Dr. sc. Sendi Kuret, mol.biol.

Klinički zavod za patologiju, sudsku medicinu i citologiju KBC Split

Split, 29.05.2015.

Nastanak tumora je proces koji se sastoji od niza promjena na genotipskoj i na fenotipskoj razini.

Razumijevanje nastanka patološkog procesa na razini molekularnih promjena osnova je na kojoj bi se trebalo temeljiti sveobuhvatno znanje o nastanku, ali i liječenju određene bolesti, odnosno stanja.

Razvoj molekularne medicine (stanična i molekularna razina) dovodi do otkrića i razjašnjenja mehanizama koji potiču nastajanje i rast tumora.

Rezultat razvoja molekularne medicine- novi terapijski postupci, koji se nazivaju ciljana (biološka) terapija, koja je usmjerena prema specifičnim molekularnim biomarkerima (EGFR, KRAS,BRAF).

Ciljana (biološka ) terapija vodi prema proizvodnji lijekova koji ciljano djeluju na biomarkere,

tzv. “ pametni lijekovi”.

Novi dijagnostički postupci i »pametni« lijekovi za liječenje raka omogućavaju personalizirani pristup u liječenju bolesnika.

Djeluju znatno selektivnije protiv tumorskih stanica, čime ciljana terapija pruža mogućnost veće učinkovitosti i manje toksičnosti ako se uspoređuje sa standardnom kemoterapijom.

- avastin (bevacizumab) -za rak debelog crijeva, dojke, pluća i bubrega - zelboraf (vemurafenib)- za melanom

- gleevec (imatinib mesylate)- za liječenje mijeloične leukemije i gastrointestinalnog stromalnog tumora (GIST)

- herceptin (trastuzumab) -za rak dojke

- iressa (gefinitib) i tarceva (erlotinib) -za rak pluća

- erbitux (cetuksimab) -za rak debelog crijeva, glave i vrata

Budućnost liječenja raka jest u personaliziranoj terapiji koja bi trebala biti prilagođena svakom pacijentu.

Jako je važno uraditi genetske analize prije nego što se krene u terapiju ovim ljekovima da bi se vidjelo kakav će biti odgovor na liječenje

Važna je suradnja onkologa, patologa i molekularnih biologa radi postavljanja točne dijagnoze i uključivanja ciljane i prilagođene terapije svakom pojedincu.

Genetsko profiliranje raka već se obavlja u brojnim laboratorijima diljem svijeta, a jedina prepreka da to postane praksa je cijena takvih analiza.

Ovakav pristup predstavlja odmak od tradicionalnih metoda liječenja kod kojih se koristi „ jedan lijek za sve“ ,

prema liječenju prilagođenom svakom pojedinom pacijentu, „pravi lijek za pravog pacijenta u pravo vrijeme“.

Zahvaljujući pametnim lijekovima, individuliziranoj

terapiji i ranom otkrivanju malignih bolesti, u svijetu je preživljenje danas čak pet puta više nego prije tridesetak godina.

Od 2010.godine radi se molekularno testiranje kojim se utvrđuje genski status KRAS, NRAS, EGFR i BRAF gena u različitim karcinomima (debelo crijevo, pluća, melanom ).

..............

..............

..............

Uzorci za testiranje mutacija

- Uzorci tumorskog tkiva

fiksirani u formalinu,

uklopljeni u parafin (FFPE)

- citološki uzorci

Dijagnostički protokol I

BIOPSIJA PHD dijagnostika

DNA ekstrakcija mol. testiranje

Dijagnostički protokol II

Citološka punkcija

CITOLOGIJA DNA ekstrakcija mol. testiranje

EUROPSKO DRUŠTVO ZA PATOLOGIJU

Predlaže dva testa ( za kliničku upotrebu-CE):

-TheraScreen kit (7 mutacija)

-KRAS LightMix kit (9 mutacija)

Test Disease

cobas® BRAF Mutation Test* Metastatic Melanoma

cobas® KRAS Mutation Test* Colorectal Cancer

cobas® EGFR Mutation Test* Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC)

cobas® PIK3CA Mutation Test* Breast Cancer

Brzina - Rezultati ispitivanja dostupani u kratkom vremenu

Točnost - Visoka osjetljivost i specifičnost

Pouzdanost - Dosljedan tijek rada

Automatizacija - Automatiziran PCR, interpretacija rezultata

i izvještaj

1.Priprema uzoraka – (cobas® DNA Sample Preparation Kit)

2.Amplifikacija i detekcija

cobas® Mutation Test

cobas® EGFR Mutation Test

1. Mutation Detected: Exon 18 G719X

2. Mutation Detected: Exon 19 Deletion

3. Mutation Detected: Exon 20 T790M

4. Mutation Detected: Exon 20 S768I

5. Mutation Detected: Exon 20 Insertion

6. Mutation Detected: Exon 21 L858R

7. Invalid (sample out of range/control failure)

8. Failed (hardware/software failure)

cobas® EGFR Mutation Test v2

cobas® 4800 System, v2.1

cobas® cfDNA Sample Preparation Kit

cfDNA Sample Preparation Kit

cobas® DNA Sample Preparation Kit

cobas® EGFR Mutation Test v2

NEW separate sample preparation kit

UPDATED tests both tissue

and blood

SAME cobas® 4800 PLATFORM

v2

cobas® EGFR Test v2 for Use with Tissue & Blood

• Amplification and Detection Kit

42 MUTATIONS

DETECTED

AMPLIFICATION MMX

TARGET

MMX1 EX19Del; S768I; EX28/IC

MMX2 L858R; T790M; EX28/IC

MMX3 v.2 L861Q; G719A/C/S; EX20Ins; EX28/IC

NEW REAGENT

Od 1. siječnja 2013. do 31. prosinca 2014. godine 147 tumora (parafinskih blokova) upućeni su na genetsku molekularnu analizu.

U 15 (13,5 %) bolesnika utvrđena je mutacija EGFR, dok u 111 bolesnika nije bilo mutacije EGFR . U 21 bolesnika nakon izolacije nije bilo dovoljno DNK za molekularnu analizu.

Rezultati analize po tipu mutacije EGFR prikazani su na slici.

0

2

4

6

8

10

12

exon 18 G719X exon 19 del exon 20 ins exon 21 L858R

ODREĐIVANJE TERAPIJE NA OSNOVI REZULTATA TESTIRANJA EGFR MUTACIJA

NEMA MUTACIJA NEMA PODATAKA O

OSJETLJIVOSTI NA INHIBITORE TIROZIN KINAZA (TKI)

PRISUTNE

MUTACIJE

DELECIJA U EKSONU 19 (bilo

koje vrste)

L858R

DOKAZANA OSJETLJIVOST NA

DJELOVANJE INHIBITORA TIROZIN

KINAZA (TKI)

G719S/A/C

ili bilo koja druga

substitucija na toj

poziciji

L861Q

DUPLE MUTACIJE

S7681

INSERCIJE U EKSONU 20

T790M

DRUGI TIP MUTACIJA

90 %

7%

3%

OGRANIČENI PODACI O

OSJETLJIVOSTI NA DJELOVANJE INHIBITORA

TIROZIN KINAZA (TKI)

TRENUTNO NEMA PODATAKA O

OSJETLJIVOSTI NA DJELOVANJE

INHIBITORA TIROZIN KINAZA (TKI)

IZVJEŠTAJ

O

TIPU

MUTACIJE

I

NJENOM

ZNAČENJU

Test Detected Mutations

cobas®

KRAS

LightMix

NRAS

KRAS exon 4

Exon 2 Exon 3

12 13 59 61

Exon 2 Exon 3 Exon 4

12 13 59 61 117 146

Exon 4

117 146

K-ras mutacija

Lijek se primjenjuje

lijek se ne primjenjuje

N-ras mutacija

The cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test- real-time PCR test dizajniran za detekciju V600E (T1799A) mutacije.

Izazovi ispitivanja molekularnih biomarkera Mnoge varijable i potencijal za pogreške

Method Many choices – benefits /drawbacks unclear

Specimen Variable quality and quantity of specimen

Laboratory Undefined pre-analytical steps contribute to different results

Reagents Multi-source reagents, inconsistent quality

Platform and results Non-validated platforms, manual analysis and reporting

U svakodnevnom radu s oboljelima od karcinoma treba implementirati rutinsko testiranje za poznate biomarkere (EGFR, KRAS, NRAS, BRAF), ali i za nove,

koji će biti povezani sa specifičnom terapijom.