遺伝子研究のための基礎...
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2ABS 分子生物学08
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遺伝子研究のための基礎DNAの性質
2ABS 遺伝生化学08
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DNAの性質
+エタノールC2H5OH
DNAが水に溶ける水和の状態
水和殻
疎水性高まる↓
水和殻壊れる↓
DNAが水に溶けていられない
↓DNAが凝集
↓沈殿
水 水
反発
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--------
塩の効果--------
--------
(ー)電荷 (+)イオン塩で中和
エタ沈
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近づける
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--------
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DNAの性質
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ベクター(vector)
組換えDNA実験のために改良した plasmid, phage 等様々な遺伝子や DNA 断片の運び屋
•複製開始点をもつ
•選択マーカーをもつ
•薬剤耐性遺伝子
•アンピシリン ampicillin (原核生物用)
•テトラサイクリン tetracycline (原核生物用)
•クロラムフェニコール chloramphenicol (原核生物用)
•オーレオバシジン aureobasidin (原核・真核生物用)
•ハイグロマイシン hygromycin (原核・真核生物用)
など
•栄養要求性遺伝子
•LEU2, HIS2, URA3, ADE2 (酵母) など
•様々な制限酵素の切断部位をまとめた部位Multi-cloning site, Multiple cloning site, polycloning site
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プラスミド (Plasmid)
host(宿主)
ゲノム DNAE. coli 4639 kb
plasmid2〜10 kb
ゲノム DNA (genomic DNA) 以外の環状DNADNA 複製は、genomic DNAと同調していないDNA 複製開始点 (ori) を持つコピー数: 1〜2 (single copy), 100〜1000 (multi copy)接合型遺伝子や薬剤耐性遺伝子をもつ
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プラスミドベクター
multiple cloning siteマルチクローニングサイト
lacZ geneβ-galactosidase
複製開始点
Ampicillin resistant gene(アンピシリン耐性遺伝子)
(β-lactamase)
multiple cloning site
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Plasmid の構造
CCCcovalently closed circular dsDNA
OCopen circular dsDNA
linear dsDNA
ssDNA��(nick)
dsDNA���
負の超らせんをもつ閉環状二本鎖 DNA
開環状二本鎖 DNA
直鎖状二本鎖 DNA 142
plasmidの形状と別名
form I DNA (CCC)
負の超らせんをもつ閉環状二本鎖 DNA
negatively supercoiled dsDNA
form II DNA (OC)
nicked circular
open circularform III DNA
(Linear)
form IV DNA
超らせんを持たない閉環状二本鎖DNA
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環状DNAのトポロジーLinking number(超らせんの程度を表す指標)
右巻き超らせん
負(ー)の超らせん
negative supercoil
左巻き超らせん
正(+)の超らせん
positive supercoil
Linking number: LkTwisting number: Tw
(二重らせんの数)
Writhing number: Wr
(超らせんの数)
Lk = Tw + Wr
Twisting number: Tw
二重らせんは約10 bpで1回転
2700 bp plasmidなら
Tw = 270
-1
Writhing number: Wr
-2
-3
+1
+2
+3
1回
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超らせんとLinking number
plasmid 2700 bp負の超らせん 50回
Tw = 270Wr = -50
Lk = 220
Topoisomerase
plasmid 2700 bp負の超らせん 0回
Tw = 270Wr = 0
Lk = 270
DNA複製or転写
Tw = 220Wr = 0
Lk = 220
2700 bp二重らせん減少負の超らせん 0回
plasmid 2700 bp正の超らせん 20回
Tw = 200Wr = +20
Lk = 220
さらに進行
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TopoisomeraseトポイソメラーゼはLkを変える
Type ITopoisomerase
右巻き超らせん
負(-)の超らせん
negative supercoil
左巻き超らせん
正(+)の超らせん
positive supercoil
Gyrase(ATP必要)Type IITopoisomerase
Type ITopoisomerase(真核生物由来のみ)
Reverse Gyrase(ATP必要)Type IITopoisomerase
トポイソメラーゼは切断再結合によりLkを変化させる。
DNAが切断されない限りLkは変化しない
form IV DNA
超らせんを持たない閉環状二本鎖DNA
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エチジウムブロマイド (EtBr) は超らせん構造を変えるがLkは変えない
EtBr
EtBr EtBr
EtBrは塩基と塩基の間にIntercalation して12°巻き戻し (untwisting)
30分子のEtBrで1回転 untwisting
negative positiverelax
Tw = 270Wr = -50Lk = 220
Tw = 220Wr = 0Lk = 220
Tw = 190Wr = +30Lk = 220
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超らせんDNAはエチジウムブロマイド (EtBr) の濃度により電気泳動の移動度が変化する
ccc(form I)
oc(form II)
EtBr 多無無 少
well