탐구 동기

• 환경 오염, 에너지 고갈, 석유 수입 의존으로 바이오디젤 생산의 중요성 증가

• 현재 각광받는 유채꽃 : 재배 기간이 길고 별도의 토지 및 관리가 필요, 계절에 따라 생산량이 다르다.

• 반면 미세조류(microalgae)는 재배가 쉽고 빠르며 지질(lipid) 함유량도 높다. (95,000L/ha; 유채꽃: 1,190L/ha) 계절에 따라여러 종이 번식하며 삼면이 바다인 우리나라에 적합. CO₂를소비, 광합성을 하여 대기 오염을 줄이는 데에도 일조, 축산폐기물 등을 이용해 재배하는 방법도 현재 연구 중.

• 대부분의 미세조류는 성장 조건이 열악해지면 지질을 많이 생산한다. 즉, 개체수가 부족한 대신 세포 당 지질이 증가하는 것.

어떻게 하면 최대의 지질 함량을 가진미세조류를 대량으로 수확할 수 있을까?

이론적 배경

• Phaeodactylum tricornutum

– 규조류

- 29.0±4.4㎛

– 지질 함유량 높음 (약 25%)

- 오메가-3 지방산 풍부

• Dunaliella tertiolecta

– 녹조류

– 12.9±2.4㎛

– 지질 함유량 높음 (약 15%)

– 베타카로틴 (항산화제, 비타민A의 전구체) 풍부

- 선택 이유 : 지질 함량이 높다.

- 성장 조건 : 빛, CO2, N, P, 염도(해양 서식) 등

- 지질 : 에너지 저장, 세포막 형성 성장 및 세포분열과 반비례

이론적 배경

• 2단계 배양 (two-step cultivation)1단계 : 최적의 배지를 제공하여 세포 수 증가

2단계 : 성장방해조건을 제공하여 세포 당 지질 증가 두 단계를 연결하면 총 지질 수확량 증가, 적은 개체수 보완

• 1단계에서 적조를 이용할 수는 없을까?* 적조현상 (Red Tide) : 물의 부영양화 등으로 플랑크톤이 엄청난 수로 번식하여 바다나 강 등의 색이 바뀌는 현상. 국내에서는 규조류, 편모조류가 주 원인.

* 이미 우리나라에서 대량번식 중인 적조생물

국내 환경에 적합

* 별다른 비용 없이 많은 수의 세포 수확 가능

* 골칫거리인 적조를 환경친화적으로 재활용 가능성

탐구 목표

① Phaeodactylum tricornutum과 Dunaliella tertiolecta가 성장이 최적화되는 조건을 찾는다.

② 2단계 배양법을 적용하여 P. tricornutum과D. tertiolecta 의 세포당 lipid 함량을 높이는 조건을 찾는다.

③ 우리나라의 적조 원인 생물이 바이오디젤의 원료로 이용될 수 있는지 적조의 기름 함유량을 알고 구체적인 실현 방안을 구상한다.

실험 1 : 성장조건 찾기① P. tricornutum과 D. tertiolecta를 각각 15ml씩 분양 받아 2주간 배양

② f/2 배지를 기준으로 N과 P의 양에 다음 표와 같은 변화를 준 4개의 실험

군과 1개의 대조군에 각각 접종

③ 성장을 측정하고자 약 2주간 24시간마다 1ml 샘플을 각각 채취, 루골 용액

20㎕로 보존처리 후 혈구계산기(hemocytometer)로 세포 수 계산

④ 이후 지질량 변화 측정을 위해 2일에 한 번 10ml씩 샘플을 채취, 냉동

(* P 3배, 5배는 비용상 분양 받은 조류의 양이 적어 시도하지 못했다.)

대조군 기존의 f/2 배지

N 3 NaNO3을 3배

N 5 NaNO3을 5배

P 1/10 NaH2PO4*H2O를 1/10배

P 1/100 NaH2PO4*H2O를 1/100배

배양실 온도 : 20℃조도 : 2700 lux광주기 : 24 hrs light배지 염도 : 33‰

PH : 7.4 (논문 참고)

실험 1 : 성장곡선 분석 (12일간 배양)

┗ N 3이 성장 제일 좋으나 대조군과의 차이는 작다 (약 9% 증가) → N 양과 성장의 상관관계 불확실; P 부족은 성장에 영향 (P 1/10은 70%, P 1/100은 95% 감소)

┗ N 3은 성장 확연히 촉진, (약 50% 증가) N 5은 오히려 약간 저조, P 부족은 성장저해하나 (약 40% 감소) P 1/10과 P 1/100 차이 적음 (오차 있을 것)

P. tricornutum

D. tertiolecta

실험 1 : lipid 값 분석

P. tricornutum* 총 lipid 양은 P 1/10이 가장 많다

* 그러나 2단계 배양법에서 lipid을 늘리는 방법을고려한다면 2단계 성장조건으로는 P 1/100이 적합

D. tertiolecta* 예상과 달리 N과 cell 당 lipid 양이 비례

* P 1/10과 P 1/100일 때 cell 당 lipid가 많으나 그둘의 차이는 근소함 N, P source에 대한 더 정교

한 실험과 제 3의 성장조건 탐색이 필요

Nile Red를 이용한 lipid 측정 방법 (논문 참고)

① 아세톤에 Nile Red 염색약을 250mg/L 비율로녹여 염색 지시약 만듦

② sample 10ml 당 염색 지시약을 40㎕씩 첨가, 지질을 염색시키고 vortex, 10분 놔둠

③ 형광측정기로 측정 (입력값 490nm, 출력값 580nm]

* lipid값 = (염색된 sample 측정값) – (염색된 f/2 배지 측정값) – (염색하기 전 sample 측정값)

→ 상대적인 값으로 단위는 고려하지 않는다

① D. tertiolecta를 각각 100ml씩 다음 ②와 같이 환경 조건을 달리하여 7일간 배양

② N 변화 : N control, 0배, ½ 배, 3배, 5배 (NaNO3 양 변화)

P 변화 : P control, 0배, ½ 배, 3배, 5배 (NaH2PO4*H2O 양 변화)

C 변화 : C control, 5배, 10배 (Na2CO3 첨가)

- C는 lipid의 주요 성분이므로

salinity 변화 : sal. control, 1.5배, 2배, 4배 (NaCl 첨가)

- 염도가 높으면 지질로 형성된 세포막이 두꺼워진다는 논문 참고

온도 변화 : temp. control (0시간), 2시간, 4시간, 8시간 (10℃에 보관)

- 조류는 낮은 온도에서 lipid를 저장원으로 사용한다는 논문 참고

UV 변화 : UV control (0분), UV 10분, UV 15분, UV 20분 (UV에 노출)

- D. tertiolecta의 베타 카로틴은 항산화물질이므로 UV에 노출 시 증가

③ 수확 후 Nile Red 염색법을 이용하여 형광측정기로 lipid 값 측정`

실험 2 : 배양 조건에 따른 lipid 값 측정

실험 2 : lipid 값 분석

N 변화

* cell 당 lipid 값 : N이 완전 결핍(0)일때 최대, 5배일 때 최소 (약 4배 차이)

* cell 당 lipid 값과 N의 전체적인 경향→ 반비례

P 변화

* cell 당 lipid 값 : P가 완전 결핍(0)일때 최대, 5배일 때 최소 (약 2배 차이)

* cell 당 lipid 값과 P의 전체적인 경향→ 반비례

실험 2 : lipid 값 분석

C 변화

* cell 당 lipid 값 : C가 10배일 때 최대, control 일 때 최소 (약 1.7배 차이)

* cell 당 lipid 값과 C의 전체적인 경향→ 반비례

salinity 변화

* cell 당 lipid 값 : salinity가 4배일 때최대, 2배일 때 최소 (약 5배 차이)

* cell 당 lipid 값과 P의 전체적인 경향→ 반비례

sal. (x4)sal. (x1)

← Nile Red 염색 후형광을 반사시켜서육안으로 확인한salinity sample

실험 3 : 적조의 가능성 연구

1

2

1. 우리나라 연안에서 적조를 일으키는 Chaetoceros

simplex의 (실험실 배양) cell 당 lipid 함유량 :

2. 경상남도 남해 자연 상태의 적조 sample의 cell 당lipid 함유량 : 여러 종이 섞여 측정이 어려우나 형광염색후 관찰한 결과 우점종(Skeletonema costatum 43.6%, Chaetoceros costatus가 27.4%)에서의 선명한 lipid 덩어리 확인 가능* 이 종은 국내 서해-인천, 남해-진주 등 부영양화 된 수역의 적조생물 중 대표 규조류* 추후 배양을 통해 최적 조건 탐색 희망

실험 결과분석 및 정리

1단계 : 성장의 최적 조건?

N P

P. tricornutum 상관관계가

뚜렷하지 않다

비례

D. Tertiolecta N3 (약 48% 증가) 비례

2단계 : cell 당 lipid 함량을 높이는 최적 조건?

N P 염도 Carbon

P. tricornutum 반비례(추가실험 필요) 반비례 - -

D. Tertiolecta 반비례 반비례 비례 비례

UV와 온도 스트레스는 큰 영향이 없음

반응성이 큰 Phaeodactylum tricornutum은 Bio-diesel에, 반응성이 작은Dunaliella tertiolecta는 소량배양 후 베타카로틴 등 유용 물질 생성에 적합

자연 상태의 적조와 Chaetoceros simplex 관찰 결과 국내 적조의 바이오디젤원료 가능성 보임 더 깊은 연구 필요

2단계 배양과 염도, N, P, Carbon 등을 이용해 수확량 늘릴 가능성 확인

제안 및 적용

2단계 배양을 응용, “적조 웅덩이”

⇒ 축산폐기물 (N, P source), 공장

이산화탄소 (C source) 을 이용, 적

조 배양. 감소한 오물 처리비용으로

웅덩이 온도 유지 등의 계절적 변화

를 극복 가능.

Bio-diesel 원료로써의 적조 활용

계절에 따른 조류 패키지 실용화

⇒계절적 특성 극복을 위해 다양한

온도에서 성장할 수 있는 조류를 섞

어 조류군집체를 만들고 오일 생산

량을 일정하게 유지 (여름 : 남조류,

봄 : 녹조류, 쌍편모조류 등)

토착조류의 기름 함량 연구필요

참고 문헌

• Amos Richmond, ed. Handbook of Microalgal Culture Biotechnology and Applied Phycology. Oxford: Blackwell Publishing, 2004

• 배양조건을 달리한 Dunaliella tertiolecta의 조체내 지방산 분석 (1989, 윤덕현 외, 해양연구소 생물응용연구실)

• Rapid method for the determination of lipid from the green algae Botryococcus braunii (1998, 오희목 외, 한국생명공학연구소)

• Two-stage 유가배양 공정을 이용한 고농도 미세조류에서의 유용물질의 대량 생산 (정욱진 외, 명지대학교)

• “Algal Oil Yields”, Oilgae - Oil & Biodiesel from Algae, http://www.oilgae.com/algae/oil/yield/yield.html

• “f/2 medium (Guillard and Ryther 1962, Guillard 1975)”, 한국해양미세조류은행, http://www.kmcc.re.kr/gzboard.php?code=Media&mode=gz_read&Page=1&no=

• “적조정보”, 해양수산연구정보, http://portal.nfrdi.re.kr/external/environment/redtide/information/information_01.jsp

* 실험에 도움을 주신 한국미세조류은행, 배재대학교 생물의약학과 조류(藻類)환경자

원연구실, 한국생명공학연구원 분들께 감사드립니다.