Dr. Oscar Alonso Luna1

Biologia Molecular en OncologiaParte 2

Temas

• Cuidado de la Salud & Medicina personalizada

• Aplicaciones de la Oncogenómica en la Oncología

Tebbutt S J et al. Chest 2007;131:1216-1223©2007 by American College of Chest Physicians

El futuro de la Genómica en la Medicina

Cuidado de la Salud & Medicina Personalizada

• Diagnóstico

• Desarrollo de fármacos

• Medicina P4 (Predictiva, Preventiva, Personalizada y Participativa)

Esquema de Medicina Personalizada

Originally published by the American Society of Clinical Oncology. MacConaill LE, Garraway LA. J Clin Oncol 2010;28:5219-5228.

6

La biopsia: Eje para la medicina personalizada en cáncer

Suficiente tejido = biomarcadores = decisiones terapéuticas efectivas

7

¿De qué sitio tomar la biopsia?

• En general, del tumor más accesible

• Para los patólogos todos los sitios son aceptables:

– Tumor primario

– Ganglios linfáticos

– Metástasis a distancia

Pirker et al., J Thorac Oncol 2010;5:1706–1713.

Heterogeneidad Tumoral

• Importancia para analitos de interés: Comparación de CCR primarios con las metástasis y comparación entre las metástasis– KRAS: Concordancia Relativa

(90%)– NRAS: Altamente discordante

• Pérdida del primario• Adquisición en la metástasis

• Número de subpoblaciones anormales

9

¿Qué cantidad de tumor debe contener el material de biopsia?

• Debe evaluarse el contenido de células tumorales antes del análisis molecular, ya que su proporción es crítica

– Disección manual o captura con microdisección láser

Pirker et al., J Thorac Oncol 2010;5:1706–1713.

Cantidad ideal de tumor Análisis

200-400 células tumorales Análisis mutacional por PCR

Al menos 50 células tumorales Prueba de FISH Vysis

≥50% del tejido con células tumorales

Secuenciación de DNA

10

Preparación del material de biopsia

• El fijador preferido es formalina 10% en buffer neutral1

– Tiempo de fijación lo más corto posible1

– No más de 48 horas para FISH o métodos basados en ARN2

• Muestras de citología podría ser adecuada para evaluación molecular

– Es necesario mayor análisis de la seguridad clínica de los datos mutacionales obtenidos desde estas muestras1

– Preparación de bloques celulares y cortes como material histológico2

1. Pirker et al., J Thorac Oncol 2010;5:1706–1713; 2. Thunnissen et al., Lung Cancer. 2012 ;76:1-18 1.

Ejemplos de las pruebas individuales de DNA

• Pruebas de portador

• Pruebas para riesgo de enfermedad

• Pruebas de respuesta a fármacos

Pruebas de portador• Estas pruebas ayudan a

identificar a los individuos que• Portan una mutación genética

perjudicial pero que se muestran usualmente asintomáticos.

• La enfermedad se manifiesta en niños cuando las parejas portadoras le transmiten una copia mutante del gen a su descendencia.

zz zz zz zz

zz zz

zzzzzz zz

Portadores no afectados

Individuo afectado

Hombre normal

zz

zz

zz

zz

zz

Mujer normal

Hemocromatosis • Un desorden heredable en el cual se acumula hierro extra en los tejidos, provocando

daño en los órganos.• Causada por mutaciones en el gen HFE. • La prueba de DNA identifica mutaciones en HFE.• Esta ayudará a los doctores a tratar a los pacientes afectados, a través de pruebas

periodicas y donación de sangre Panel Neonatal

Pruebas de riesgo de Enfermedad

• Las pruebas de determinación del riesgo a la enfermedad son usadas para cuantificar el riesgo de que la enferemedad ocurra antes de que los individuos presenten sintomatología.

• La intervención temprana puede ayudar a controlar mejor las manifestaciones clínicas y el comienzo de la enfermedad.

Prueba genética

CGTCGATCGGC CGTCGCTCGGC

Individuos en la población con diferentes niveles de riesgo a una enfermedad

Individuos con un riesgo a la enfermedad no mayor al riesgo

poblacional del ella

Individuos con un riesgo mayor a la enfermedad con respecto a la

población en general

• Monitoreo proactivo de la enfermedad

• Medidas preventivas para mitigar la ocurrencia de la enfermedad

• Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 están relacionadas fuertemente con la predisposición al cancer de mama y ovárico en las mujeres.

• El análisis de DNA ayudará a identificar las mutaciones en BRCA1/2 y en consecuencia, a predecir el riesgo relativo a desarrollar cáncer de mama.

• Usando los resultados del análisis, los doctores pueden dar consejo informado a los pacientes en riesgo para tomar pasos preventivos y de monitoreo sobre el cáncer.

Estado mutacional de BRCA1/2 (factor de riesgo de un solo gen)

Pruebas de respuesta a fármacos

• Estas pruebas ayudan a identificar individuos que son• propensos a responder a ciertos fármacos • probablemente respondan adversamente a un

fármaco• La prueba ayudará

• a doctores y pacientes a tomar decisiones informadas sobre el tratamiento.

• a las compañías farmaceúticas a contar con una prueba diagnóstica paralela a la venta de fármacos.

• El nuevo campo de la Farmacogenómica

Selected target therapeutics in the routine oncology practice

Targeted therapeutics Target Tumor

Antibodies

Trastuzumab Her-2 Breast Ca

Rituximab CD20 B-Cell Lymphoma

Cetuximab EGFR/KRAS CRC & HN Ca

Bevacizumab VEGF Breast Ca / CRC / NSCLC

Panitumumab EGFR CRC

Small Molecule Inhibitors

Imatinib c-kit / BCR-ABL GIST and CML

Gefitinib EGFR Lung Ca

Erlotinib EGFR NSCLC & Pancreatic Ca

Lapatinib Her-2 & EGFR Breast Ca

Sorafenib VEGFRs/PDGFR/RAF HCC & RCC

Sunitinib VEGFRs/PDGFR/RET RCC & GIST

Tensirulimus / Everolimus mTOR RCC

Bortezomib Proteasome MM & MCL

VorinostatBortezomib HDAC Cutaneous TCL

From: Quek, Yan, Yong and Salto-Tellez. Personalized Medicine (2009) 6(5),465-468

El Cáncer como una enfermedad genética

• Las mutaciones en el DNA se acumulan en el transcurso del tiempo

• Eventualmente, algunas de esas mutaciones (mutaciones somáticas) provocan el crecimiento desmedido de las células

– Algunos cambios alteran el estado de activación de las proteínas, otras incrementan la expresión

• De cierto modo, el cáncer es evolución acelerada

• Comprender los defectos genéticos (aberraciones en el ADN) en el cáncer, ayudará a desarrollar una terapeútica racional y así permitir convertir la enfermedad en una de tipo crónico

Célula normal

Tumor benigno

Cáncer invasivo temprano

Cáncer invasivo tardío

Célula normal

Célula normal

Célula premaligna

Acumulación de mutaciones

Pruebas de mutación en Cáncer

• Pruebas genéticas disponibles, diseñadas para localizar variaciones somáticas en los tumores de los pacientes

• Esto ayudará a que– los oncólogos desarrollen terapias racionales basadas en mutaciones.– las compañías farmaceúticas seleccionen pacientes adecuados para sus

ensayos clínicos.

• Mientras más baje el costo de la secuenciación, más genomas completos de individuos con cáncer seran secuenciados

– Los cambios son usados para realizar decisiones racionales sobre el tratamiento

Célula normal

Tumor benigno

Cáncer invasivo temprano

Cáncer invasivo tardío

Célula normal

Célula normal

Célula premaligna

Acumulación de mutaciones

Qué podemos conocer del estudio de las variaciones (SNPs) ?

• Comprender el riesgo de un niño afectado por desordenes hereditarios• Estado del portador en caso de padres no afectados

• Identificar SNPs asociados con desarrollo de enfermedad• diabetes, padecimientos cardíacos, adicción, Alzheimer, etc.

• Explicar respuesta diferencial a fármacos• Ajuste a dosis de fármacos

• Identificar pacientes que se beneficiarán con cierto fármaco

• Apoyar en el desarrollo terapéutico

¿Qué es un blanco molecular?

Estructura celular o molecular involucrada en una patología

específica y sobre la cual, actúa alguna droga

22

Selección del tratamiento: evolución de la histología a blancos oncogénicos

Figura: Massachusetts General Hospital, data on file. Horn L, Pao W. J Clin Oncol. 2009;26:4232–4235.

1999Selección basada

en histología

Adenocarcinoma

Carcinoma epidermoide

Carcinoma de células grandes

2008

Actual

No epidermoide

EpidermoideEGFR WTEGFR

Mu

Epidermoide

EGFR Mu

KRAS Mu

ALK+Otro no

epidermoide WT

Epidermoide

Evolución del tratamiento del CPCNP

Estándar actual de tratamiento CPCNP

KRAS

EGFR

BRAF

HER2

PIK3CA

ALK

MET

Desconocido

2010Orientación a controladores oncogénicos

*Incidencia de mutaciones en adenocarcinoma como ejemplo

Hanahan and Weinberg, Cell 144:646 (2011)

“Therapeutic Targeting of the Hallmarks of Cancer”

BCR-ABL Imatinib100% CML

HER2 Trastuzumab20-30% IDC

EGFR Erlotinib/ Gefitinib/Afatinib20% Adenocarcinoma de pulmón

ALK Crizotinib3-5% Adenocarcinoma de pulmón

BRAF V600E PLX403250-60% Melanoma

BRAF1799 T>A

V600E

BCR-ABL Imatinib100% CML

HER2 Tastuzumab20-30% IDC

EGFR Erlotinib/ Gefitinib20% Lung adenocarcinomas

ALK Crizotinib3-5% Lung adenocarcinoma

BRAF V600E PLX403260% Melanoma

BRAF1799 T>A

V600E

Romond EH et al., Trastuzumab plus Adjuvant Chemotherapy for Operable HER2-Positive Breast Cancer. NEJM 2005.

O’Brien et al., Imatinib Compared with Inter-feron and Low-Dose Cytarabine for Newly Diagnosed Chronic-Phase Chronic Myeloid Leukemia, NEJM 2003

Mok et al., NEJM 2009

Shaw et al. Lancet Oncol. 2011;12:1004-12.

Perfil mutacional de Cáncer colorrectal

Sin mutación identificada34%

KRAS25%TP53

21%

PIK3CA 6%

NRAS 3%

APC 4%

BRAF 7%

N=250

Factores de Crecimiento,e.g. EGF

EGFR

Membrana Celular

ProliferaciónCelular

Mutaciones KRAS presentes→ resistencia a TKI y

EGFR-AbM

Mutaciones EGFR-1→ sensibilidad a TKI ↑↑

Kinase

TKIGefitinibErlotinib

Kinase

EGFR-AbMcetuximabpanitumumab

BLANCOS MOLECULARES EN CCRm

Adenocarcinoma de Colon: Sobreposición de mutaciones

KRAS 20 aislados(36 totales)

TP5318 aislados(28 totales)

APC 1 NRAS

3

PIK3CA

BRAF6 aislados

4

3

4

1

1

3

2

1

61

Blancos moleculares en Melanoma

Perfil mutacional de Cáncer de Pulmón

KRAS 23%

Sin mutación 42%

EGFR 15%

TP53 5%

IDH1 <1%

NRAS 1%BRAF 2%

HER2 2%

PIK3CA 4%ALK 3%

CTNNB1 2%

AKT 1%

N=650

1

2

KRAS56 aislados(58 totales)

EGFR36 aislados(50 totales)

ALK 13

T790M5

PIK3CA5

TP53

1

11

1

1

4

2

APC

NRAS

BRAF

1

13

B-cat

Adenocarcinoma de Pulmón: Sobreposición de mutaciones

Belinda Waltman/ Lecia Sequist

Analisismutacional del DNA extraído

de biopsias de pacientesEGFR, KRAS

Resultado: No Mutación Detectada

Resultado: Mutación Detectada EGFR

Reporte:Mutación Detectada

Mutación Específica y Evidencia

Deleción Exon 19 (cualquiera)

L858R

L861Q

G719S/A/C ó otra substitución en esta

posición

S768I

Exon 20 inserciones

Datos que apoyan sensibilidad al Afatinib

Gefitinib/Erlotinib

Doble Mutaciones

Actualmente limitados datos que apoyan la sensibilidad al Gefitinib/Erlotinib

T790M

Otras Mutaciones

Actualmente sin datos que apoyen la sensibilidad al

Gefitinib/Erlotinib

Determinación de mutaciones del gen HER2:L755S, M774AYVM, A775YVMA, G776X

90%

7%

3%

T854A Datos que apoyan sensibilidad al Afatinib

T858R

Deleción Exón 19(cualquiera)

D761Y

Algoritmo del Analisis Mutacional del CPCNP

Determinación de la Traslocación ALK

Traslocación Positiva: Crizotinib

Traslocación Negativa

Resultado: Mutación Detectada KRAS

Astudillo and Arrieta, et al. 2012

“Dependencia Oncogénica”(Weinstein IB. Science 2002; 297:63-4)

• Dependencia de las células tumorales y predeterminante de su actividad oncogénica para mantener la proliferación y/o supervivencia.

• Adicción de un oncogén para mantener una neoplasia.

Niels Bohr, 1885-1962

Prediction is difficult, especially about the future

Paciente con cáncer

Diagnóstico Molecular

Información clínica

Resección quirúrgica

Patológico rutinario

Un nuevo paradigma en el Tratamiento del Cáncer

Terapia dirigida

Tsao: “La Era Molecular llegó”Molecular Rebiopsy:- Unknown (other pathways)- MET- PIK3CA- SCLC

Sequist L et al. Sci Transl Med 2011;3:75ra26-75ra26

La caracterización molecular permitirá tratamientos individualizados…

Radioterapia

Terapia Hormonal

Quimioterapia 5-FluorouraciloCiclofosfamidaEpirubicinaPemetrexedGemcitabina

Terapias Biologicas de BM Trastuzumab Panitumumab Cetuximab Bevazucimab

Tipo de tumorHistopatología

Imunohistoquímica

Etapa de la enfermedadClínica

Estudios de gabinete

Fenotipo MolecularOncotype DX

Firmas Genómicas

Genotipo tumoralKRasEGFRBRaf

TRATAMIENTO

Cirugía

Terapias BlancoMolecular (BM) Gefitinib Pazopanib Lapatinib Sorafenib Vorinostat

RescateInmune

Mismo genomaDiferente proteoma

Más allá del genoma

POR QUE ANALIZAR MOLECULARMENTE UNA NEOPLASIA?

• Se ha demostrado que incluso los tumores metastásicos responden a terapias específicas. Incluso si no se cura, algunos pacientes pueden experimentar otros beneficios importantes:

• Más tolerables y eficaces opciones de tratamiento• Menos necesidad de pruebas de imágenes repetidas (y menos exposición

a los agentes de contraste)• Menos tiempo en viajes o en los servicios médicos para las pruebas,

exámenes o procedimientos de biopsia repetida• Menor exposición a los regímenes de quimioterapia de amplio espectro

que pueden ser más tóxicos e ineficaces• Menos carga emocional y financiera a los pacientes y cuidadores

Oportunidades para que los pacientes entran en experimentos clínicos apropiados

• Nueva información para los miembros de la familia en la evaluación de su riesgo familiar de cáncer

• References1. Abbruzzese JL, Abbruzzese MC, Lenzi R, Hess KR, Raber MN. Analysis of a diagnostic strategy for patients with suspected tumors of unknown origin. J Clin Oncol. 1995;13:2094-103.2. Briasoulis E, Pavlidis N. Cancer of unknown primary origin. Oncologist. 1997;2:142-152.

La Patología Molecular asumirá un papel crítico

en el cuidado de la salud

La Patología Molecular asumirá un papel crítico

en el cuidado de la salud

• Tienen un nuevo conocimiento del proceso de la enfermedad

• Son integradores del conocimiento• Pueden conseguir acceso a todos los

datos necesarios del diagnóstico• SERAN RESPONSABLES de la

evaluación de lo que será la terapia

Patólogos Molecularesy/o Biólogos Moleculares

El incremento en el éxito del tratamiento será alcanzado cuando se diseñen a la medida, para

seleccionar grupos pacientes definidos por marcadores moleculares

Actualmente muchos tratamientos son ampliamente aplicados con éxito variable

25-80 % de los pacientes reciben une tratamiento efectivo1

El Modelo de la Medicina Personalizada

.

Población heterogénea

Selección de pacientes: Prueba de biomarcadores

Pacientes que se beneficiarán

Aplicaciones de la PCR Oncología Médica

Definir el interactoma en el Cáncer

A donde vamos? ó Donde estamos?Medicina Personalizada

Herbst et al N Eng J Med 2008

Perfiles Genéticos de línea Germinal (eg, SNPs)

Perfiles basados en sangreProteómicos,

Citocinas, Factor angiogénicoDNA ó RNA circulante

Células Circulantes (eg, tumor, endotelio, linfocitos)

Genética ó epigenéticaMutaciónDeleciónAmplificación

TranslocaciónMetilación

Expresión GénicaMicroarreglos de Expresión

Perfiles de MicroRNA Aplicaciones basadas-PCR

ProteínasIHQ

Proteómica

Interaccionesinvolucrandoal hospedero,

tumor,y la terapia

Sensibilidad tumoral

a la terapia

MedicinaPersonalizada

Hospedero

Tumor,microambiente local

La Medicina Personalizadasalva vidas y dinero…

Langreth, R. (2008), ‘Imclone’s Gene Test Battle’, Forbes.com, 16May

Test de MutacionesKRAS, EGFR, ALK

No Tratados (mutados o sin rearreglo cromosomico)

Tratados con Anti-EGFR o Anti-ALK

TratamientosExitosos

Sin Test de MutacionesTratados con Anti-EGFR o Anti-ALK

PacientesCa Pulmón(CPCNP)

• El futuro está en los Genes• Incluyendo el futuro de la Humanidad!!!

• Oportunidad enorme en diversos campos• México aún atrasado al respecto – pero

todavía puede ponerse al corriente

Conclusión

• La genética del cáncer se está expandiendo rapidamente y es altamente compleja

• El perfilado molecular conducirá el tratamiento del cáncer

• Necesidad continuada de genotipado del cáncer con aún mayor rendimiento

• El secuenciado clínico de siguiente generación se aproxima

• Los esfuerzos colaborativos tales como los Consorcios de genotipado serán clave para resolver problemas de tipos de cáncer con genotipos raros

Conclusión

“The Anatomy Lesson of Dr. Nicolaes Tulp” (1632)

Una nueva medicina…

www.nanopharmacia.com