Download - Vplyv vybraných génových polymorfizmov receptoru vitamínu D na priebeh sclerosis multiplex
Vplyv vybraných génových polymorfizmov receptoru vitamínu D na priebeh sclerosis multiplex
Čierny Daniel 1, Michalik, J. 2, Dobrota, D. 1, Lehotský, J. 1
UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVEJesseniova lekárska fakulta v Martine
1 Ústav lekárskej biochémie JLF UK, Martin2 Neurologická klinika, Univerzitná nemocnica Martin
14. vědecko-pedagogická konference učitelů biochemických oborů lékařských fakult v ČR a SR
Plzeň, 30. 5. 2013
Etiopatogenéza sclerosis multiplex
Environmentálne faktory
• vitamín D• infekcie – EBV, HSV• fajčenie
Genetické faktory
• HLA gény• non-HLA gény
Epigenetické zmeny
• demyelinizačné zápalové autoimunitné ochorenie CNS
• autoreaktívny klon T-lymfocytov → zápal → poškodenie myelínu →
axonálna degenerácia → remyelinizácia → neurologický deficit
Rýchlosť progresie sclerosis multiplexSkóre EDSS (Expanded Disability Status Scale, Kurtzke) : 0 – 10
• rozšírená Kurtzkeho škála funkčnej nespôsobilosti
• posudzuje hybnosť rúk, schopnosť chôdze, výkon denných aktivít, sebestačnosť, schopnosť komunikácie, prehĺtania, poruchy funkčných systémov
Zneschopnenie pacienta
KURTZKE, J.F. 1983.
„malígna“ SM ČAS (roky)
„benígna“ SM
EDSS ≥ 3,5 5
EDSS ≥ 4 7 EDSS ≤ 2EDSS ≥ 5 10 EDSS ≤ 3 EDSS ≥ 6 15 EDSS ≤ 4
EDSS ≥ 6,5 20 EDSS ≤ 5EDSS ≥ 7 30 EDSS ≤ 6
Vitamín D
• príjem – v potrave, tvorba v koži (UV žiarenie)
• odporúčaná denná dávka – cca 1000 IU
• regulácia kostného metabolizmu
• imunomodulačné účinky (karcinogenéza, autoimunita)
Imunomodulačné účinky vitamínu D
• T-lymfocyty - inhibícia sekrécie INF-γ TH1-ly, zlepšenie funkcie TREG-ly,
↑ tvorby IL-10, posun v smere TH2
• B-lymfocyty – ↓ expresie MHC II molekúl, ↓ tvorby Ig,
↓ diferenciácie plazmatických buniek
• makrofágy a dendritické bunky - ↓ sekrécie IL-12 a TNF-ɑ, ↓sekrécie
stimulačných molekúl, ↓ zrenia a chemotaxie DC
(Bikle, 2011)
Vitamín D a sclerosis multiplex
• vplyv na oligodendrocyty už počas vývinu jedinca
• protektívny efekt voči vzniku SM (Munger et al., 2004)
• hypovitaminóza D – rizikový faktor vzniku SM
• denná dávka 400 IU redukuje riziko vzniku SM o 80 % (Simon et al., 2010)
• plazmatická hladina negatívne koreluje s výskytom relapsov SM (Soilu- Hanninen et al., 2005)
• v oblastiach mierneho klimatického pásma, tehotné ženy, deti s
anamnézou SM – preventívna suplementácia vit. D (Pierrot-Deseilligny a
Souberbielle, 2011, Chaudhuri, 2005)
• potenciálne liečebné účinky u pacientov s SM (Cadden et al.., 2011)
Mechanizmus účinku vitamínu D
Imunomodulačné účinky
KALCITRIOL v plazmevitamín D viažúci proteín (DBP)
Cieľové tkaniváVDR - receptor
vitamínu D
Kostný metabolizmus
hydroxylácia
Antibakteriálne účinky
Génové polymorfizmy VDR
Ovplyvnenie: • VDR mRNA – hladina, stabilita, zostrih• VDR proteín – stabilita, izoformy, interakcie
Génové polymorfizmy VDR a SM
• zámena C / T resp. F / f (SNP rs10735810)
• spôsobuje posun iniciačného kodónu VDR génu
• alelová varianta f (resp. T) - vznik VDR proteínu dlhšieho o 3 aminokyseliny v porovnaní s alelou F
• alela F (resp. C) – kratší VDR proteín divého typu – vyššia transkripčná aktivita (účinnejšia interakcia s TFIIB)
Fok I polymorfizmus VDR
Fok I polymorfizmus VDR
• protektívny efekt vitamínu D z exogénnych zdrojov – iba u jedincov s genotypom ff (Simon et al., 2010)
• zníženie rizika vzniku SM – genotyp ff (Partridge et al.,2004)
• nižšia frekvencia genotypu ff u pacientov s vyšším EDSS skóre (Mamutse et al., 2008)
• u jedincov s genotypom obsahujúcim alelu F nižšia plazmatická hladina kalcidiolu (Orton et al., 2008)
FF Ff ff
ApaI a TaqI polymorfizmus VDRApaI polymorfizmus
• zámena G / T resp. A / a (SNP rs7975232)• bez zmeny aminokyseliny, ale mení stabilitu mRNA• alela A – vyššie riziko vzniku SM (Tajouri et al., 2005)
• alela A – ↑ frekvencia u SM pacientov, ↑ riziko SM v kombinácii s alelou b a HLA-DRB1*1501 (Niino et al., 2000)
TaqI polymorfizmus
• zámena T / C resp. T / t (SNP rs731236)• alela t – ↑ frekvencia u SM pacientov, 2-krát ↑ riziko vzniku SM,
3-krát ↑ riziko vzniku progresívnej SM (Tajouri et al., 2005)
Súbor vyšetrovaných jedincov
Doteraz nazbierané vzorky DNA:
160 dobrovoľných darcov krvi205 pacientov s SM
Vyšetrení jedinci: PACIENTI SMSPOLU 100POMALÁ PROGRESIA 33RÝCHLA PROGRESIA 21KONVENČNÁ SM 79
ZDRAVÍ JEDINCISPOLU 100
Metodika práce• odber 5 ml vzorky periférnej krvi
• izolácia DNA
• amplifikácia DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)
• štiepenie produktu PCR restrikčnými endonukleázami
(FokI , ApaI, TaqI)
• elektroforéza (2% agarózový gél, etídiumbromid)
• vyhodnotenie (UV lampa)
Predbežné výsledky
• 39 pacientov s SM (18 RP SM, 21 PP SM) a 58 zdravých jedincov
S rýchlejšou progresiou SM je asociovaná:
• alela f FokI polymorfizmu (OR = 2,48, 95% CI = 1,14 – 5,35, p = 0,016, vs. CTL)
• alela a ApaI polymorfizmu (OR = 2,5, .95% CI = 0,99 – 6,26, p = 0,04, vs. PP SM)
alela F alela f0.00%
10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%
CTLSMRP SMPP SM
FokI polymorfizmus – alelové frekvencie
alela A alela a0.00%
10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%80.00%
CTLSMRP SMPP SM
ApaI polymorfizmus – alelové frekvencie
Výsledky – ApaI polymorfizmus VDR
ApaI polymorfizmus VDR - genotypy
AA Aa aa
CTL 34 37 29
SM 30 52 18
POMALÁ PROGRESIA 12 17 4
RÝCHLA PROGRESIA 6 7 8
KONVENČNÁ SM 24 45 10
Výsledky – Taq I polymorfizmus VDR
TaqI polymorfizmus VDR - genotypy
TT Tt tt
CTL 41 41 18
SM 36 52 12
POMALÁ PROGRESIA 7 22 4
RÝCHLA PROGRESIA 10 7 4
KONVENČNÁ SM 26 45 8
Výsledky – Fok I polymorfizmus VDR
FokI polymorfizmus VDR - genotypy
FF Ff ff
CTL 35 53 12
SM 32 52 16
POMALÁ PROGRESIA 9 19 5
RÝCHLA PROGRESIA 3 12 6
KONVENČNÁ SM 29 40 10
V skupine s rýchlou progresiou SM:• signifikantne vyššia frekvencia alely f (vs. CTL: p = 0.02; OR = 2.12; .95 CI = 1.08 – 4.18)
(vs. konv. SM: p = 0.02; OR = 2.17; .95 CI = 1.09 – 4.34)
**
*
Záver
• alelové frekvencie polymorfizmov FokI, ApaI a TaqI sa nelíšia medzi kontrolnou skupinou a SM
• alelové varianty polymorfizmov ApaI a TaqI nesúvisia s rýchlosťou progresie SM
• alela f polymorfizmu FokI je spojená s rýchlejšou progresiou SM
• predpoklad - efekt je spôsobený znížením aktivity VDR a následnou nedostatočnou imunomodulačnou a protizápalovou funkciou vitamínu D
Ďalšie ciele• overiť zistené súvislosti vo väčšej skupine jedincov• analyzovať imunologické a biochemické parametre• vyšetriť ďalšie génové polymorfizmy metabolizmu vitamínu D
Gén Funkcia Lokalizácia génu
SNP Polymorfná alela
CYP27B1 (25-hydroxy-vitamín D-1α-hydroxyláza)
hydroxylácia 12q13
rs703842 C/Trs10877012 G/Crs4646536 C/T
rs10877015 A/Grs118204009 A/Grs118204012 A/Grs118204011 C/T
CYP2R1 (mikrozomálna vitamín D 25-hydroxyláza)
hydroxylácia 11p15 rs10741657 A/Grs10500804 G/Trs12794714 A/G
DBP (vitamín D viažúci proteín) transport v plazme 4q12 rs7041 G/Trs4588 A/C
VDR (vitamín D receptor)receptor 12q13
rs1544410 (BsmI) T/C (B/b)rs7975232 (ApaI) T/G (A/a)rs731236 (TaqI) T/C (T/t)
rs10735810 (FokI) C/T (F/f)rs11568820 (Cdx2) G/A
rs2254210 A/Grs98784 C/T
CYP24A1 (vitamín D 24-hydroxyláza) deaktivácia 20q13 rs2296241 A/G
Spolupráca
• Ústav lekárskej biochémie JLF UK
• Neurologická klinika UNM
• Národná transfúzna služba v Martine
Ďakujem za pozornosť!