dr. abel moreno carcamo - ifuap.buap.mx · pdf filedr. abel moreno carcamo departamento de...
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DR. ABEL MORENO CARCAMO
Departamento de Química Biomacromolecular Instituto de Química
UNAM E-mail-address : [email protected]
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La Biomineralización es el estudio de la formación,
estructura y propiedades de sólidos inorgánicos
depositados en sistemas biológicos.
Esta es una ciencia emergente que está conectada a la
Biología, la Química, la Física y la Ciencia de los
Materiales.
¿Qué significa la biomineralización?
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BIOMINERALIZACIÓN
Este proceso se puede dividir en los seres vivos en dos tipos:
• 1) Patológico: cálculos renales y biliares así como la precipitación cardiovascular.
• 2) No patológico: como la formación de hueso, cascarones de huevo, concha nácar, formación de cristales de oxalato de calcio en plantas.
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Biomineralización de Carbonato de Calcio (CaCO3)
•Calcita
•Aragonita
•Vaterita
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Mg-CaCO3 (Calcita)
CaCO3 (Vaterita)
CaCO3 (Calcita
Aragonita)
CaCO3 * nH2O
(Amorfo)
Reserva
Refuerzo
mecánico
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BIOMINERALIZACIÓN de CaCO3
• Addadi, L.; Weiner, S. 1992. Control and Design Principles in Biological Mineralization.
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31, 153-169.
• Mann, S.; Webb, J & Williams, J. P. (ed). 1989. Biomineralization. Chemical and biochemical
perspectives. VCH. N. Y. USA. 541 pp.
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...biomineralización de CaCO3 en cascarones de huevos...
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...los cascarones de huevos de aves están compuestos de CaCO3 ...
Membrana orgánica fibrilar
Cono
Cutícula
Palizada Mineral
Zona Mamilar
• Dauphin, Y.; Cuif, Jean-Pierre.; Salome, M.; Susini, J.; Williams, C. T. 2006. Microstructure and
chemical composition of giant avian eggshells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 386, 1761-
1771.
• Hincke, M. T.; Gautron, J.; Panheleux, M.; García-Ruíz, J. M.; McKee, M. D.; Nys, Y. 2000.
Identification and localization of lysozyme as a component of the eggshell membranes and eggshell
matrix. Matrix Biol. 19, 443-453
• 96 % CaCO3, 4 % de fase
orgánica.
• color blanco. 15 cm x 13
cm.
• Mg, S, P, Fe, Ba, Mn y Sr
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... ¿ Cómo se forman los núcleos cristalinos de CaCO3?...
20 Å20 Å
CaCO3
ProteProteíínas int ramineralesnas int raminerales
Núcleo
cristalino de CaCO3
Proteína
Membrana orgánica fibriliar
• Fernández, M. S.; Passalacqua, K.; Arias, J. I.; Arias, J. L. 2004. Partial biomimetic reconstitution of avian
eggshell formation. Journal of Structural Biology. 148, 1-10
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Struthio Camelus (SCA-1
y SCA-2) Rhea americana
(RCA-1 y RCA-2)
Dromaius
novaehollandiae
(DCA-1 y DCA- 2)
Gallus gallus (OC-17)
Anser anser (Ansocalcina)
...proteínas intraminerales del cascarón de huevo de algunas aves ...
• Mann, K.; Siedler, F. 2006. Amino acid sequences and phosphorylation sites of emu and rhea eggshell C-
type lectin-like proteins. Comparative Biochemistry and Phisiology, Part B. 160-170.
SCA-1 (PM: 15,343.2 ± 4 Da)
SCA-2 (PM: 16,834.1 ± 2 Da)
RCA-1 DCA-1 SCA-1 ANCA RCA-2 DCA-2 SCA-2 OC-17
DCA-1 77.0
SCA-1 73.5 69.7
ANCA 69.7 63.6 62.9
RCA-2 45.2 45.8 45.4 47.0
DCA-2 43.0 43.7 43.2 44.7 78.2
SCA-2 43.7 44.4 43.9 44.7 84.5 82.4
OC-17 37.8 37.3 38.6 35.6 46.5 42.3 43.7
RCA-1 DCA-1 SCA-1 ANCA RCA-2 DCA-2 SCA-2 OC-17
DCA-1 77.0
SCA-1 73.5 69.7
ANCA 69.7 63.6 62.9
RCA-2 45.2 45.8 45.4 47.0
DCA-2 43.0 43.7 43.2 44.7 78.2
SCA-2 43.7 44.4 43.9 44.7 84.5 82.4
OC-17 37.8 37.3 38.6 35.6 46.5 42.3 43.7
DCA-1 (PM: 16,343.2 ± 4 Da)
DCA-2 (PM: 16,734.1 ± 2 Da
RCA-1 (PM: 16,635.2 ± 4 Da)
RCA-2 (PM: 16,347.1 ± 2 Da)
ANCA (PM: 15,300.2 ± 4 Da)
OC-17 (PM: 15,300.2 ± 4 Da)
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• Mann, K.; Siedler, F. 2006. Amino acid sequences and phosphorylation sites of emu and rhea eggshell C-
type lectin-like proteins. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B. 160-170.
• Alineamiento de secuencias
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...proteínas con dominios similares al de Lectina tipo-C (CTLD)
Estructura CTLD
• Zelensky, A. N.; Gready, J. E. 2005. The C-type lectin-like domain superfamily. FEBS Journal. 272, 6179–
6217
• Reyes-Grajeda, J. P.; Moreno, A.; Romero, A. 2004. Crystal Structure of Ovocleidin-17, a Major Protein of
the Calcified Gallus gallus Eggshell. Journal of Biological Chemistry. 279, 40876-40881.
OC-17 Sitios de unión a calcio en CTLDs
EPN QPN WND
Ca2+
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Cristal de Ovocleidin-17. Escala de barra = 0.1mm
Grupo espacial P3221 (OC-17)
Parámetros de celda (Å) a = b = 58.26 c = 82.46
Ángulos = 90.00 = 90.00 =120.000
Limite de Resolución (Å) 1.5 Volumen de la celda
unitaria
279888.008
Rmerge(%) 0.63
Número de moléculas en
ASU
1
Mosaicity: 0.2
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Patrón de Difracción
Estructura 3D de la OC-17
a 1.5Å de resolución
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Mapa de densidad electrónica a 1.5 Å
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Molecular surface and electrostatic potential
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... proteínas intraminerales (CTLD) sin conservación de los
motivos de unión a Ca2+...
• Alineamiento de secuencias
• http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html
¿ interacción con iones carbonato?
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Núcleo
cristalino de CaCO3
Proteína
Membrana orgánica fibriliar OC-17
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EXTRACCIÓN
* Lavar con
abundante agua y
fraccionar en
trozos grandes
Lavar, EDTA 5 % (1 h, 4 oC)
Secar a temp. ambiente.
Mortero-polvo cascarón
Extraer ác. acético 10 %
(20 mL/g polvo cascarón, 36-48 h, 4 oC)
Filtrar extracto (eliminar trozos de
cascarón, 0.2 μm )
Concentrar-Amicón-YM3
1. AISLAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS SCA-1 Y SCA-2
Protocolo de aislamiento y purificación
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
ANTES DEL HPLC
Dializar (5x10 vol., ác. acético 5 %,
eliminar iones calcio)
Precipitar fracción soluble (sulfato
de amonio, 24 h).
Centrifugar (90 min, 4 oC, se
descarta sobrenadante, se
resuspende el botón en ác. acético 5
%)
Dializar (5x10 vol., ác. acético 5 %,
eliminar el sulfato de amonio)
Filtrar, PVDF, 0.2 μm.
Muestra lista para HPLC
HPLC-FASE REVERSA (C-18,
acetonitrilo, TFA 0.1 %) o Exclusión
molecular Sephadex-75.
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Figura 1. a) SDS-PAGE 12.5 % (extracto intramineral), b) Cromatograma del
extracto intramineral (HPLC fase reversa), c) Proteínas SCA-1 y SCA-2
2. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LAS PROTEÍNAS SCA-1 Y SCA-2
1 2(kDa)
188
62
49
38
28
18
14 SCA-1
SCA-2
a)
SCA-1
SCA-2
SCA-2
b)
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5. INTERACCIÓN DE LAS PROTEÍNAS SCA-1 y SCA-2 CON IONES CARBONATO
POTENCI OSTATO-
GALVANOSTATO
ET ER EA
ÄV
IElectrolito
(LiClO4 )
E T : electrodo de trabajo
E R : electrodo de referencia
E A : electrodo auxiliar
ÄV : voltaje entre ET y ER
I: corriente entre ET y EA
VOLTAMPEROMETRÍA CÍCLICA POTENCIOSTATO/GALVANOSTATO
AUTOLAB PGSTAT 30.
EA: ALAMBRE DE PLATINO
ER: CALOMEL SATURADO, E = 0.241 V
versus NHE
Liliana Marín-García, et al., Crystal Growth and Design 8 (2008) 1340-1345
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...interacción proteína-carbonato...
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...interacción proteína-carbonato...
-100
-50
0
50
100
150
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5
SCA-1
I (μ
A)
-100
-50
0
50
100
150
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5
I (μ
A)
SCA-2
-100
-50
0
50
100
150
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5
Blanco (sin proteína adsorbida sobre ET)
I (μ
A)
• 0.1 mol L-1 LiClO4
• adiciones sucesivas
de Na2CO3
• 100 mVs-1
• 10 µg cada una de las
proteínas
Liliana Marín-García, et al., Crystal Growth and Design 8 (2008) 1340-1345
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...interacción proteína-carbonato...
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8 10 12 14
a
b
c
Concentración de iones carbonato (mM)
I Io
SCA-1
SCA-2
Blanco
Proteína intramineral
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Malvern Nano S
3. ESTUDIOS DE DISPERSIÓN DINÁMICA DE LUZ
Detector
LáserAnalito
173 o
Detector
LáserAnalito
173 o
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...estudios de dispersión dinámica de luz (DLS)...
Ecuación Stokes-Einstein:
kT
3 π η D dH =
dH
Láser
633 nm
Detector
Correlación perfecta
Partículas grandes
Partículas pequeñas
t = ∞ t = 0
Tiempo
Co
rrel
ació
n
1.00
Coeficiente de difusión
traslacional (D)
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... determinación de los estados de agregación de las
proteínas SCA-1 y SCA-2 en función de la temperatura...
dH
0
200
400
600
800
1000
0 10 20 30 400
500
1000
1500
2000
0 10 20 30 40
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Templado de proteína con dH constante
Núcleo cristalino de carbonato de calcio
dH
dH
¡Se forman templados de SCA-1 en presencia de CO32-!
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4. INFLUENCIA DE LAS PROTEÍNAS SCA-1 Y SCA–2 SOBRE
LA CRISTALIZACIÓN DEL CARBONATO DE CALCIO
0.1 M CaCl2
0.1 M Carbonato de Amonio
Proteínas: 50, 100, 200 μg 1. Calcita/SCA-1 2. Calcita/SCA-2
4. Calcita/lisozima 3. Calcita/OC-17
Liliana Marín-García, et al., Crystal Growth and Design 8 (2008) 1340-1345
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Templado de proteína con dH constante
Núcleo cristalino de carbonato de calcio
dH
... estudios de DLS: ¿Se forman templados de proteínas?...
FLUIDO UTERINO:
10 mM Ca2+
70 mM CO32-
• Fernández, M. S.; Passalacqua, K.; Arias, J. I.; Arias, J. L. 2004. Partial biomimetic
reconstitution of avian eggshell formation. Journal of Structural Biology. 148, 1-10.
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Estudios de agregación a través de DLS
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SCA-1 SCA-2
Experimento de adición: 10 mM, 70 mM, 100mM of Na2CO3
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Ansocalcina obtenida del cascaron de huevo de ganso: :
a) filtered, b) 10 mM, c) 70 mM, d) 100mM of Na2CO3
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DLS on Lysozyme at: a) filtered, b) 10 mM, c) 70 mM, d) 100mM
of Na2CO3
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![Page 35: DR. ABEL MORENO CARCAMO - ifuap.buap.mx · PDF fileDR. ABEL MORENO CARCAMO Departamento de Química Biomacromolecular Instituto de Química UNAM E-mail-address : carcamo@unam.mx abel.moreno@mac.com](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042600/5a79ae5d7f8b9a880c8bc73d/html5/thumbnails/35.jpg)
MECANISMO PROPUESTO PARA LA INTERACCIÓN PROTEÍNA-CARBONATO Y
PARA LA OXIDACIÓN DE ÉSTE EN UN ELECTRO DE PASTA DE CARBONO
![Page 36: DR. ABEL MORENO CARCAMO - ifuap.buap.mx · PDF fileDR. ABEL MORENO CARCAMO Departamento de Química Biomacromolecular Instituto de Química UNAM E-mail-address : carcamo@unam.mx abel.moreno@mac.com](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042600/5a79ae5d7f8b9a880c8bc73d/html5/thumbnails/36.jpg)
DATOS RECIENTES SOBRE LA ESTRUCTURA 3D DE SCA-1
Cristalización de SCA-1
SCA-2
SCA-1 Exclusión molecular
C.D. Rayana Ruiz Arellano, Ph.D. Thesis
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Grupo espacial P21212 (SCA-1)
Parámetros de celda (Å) a = 32.67 b = 55.91 c = 72.06
Ángulos a= 90.00 b= 90.00 g=90.00
Limite de Resolución
(Å)
1.5
Volumen de la celda
unitaria
131623.328
Rmerge(%) 0.145
Número de moléculas en ASU
1
Mosaicity: 0.7
Grupo espacial P3221 (OC-17)
Parámetros de celda (Å) a = b = 58.26 c = 82.46
Ángulos a= 90.00 b= 90.00 g=120.000
Limite de Resolución (Å) 1.5
Volumen de la celda unitaria
279888.008
Rmerge(%) 0.63
Número de moléculas en
ASU
1
Mosaicity: 0.2
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Comparación de las dos estructuras SCA-1 y OC-17
SCA-1 con puentes disulfuro OC-17
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Superposición de ambas proteínas
Ovocleidina-17 (azul) con Estrutiocalcina-1 (rojo)
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Stephen Weiner, J. Structural Biology 163 (2008) 229-234. Review
![Page 41: DR. ABEL MORENO CARCAMO - ifuap.buap.mx · PDF fileDR. ABEL MORENO CARCAMO Departamento de Química Biomacromolecular Instituto de Química UNAM E-mail-address : carcamo@unam.mx abel.moreno@mac.com](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042600/5a79ae5d7f8b9a880c8bc73d/html5/thumbnails/41.jpg)
Valdría la pena volver a la vida a animales extintos para entender algunos de los procesos de Biomineralización?
![Page 42: DR. ABEL MORENO CARCAMO - ifuap.buap.mx · PDF fileDR. ABEL MORENO CARCAMO Departamento de Química Biomacromolecular Instituto de Química UNAM E-mail-address : carcamo@unam.mx abel.moreno@mac.com](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042600/5a79ae5d7f8b9a880c8bc73d/html5/thumbnails/42.jpg)
Mi gran deseo…
Dinosaur Eggshell (NHM-London)
Dodo-bird Oxford University MNH Aepyornis eggs Muséum national d'Histoire naturelle, Paris
Elephant Bird Skull of an Elephant bird
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Mi realidad e inspiración…
Una ave no pertenece al nido donde nace sino al cielo donde vuela…
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CONCLUSIONES
• Los minerales que son producidos o sintetizados en seres vivos, permiten desarrollar propiedades y funciones específicas en combinación con macromoléculas biológicas.
• Estos biominerales participan inclusive en la estereo selectividad química, para elegir la incorporación de L-aminoácidos en proteínas y D-azúcares en polisacáridos, así como en la síntesis de sencillas y grandes biomoléculas hasta los grandes complejos macromoleculares proteína-DNA o proteína-RNA.
• La formación de huesos, dientes y algunas otras formas de estructuras biológicas, quizás siguen las teorías de crecimiento cristalino, pero la morfología (no-cristalográfica) quizás está gobernada por genes.
• La relación: estructura-función, no puede atribuirse solamente a la resolución estructural de una sola biomolécula, sino que requiere de la resolución estructural de varias macromoléculas y los aspectos químicos que rigen dichos procesos.
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AGRADECIMIENTOS CARBONATO DE CALCIO:
• Dr. Juan Pablo Reyes Grajeda, INMEGEN, México.
•Dr. Hugo Javier Serrano Posada, Facultad de Química, UNAM
• Dra. María Liliana Marín García, Instituto Politécnico Nacional, IPN
• Dr. Vivian Stojanoff, Brookhaven National Laboratory (BNL), USA.
• Dr. Jean Jakoncic, Brookhaven National Laboratory (BNL), USA
• C.D. Rayana R. Ruiz-Arellano, PhD Thesis IQ-UNAM.
• DGAPA-UNAM Proyecto IN214506 / IN201811
• CONACYT proyecto 82888, 175924.
FOSTATO DE CALCIO:
• Dra. Azucena E. Jiménez Corona, CINVESTAV, México.
• Dr. Eduardo Villarreal Ramírez, Mineralized Tissue Laboratory. HSS-New York, USA.
• Apoyo de CONACYT: Proyectos 58515 /82888
OXALATO DE CALCIO EN PLANTAS
Dr. David Jáuregui Zúñiga, IBT UNAM.
BIOSILIFICACIÓN
Dra. Nuria Sanchez Puig, IQ-UNAM