten zijn aanwezig in onderstaande tabel.
Een aantal stalen werden op lijn A of B geanalyseerd en ook op H om eventuele verschillen na te gaan. De
PCR plaat werd afgedekt met folie.
Tabel 6 Resultaten validatieproef 6
Monsternr. Analist Aard Categorie Resultaat
PCR A/B
Resultaat
PCR H
Resultaat ISO
08431925 SV vleesbereidingen 2, 4 - - -
08431960 vleesbereidingen 2, 4 - niet uitgevoerd -
08440168 vleesproducten 4 - - -
08440176 vleesbereidingen 2, 4 - - -
Vlees 1 varken lage rib 4 + + niet uitgevoerd
vlees 1 blanco - niet uitgevoerd niet uitgevoerd
vlees 2 rumsteak rund 4
- - +
vlees 2 blanco - niet uitgevoerd niet uitgevoerd
gehakt 1 rund-varken 2
- - -
gehakt 1 blanco - niet uitgevoerd niet uitgevoerd
gehakt 2 varken-kalf 2
- - +
gehakt 2 blanco - niet uitgevoerd niet uitgevoerd
kaas camembert carref. 4 + + niet uitgevoerd
kaas blanco - niet uitgevoerd niet uitgevoerd
referentiestam - - + + +
blanco steriel water - - - niet uitgevoerd
Aantal stalen 4
Opnieuw werden sommige besmette stalen niet teruggevonden, ookal werden 10 cfu’s toegevoegd (de
detectielimiet van de PCR methode is volgens de fabrikant < 10 cfu).
Een aantal zaken werden gecontroleerd:
- vervaldatum BCR’s: er werden BCR’s gebruikt die houdbaar waren tot 01/01/2009; een
mogelijke oorzaak bestaat erin dat deze BCR’s door deze lange bewaartermijn toch van mindere
kwaliteit waren
- in 1.6 % van de BCR’s zijn geen Salmonella spp. aanwezig; dit kan echter niet verklaren
waarom er in deze proef zoveel besmette monsters niet werden teruggevonden
- alle controles = OK
- de monsters geanalyseerd op A/B of op H geven dezelfde resultaten.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 14/42
Bij het nakijken van de PCR curven echter is op H1 (monster vlees 1) wel een verschil aanwezig (zie
bijlage 6b) met hetzelfde monster geanalyseerd op A5: op H1 daalt de curve op het einde van de
PCR reactie en het signaal ligt lager. Toch is de eindconclusie dezelfde: beide waren positief.
Dit dalen van de curve wijst op het uitdampen van de well tijdens de PCR reactie.
- het is niet analist gebonden want alle analisten bekomen gelijkaardige resultaten
Vlees 2, gehakt 1 en gehakt 2 werden door SV ook verder volgens de ISO methode geanalyseerd. Gehakt 1
werd niet teruggevonden maar de twee andere stalen wel.
3.6.3 Besluit
Met toevoeging van 2 BCR’s werden niet alle besmette monsters teruggevonden. Vlees en gehakt geven
problemen.
Deze proef wijst erop dat de detectielimiet van de methode > 10 cfu, wat volgens de fabrikant niet mogelijk
is.
Het uitdampen van de wells was in deze proef geen probleem, maar zou het wel kunnen zijn in andere runs.
Daarom werd in een volgende proef enkel caps gebruikt.
Ook werden nieuwe, recente BCR’s besteld om te besmetten.
3.7 Validatieproef 7: categorie 2,3,4 + 2 BCR’s en proefmonsters
3.7.1 Werkwijze
Zie 3.6.
3.7.2 Resultaten
PCR werd door KDG en LS uitgevoerd op 30/10/08. De resultaten zijn aanwezig in onderstaande tabel.
De PCR plaat werd afgedicht met caps. In de reeks van KDG werden nieuwe BCR ’s meegenomen (met een
houdbaarheidstermijn tot oktober 2009). In de reeks van LS werden zowel ‘oudere’ als nieuw toegekomen
BCR’s meegenomen.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 15/42
Tabel 7 Resultaten validatieproef 7
Monsternr. Analist Aard Categorie Resultaat PCR Resultaat ISO
Kaas KDG camembert 1 4
+ niet uitgevoerd
Kaas blanco -
Gehakt rund-varken
(cfr. SV in proef 6)
2 -
Vlees 1 hespensneden 4
-
Vlees 1 blanco -
Vlees 2 varken lage rib 4
+
Vlees 2 blanco -
blanco steriel water - -
referentiestam - - + +
08431443 kaas 4 - -
08440002 swabs 4 - -
08440003 swabs 4 - -
08440005 swabs 4 - -
08440006 swabs 4 - -
08440085 volledige vogels 4 - -
08440097 volledige vogels 4 - -
08440156 patisserie 4 - -
08440158 patisserie 4 - -
08440165 patisserie 4 - -
08440175 ber. rauwe eieren 4 - -
08440204 filet américain 2 - -
08440221 koude schotel 4 - -
08440227 filet américain 2 - -
Groenten 1 LS salade en rauwkost 3
+ niet uitgevoerd
Groenten 1 blanco -
Groenten 2 geraspte wortelen 3
+
Groenten 2 blanco -
Kaas 1 camemebert 1 4
+
Kaas 1 blanco -
Kaas 2 camembert GB 4 +
Kaas 2 blanco -
Vlees 1 rumsteak rund 4 -
Vlees 1 blanco -
Vlees 2 hespensneden 4 +
Vlees 2 blanco -
Gehakt 1 rund-varken 2 -
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 16/42
Gehakt 1 blanco -
Gehakt 2 varken-kalf 2 -
Gehakt 2 blanco -
Referentiestam - - + +
Aantal stalen 14
Opnieuw werden een aantal besmette monsters niet teruggevonden met dit easy protocol.
Het gebruik van caps en nieuwe BCR’s heeft het probleem niet verholpen. Alle positieve curves vertoonden
een goed exponentieel verloop.
3.7.3 Besluit
Met toevoeging van 2 BCR’s werden niet alle besmette monsters teruggevonden. Vlees en gehakt geven
problemen.
3.8 Samenvatting besmette monsters proeven 2, 3, 4, 6 en 7
In onderstaande tabel wordt een samenvatting gegeven van de besmette monsters.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 17/42
Tabel 8 Samenvatting besmette monsters
Aard Monster Analist Proef Aantal BCR’s Resultaat PCR
GPW GPW KDG/SV 2 1 +
2 +
Melk UHT melk 1 SV 3 1 +
UHT melk 2 2 +
UHT melk 1 LS 1 +
UHT melk 2 2 +
UHT melk 1 EH 1 +
UHT melk 2 2 +
Groenten salademix 1 KDG 4
1 +
salademix 2 1 +
salademix 1 SV 1 +
salademix 2 1 +
salade en rauwkost LS 7 2 +
geraspte wortelen 2 +
Gehakt rundgehakt 1 KDG 4
1 -
varken-rund 2 1 -
rundgehakt 1 SV 1 +
varken-rund 2 1 -
rund-varken 3 SV 6 2 -
varken-kalf 4 2 -
varken-rund 3 KDG 7
2 -
rund-varken 5 LS 2 -
varken-kalf 6 2 -
Vlees vees 1 KDG 4
1 -
vees 2 1 -
vees 1 SV 1 -
vees 2 1 -
varken lage rib SV 6 2 +
rumsteak rund 2 -
hespensneden KDG 7
2 -
varken lage rib 2 +
rumsteak rund LS 2 -
hespensneden 2 +
Kaas camembert 1 KDG 4
1 -
camembert 2 1 +
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 18/42
camembert 1 SV 1 -
camembert 2 1 +
camembert GB SV 6 2 +
camembert KDG 7
2 +
camembert LS 2 +
camembert GB 2 +
Vlees en gehakt geven duidelijk problemen bij het bepalen van de detectielimiet.
Dit werd besproken met het labo te Gembloux. In Gembloux hebben ze geen problemen ondervonden met
het besmetten van deze matrices. Ze hebben wel geen BCR’s gebruikt bij het besmetten omdat ze daar
geen goede ervaring mee hadden in het verleden.
Deze resultaten werden ook besproken met Biorad op 04/11/08. Volgens hen kan het zijn dat gehakt en
vlees teveel interfererende flora hebben om de PCR reactie goed te laten doorgaan. Ze stellen voor om het
standaard protocol uit te proberen voor deze stalen omdat op die manier meer staal wordt genomen (alle
voorgaande proeven werden uitgevoerd met het easy protocol).
Er werd opgemerkt dat waarschijnlijk vanaf 2009 het easy protocol zal aangepast worden: i.p.v. 50 µl zal 100
µl BPW worden genomen. Dit kan een oplossing zijn voor ons probleem (meer staalafname zodat de
stoorflora minder belangrijk wordt) en zal in een volgende proef worden uitgetest.
Op 04/11/08 werd tijdens de training van Biorad een staal vlees en gehakt meegenomen in de reeks. Beide
besmet met 1 BCR en met 2 BCR’s. Zowel het easy als het standaard protocol werden uitgevoerd.
Het besmette vlees werd teruggevonden volgens beide protocols, zowel 1 BCR als 2 BCR’s. Het gehakt
besmet met 1 BCR werd niet teruggevonden volgens het easy protocol, maar wel volgens het standaard
protocol. Gehakt geënt met 2 BCR’s werd volgens beide protocols teruggevonden. Dit resultaat kan erop
wijzen dat het standaard protocol beter is voor deze stalen.
Er werden ook melkstalen geanalyseerd, maar deze bleken negatief te zijn a.g.v. een pipetteerfout van de
opleider.
Tijdens de opleiding van Biorad werd door onze analisten nagegaan of er verschillen waren in hun en onze
werkwijze. Het enige verschil in werken dat kon achterhaald worden was de monstername: wanneer in het
BPW een te dikke vetlaag aanwezig is, werd door onze analisten in voorgaande proeven een deel van het
staal overgegoten in een Stomacherzak met filter vooraleer het staal werd bemonsterd voor PCR.
Biorad stelde voor om met een grotere pipet eerst een deelmonster, voldoende onder de vetlaag genomen,
in een BO-potje te pipetteren om daaruit dan 50 µl monster te nemen voor PCR. Dit zal in een volgende
proef worden uitgetest.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 19/42
In deze reeks werd folie gebruikt. Op de positie H 12 werd een extra positieve controle meegenomen. Het
bleek dat hier inderdaad verdamping optrad (zoals ook gezien bij de GGO’s). Dit is in de grafieken te zien als
een stijgende lijn (i.p.v. een exponentieel verloop). Op 05/11/08 werd het toestel door de fabrikant
gecontroleerd maar er werd geen technisch defect vastgesteld.
Biorad raadt het gebruik van caps aan in plaats van het gebruik van folie omdat het toestel de folie niet goed
aandrukt zodat verdamping mogelijk kan zijn.
Een andere opmerking van Biorad was in verband met de positieve controle: het wordt afgeraden om
stelselmatig in een reeks dergelijke hoge besmetting mee te nemen om contaminatie te voorkomen. Daarom
werd voorgesteld om de positieve controle zeker 1000 x te verdunnen zodat het signaal i.p.v. na 15 cycli pas
na 25 cycli zou stijgen.
In een volgende proef zal het referentiemonster worden meegenomen.
3.9 Validatieproef 8: detectielimiet in gehakt
Omdat in bovenstaande proeven problemen optraden met het bepalen van de detectielimiet in vlees en
vooral in gehakt, werd in deze proef de detectielimiet bepaald in gehakt volgens een nieuw protocol.
3.9.1 Werkwijze
Twee soorten gehakt werden aangekocht om te besmetten met verschillende verdunningen van het
referentiemonster van V.W.A. (lotnummer 6p-0712; 700 cfu/ml). De gebruikte verdunningen om te enten
werden ook uitgeplaat op Brilliance Salmonella om het aantal cfu te bepalen (1 ml / 3 platen Brilliance
Salmonella).
Omdat het easy protocol van Biorad zal wijzigen (in plaats van 50 µl GPW, wordt 100 µl genomen en zo ook
100 µl reagens A) werd dit in deze test ook uitgeprobeerd.
In deze proef werd ook voor ‘vuile’ stalen, op aanraden van Biorad, eerst een deelmonster in een BO potje
overgebracht om vervolgens 50 µl (of 100 µl) te nemen om mee verder te werken. Dit zou het contamineren
van de pipet voorkomen en de kans op verstoring van de PCR reactie wegnemen.
Omdat in de voorgaande proeven een te hoge besmetting van de positieve controle aanwezig was, werd in
deze test slechts 1 ml van het referentiemonster meegenomen (= 700 cfu/ml).
3.9.2 Resultaten
De proef werd door KDG uitgevoerd op 12/11/08. PCR werd uitgevoerd op 13/11/08.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 20/42
De resultaten van de gebruikte verdunningen van het referentiemonster zijn aanwezig in onderstaande tabel.
Tabel 9 Overzicht verdunningsoplossingen
Verdunnings-
oplossing
Verdunning cfu/ml
Verwacht aantal * Geteld aantal
B 1/8 referentiemonster 88 23
C 1/2 B 44 9
D 1/2 C 22 6
E 1/2 D 11 4
F 1/2 E 6 4
* berekend aan de hand van de referentiewaarde
De resultaten van de PCR zijn aanwezig in onderstaande tabel.
Tabel 10 Overzicht resultaten validatieproef 8: detectielimiet gehakt
Monsternr. Protocol Type gehakt Verdunning Resultaat PCR
1 100 µl Varken-rund B +
2 C +
3 D +
4 E +
5 F -
6 geen -
7 Varken-kalf B +
8 C +
9 D +
10 E +
11 F +
12 geen -
13 50 µl Varken-rund B +
14 C +
15 D +
16 E +
17 F -
18 geen -
19 Varken-kalf B +
20 C +
21 D +
22 E +
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 21/42
23 F +
24 geen -
Referentie referentiemonster 1
ml
- +
Blanco water - -
3.9.3 Besluit
De detectielimiet van < 10 cfu/25 g werd met dit nieuwe besmettingsprotocol behaald.
Misschien zijn de Salmonella ’s aanwezig in BCR’s teveel gestresseerd om een goed PCR resultaat te
geven. Alle volgende proeven zullen met dit nieuwe protocol worden uitgevoerd. Er werd geen verschil
gevonden tussen het 50 µl en het 100 µl protocol.
In dit geval werd Salmonella Enteritidis toegevoegd. In een van de volgende proeven zal uitgetest worden of
Salmonella Typhimurium ook kan teruggevonden worden op een dergelijk laag niveau (validatieproef 10).
1 ml van het referentiemonster werd meegenomen als positieve controle, dit bleek nog te hoog te zijn omdat
het PCR signaal al na 18 cycli begon te stijgen. In een volgende proef werd dit niveau van besmetting nog
verlaagd.
3.10 Validatieproef 9: proefmonsters
3.10.1 Werkwijze
In deze proef werden door LS enkel proefstalen bemonsterd. ‘Vuile’ stalen werden eerst bemonsterd in een
BO potje vooraleer 50 µl te nemen voor het uitvoeren van de PCR.
3.10.2 Resultaten
De PCR werd door LS uitgevoerd op 15/11/08. De resultaten zijn samengevat in onderstaande tabel.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 22/42
Tabel 11 Resultaten validatieproef 9
Monsternr. Aard Categorie Resultaat PCR Resultaat ISO
08460031 Filet americain 2 - -
08460032 Filet americain 2 - -
08460033 Filet americain 2 - -
08460034 Filet americain 2 - -
08460035 Filet americain 2 - -
08460041 Gehakt 2 - -
08460042 Gehakt 2 - -
08460043 Gehakt 2 - -
08460044 Gehakt 2 - -
08460045 Gehakt 2 - -
08460051 Filet americain 2 - -
08460052 Filet americain 2 - -
08460053 Filet americain 2 - -
08460054 Filet americain 2 - -
08460055 Filet americain 2 - -
08460084 Roomijs 2 - -
08460132 Vacht 4 - -
08460133 Vacht 4 - -
08460134 Vacht 4 - -
08460135 Vacht 4 - -
08460136 Vacht 4 - -
08460203 2 kleppige weekdieren 4 - -
08460215 Versneden Vlees 4 - -
08460222 Versneden Vlees 4 - -
08460225 Versneden Vlees 4 - -
08460229 Vleesproducten 4 - -
08460237 Mayonaise 2 - -
08460256 Filet americain 2 - -
08460259 Filet americain 2 - -
08460266 Versneden vlees 4 - -
08460269 Filet americain 2 - -
08460306 Koude zakouski 4 - -
08460270 Versneden vlees 4 - -
08460056 Volledige vogels 4 - -
Referentie monster - + +
Blanco Steriel water - - -
Aantal stalen 34
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 23/42
3.10.3 Besluit
De resultaten kwamen overeen.
Er werd geen inhibitie teruggevonden bij mayonaise (= matrix waarbij inhibitie kan optreden volgens Biorad).
3.11 Validatieproef 10: detectielimiet van S. Typhimurium en S. Enteritidis in vlees en gehakt
In deze proef werd naast Salmonella Enteritidis ook met Typhimurium besmet.
3.11.1 Bepalen niveau opkweek referentiestam
Op 24/11/08 heeft LS de referentiestam (Salmonella Typhimurium) opgekweekt en geteld om na te gaan wat
de concentratie was na 3 u incubatie bij 37 °C (BHI). Er werden twee opkweken aangemaakt.
Na incubatie werd een verdunningsreeks aangemaakt om uit te platen (0.1 ml / Brilliance Salmonella).
Het resultaat is aanwezig in onderstaande tabel.
Tabel 12 Validatieproef 10a
Verdunning Platen opkweek 1 Platen opkweek 2
100 overgroeid overgroeid
10-1
overgroeid overgroeid
10-2
overgroeid overgroeid
10-3
overgroeid overgroeid
10-4
159 206
10-5
42 60
10-6
10 14
concentratie 4.7 x 106 cfu/ml 6.2 x 10
6 cfu/ml
Er werd in beide opkweken een vergelijkbaar aantal cfu’s teruggevonden.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 24/42
3.11.2 Besmetten gehakt/vlees met S. Typhimurium en S. Enteritidis
3.11.2.1 Werkwijze
De werkwijze voor de besmetting met S. Typhimurium was als volgt:
- opkweken referentiestam gedurende 3 u bij 37 °C (BHI)
- aanmaken verdunningsreeks tot 10-7
- uitplaten verdunning 10-6
en 10-7
(0.1 ml / Brilliance Salmonella)
- gehakt (kalf-varken) en vlees (kotelet) besmetten met 1 ml van verdunning 10-6
en 1 ml van verdunning
10-7
- ook blanco monsters bepalen
Voor de besmetting met S. Enteritidis werd vertrokken van het verdund referentiemonster zoals beschreven
in validatieproef 8.
Als positieve controle werd 1 kolonie van de referentiestam meegenomen. Vooraleer PCR uit te voeren
werd het geïncubeerde BPW 1000 x verdund.
Het 50 µl protocol werd gevolgd.
3.11.2.2 Resultaten
De proef werd door LS uitgevoerd op 16/12/08 en PCR op 17/12/08. De resultaten zijn aanwezig in
onderstaande tabel.
De opkweek van de referentiestam bevatte 1.2 x 108 cfu/ml zodat het besmettingsniveau kon berekend
worden (zie tabel).
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 25/42
Tabel 13 Resultaten validatieproef 10b
Omschrijving Besmettingsniveau Resultaat PCR
S. Typhimurium Gehakt + verdunning 10-6
130 cfu +
Gehakt + verdunning 10-7
13 cfu +
Vlees + verdunning 10-6
130 cfu +
Vlees + verdunning 10-7
13 cfu +
S. Enteritidis Gehakt + SE 17 cfu +
Vlees + SE +
Blanco’s Gehakt geen -
Vlees -
Water -
Referentie Stam onverdund ongekend +
Stam 1000 x verdund ongekend +
3.11.2.3 Besluit
Zowel Salmonella Enteritidis als Salmonella Typhimurium werden op een laag besmettingsniveau
teruggevonden in gehakt en vlees.
De positieve controle (referentiestam), 1000x verdund gaf ook een positief signaal met PCR. Het signaal
van de onverdunde referentiestam ging na 16 cycli omhoog terwijl het signaal van de verdunde
referentiestam pas na 28 cycli de hoogte in ging. Dit lijkt een goede manier om in volgende runs toe te
passen.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 26/42
3.12 Validatieproef 11: resultaten SDC
In de eerste reeks werd besmet met 1 BCR, in alle andere reeksen werd besmet volgens het nieuw protocol.
In de tweede reeks werden ook twee alternatieven uitgeprobeerd om mee te nemen als positieve controle:
- 100 µl van het referentiemonster (i.p.v. 1 ml) - referentiestam 1000 x verdunnen (i.p.v. een volledige kolonie mee te nemen)
3.12.1 Resultaten reeks 1 SDC
De eerste reeks werd uitgevoerd onder supervisie van KDG op 14/11/08.
Een samenvatting van de uitgevoerde testen door SDC is aanwezig in onderstaande tabel.
Tabel 14 Resultaten validatieproef 11: reeks 1
Datum PCR Monsternr. Aard Categorie Resultaat PCR Resultaat ISO
14/11/08 1 Melk 1 1 - niet uitgevoerd
2 Blanco melk 1 -
3 Melk 2 1 +
4 Blanco melk 2 -
5 Geraspte wortelen 3 +
6 Blanco wortelen -
7 Rauwkost 3 +
8 Blanco rauwkost -
08451713 Vleessla 2 - -
08451745 Kipsla 2 - -
08451750 Charc. worst 2 - -
08451824 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451825 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451826 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451827 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451828 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451947 Kaas 4 - -
Referentie 1 ml referentiemonster - + +
Blanco Steriel water - - niet uitgevoerd
Aantal stalen 9
Melk geënt met 1 BCR werd niet teruggevonden. Dit werd herhaald in een volgende proef maar met het
nieuwe protocol zoals beschreven in validatieproef 8.
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 27/42
3.12.2 Resultaten reeks 2 SDC
De proef werd op 10/12/08 uitgevoerd onder supervisie van SV.
De resultaten zijn aanwezig in onderstaande tabel.
De besmettingsoplossing bevatte 1 cfu/ml (1 kolonie op Brilliance Salmonella).
In deze proef werd ook een test uitgevoerd i.v.m. de positieve controle: er werden twee protocols uitgetest
(zie tabel).
Tabel 15 Resultaten validatieproef 11: reeks 2
Datum PCR Monsternr. Aard Categorie Resultaat PCR Resultaat ISO
10/12/08 Kaas 1 Besmette kaas 4 + niet uitgevoerd
Kaas 1b Blanco kaas -
Kaas 2 Besmette kaas 4 +
Kaas 2b Blanco kaas -
Melk Besmette melk 1 +
Melkb Blanco melk -
08501406 Kipsla 2 - -
08501502 Weekdieren 4 - -
08501866 Kipsla 2 - -
PoscontA 100 µl van het
referentiemonster
- + niet uitgevoerd
PoscontB 1 kolonie van de
referentiestam 1000 x
verdund
- +
Referentiestam - - +
Blanco water - -
Aantal stalen 3
De besmette monsters werden correct teruggevonden.
Zowel PoscontA als PoscontB hadden te hoge DNA waarden (al na 20 cycli positief). Op 17/12/08 werd door
LS een ander protocol uitgetest (zie validatieproef 10).
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 28/42
3.12.3 Resultaten reeks 3 SDC
De proef werd zelfstandig uitgevoerd op 19/12/08.
De resultaten zijn aanwezig in onderstaande tabel.
De besmettingsoplossing bevatte 4 cfu/ml (4 kolonies op Brilliance Salmonella).
Tabel 16 Resultaten opleiding SDC reeks 3
Datum PCR Monsternr. Aard Categorie Resultaat
PCR
Resultaat ISO
17/12/08 gehakt a Besmet gehakt (varken-kalf) 2 + niet uitgevoerd
blanco Blanco gehakt * -
gehakt b Besmet gehakt (varken-rund) 2 +
blanco Blanco gehakt -
Vlees a Besmet vlees (kotelet) 4 +
Blanco Blanco vlees * -
Vlees b Besmet vlees (biefstuk) 4 +
blanco Blanco vlees -
08510049 pudding 4 - -
08510243 pudding 4 - -
08510261 volledige vogels 4 - -
08510422 versneden vlees 4 - -
08510438 braadkippen 4 - -
08510449 versneden vlees 4 - -
08510133 bereidingen met rauwe eieren 4 - -
08510468 vloeibare eiproducten 2 - -
08510544 koude zakoeski 4 - -
Blanco water - - niet uitgevoerd
referentie referentiemonster - + +
Aantal stalen 9
* blanco werd door LS geanalyseerd in proef 10 (SDC en LS hebben dezelfde stalen gebruikt om te
besmetten en te analyseren)
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 29/42
4 Algemeen besluit
De detectielimiet van de PCR methode voor de vier verschillende categorieën is < 10 cfu / 25 g of ml. Een
samenvattende tabel van alle besmette monsters wordt hieronder gegeven.
Tabel 17 Overzicht besmette monsters
Datum Monsternummer Aard Categorie Resultaat PCR
01/10/08* Melk + 1 BCR melk 1 +
Melk + 2 BCR melk 1 +
Melk + 1 BCR melk 1 +
Melk + 2 BCR melk 1 +
Melk + 1 BCR melk 1 +
Melk + 2 BCR melk 1 +
08/10/2008* 1a groentemix + BCR 3 +
1b groentemix + BCR 3 +
2a kaas + BCR 4 -
2b kaas + BCR 4 +
3a gehakt + BCR 2 -
3b gehakt + BCR 2 -
4a vlees + BCR 4 -
4b vlees + BCR 4 -
3a blanco gehakt blanco 2 -
3b blanco gehakt blanco 2 -
4a blanco vlees blanco 4 -
4b blanco vlees blanco 4 -
1a groentemix + BCR 3 +
1b groentemix + BCR 3 +
2a kaas + BCR 4 -
2b kaas + BCR 4 +
3a gehakt + BCR 2 +
3b gehakt + BCR 2 -
4a vlees + BCR 4 -
4b vlees + BCR 4 -
1a blanco groentemix blanco 3 -
1b blanco groentemix blanco 3 -
2a blanco kaas blanco 4 -
2b blanco kaas blanco 4 -
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 30/42
29/10/2008* Vlees 1 varken lage rib 4 +
vlees 1 blanco -
vlees 2 rumsteak rund 4
-
vlees 2 blanco -
gehakt 1 rund-varken 2
-
gehakt 1 blanco -
gehakt 2 varken-kalf 2
-
gehakt 2 blanco -
kaas camembert carref. 4 +
kaas blanco -
30/10/2008* Kaas camembert 1 4
+
Kaas blanco -
Gehakt rund-varken
(cfr. SV in proef 6)
2 -
Vlees 1 hespensneden 4
-
Vlees 1 blanco -
Vlees 2 varken lage rib 4
+
Vlees 2 blanco -
Groenten 1 salade en rauwkost 3
+
Groenten 1 blanco -
Groenten 2 geraspte wortelen 3
+
Groenten 2 blanco -
Kaas 1 camemebert 1 4
+
Kaas 1 blanco -
Kaas 2 camembert GB 4 +
Kaas 2 blanco -
Vlees 1 rumsteak rund 4 -
Vlees 1 blanco -
Vlees 2 hespensneden 4 +
Vlees 2 blanco -
Gehakt 1 rund-varken 2 -
Gehakt 1 blanco -
Gehakt 2 varken-kalf 2 -
Gehakt 2 blanco -
12/11/2008 Gehakt + 23 cfu Varken-rund
100 µl protocol
B +
Gehakt + 9 cfu C +
Gehakt + 6 cfu D +
Gehakt + 4 cfu E +
Gehakt + 4 cfu F -
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 31/42
Blanco geen -
Gehakt + 23 cfu Varken-kalf
100 µl protocol
B +
Gehakt + 9 cfu C +
Gehakt + 6 cfu D +
Gehakt + 4 cfu E +
Gehakt + 4 cfu F +
blanco geen -
Gehakt + 23 cfu Varken-rund
50 µl protocol
B +
Gehakt + 9 cfu C +
Gehakt + 6 cfu D +
Gehakt + 4 cfu E +
Gehakt + 4 cfu F -
blanco geen -
Gehakt + 23 cfu Varken-kalf
50 µl protocol
B +
Gehakt + 9 cfu C +
Gehakt + 6 cfu D +
Gehakt + 4 cfu E +
Gehakt + 4 cfu F +
blanco geen -
14/11/08 Melk 1 Besmette melk 1 -
Blanco melk 1 Blanco -
Melk 2 Besmette melk 1 +
Blanco melk 2 Blanco -
Geraspte wortelen Besmette Geraspte
wortelen
3 +
Blanco wortelen Blanco -
Rauwkost Besmette Rauwkost 3 +
Blanco rauwkost Blanco rauwkost -
24/11/2008 Gehakt + 130 cfu
Besmet monster 2 +
Gehakt + 13 cfu Besmet monster +
Vlees + 130 cfu Besmet monster 4 +
Vlees + 13 cfu Besmet monster +
Gehakt + 17 cfu Besmet monster 2 +
Vlees +17 cfu Besmet monster 4 +
Gehakt Blanco -
Vlees blanco -
10/12/08 Kaas 1 Besmette kaas 4 +
Kaas 1b Blanco kaas -
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 32/42
Kaas 2 Besmette kaas 4 +
Kaas 2b Blanco kaas -
Melk Besmette melk 1 +
Melkb Blanco melk -
17/12/08 gehakt a Besmet gehakt (varken-
kalf)
2 +
blanco Blanco gehakt * -
gehakt b Besmet gehakt (varken-
rund)
2 +
blanco Blanco gehakt -
Vlees a Besmet vlees (kotelet) 4 +
Blanco Blanco vlees * -
Vlees b Besmet vlees (biefstuk) 4 +
blanco Blanco vlees -
*BCR protocol (werkte niet altijd)
Verdere aanvulling van de besmette monsters is aanwezig in onderstaande tabel.
Tabel 18 Overzicht vervolg besmette monsters
Datum/analist Besmettingsniveau Monster Type Resultaat
(/ 25 g of ml)
08/01/09
AVB
6 cfu ME 1 Melk
Categorie 1
Aanwezig
ME 1 blanco Afwezig
ME 2 Aanwezig
ME 2 blanco Afwezig
GR 1 Versneden groenten
Categorie 3
Aanwezig
GR 1 blanco Afwezig
GR 2 Aanwezig
GR 2 blanco Afwezig
12/01/09
AVB
1 cfu KA 1 Kaas Aanwezig
KA 1 blanco Afwezig
KA 2 Aanwezig
KA 2 blanco Afwezig
15/01/09
AVB
4 cfu VL 1 Vlees Aanwezig
VL 1 blanco Afwezig
VL 2 Aanwezig
VL 2 blanco Afwezig
GE 1 Gehakt Aanwezig
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 33/42
GE 1 blanco Afwezig
GE 2 Aanwezig
GE 2 blanco Afwezig
14/01/09
CDS
3 cfu ME 1 Melk Aanwezig
ME 1 blanco Afwezig
ME 2 Aanwezig
ME 2 blanco Afwezig
GR 1 Versneden groenten Aanwezig
GR 1 blanco Afwezig
GR 2 Aanwezig
GR 2 blanco Afwezig
19/01/09
CDS
8 cfu KA 1 Kaas Aanwezig
KA 1 blanco Afwezig
KA 2 Aanwezig
KA 2 blanco Afwezig
VL 1 Vlees Aanwezig
VL 1 blanco Afwezig
VL 2 Aanwezig
VL 2 blanco Afwezig
29/01/09
CDS
3 cfu GE 3 Gehakt Aanwezig
GE 3 blanco Afwezig
GE 4 Afwezig
(laag niveau)
GE 4 blanco Afwezig
30/01/09
CDS
14 cfu GE 5 Gehakt Aanwezig
GE 5 blanco Afwezig
15/01/09
MDM
3 cfu ME 1 Melk Aanwezig
ME 1 blanco Afwezig
ME 2 Aanwezig
ME 2 blanco Afwezig
GR 1 Versneden groenten Aanwezig
GR 1 blanco Afwezig
GR 2 Aanwezig
GR 2 blanco Afwezig
19/01/09
MDM
13 cfu KA 1 Kaas Aanwezig
KA 1 blanco Afwezig
KA 2 Aanwezig
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 34/42
KA 2 blanco Afwezig
VL 1 Vlees / gehakt Aanwezig
VL 1 blanco Afwezig
VL 2 Aanwezig
VL 2 blanco Afwezig
GE 2 Aanwezig
GE 2 blanco Afwezig
29/01/09
MDM
5 cfu GE 3 Gehakt Afwezig
(laag niveau)
GE 3 blanco Afwezig
GE 4 Aanwezig
GE 4 blanco Afwezig
30/01/09
MDM
10 cfu GE 5 Gehakt Aanwezig
GE 5 blanco Afwezig
Een samenvatting van alle proefmonsters die parallel volgens de ISO norm en met de PCR methode werden
uitgevoerd is aanwezig in onderstaande tabel. De resultaten kwamen grotendeels overeen..
Tabel 19 Overzicht monsters parallel PCR en ISO
Monsternummer Aard Categorie Resultaat PCR Resultaat ISO
08310129 worst 2 + + (S. Paratyphi B)
08310127 worst 2 + + (S. Paratyphi B)
08310131 worst 2 + + (S. Paratyphi B)
08310130 worst 2 + + (S. Paratyphi B)
08310863 separatorvlees 2 - -
08310864 separatorvlees 2 - -
08320090 roomijs 2 - -
08320059 babyvoeding 4 - -
08320080 radijzen 4 - -
08320053 kip 4 - -
08381291 ham 4 - -
08381547 worst 2 - -
08381319 Schaaldieren 4 - -
08381629 chocomousse 2 - -
08381868 swabs 4 - -
08381869 swabs 4 - -
08381870 swabs 4 - -
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 35/42
08381871 swabs 4 - -
08381872 swabs 4 - -
08381900 weekdieren 4 - -
08391961 ham 4 - -
08391965 worst 2 - -
08391969 weekdieren 4 - -
08391974 schaaldieren 4 - -
08391998 schaaldiersalade 2 - -
08391997 schaaldiersalade 2 - -
08392090 swabs 4 - -
08392091 swabs 4 - -
08392092 swabs 4 - -
08392093 swabs 4 - -
08392094 swabs 4 - -
08391859 eiproduct poeder 1 - -
08391861 eiproduct poeder 1 + -
08391964 eiproduct poeder 1 - -
08391966 worst 2 - -
08391970 worst 2 - -
08391973 ham 4 + -
08392051 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Llandof)
08392052 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Anatum)
08392053 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Montevideo)
08392054 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Llandof)
08392055 NHC dierl. eiwitten 1 + + (S. Montevideo)
08391961 ham 4 - -
08391998 schaaldiersalade 2 - -
08401342 kaas 4 - -
08401530 vacht 4 + + (S. Senftenberg)
08401531 vacht 4 - -
08401532 vacht 4 + + (S. Virchow)
08401533 vacht 4 - -
08401534 vacht 4 - -
08401559 vloeibaar eiproduct 1 - -
08401679 volledige vogels 4 - +
08401751 kant en klaar product 4 - -
08431925 vleesbereidingen 2, 4 - -
08431960 vleesbereidingen 2, 4 niet uitgevoerd -
08440168 vleesproducten 4 - -
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 36/42
08440176 vleesbereidingen 2, 4 - -
08431443 kaas 4 - -
08440002 swabs 4 - -
08440003 swabs 4 - -
08440005 swabs 4 - -
08440006 swabs 4 - -
08440085 volledige vogels 4 - -
08440097 volledige vogels 4 - -
08440156 patisserie 4 - -
08440158 patisserie 4 - -
08440165 patisserie 4 - -
08440175 ber. rauwe eieren 4 - -
08440204 Filet américain 2 - -
08440221 koude schotel 4 - -
08440227 Filet américain 2 - -
08460031 Filet americain 2 - -
08460032 Filet americain 2 - -
08460033 Filet americain 2 - -
08460034 Filet americain 2 - -
08460035 Filet americain 2 - -
08460041 gehakt 2 - -
08460042 Gehakt 2 - -
08460043 Gehakt 2 - -
08460044 Gehakt 2 - -
08460045 Gehakt 2 - -
08460051 Filet americain 2 - -
08460052 Filet americain 2 - -
08460053 Filet americain 2 - -
08460054 Filet americain 2 - -
08460055 Filet americain 2 - -
08460084 Roomijs 2 - -
08460132 Vacht 4 - -
08460133 Vacht 4 - -
08460134 Vacht 4 - -
08460135 Vacht 4 - -
08460136 Vacht 4 - -
08460203 2 kleppige weekdieren 4 - -
08460215 Versneden vlees 4 - -
08460222 Versneden vlees 4 - -
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 37/42
08460225 Versneden vlees 4 - -
08460229 Vleesproducten 4 - -
08460237 Mayonaise 2 - -
08460256 Filet americain 2 - -
08460259 Filet americain 2 - -
08460266 Versneden vlees 4 - -
08460269 Filet americain 2 - -
08460306 Koude zakouski 4 - -
08460270 Versneden vlees 4 - -
08460056 Volledige vogels 4 - -
08451713 Vleessla 2 - -
08451745 Kipsla 2 - -
08451750 Charc. worst 2 - -
08451824 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451825 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451826 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451827 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451828 Vleesber. pluimvee 4 + + (S. Typhimurium)
08451947 Kaas 4 - -
08501406 Kipsla 2 - -
08501502 Weekdieren 4 - -
08501866 Kipsla 2 - -
08510049 pudding 4 - -
08510243 pudding 4 - -
08510261 volledige vogels 4 - -
08510422 versneden vlees 4 - -
08510438 braadkippen 4 - -
08510449 versneden vlees 4 - -
08510133 bereidingen met rauwe
eieren
4 - -
08510468 vloeibare eiproducten 2 - -
08510544 koude zakoeski 4 - -
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 38/42
5 Foto’s van de methode
Hieronder volgen enkele foto’s van de methode.
PCR met bijhorende computer
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 39/42
PCR plaat in het PCR toestel brengen en starten van het toestel
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 40/42
Enten RVS en MKTTn
+ XLD plaat
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 41/42
+ Brilliance Salmonella
FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE
LABO: FLVVM SECTIE - SECTION: Biologische Analyses
LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport – Modèle rapport de validation v.01 2012-03-15 42/42
Bevestigingstest met API