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Erwin R. SchmidtInstitut für Molekulargenetik
2. VL
Thema Gentechnologie
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gibt 4 ,IV
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Restriktionsenzyme
• Statistik:Enzymes: Total: 15093 • Restriction Enzymes 3843 • Type I 92 • Type II 3735 • Type III 11 • Type IV 5• Weirdo REs 1• Putative REs 3484 • Kommerziell erhältlich 278
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Struktur R-Enzym HincII
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Struktur der R-Endonuklease Bam HI
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Erkennungssequenz
Hochmolekulare DNA
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Typ II-Restriktionsenzyme erkennen und schneiden die DNA an palindromischen Sequenzen
z. B. 5´-GGAATTCC-3´
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Restriktionsenzyme
• Sternaktivität? R-Enzyme können bei suboptimalen Bedingungen eine reduzierte Spezifität bezüglich der Erkennungssequenz aufweisen
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Restriktionsenzyme
Alles über R-Enzyme:http://rebase.neb.com
• http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp
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In der Gentechnologieist die Neukombinationunterschiedlicher DNA-Moleküle wichtig.
Das Verknüpfen von DNA-Molekülen erledigt das Enzym „DNA-Ligase“
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Komplementäreüberhängende Enden („Sticky ends“)erleichtern das Wiederverknüpfen von DNA-Molekülen
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Die DNA-Ligase verknüpft zwei DNA-Moleküle
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Die DNA-Ligasen sind in der Lage, Phospho-diesterbindungen zu knüpfen. Sie brauchen dafüEnergie, die entweder durch ATP oder NAD+geliefert wird
T4-DNA-Ligase
E. coli DNA-Ligase
Ligase AMP
Ligase
AMP
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In der Gentechnologieist die Neukombinationunterschiedlicher DNA-Moleküle wichtig.
Das Verknüpfen von DNA-Molekülen erledigt das Enzym „DNA-Ligase“
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Für die Selektionder gewünschtenrekombinantenKlone braucht mandie Vektor-DNA
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Asymmetrische Restriktion von Vektor und Integrat-DNA
AATTGGCC
CCGGAATT
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Funktionen der Vektor DNA
• Sorgt für Replikation in der Wirtszelle• Stellt selektierbare Markergene bereit• Hat Vielzweck-Klonierungsstelle• Trägt Signalsequenzen für Genexpression• Verschiedenste Modifikationen für
spezielle Anwendungen (z. B. „Shuttle“zwischen Pro- und Eukaryoten; Elemente für künstl. Chromosomen)
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Typische Vektoren besitzen einen Replikationsorigin,selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle
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Typische Vektoren besitzen einen Replikationsorigin,selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle
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Inzwischen gibt es die verschiedensten Farbvariationen als Marker oder Reportergene
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Plasmide als Vektoren
Plasmide sind extrachromosomale, autonom replizierende,meist zirkuläre DNA-Moleküle,die natürlicherweise in vielen Bakterien vorkommen
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Plasmid-DNA
E. coli DNA
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Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Plasmids in der Zustandsform
„supercoiled“(rechts) bzw. „relaxed circle“ (links)
http://www.gen.cam.ac.uk/Images/summers/plasmids.jpg
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aus Weaver/Hedrick
z.B. Resistenzplasmide
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Plasmide als Vektoren