duración: un año des: facultad de ciencias químicas
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DATOS GENERALES
Titulo del Proyecto: Evaluación del posible efecto antiparkinsoniano de la toxina 1 de C. tecomanus en neuronas de rata.
Duración: Un año
DES: Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Colima
Cuerpo académico, UCOL-CA-35
Línea de Investigación: “Productos Naturales, síntesis, y diseño molecular con aplicación farmacéutica”
_______________________________
Dra. Laura Leticia Valdez Velázquez
Responsable del proyecto
_______________________________
M.C. Daniel Jaramillo Cano
Responsable de la DES, Faculta de Ciencias Químicas
MODALIDAD I: APOYO A INICIATIVAS DE PROFESORES-INVESTIGADORES
TITULO DEL PROYECTO: EVALUACIÓN DEL POSIBLE EFECTO ANTIPARKINSONIANO DE LA TOXINA 1 DE C. TECOMANUS EN NEURONAS DE RATA.
DATOS DEL RESPONSABLE DEL PROYECTO: Nombre: Laura Leticia Valdez Velázquez. Titulo: Doctora en Genética Humana.
Nombramiento: Profesor e Investigador de Tiempo Completo Asociado C.
Domicilio Laboral: Facultad de Ciencias Químicas, Km 9, Carretera Collima-Coquimatlán, Coquimatán,
Colima, México. CP 28400.
Teléfono/fax: 316 11 63
Email: [email protected], [email protected] Domicilio particular: Amatista 81, Col. Esmeralda Norte, Colima, Colima, México. Teléfono: 39 66 029
Firma. __________________
DATOS DEL ADMINISTRADOR DEL PROYECTO
Nombre: C.P. Juan Carlos Morales Ramirez.
Teléfono/fax: 316 11 63
Domicilio laboral: Facultad de Ciencias Químicas, Km 9 Carretera Colima-Coquimatlán, Coquimatlán, Colima, México. CP 28400
Firma: _____________________
GRUPO DE TRABAJO: *Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Colima. †Facultad de Medicina, Universidad de Colima. ΩCentro Universitario de Investigaciones Biomédicas. +Facultad de Ciencias, Universidad de Colima.
*Dra. en C. Laura Leticia Valdez Velázquez. ΩDr. en C. Enrique Alejandro Sánchez Pastor. †Dr. en C. Iván Delgado Enciso. +Dra. en C. Silvia Guillermina Ceballos Magaña.
*Dr. en C. Roberto Muñiz Valencia. †M. en C. Sandra Alejandrina Pérez Parra.
*QFB en formación Guillermo Camargo Flores.
*QFB en formación Christian Zamora Rincón.
RESUMEN EJECUTIVO: La Enfermedad de Parkinson (EP) se considera la segunda enfermedad neurodegenerativa más común
(Recchia y cols., 2004) afectando de 1 a 2% de las personas mayores de 65 años (Ramírez, 2006).
El tratamiento de la EP está dirigido principalmente al mejoramiento de la función motora; no obstante, los
pacientes manifiestan efectos secundarios adversos debido al tratamiento farmacológico, especialmente en
estadios avanzados, lo cual tiene mayor efecto negativo en la calidad de vida. Además, la eficacia, la tolerancia
e inocuidad de los medicamentos declinan proporcionalmente y de manera directa con el tiempo de evolución
del padecimiento; produciendo complicaciones motoras muy discapacitantes como: fenómenos “on-off’,
fluctuaciones motoras, discinesias y el fenómeno de “fin de dosis” (Casamitjana y cols., 2007).
Tomando en cuenta los efectos potenciales de las toxinas presentes en los venenos (de animales) ricos en
compuestos bioactivos; en los últimos años se ha puesto gran interés en el desarrollo de drogas contra la EP
mediante el uso de compuestos bioactivos. Estos compuestos no solo proporcionan las herramientas para
descifrar los detalles moleculares de diversos procesos fisiológicos, sino que también sirven como fuente
molecular para diseñar y desarrollar agentes terapéuticos (Pereáñez y cols., 2009). En este sentido, venenos de
varias especies de animales han demostrado tener potencial terapéutico contra enfermedades (Gomes y cols.,
2010). Algunos de éstos péptidos, debido a su pequeño tamaño, la relativa facilidad de síntesis, la estabilidad
estructural y la especificidad, se han convertido en importante agentes terapéuticos. (Lewis y García, 2003).
Schiavon y cols., en el 2010 encontraron que la toxina Cn2 del escorpión Centruroides noxius aumenta la
activación de canales de Na+ y proponen su utilización como compuesto principal para el estudio de la EP
debido a la selectividad de esta toxina por estos canales. Sin embargo en 1988, Martin y cols., también
demostraron que la toxina 1 de C. tecomanus es específica para canales de Na+, afectando la inactivación de
los canales, al parecer retardando la inactivación de esos canales. Por lo tanto, estas toxinas podrían
emplearse como fármacos que reemplacen la estimulación cerebral profunda del núcleo subtalámico en
pacientes con EP (Schiavon y cols., 2010). Esto debido a que los canales de Na+ sensibles al voltaje son
cruciales para el funcionamiento del sistema nervioso, lo cual puede ser una herramienta poderosa para activar
la liberación de la dopamina y de segundos mensajeros que intervienen en los procesos neuronales. Por tanto,
es importante conocer los efectos de la toxina 1 del C. tecomanus sobre los canales de Na+ y su subsecuente
implicación en la liberación de dopamina en la EP pudiendo esta toxina actuar como un agente terapéutico.
Además, el estudio propuesto permitirá apoyar a futuras investigaciones acerca de las implicaciones de esta
toxina con la EP.
PROBLEMA: ¿Existe un posible efecto antiparkinsoniano de la toxina 1 del Centruroides tecomanus en
neuronas de rata? OBJETIVO PRINCIPAL DEL PROYECTO: Determinar el posible efecto antiparkinsoniano de la toxina 1 del Centruroides tecomanus en neuronas de rata.
PROTOCOLO DEL PROYECTO: ANTECEDENTES ENFERMEDAD DE PARKINSON La enfermedad de Parkinson (EP), descrita por James Parkinson en 1817 (Arias, 2008) se considera la
segunda enfermedad neurodegenerativa más común después de la enfermedad de Alzheimer; usualmente se
manifiesta en la quinta y sexta década de la vida (Recchia y cols., 2004). En consecuencia, se calcula que
podrían existir alrededor de 140 000 personas con esta afección en México (INEGI, 2000).
Clínicamente, los síntomas parkinsonianos son caracterizados por varios síntomas motores incluyendo:
bradicinesia (lentitud y disminución de la amplitud de los movimientos), temblor en reposo (4 o 5 por segundo),
rostro inexpresivo, rigidez muscular y problemas de postura. También destaca, la marcha festinante
(arrastrando los pies), así como la postura flexionada y un equilibrio inestable (Arias, 2008).
En cuanto a la patología de la EP, los defectos en la función motora se deben a un trastorno neurodegenerativo
caracterizada por una marcada degeneración de neuronas dopaminérgicas en la parte compacta de la
sustancia nigra, teniendo como consecuencia la interrupción de los sistemas neuronales cerebrales
responsables de funciones motoras. (Recchia y cols., 2004).
No se sabe con certeza lo que inicia el desarrollo de la EP, (Cookson y cols., 2005 Hattori y cols., 2003) factores
de riesgos genéticos y ambientales se han considerado como posibles causas pero su contribución en la
iniciación del proceso de neurodegeneración sigue siendo debatida (Recchia y cols., 2004).
DOPAMINA
La dopamina es una catecolamina que actúa como mensajero químico en el Sistema Nervioso de los mamíferos
y es el transmisor catecolaminérgico más importante del SNC (Bahena y cols., 2000). Las neuronas
dopaminérgicas están involucradas en el control de movimientos involuntarios (Michel y cols., 2007).
La síntesis del neurotransmisor tiene lugar en las terminales nerviosas dopaminérgicas donde se encuentran en
alta concentración las enzimas responsables, la tirosina hidroxilasa (TH) y la descarboxilasa de aminoácidos
aromáticos o L-DOPA descarboxilasa. (Figura 1) (Bahena y cols., 2000).
En las terminales dopaminérgicas el neurotransmisor es sintetizado en el citoplasma de donde puede ser
liberado directamente al espacio sináptico o bien ser transportado al interior de las vesículas sinápticas para ser
liberado por exocitosis. Las vesículas transportan el neurotransmisor a su interior mediante una proteína
transportadora. Una vez liberada al espacio sináptico la dopamina se une a receptores pre y postsinápticos. La
mayor parte de las vesículas sinápticas (~90%) que contienen al neurotransmisor no están libres en el
citoplasma sino que se encuentran unidas al citoesqueleto de la terminal presináptica mediante la interacción de
proteínas presentes en la membrana de la vesícula (sinapsinas I y II) con proteínas del citoesqueleto. Cuando
un potencial de acción alcanza la terminal nerviosa, el cambio en el potencial de membrana activa a los canales
de Ca2+. La adición de un grupo fosfato a las sinapsinas debilita la unión de las vesículas sinápticas al
citoesqueleto, facilitando así su transporte a la zona activa (Bahena y cols., 2000).
Receptores Dopaminérgicos Los receptores para dopamina pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G (Bahena y
cols., 2000). Con base en sus características moleculares se han descrito 5 subtipos de receptores para
dopamina, los cuales han sido agrupados en 2 familias farmacológicas denominadas D1 (subtipos D1 y D5) y D2
(subtipos D2, D3 y D4). Los receptores de la familia D1 actúan a través de proteínas G que estimulan a la enzima
adenilil ciclasa conduciendo a la producción de AMPc dependiente de proteínas kinasas (PKA), en tanto que la
activación de los receptores pertenecientes a la familia D2 inhibe su formación (Bahena y cols., 2000) (Girault y
cols., 2004). Además D1 estimula la fosforilación de canales iónicos como Ca2+, Na+, K+ y receptores NMDA
(Berke y cols., 2000).. Reportes recientes indican que dentro de la familia D2, el subtipo D3 podría ser el
autorreceptor responsable de la regulación de la síntesis y liberación de dopamina. La acción de los
autorreceptores parece deberse a la modulación de canales iónicos activados por voltaje, inhibiendo corrientes
de Ca2+ o facilitando la apertura de canales de K+ (Bahena y cols., 2000).
MECANISMO MOLECULAR DE LA DOPAMINA EN LA ENFERMEDAD DE PARKINSON
La Dopamina regula la actividad de voltaje en canales iónicos, incluyendo canales de Na+ y K+, modulando el
estado de fosforilación de esos canales o de proteínas asociadas. La dopamina también ejerce efecto en
factores transcripcionales que regulan la expresión de genes específicos, a través de cascadas de fosforilación,
que conducirán a incrementar la actividad y la expresión de genes (Girault y cols 2004). Los mecanismos de
acción a nivel molecular parecen ser complejos pero pueden involucrar, una inactivación de los canales
dependientes de Na+ (Bernéoud y cols., 1996).
Se conoce que varios genes y sus correspondientes productos proteicos están involucrados en la EP.
Mutaciones en al menos cuatro genes han sido ligadas a la EP: α-sinucleína (PARK1), Parkin (PARK2), DJ-1
(PARK7) y PTEN (una fosfatasa con deleción homóloga en el cromosoma 10) inducida por Kinasa 1 (PINK1),
también conocida como PARK6 (Bossy y cols., 2004). En la mayoría de los casos la EP es esporádica, aunque
no son raras las formas genéticas familiares de la enfermedad. En la EP esporádica, el estrés oxidativo
(depleción de glutatión, depósito de hierro, el aumento de los marcadores de la peroxidación lipídica, ROS
(especies reactivas del oxígeno), el daño oxidativo del ADN, y la oxidación de proteínas y la disfunción
mitocondrial juegan un papel destacado en la muerte de neuronas de dopamina, quizás a través de una
combinación de mecanismos de excitotoxicidad y apoptosis (Figura 2) (Cookson y cols., 2005 Hattori y cols.,
2003).
Figura 2. Mecanismos moleculares del Parkinson en las células presináptica y postsináptica.
La exposición ambiental y de neurotoxinas, resulta en el estrés oxidativo mitocondrial y la liberación de especies
reactivas del oxígeno (ROS), que conduce a una serie de respuestas celulares como la apoptosis y el
plegamiento de la α-sinucleína, que puede agregar consigo mismo y con otras proteínas para formar cuerpos de
Lewy citotóxicos. El plegamiento de la α-sinucleína es normalmente ubiquitinada por parkin resultando en la
degradación proteosomal. Sin embargo, las mutaciones genéticas de ambas α-sinucleína y parkin interrumpen
esta vía y darán lugar a una mayor acumulación en los cuerpos de Lewy (Bossy y cols., 2004). Un componente
inflamatorio de la enfermedad, como resultado de la activación de la microglía causa la liberación de citocinas
inflamatorias y estrés celular. Esta activación de la microglía provoca apoptosis a través de la vía de JNK y
bloqueo de la vía de señalización Akt a través de REDD1 (Wood y cols., 2006).
MODELOS PARKINSONIANOS
Todos los modelos comúnmente aceptados de la enfermedad de Parkinson, como la enfermedad en sí, se cree
que involucran los procesos oxidativos en el centro de la lesión dopaminérgica. Ejemplos de tales modelos
incluye el análogo de la dopamina 6-hidroxidopamina (6-OHDA), que hemos decidido utilizar en estos
experimentos. El daño unilateral en el sistema nigroestrial de la dopamina por medio de 6-OHDA está bien
establecido y ampliamente usado en modelos animales en la EP (Bernéoud y cols., 1996). Al igual que la
dopamina, la 6-OHDA puede oxidar para generar un amplio espectro de los radicales de oxígeno. La inyección
dirigida en el intraestriado por el compuesto produce lesión dopaminérgica selectiva en un patrón que es casi
idéntica a la pérdida y degeneración cerebral visto en la EP. Además, 6-OHDA se ha aislado de pacientes con
EP, haciendo de esta neurotoxina una herramienta potencialmente valiosa para investigar más a fondo el papel
del estrés oxidativo en la EP (Mole, 2006).
ASPECTOS GENERALES DE LOS ESCORPIONES
Los escorpiones son artrópodos terrestres muy antiguos, poseen un par de glándulas venenosas localizadas a
nivel del telson, el veneno es una secreción apocrina, compuesta de proteínas y péptidos de bajo peso
molecular, activos sobre canales iónicos sensibles a voltaje de Na+, K+, Ca++, y Cl–, que modifican la
excitabilidad celular (Gómez y cols., 2007).
Las proteínas del veneno de los escorpiones son de tres clases: neurotoxinas de cadena corta que contienen
30 a 40 residuos de aminoácidos, neurotoxinas de cadena mediana que contienen de 60 a 70 residuos de
aminoácidos, y neurotoxinas de cadena larga que contienen más de 70 residuos (Saldarriaga y Otero 2000).
Centruroides tecomanus (Alacrán endémico en el estado de Colima).
En lo que concierne a los estudios realizados de la especie de Colima, Centruroides tecomanus, solo existen
tres reportes que dan conocimiento acerca de la composición de su veneno.
Possani y colaboradores (1980), purificaron (por filtración en gel seguida de intercambio iónico) y caracterizaron
una toxina para mamíferos del veneno del alacrán, obteniendo la secuencia N-terminal de la misma. Así mismo
mostraron actividad hialuronidasa de una de las fracciones obtenidas y 15 diferentes componentes positivos a
ninhidrina (Possani y cols., 1980).
En 1988, Ramírez y colaboradores, aislaron varias toxinas del veneno del alacrán por filtración en gel seguida
de una separación por intercambio iónico, obteniendo 24 fracciones. Dentro de las fracciones se encuentra la
toxina 1 (componentes II.20.3.4) del veneno del C. tecomanus, que está compuesta aproximadamente de 66
residuos de aminoácidos (Ramírez y cols 1988).
Martin y colaboradores (1988), determinaron la secuencia de aminoácidos y la caracterización fisiológica de la
toxina 1 del veneno del alacrán, la cual retarda la inactivación de la corriente de Na+, mientras que la corriente
de Ca2+ es muy poco afectada (Martin y cols., 1988).
Canales de Sodio (Na+) Los canales de Na+ sensibles a voltaje son responsables de la despolarización rápida que se produce en la fase
inicial del potencial de acción en los nervios y músculos. Las propiedades y las estructuras de éstos canales
han sido ampliamente estudiadas con neurotoxinas que específicamente alteran su función normal. Por lo
menos se han demostrado cinco sitios de unión presentes en este canal iónico: Sitio 1 se une la tetrodotoxina
(TTX), saxitoxina (STX) y μ-conotoxina, sitio 2, veratridina y batracotoxina; sitio 3, las α-toxinas de escorpión (α-
ScTX) y toxinas de anémona de mar; sitio 4, β-toxinas de escorpión (β-ScTX) y sitio 5, brevetoxinas (Jover y
cols., 1988).
Los principales blancos moleculares de las escorpiotoxinas son los canales de Na+ y de K+ dependientes de
voltaje presentes en las membranas excitables. Las toxinas tipo α impiden el cierre del canal de Na+, mientras
que las tipo β impiden el funcionamiento normal del mecanismo de apertura de dichos canales. Las toxinas que
se unen a canales de Na+ en las neuronas, despolarizan la membrana celular y producen la liberación de
neurotransmisores. Las toxinas que se unen a canales de Na+ cerrados evitan la apertura de dicho canal y las
que se unen a canal abierto alteran la inactivación por alargamiento del tiempo de apertura del canal o por
incremento de la habilidad del canal a reabrirse después de la inactivación (Saldarriaga y Otero, 2000).
Las toxinas de escorpión específicas de canales de Na+ han sido clasificadas en dos grupos, las que afectan los
mecanismos de inactivación de los canales (α-toxinas de escorpión) y las que modifican los mecanismos de
activación (β-toxinas de escorpión). Además se ha demostrado que entre las toxinas de escorpión que se unen
a canales de Na+ hay una notable especificidad en las especies. Hay toxinas específicas para mamíferos,
insectos o crustáceos. Así, diferencias entre los polipéptidos de las toxinas, tales como las α- y β-toxinas de
diferentes especies de escorpión, deberían residir en variaciones estructurales observadas en la secuencia de
sus aminoácidos (regiones altamente variables), o en la longitud total de varios péptidos (Ramírez y cols.,
1994). En este sentido en 1988 Martin y cols., demostraron que la toxina 1 de C. tecomanus es específica para
canales de Na+, atrasando su inactivación.
Se ha especulado que las alteraciones en corrientes iónicas podrían contribuir activamente a la mortalidad de
estas neuronas en la EP (Michel y cols., 2007). Además de que en varios estudios se ha evidenciado que la
supervivencia de las neuronas dopaminérgicas es controlada por su actividad eléctrica (Michel y cols., 2007).
Salthun y cols., 2004 mencionan que la activación de bajos niveles de canales de sodio dependientes de voltaje
por la α-toxina de escorpión demostró ser muy eficaz en la prevención de la pérdida de neuronas
dopaminérgicas que se produce de forma selectiva y de manera espontánea por apoptosis en cultivos
embrionarios.
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METODOLOGÍA Tipo de estudio: Experimental, comparativo. Descripción del estudio
Criterios de inclusión. Ratas macho Wistar de entre 250 y 350 gramos de peso, clínicamente sanas mantenidas
en condiciones de bioterio. Sin ningún manejo experimental previo.
Criterio de no inclusión. Cualquier incidente patológico que se presente durante la fase de preparación de los
animales, como infecciones intercurrentes de cualquier tipo.
Criterios de eliminación.
Ratas que mueran por causas ajenas a la manipulación experimental.
Mortalidad o complicaciones anestésico-quirúrgicas que dificulten o interfieran con la evaluación de las
variables.
Reposición por pérdidas. Los animales que mueran o se excluyan por causas ya descritas serán repuestos
hasta completar la muestra.
Operacionalización de las Variables
INTERRELACIÓN NATURALEZA ESCALA DE MEDICIÓN
Variable Dependiente Dosis efectiva media
Cuantitativa Discreta
Variable Dependiente Cuantificación de la corriente
de los canales de Na+
Cuantitativa Discreta
Variable Dependiente Cuantificación de dopamina
Cuantitativa Discreta
Variable Independiente Células Dopaminérgicas
Cualitativa Nominal
Extracción y cuantificación del veneno.
La extracción del veneno de 100 alacranes por muestra se realizará a través de estimulación eléctrica,
aplicando 15 voltios en el cuerpo del artrópodo. El veneno recién obtenido se solubilizará en 400 μl de agua
tetradestilada. Posteriormente, con el objetivo de precipitar proteínas de alto peso molecular y partículas en
suspensión se centrifugará a 14000 rpm durante 15 minutos a 4 ºC en una centrifuga refrigerada. El contenido
de proteínas del veneno se estimará mediante la lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro a 280 nm,
considerando que una unidad de absorbancia corresponde a la concentración de un miligramo de proteína por
mililitro de solución. La muestra se almacenará a -20 ºC hasta su procesamiento.
Separación del veneno.
Alícuotas de veneno total serán sometidas a separación por medio de Cromatografía Liquida de Alta Resolución
(HPLC, por sus siglas en inglés) en una columna analítica C18 (250 x 4.6 mm x 5 μm), aplicando un gradiente
lineal de 0% de solvente A (ácido trifluoroacético (TFA) al 0.12% en agua) a 60% de solvente B (TFA al 0.10%
en acetonitrilo) durante 60 minutos (Anexo 2), a un flujo de 1 ml/min. Las fracciones se colectarán manualmente
por monitoreo de absorbancia a 230 nm y posteriormente se secarán en un aparato.
Manejo de Animales
Serán usadas ratas, con un peso de 250-350 g al comenzar el experimento. Las ratas serán alojadas
individualmente en jaulas macrolon (42 × 13 x 18 cm). Se vigilarán las ratas desde el nacimiento hasta obtener
el peso óptimo para el estudio. Se mantendrán en un ciclo de 12 hr día-noche (luces de 6.00 am a 6.00 pm) y el
agua corriente ad libitum. Durante el periodo de prueba, los animales serán alimentados con 15-18 g de comida
rodet chow (dieta balanceada para rata) al final de cada día (Bernéoud y cols., 1996).
Al finalizar su formación, las ratas serán lesionadas en el hemisferio contralateral según lo descrito por
Bernéoud y cols. Para la cuantificación de la dopamina las ratas serán divididas en 4 grupos de 6 ratas cada
uno:
a) ratas sin la inducción del modelo Parkinsoniano y sin toxina 1 de C. tecomuanus.
b) ratas sin la inducción del modelo Parkinsoniano y con toxina 1 de C. tecomuanus.
c) ratas con la inducción del modelo Parkinsoniano y sin toxina 1 de C. tecomuanus.
d) ratas con la inducción del modelo Parkinsoniano y con toxina 1 de C. tecomuanus.
Para el registro de las corrientes iónicas a través de canales de Na+ se realizarán dos grupos de 6 ratas:
1) Ratas sin la inducción del modelo Parkinsoniano.
2) Ratas con la inducción del modelo Parkinsoniano.
Se agregaran diferentes concentraciones de la toxina 1 de C. tecomanus para determinar la dosis efectiva
media.
Inducción del Modelo Parkinsoniano mediante 6-hidroxidopamina
Todos los animales serán anestesiados con equitesina (3 ml/kg). El sistema mesotelencefálico será lesionado
por una inyección estereotáxica unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en el haz medial del cerebro anterior
de acuerdo a Abrous y cols 1996. La 6-OHDA será inyectada, en un volumen de 1,5 µl y en una concentración
de 4 µg (base libre) / µl (solución salina al 0,9% y 0,01% de ácido ascórbico), dos veces a 3 minutos mediante
una cánula de acero inoxidable de calibre 30 en el estereotáxica coordenadas (antero-posterior AP, lateral L
y vertical V) L = 1,6 mm, AP = 0 mm, V = - 7,6 mm y L = 1,6 mm, AP = - 1 mm, V = - 8 mm. Las coordenadas
AP y L será estimada relativa a hacia la bregma, y V se medirá desde el nivel de la duramadre, con la barra de
incisivos, a 5 mm por encima de la línea interauricular (Barnéoud y cols., 1996).
Después de cada inyección, la cánula se dejará en su lugar durante 4 minutos para permitir la difusión de la
neurotoxina. El grupo de animales que se le administrara la toxina 1 de C. tecomanus recibirá la administración
de ésta toxina, 24 horas después de la lesión. La comida que será proporcionada durante la recuperación de
una semana post-quirúrgico será ad libitum (Barnéoud y cols 1996).
Cuantificación de la Dopamina
Los animales serán sacrificados para el análisis de la cuantificación de la Dopamina a las 12 semanas. El
cerebro será removido, la parte derecha e izquierda del estriado, la sustancia negra, la corteza prefrontal, serán
disecadas, se pesarán y se homogenizarán en HClO O.1 N con EDTA 0.1 mM. El homogenizado se
centrifugará a 12 000 g X 60 minutos. Los niveles dopamina y el DOPAC (3,4-dihidroxifenilacetato) de los
tejidos serán determinados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección electroquímica,
usando una adaptación del método descrito por Hétier y cols., 1998. La dopamina y la DOPAC se separarán en
una columna Nucleosil C18 de 150 x 4.6 mm y 5 μm de tamaño de partícula. La fase móvil será (NaH2PO4
100mm; HCIO4 20 mM, NaCl 1 mM; EDTA 0,1 mM, ácido l-heptanosulfónico, 8.2 mM, conteniendo metanol 7%
v / v, pH 3,7) a una velocidad de 2 ml / min a 35 ° C. El potencial del detector se fijó en 0.7 V contra Ag/AgCl. La
relación entre los niveles de DOPAC/dopamina serán usados como índice de utilización de la dopamina
(Bernéoud y cols 1996).
Dispersión celular
Las neuronas se disociarán como describe Raman y cols., 1997. Las capas superficiales del cerebelo se
retiraran en hielo picado conteniendo la solución de disociación oxigenada (en mM): 82 Na2SO4, 30 K2SO4, 5
MgCl2, 10 HEPES, 10 glucosa, y del 0,001% rojo de fenol (buffer a pH7.4 con NaOH). El tejido será incubado
durante 7 min en 10 ml de solución de disociación que contiene 3 mg / ml de la proteasa XXIII (pH reajustado)
con un 100% de oxígeno sobre la superficie del líquido a 31 °C. El tejido se lavará en caliente, la solución de
disociación oxigenada contendrá un 1 mg / ml de albúmina de suero bovino y 1 mg / ml inhibidor de la tripsina y
luego será trasladada a la solución de Tyrode que contiene (en mM): 150 NaCl, 4 KCl, 2 CaCl2, 2MgCl2, 10
HEPES, y 10 de la glucosa (pH reajustados) a temperatura ambiente. El tejido será microdiseccionado y
triturado con una serie de pipetas Pasteur para liberación individual de las neuronas. Las células se utilizarán
para el registro entre 1 y 6 horas después de la trituración (Khaliq y col., 2003).
Electrofisiología Los registros serán realizados con la técnica de patch clamp en la configuración de célula completa (Whole
cell). Se registrarán las corrientes iónicas a través de canales de Na+ en células dopaminérgicas dispersadas.
Los registros se llevarán a cabo a temperatura ambiente empleando un amplificador Axopatch 200B utilizando
pipetas de borosilicato entre 1-3 MΩ para Whole cell. Las corrientes serán filtradas a 1 kHz y digitalizadas a 10
kHz. La solución del baño tendrá la siguiente composición (mM): 103.5 KCH3O3S (Metanosulfonato de K), 1.8
NaCl, 0.9 EGTA, 9 HEPES, 1.8 MgCl2, 57.6 sucrosa, 14 Tris-fosfato de creatina, 4 MgATP, 0.3 Tris-GTP, buffer
a pH 7 con KOH para una concentración final de potasio de 128 mM o la misma solución del baño (Na+
simétrico a ambos lados de la membrana). Para inactivar otras corrientes activadas por voltaje, el potencial de
mantenimiento (Vh) será establecido a 0 mV. El protocolo de pulsos será desde -60 a 0 mV con incrementos de
10 mV. Para el registro del curso temporal, se aplicarán pulsos de prueba de 120 mV cada 3 s. Las corrientes
de célula completa se normalizarán a la capacitancia de la célula para obtener la densidad de corriente.
ANALISIS ESTADÍSTICOS La distribución o normalidad de los datos será determinada con la prueba de Kolmogorov-Smirnov. La
comparación entre los niveles de dopamina entre los grupos se realizará con la prueba ANOVA, si los datos
tienen una distribución normal, en tanto que si carecen de normalidad se utilizará la prueba no paramétrica de
Kruskall-Wallis.
La significancia estadística será interpretada a valores de p < 0.05.
Los registros de corrientes iónicas serán analizados utilizando la subrutina Clampfit de pClamp 9.2 (Axon
Instruments). Se determinarán curvas dosis-respuesta empleando el programa Origin 6.0 y los datos se
ajustarán a la ecuación de Hill:
E=Emax/(1+(EC50/x)h)
Donde E es el porcentaje de Efecto, Emax es el valor máximo del efecto, EC50 es la concentración efectiva
media, x es la concentración de la droga y h representa el coeficiente de Hill.
La significancia de los resultados será evaluada mediante la prueba t de student o ANOVA considerando una p
< 0.05.
OBJETIVOS Y METAS:
Objetivos
El objetivo principal de este proyecto es evaluar el posible efecto antiparkinsoniano de la toxina 1 del
Centruroides tecomanus en neuronas de rata.
Para lograr este objetivo es necesario cumplir con las siguientes metas:
1. Extraer y purificar el veneno de Centruroides tecomanus.
2. Separar la toxina 1 del veneno de Centruroides tecomanus utilizando HPLC.
3. Inducir el modelo Parkinsoniano in vivo en ratas mediante la 6-OHDA.
4. Medir el flujo de la corriente de Na+ en las células dopaminérgicas en ausencia y en presencia de la
toxina 1 del veneno de Centruroides tecomanus.
5. Cuantificar los niveles de dopamina en las células dopaminérgicas en ausencia y en presencia de la
toxina 1 del veneno de Centruroides tecomanus utilizando HPLC.
6. Determinar la dosis efectiva media de la toxina 1 del veneno de Centruroides tecomanus.
Metas
• Evaluar el efecto que produce la toxina 1 de Centruroides tecomanus sobre las corrientes de sodio en un
modelo parkinsoniano en ratas.
• Evaluar el efecto que produce la toxina 1 de Centruroides tecomanus en la liberación de la dopamina en un
modelo parkinsoniano en ratas.
• Contribuir con evidencia sobre el efecto que produce la toxina 1 de Centruroide tecomanus sobre un modelo
parkinsoniano en rata para su posible uso terapéutico.
INFRESTRUCTURA Y APOYO TECNICO DISPONIBLE: El proyecto será realizado en el laboratorio de Productos Biológicos de la Facultad de Ciencias Químicas donde
se cuenta con un alacranario y un modulador de voltaje para la extracción del veneno de alacrán; en la
Facultad de Ciencias donde se cuenta con un HPLC para separar los componentes del veneno de alacrán y
realizar la cuantificación de dopamina. En la Facultad de Medicina, se cuenta con un bioterio y un equipo
estereotáxico para la inducción del parkinson en rata y en el Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
(CUIB) donde se realizará las mediciones de corriente de sodio con el equipo Patch-Clamp.
PRODUCTOS ESPERADOS:
• Académicos:
o Tesis de una estudiante de doctorado.
o Tesis de dos estudiantes de licenciatura.
• Científicos
o Presentación de los resultados en distintos foros.
o Publicación de al menos un artículo en revista arbitrada.
CALENDARIO DE ACTIVIDADES:
ACTIVIDADES PRIMER
TRIMESTRE SEGUNDO
TRIMESTRE TERCER
TRIMESTRE CUARTO
TRIMESTRE
Revisión bibliográfica X X X X
Obtención del veneno de
C. tecomanus X
Separación de la toxina 1 del veneno
de C. tecomanus X
Inducción del modelo Parkinsoniano X
Medición del flujo de la corriente de Na+
en las células dopaminérgicas X X
Cuantificación de los niveles de
dopamina en las células
dopaminérgicas
X
Análisis de los Resultados X X X
Escritura y revisión de tesis X
Presentación de resultados finales en
distintos foros X
Publicación de artículo X
REGISTRO DE PARTICIPANTES: Nombre: Laura Leticia Valdez Velazquez.
Tipo de participante: Investigadora
Nombramiento: Profesor e Investigador de Tiempo Completo Asociado C.
Grado académico máximo: Doctora en Genética Humana.
Miembro del cuerpo académico CA-35.
Miembro de SNI: Si, Nivel 1.
Perfil de PROMEP: Si.
Publicaciones en revistas indizadas: • Valdez LL, Quintero A, Garcia E, Olivares N, Celis A, Rivas F Jr, Rivas F. Thrombophilic polymorphisms
in preterm delivery. 2004;33:51-56.
• Barajas-Barajas LO, Valdez LL, Gonzalez JR, Garcia-Garcia C, Rivera H, Ramirez L. Sensorineural deafness in two infants: a novel feature in the 22q distal duplication syndrome. Cardinal signs in trisomies 22 subtypes. Genet Couns. 2004;15:167-173.
• Quintero-Ramos A, Valdez-Velazquez LL, Hernandez G, Baltazar LM, Padilla-Gutierrez JR, Valle Y,
Rodarte K, Ortiz R, Ortiz-Aranda M, Olivares N, Rivas F. Assessment of five thrombophilic genetic polymorphisms among couples with habitual abortion. Gac Med Mex. 2006;42:95-98.
• Laura L. Valdez-Velazquez, Antonio Quintero-Ramos, Sandra A. Perez, Francisco Mendoza-Carrera,
Hector Montoya-Fuentes, Fernando Rivas Jr., Norma Olivares, Alfredo Celis, Oscar F. Vazquez, Fernando Rivas. Genetic polymorphisms of renin angiotensin system in preterm delivery and premature rupture of membranes. JRAAS. 2007;8:160-168.
• Miguel Á. García-Ruiz, Laura L. Valdez-Velazquez, Zeferino Gómez-Sandoval. Integración de
visualización científica molecular en el salón de clases. Quim. Nova. 2008 31:2184-2189.
• Quintero-Ramos A, Padilla-Gutiérrez JR, Hernández-Zaragoza G, Valle Y, Valdez-Velázquez LL, Olivares N, Rivas F. Population data of five STRs from the INTERPOL series in a mestizo population of western Mexico (State of Jalisco). Rev Invest Clin. 2009 61:104-109.
• Valdez-Velázquez LL, Mendoza-Carrera F, Pérez SA, Rodarte KM, Sandoval-Ramirez L, Montoya-
Fuentes H, Quintero-Ramos A, Delgado-Enciso I, Montes-Galindo DA, Gomez-Sandoval Z, Olivares N, Rivas F. Renin gene haplotype diversity and linkage disequilibrium in two Mexican and one German population samples. Aceptado en JRAAS, 2010.
• Mendizábal-Ruiz AP, Morales JA, Castro-Martínez X, Valdez Laura, Vázquez-Camacho G, Sanchez-Corona J, Moran-Moguel MC. RAS Polymorphisms in cancerous and benign breast tissue. Aceptado en JRAAS, 2010.
Estancia: En el laboratorio del Dr. Possani (investigador emerito) del Instituto de Biotecnologia de la UNAM en
Cuernavaca, Morelos. Julio y Agosto de 2009, Enero 2010. Se realizaron análisis proteómicos del veneno de
alacrán y librería de ADN.
Tesis dirigidas:
DETERMINACIÓN MORFOMETRICA Y GENÉTICA DE LAS VARIEDADES DE ALACRÁN EXISTENTES EN EL ESTADO DE COLIMA. Tesis de licenciatura carrera de Químico Farmacéutico Biólogo de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Colima. Ma. Teresa Romero Gutiérrez. Concluida 2010.
ANALISIS PROTEOMICO Y DE ESPECTROMETRIA DE MASAS Y ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LOS COMPONENTES DEL VENENO DE ALACRAN CENTRUROIDES TECOMANUS HOFFMANN, 1932 (SCORPIONES: BUTHIDAE). Tesis de licenciatura carrera de Químico Farmaceutico Biólogo de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Colima. Luis Jose Guadalupe Zamora Pizano. Concluida 2010.
EVALUACIÓN DEL VENENO DE CENTRUROIDES LIMPIDUS TECOMANUS COMO AGENTE ANTITUMORAL EN LÍNEAS CELULARES CANCEROSAS Y EN UN MODELO ANIMAL MURINO. Tesis de licenciatura carrera de Químico Farmacéutico Biólogo de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Colima. Luis José Guadalupe Zamora Pizanoy Jaime Bolaños Delgado. Concluida 2010.
ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO 12109G>A (Mbo I) DEL GEN DE RENINA EN PARTO PRETERMINO. Tesis de licenciatura carrera de Químico Farmaceutico Biológo de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Colima. Yusvi Elizabeth Farias Contreras. Concluida 2010.
ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO GÉNICO DE LA ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA INS/DEL DEL SISTEMA RENINA ANGIOTENSINA EN LESIONES INTRAEPITELIALES Y CÁNCER CERVICOUTERINO” .Tesis de licenciatura carrera de Químico Farmaceutico Biólogo de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Colima. Ángel Eduardo Hernández Araujo. Concluida 2010.
ANALISIS HAPLOTIPICO DE LOS POLIMORFISMOS 2707C>T, 2805A>G, Y 12109 G>A DEL GEN RENINA EN CÁNCER CERVICOUTERINO. Tesis de licenciatura carrera de Químico Farmaceutico Biologo de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Colima. Claudia Lizette Cabadas Torres. Concluida 2009
ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS T174M Y M235T DEL GEN DE ANGIOTENSINÓGENO EN LESIONES INTRAEPITELIALES Y CÁNCER CERVICOUTERINO. Tesis de licenciatura carrera de Químico Farmacéutico Biólogo de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Colima. Liliana Mejía Fuentes y Stephania Suarez Caro. Concluida 2009.
ASOCIACIÒN DEL POLIMORFISMO A1166C DEL RECEPTOR DE ANGIOTENSINA II EN LESIONES INTRAEPITELIALES A CANCER CERVICOUTERINO”. Tesis de licenciatura carrera de Químico Farmaceutico Biólogo de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Colima. Ana Cristina Macías Sevilla. Concluida 2008
DIVERSIDAD HAPLOTIPICA Y ESTMACIÓN DE DESEQUILIBRIO DEL LIGAMENTO EN EL GEN RENINA. ESTUDIO DE FAMILIAS”. Tesis de licenciatura de la carrera de Químico Farmacobiólogo del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías de la Universidad de Guadalajara. Sandra Alejandrina Pérez Parra. Concluida 2007.
Descripción de su papel en el proyecto:
• Planeación y coordinación de las actividades de investigación.
• Entrenamiento de la metodología a los estudiantes.
• Asesoría de tesis
• Análisis y discusión de resultados.
• Elaboración y presentación de los productos de investigación.
Firma: _____________________________________
Dra. Laura Leticia Valdez Velazquez
Nombre: Enrique Sánchez Pastor.
Tipo de participante: Investigador.
Nombramiento: Profesor e Investigador de Tiempo Completo, Asociado C.
Grado académico máximo: Doctor en Ciencias Fisiológicas.
Miembro de SNI: Candidato.
Perfil de PROMEP: Si.
PUBLICACIONES: Sánchez-Pastor, E.A., Huerta, M., Trujillo, X. and Andrade, F. Effects of cannabinoids on synaptic transmission in the frog neuromuscular junction. J Pharmacol Exp Ther. 2007. 321(2):439-45.
Shabala, L., Sánchez-Pastor, E.A., Trujillo, X., Shabala, S., Muñiz, J. and Huerta, M. Effects of verapamil and gadolinium on caffeine-induced contractures and calcium fluxes in frog slow skeletal muscle fibers. J Memb Biol. 2008. 221:7-13.
Huerta, M., Ortiz-Mesina, M., Trujillo, X., Sánchez-Pastor, E.A., Vásquez, C., Castro, E., Velasco, R., Montoya-Perez, R. and Onetti, C. Effects of cannabinoids on caffeine contractures in slow and fast skeletal muscle fibres of the frog. J Memb Biol. 2009. 229:91-99.
Kundu, P., Alioua, A., Kumar, Y., Lu, R., Ou, J., Sánchez-Pastor, E., Li, M., Stefani, E. and Toro, L. BK Channels: Regulation of Expression and Physiological Impact in Structure, Function and Modulation of Neuronal Voltage-Gated Ion Channels. Eds. V. Gribkoff and L.K. Kaczmarek. Wiley-Blackwell, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ USA. 2009. pp 317-342. ISBN 978-0-471-93013-6.
Trujillo, X., Huerta, M., Vásquez, C., Sánchez-Pastor, E., Andrade, F., Castro, E., Ortiz, M. and Montoya-Perez, R. Cannabinoids effects on synaptic transmission in Recent Advances in the Neurophysiological Basis of Disease and Addiction. Eds. M. Huerta, X. Trujillo and C. Vasquez. Research Signpost. 2009. ISBN 978-81-308-0359-3.
Trujillo, X. Huerta, M., Monroy, H. and Sánchez-Pastor, E. Cellular and molecular mechanisms of MDMA and cocaine addiction in Recent Advances in the Neurophysiological Basis of Disease and Addiction. Eds. M. Huerta, X. Trujillo and C. Vasquez. Research Signpost. 2009. ISBN 978-81-308-0359-3.
Sánchez-Pastor, E.A. Estudio de los efectos de los canabinoides en la unión neuromuscular de la rana. Ed. Myriam Cruz Calvario. Universidad de Colima. 2009. pp 92. ISBN 978-607-7565-32-1.
Rocío Montoya-Pérez, Alfredo Saavedra-Molina, Xóchitl Trujillo, Miguel Huerta, Felipa Andrade, Enrique Sánchez-Pastor and Mónica Ortiz. Inhibition of oxygen consumption in skeletal muscle-derived mitochondria by pinacidil, diazoxide, and glibenclamide, but not by 5-hydroxydecanoate. J. Bioenerg. Biomembr. 2010. 42:21-27.
Li, M., Tanaka, Y., Alioua, A., Wu, Y., Lu, R., Kundu, P., Sanchez-Pastor, E., Marijic, J., Stefani, E. and Toro, L. Thromboxane A2 receptor and MaxiK channel intimate interaction supports channel trans-inhibition independent of G-protein activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. 107(44):19096-101.
Andrade, F., Trujillo, X., Sánchez-Pastor, E., Montoya-Pérez, R., Saavedra-Molina, A., Ortiz-Mesina, M. and Huerta, M. Glibenclamide increases post-fatigue tension in chicken slow skeletal muscle fibers. J. Comp. Physiol. B. 2010 Nov 16 [Epub ahead of print].
Sánchez-Pastor, E., Morales, A., Kundu, P., Alioua, A., Li, M., Stefani, E. and Toro, L. A seven amino acids signal in a large-conductance and Ca2+-activated K+ channel splice variant isoform confers basolateral targeting. Enviado PNAS.
Sánchez-Pastor, E., Ou, J., Alioua, A., Kundu, P., Stefani, E. and Toro, L. “Microtubule network is necessary to direct and maintain the apical localization of Slo1 channels in epithelial cells”. En preparación.
ESTANCIA POSDOCTORAL:
Laboratorio de la Dra. Ligia Toro, División de Medicina Molecular, Departamento de Anestesiología, Universidad de California, Los Angeles. Estados Unidos. (BH-509A CHS, Box 957115, Los Angeles, CA 90095-7115, Tel: 310-794-7809), Junio 15 de 2006 a Octubre 31 de 2008.
Descripción de su papel en el proyecto: Apoyo en medición de corrientes de los canales de sodio.
Firma: ________________________________
Dr. Enrique Sánchez Pastor
Nombre: Ivan Delgado Enciso.
Tipo de participante: Investigador.
Nombramiento: Profesor e Investigador de Tiempo Completo Titular A.
Grado académico máximo: Doctor en Biología Molecular.
Miembro de SNI: Si, Nivel 1.
Perfil de PROMEP: Si.
PUBLICACIONES
1. Delgado-Enciso I, Rojas-Martínez A, Barrera-Saldaña HA, Ortiz-Lopez R. Los virus: Una importante causa de neoplasias en humanos. Rev Invest Clin 2004; 56:495-506. 2. Santillan AA, Camargo CA Jr, Ramirez-Rivera A, Delgado-Enciso I, Rojas-Martinez A, Cantu-Diaz F, Barrera-Saldana HA. Association between beta2-adrenoceptor polymorphisms and asthma diagnosis among Mexican adults. J Allergy Clin Immunol. 2003 ;112:1095-100. PMID: 14657864 [PubMed - indexed for MEDLINE] 3. Martínez de Villareal LE, Delgado-Enciso I, Valdez-Leal R, Ortíz-López R, Rojas-Martínez A, Limón-Benavides C, Sánchez-Peña MA, Áncer-Rodríguez J, Barrera-Saldaña HA, Villarreal-Pérez JZ. Folate levels and MTHFR genotype in mothers of deceased NTD products. Arch Med Res 32:277-282. 2001. PMID: 11440783 [PubMed - indexed for MEDLINE] 4. Martínez-Villarreal RT, Rojas-Martínez A, Sánchez-Hernández JG, Hernández-Torres U, Delgado-Enciso I, Ortiz-López R. Evaluación clínica, bioquímica y molecular de una familia con recurrencia de defectos del tubo neural. Revista Salud Pública y Nutrición 2:4. 2001 http://www.uanl.mx/publicaciones/respyn/ii/4/articulos/anacefalia.html 5. Rojas Martínez, A., Ortiz López, R., Delgado Enciso, I. “Genética y Medicina Molecular en Cardiología. Revista Española de Cardiología; 54: 91-108. 2001. PMID: 11141459. PubMed - indexed for MEDLINE 6. Delgado Enciso, I., Martínez Garza, S.G., Rojas Martínez, A., Ortiz López, R., Bosques Padilla, F., Calderón Garcidueñas, A.L.Zárate Gómez, M., Barrera Saldaña, H.A. “Mutación 677T del gen MTHFR en adenomas y cáncer colorrectal en una muestra de la población del noreste de México”. Rev. de Gastroenterología de México. (66)1: 32-37, 2001. [PubMed - indexed for MEDLINE] 7. Rojas-Martinez A, Santillan AA, Delgado-Enciso I, Barrera-Saldana HA. Genetic aspects of asthma. Rev Invest Clin 2000 Jul-Aug;52:441-450. PMID: 11061107 [PubMed - indexed for MEDLINE
Resumenes en Revistas Internacionales.
1. Martínez de Villareal LE, Delgado-Enciso I, Valdez-Leal R, Ortíz-López R, Rojas-Martínez A, Limón-Benavides C, Sánchez-Peña A, Áncer-Rodríguez J, Barrera-Saldaña HA, Villarreal-Pérez JZ. Folate levels and MTHFR genotype in mothers of deceased NTD roducts. Teratology 2000; 61:473.
2. Augusto Rojas-Martínez, Jacinto Esteban-María, Juan Francisco González-Guerrero, Raquel Garza-Guajardo, Rocío Ortiz-López, Iván Delgado-Enciso, Juan Pablo Flores-Gutiérrez, Andrés Hernández-García, Laura Aguilar, Bryan Butler, Dov Kadmon, Hugo A. Barrera-Saldaña, Estuardo Aguilar-Córdova. Pre-
Prostatectomy AdV-tk/prodrug gene rtherapy prostate cancer clinical trial in Mexico: Analysis of vector disstribution and anti-tumor effects. Molecular therapy 2003;7:S283. 3. Iván Delgado-Enciso, Irma A Martínez-Dávila, Rocío Ortiz-López, Ramón Alemany-Bonastre, Christian I Silva-Platas, Ángel Lugo-Trampe, Hugo A Barrera-Saldaña, Augusto Rojas-Martínez.A potent Replicative Delta Adenoviral vector for HPV tumors. Mol Ther 2005;11(supp 1): S213.
Aportaciones Originales a Bases de Datos Internacionales
Reporte de 9 secuencias nucleotídicas diferentes del papilomavirus humano tipo 16 en la base de datos más importante del mundo en su genero: Nucleotide sequence database (GenBank) del Nacional Biotechnology Information de los Estados Unidos de America.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=PubMed
1. Human papillomavirus type 16 isolate URRHPV16-C10 long control region sequence. GeneBank accession AY552077
2. Human papillomavirus type 16 isolate URRHPV16-C12 long control region sequence. GeneBank ACCESSION AY552070
3. Human papillomavirus type 16 isolate URRHPV16-C24 long control region sequence. GeneBank ACCESSION AY552071
4. Human papillomavirus type 16 isolate URRHPV16-C27 long control region sequence. GeneBank ACCESSION AY552072
5. Human papillomavirus type 16 isolate URRHPV16-C3 long control region sequence. Gene Bank ACCESSION AY552074
6. Human papillomavirus type 16 isolate URRHPV16-C43 long control region sequence. Gene Bank ACCESSION AY552073
7. Human papillomavirus type 16 isolate URRHPV16-C51 longcontrol region sequence. GeneBank ACCESSION AY552078
8. Human papillomavirus type 16 isolate URRHPV16-C7 long control region sequence. Gene Bank ACCESSION AY552075.
9. Human papillomavirus type 16 isolate URRHPV16-C9 long control region sequence. GeneBank ACCESSION: AY552076
Descripción de su papel en el proyecto: Apoyo en la inducción del modelo parkinsoniano en ratas.
Firma: _____________________________
Dr. Ivan Delgado Enciso
Nombre: Silvia Guillermina Ceballos Magaña.
Tipo de participante:Investigadora.
Nombramiento: Profesor e Investigador de Tiempo Completo
Grado académico máximo: Doctora en Estudios Avanzados en Química
Miembro de SNI: Si, Nivel 1.
Perfil de PROMEP: Si.
PUBLICACIONES 1. R. Muñiz-Valencia, S.G. Ceballos-Magaña, R. Gonzalo-Lumbreras, A. Santos Montes, R. Izquierdo-Hornillos. “GC-MS method development and validation for anabolic steroids in feed samples” Journal Separation Science 31 (2008) 727-734.
2. R. Muñiz-Valencia, S.G. Ceballos-Magaña, R. Gonzalo-Lumbreras, A. Santos Montes, R. Izquierdo-Hornillos.“Sample preparation for determination of steroid corticoids and anabolics in feed using LC” Journal Separation Science 31 (2008) 2303-2309.
3. R. Muñiz-Valencia, S.G. Ceballos-Magaña, R. Gonzalo-Lumbreras, A. Santos-Montes, R. Izquierdo-Hornillos. “A liquid chromatography method using a monolithic column for the determination of corticoids in animal feed and animal feeding water” Analytical and Bioanalytical Chemistry 391 (2008) 2683-2691.
4. R. Muñiz-Valencia, S.G. Ceballos-Magaña, D. Rosales-Martinez, R. Gonzalo, A. Santos-Montes, A. Cubedo-Fernández, R. Izquierdo-Hornillos.
Título: “Method development and validation for melamine and its derivatives in rice concentrates by liquid chromatography. Application to animal feed samples”
Revista: Analytica and Bioanalytical Chemistry 392 (2008) 523-531.
5. S.G. Ceballos-Magaña, M. Martín, M. Jurado, F. Pablos. “Quantitation of twelve metals in Tequila and Mezcal spirits as authenticity parameters”. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57 (2009) 1372-1376
ESTANCIAS DE INVESTIGACIÓN 1.- Departamento de Química Analítica, Facultad de Química, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, España
Tema: Determinación de compuestos volátiles en bebidas alcohólicas mediante cromatografía de gases
Periodo: 01/10/2005 al 01/03/2006
2.- Centro: Gerencia de Geotermia, Departamento de Energías Alternas, Instituto de Investigaciones Eléctricas (IIE), Cuernavaca, Morelos, México
Tema: proyecto: “Implantación de métodos analíticos para la modelación geoquímica de sistemas acuíferos”
Periodo: 23/09/2002 al 23/03/2003
3.- Centro: Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV) del Instituto Politécnico Nacional (IPN), Ciudad de México, México
Tema: Prácticas Profesionales, realizando el proyecto “Reacciones de Diels-Alder con catalizadores de Boro”
Periodo: 11/02/2002 al 01/07/2002
4.- Centro: Gerencia de Geotermia, Departamento de Energías Alternas, Instituto de Investigaciones Eléctricas (IIE), Cuernavaca, Morelos, México
Tema: Determinación metálica y de contenido isotópico muestras de agua procedentes de pozos geotérmicos y subterráneos realizado durante el “XI Verano de la Investigación Científica”
Periodo: 25/06/2001 al 24/08/2001
5.- Centro: Observatorio Vulcanológico, Universidad de Colima, Colima, México
Tema: Toma de muestras de gases en tierra en las zonas aledañas y fumarolas del volcán de Colima
Periodo: 27/02/2001 al 27/10/2001
6.- Centro: Centro de Investigaciones Científicas de Yucatán (CICY), Mérida, Yucatán, México
Tema: Cultivo in Vitro de embrión cigótico de cocotero
Periodo: 03/07/2000 al 25/08/2000
DISTINCIONES
• “Peña Colorada” al mejor expediente académico. Noviembre del 2003. • Los mejores estudiantes de México” al mejor expediente académico de la promoción 1998-2002 en
la Licenciatura en Ciencias con Especialidad en Química. 25 de noviembre del 2002.
Descripción de su papel en el proyecto: Apoyo la separación de los componentes de veneno de alacrán y en la determinación de dopamina.
Firma: _______________________________________
Dra. Silvia Guillermina Ceballos Magaña
Nombre: Roberto Muñiz Valencia.
Tipo de participante: Investigador.
Nombramiento: Profesor e Investigador de Tiempo Completo,
Grado académico máximo: Doctor en Ciencias Quimicas
Miembro de SNI: Nivel 1
Perfil de PROMEP: Si.
PUBLICACIONES: R. Gonzalo-Lumbreras, R. Muñiz-Valencia, A. Santos Montes, R. Izquierdo-Hornillos. “Liquid chromatographic method development for steroids determination (corticoids and anabolics). Application to animal feed samples”. Journal of chromatography A 1156 (2007) 321-330. Factor de impacto: 3.64
R. Muñiz-Valencia, R. Gonzalo-Lumbreras, A. Santos Montes, R. Izquierdo-Hornillos. “Method development validation for corticoids in animal feed samples by liquid chromatography using a monolithic column”. Journal Separation Science 30 (2007) 2950-2957. Factor de impacto: 2.63
R. Muñiz-Valencia, R. Gonzalo-Lumbreras, A. Santos Montes, R. Izquierdo-Hornillos. “Quantitative screening for steroids in animal feeding water using reversed phase LC with gradient elution”. Journal Separation Science 31 (2008) 219-228. Factor de impacto: 2.63
R. Muñiz-Valencia, S.G. Ceballos-Magaña, R. Gonzalo, A. Santos, R. Izquierdo. “GC-MS method development and validation for anabolic steroids in feed samples”. Journal Separation Science 31 (2008) 727-734. Factor de impacto: 2.63
R. Muñiz-Valencia, R. Gonzalo-Lumbreras, A. Santos Montes, R. Izquierdo-Hornillos. “Liquid chromatographic method development for anabolic androgenic steroids using a monolithic column. Application to animal feed samples”. Analytica Chimica Acta 611 (2008) 103-112. Factor de impacto: 3.19
R. Muñiz-Valencia, S.G. Ceballos-Magaña, R. Gonzalo-Lumbreras, A. Santos Montes, R. Izquierdo-Hornillos. “Sample preparation for determination of steroid corticoids and anabolics in feed using LC”. Journal Separation Science 31 (2008) 2303-2309. Factor de impacto: 2.63
R. Muñiz-Valencia, S.G. Ceballos-Magaña, R. Gonzalo-Lumbreras, A. Santos-Montes, R. Izquierdo-Hornillos. “A liquid chromatography method using a monolithic column for the determination of corticoids in animal feed and animal feeding water”. Analytical and Bioanalytical Chemistry 391 (2008) 2683-2691. Factor de impacto: 2.87
R. Muñiz-Valencia, S.G. Ceballos-Magaña, R. Gonzalo-Lumbreras, Daniel Rosales-Martinez, Ana Santos-Montes, A. Cubedo-Fernandez-Trapiella, R. Izquierdo-Hornillos. “Method development and validation for melamine and its derivatives in rice concentrates by liquid chromatography. Application to animal feed samples” Analytical and Bioanalytical Chemistry 392 (2008) 523-531. Factor de impacto: 2.87
Distinciones “Peña Colorada” al mejor expediente académico, Fecha: Noviembre del 2003.
Estancias de Investigación: Ha realizado estancias de investigación en las siguientes instituciones: en 3 ocasiones en el Instituto de Investigaciones Eléctricas. Cuernavaca, Morelos, México. Depto de Química Analítica de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Uztapalapa y Instituto de Biotecnología de la UNAM. Cuernavaca, Morelos, México.
Línea de investigación: Manejo de técnicas para detección elemental (ICP, EAA) y cromatográficas (HPLC y GC) para el desarrollo y validación de métodos analíticos para la determinación de compuestos en distintas muestras de interés analítico.
Descripción de su papel en el proyecto: Apoyo la separación de los componentes de veneno de alacrán y en la determinación de dopamina.
Firma: ______________________________
Dr. Roberto Muñiz Valencia
Nombre: Sandra Alejandrina Pérez Parra (No. de Cuenta 2008 8657)
Grado académico máximo: Maestra en Ciencias Médicas.
PUBLICACIONES
Valdez‐Velazquez LL, Mendoza‐Carrera F, Perez‐Parra SA, Rodarte‐Hurtado KM, Sandoval‐Ramirez L, Montoya‐Fuentes H, Quintero‐Ramos A, Olivares N, Rivas F. Linkage disequilibrium and haplotype diversity in the renin gene in Mestizo and Native Mexican, and German Caucasian populations. Renin-Angiotensin Aldosterone System. Aceptado Julio 2010.
Laura L. Valdez, Antonio Quintero-Ramos, Sandra A. Pérez, Francisco Mendoza-Carrera, Héctor Montoya-Fuentes, Fernando Rivas Jr., Norma Olivares, Alfredo Celis, Oscar F. Vázquez, Fernando Rivas. Genetic polymorphisms of renin angiotensin system in preterm delivery and premature rupture of membranes, Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 2007; 8(4):160-168.
Descripción de su papel en el proyecto: Revisión bibliográfica, obtención del veneno, separación de los componentes del veneno por HPLC, inducción
del modelo parkinsoniano en ratas, medición de los canales de sodio y cuantificación de dopamina.
Firma:___________________________________
M.C. Sandra Alejandrina Pérez Parra
Nombre: Christian Zamora Rincón. (No. de Cuenta 2004-5306)
Grado académico máximo: 6º Semestre de Químico Farmacéutico Biólogo
Semestre que cursa: 7º Semestre de Químico Farmacéutico Biólogo
Descripción de su papel en el proyecto:
Revisión bibliográfica, recolección y mantenimiento de especímenes, obtención del veneno, separación de los
componentes del veneno por HPLC, apoyo en la cuantificación de dopamina.
.
Firma: ________________________
Christian Zamora Rincón
Nombre: Guillermo Camargo Flores (No. de Cuenta 2004-8655)
Grado académico máximo: 6º Semestre de Químico Farmacéutico Biólogo
Semestre que cursa: 7º Semestre de Químico Farmacéutico Biólogo
Descripción de su papel en el proyecto:
Revisión bibliográfica, recolección y mantenimiento de especímenes, obtención del veneno, apoyo en el
mantenimiento de las ratas y medición de las corrientes de sodio.
Firma: ________________________
Guillermo Camargo Flores
REQUERIMIENTOS FINANCIEROS:
GASTO DE INVERSIÓN – EQUIPO DE LABORATORIO 30%
PARTIDA MONTO ($) OBJETO DEL GASTO JUSTIFICACIÓN
Columna especial para HPLC
30000 Separación de la toxina 1 del veneno del C. tecomanus y obtención de Dopamina del modelo parkisoniano.
Las columnas para HPLC son especiales para el componente que se requiera separar, es necesario la compra de columnas para la separación de la toxina 1 del veneno de alacrán y es necesaria una columna para la obtención de dopamina ya que seria la forma de saber si el veneno ejerce la acción de liberar la dopamina.
GASTO CORRIENTE-MATERIALES 50%
PARTIDA MONTO OBJETO DEL GASTO JUSTIFICACIÓN
Material de laboratorio y reactivos para la obtención y purificación de la toxina.
$12000 Para el mantenimiento de alacranes, obtención del veneno, solventes para HPLC.
Es necesario mantener los alacranes porque se tendrá que estar obteniendo el veneno cada tres semanas durante seis meses. Y materiales y reactivos para cada proceso de la obtención y purificación de la toxina.
Animales (ratas), material de laboratorio y reactivos para la inducción del modelo parkinsoniano.
$8000 Para el mantenimiento de las ratas, soluciones y materiales para la inducción del modelo parkinsoniano.
Es necesario mantener a las ratas para poder evaluar el efecto de la toxina sobre las ratas parkinsonianas.
Material de laboratorio y reactivos para la medición de las corrientes de sodio.
$15000 Para los experimentos de electrofisiología se requiere de sales y buffer para la preparación de las diferentes soluciones fisiológicas y de la compra de capilares de vidrio para las pipetas de registro.
También se requiere de la compra de Oxígeno para el sistema de perfusión.
El material es necesario para evaluar cambios en las corrientes de sodio con y sin la toxina.
Material de laboratorio y reactivos para la cuantificación de dopamina.
$15000 El material es necesario para evaluar la liberación de la dopamina con y sin la toxina.
GASTO CORRIENTE-SERVICIOS 10%
PARTIDA MONTO OBJETO DEL GASTO JUSTIFICACIÓN
Viáticos
$8000 Hospedaje y alimentos Estancia en el laboratorio de la UNAM, de estudiantes o investigadores en Cuernavaca, Morelos para el entrenamiento y/o la estandarización del protocolo de HPLC para la separación de la toxina 1 de C. tecomanus
Pasaje $2000 Transporte terrestre Estancia en el laboratorio de la UNAM, de estudiantes o investigadores en Cuernavaca, Morelos para el entrenamiento y/o la estandarización del protocolo de HPLC para la separación de la toxina 1 de C. tecomanus
GASTO CORRIENTE – ACERVO BIBLIOGRÁFICO 10%
PARTIDA MONTO ($) OBJETO DEL GASTO
JUSTIFICACIÓN
Compra de libros y publicaciones arbitradas no libres en la red
10000
Libros sobre la enfermedad de Parkinson y toxinas. Publicaciones arbitradas, nuevas, de apoyo para discusión de resultados que no se encuentran gratis en la red.
Los libros serán de apoyo para los estudiantes involucrados en este proyecto, las publicaciones son necesarias para para fundamentar los antecedentes y discusiones de resultados del proyectos así como de apoyo en la metodología.
OFICIO DE PRESENTACIÓN
Los abajo firmantes opinamos que el proyecto “Evaluación del posible efecto antiparkinsoniano de la toxina 1 de C. tecomanus en neuronas de rata.” presentado por la Dra. Laura Leticia Valdez Velazquez es:
Marque
Viable Si
Contribuye a la consolidación de una LGAC existente Si
Abre una nueva LGAC de interés para los programas de desarrollo de las DES y del cuerpo académico No
____M. C. Daniel Jaramillo Cano______ ____Francisco Martinez Martinez___
Nombre y firma del director de la Unidad Nombre y firma del líder del CA*
Académica+
+En el caso en que el director sea el responsable del proyecto, firmará el PTC miembro de su CA de mayor grado académico y mayor antigüedad.
*En el caso en que el líder sea el responsable del proyecto, firmará el PTC miembro del CA de mayor grado académico y mayor antigüedad.