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生殖细胞发育

浙江大学发育生物学课程

范衡宇

浙江大学生命科学研究院

第一节：概论

什么是生殖细胞？

生殖细胞（germ cell）是多细胞生物体内能繁殖后代的细胞的总称，包括从原始生殖细胞直到最终已分化的生殖细胞。

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此术语由A∙恩格勒和K∙普兰特尔于1897年提出以与体细胞相区别。

体细胞最终都会死亡，只有生殖细胞有延存至下代的机会。

物种主要依靠生殖细胞而延续和繁衍。长期的自然选择使每一种生物的结构都为其生殖细胞的存活提供最好的条件。

2001年诺贝尔奖：通过研究卵子成熟找到细胞周期调控的关键

蛋白 （同源重组和基因敲除小鼠）

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2010年诺贝尔奖：试管婴儿

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• 英国生理学家Rbert G. Edwards,在1978年创造了第一个试管婴儿。多年以来，许多宗教领袖一直要求他停止“扮演上帝”。

历时三十年的人类试管婴儿实验（1978‐2008）

2012年诺贝尔奖：体细胞核重编程

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• 日本京都大学山中伸弥（Shinya Yamanaka）与英国发育生物学家John Gurdon因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献，获得2012年诺贝尔生理学奖。

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对生命科学和人类社会贡献最大的华人生物学家

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张民觉，美籍华人生殖生物学家、口服避孕药的创始人之一。1908年生于山西省岚县。1933年毕业于清华大学心理系。1938年赴英国，1941年获剑桥大学博士学位。1945年赴美国，长期担任波士顿大学教授。1947年在世界上首次成功实现胚胎移植，1951年发现“精子获能”的生理现象，1961年在世界上首次成功获得体外受精兔子。为现代生殖医学和动物繁殖学奠定了理论基础，被誉为“试管婴儿”之父。于1990年当选美国科学院院士，三次获得诺贝尔奖提名。

第一节：生殖细胞的起源

在很多动物类群中，如昆虫、线虫和脊椎动物，生殖细胞在发育很早期就与体细胞区分开来。生殖细胞的前体——原生殖细胞（primordial germ cells，PGC）并不是在生殖腺

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原生殖细胞（primordial germ cells，PGC）并不是在生殖腺内形成，而是在身体其他部位形成以后再迁移到生殖腺。

关于生殖细胞发育的“惰性基因组假说

（inert genome hypothesis）”

原始生殖细胞的起源果蝇 线虫 斑马鱼 非洲爪蟾 小鼠

生殖质（Germ plasm）生殖质：

在线虫、果蝇和青蛙胚胎发育过程中，卵子中有一团特殊的细胞质成分，由多种蛋白质和mRNA构成。在卵裂过程中获

得这团物质的细胞将发育为原生殖细胞。这种特殊的细胞质成分被称为生殖质（germ plasm）。

果蝇：PGC最早在胚胎后端形成，称为极细胞（pole cells）。由果蝇的生殖质——pole plasm决定，包含Nanos和Vasa mRNAs，以及一

些功能尚不清楚的非编码RNA。

线虫的生殖质：P‐granule

含有转录抑制因子和RNA结合蛋白，如Nanos和Vasa

鱼类、无尾两栖类的生殖质

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原始生殖细胞的起源和迁移

DPC: day post‐coitusPD: postnatal day

PGCs的迁移表明它应答于一种由生殖嵴释放的诱导因子，可能是趋化因子CXCL12或生长因子配体KITL。随后，PGCs 改变形态，运动性降低并持续增殖1‐2天，因此在受精后第13.5天生殖腺中有大约26000个生殖细胞。

(Ewen and Koopman, Mol Cell Endocrino 2010)

原始生殖细胞的起源和迁移

性腺的分化 PGC 在进入减数分裂期前的存活和增殖PGC 存活和增殖对于维持正常生殖功能是必要的。为了增加数量， PGCs在迁移至生殖嵴的整个过程中都在进行有丝分裂增殖，并且在迁移至生殖嵴后的1‐2天也进行有丝分裂增殖。在生殖腺中，PGCs数量从受精后第8.5天的约100个细胞迅速增加到第13.5天的约25000个细胞，每次倍增时间约为16小时。PGC 数量受很多胞外生长因子、蛋白质和基因的调节，生长因子通过旁分泌和自分泌途径提高PGC存活率并且促进其增殖。

PGC的衍生物：ES细胞、EG细胞、EC细胞

Embryonal carcinoma (EC) cells

Embryonic germ (EG) cells: PGC‐derived stem cells in vitro.

Teratocarcinoma（畸胎癌）

小鼠从PGC到产生成熟的配子的时间表

在大约受精后第13.5天的小鼠卵巢中，

生殖细胞停止增殖，进入第一次减数分裂期。

在大约受精后第13.5天，雄性生殖细胞阻滞在有丝分裂的G0 或 G1期，出生后重新启动有丝分裂生后重新启动有丝分裂。

在雄性中，减数分裂在整个生命过程中持续发生，由精原干细胞提供持续的精子发生。

(Bowles and Koopman, Development 2007)

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是什么引起了生殖细胞的性别分化？

生殖细胞最初的性别分化不是由它的染色体组成决定的，而是由它所处的环境决定的。

有一种被普遍接受的假说解释了雄性中生殖细胞命运的决定：发育中的睾丸组织产生了一种减数分裂抑制因子。睾丸组织产生了 种减数分裂抑制因子。

卵巢中卵母细胞减数分裂触发的可能机制：1) 在发育的卵巢中，最初的减数分裂自发地发生，可能被分子时钟调节。2)减数分裂由周围体细胞组织诱导发生。

视黄酸(RA) 诱导PGC进入减数分裂

RA 是一种小的极性分子，很容易扩散透过组织，并与细胞核的RA受体(RARs)结合而发挥功能。

RAR 与类视黄醇X受体(RXR)形成异二聚体。RAR‐RXR异二聚体与RA反应元件(RAREs)结合来控制RA相关基因的表达。

生殖腺中的生殖细胞进入减数分裂的调节

Once Sry is expressed in the male gonad (at 11.5 dpc), Cyp26b1 expression is up‐regulated.

germ cells in the developing ovary enter meiosis in an anterior‐to‐posterior wave.

CYP26B1 selectively removes RA from the developing testis

13.5 dpc

Marker gene expression in 13.5 dpc mouse gonads

Stra8：生殖细胞进入减数分裂的markerPou5f1（Oct4）：未分化生殖细胞的marker

RA 如何诱导减数分裂?

RA 必须通过诱发胞质蛋白 STRA8来触发减数分裂。

在Stra8缺失的胎鼠卵巢的生殖细胞中没有产生结合蛋白，联会复合体没有形成，出现了双链DNA损伤并且未被修复。

虽然现在已经有证据证明STRA8 对于细胞进入减数分裂前期是必须的(Baltus et al., 2006), 但该蛋白质在细胞内的功能却未知。

为什么减数分裂仅限于生殖细胞？是什么赋予了生殖细胞应答RA的能力？RA信号如何用于参与减数分裂？这些都还没有确切的结论。

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第二节：雄性生殖细胞发育——精子发生

精子发生的关键事件和时间点：

精原干细胞的维持和增殖（PD3）精原干细胞的维持和增殖（PD3）

进入减数分裂（PD9）

进入减数分裂粗线期（PD21）

形成第一波精子（PD35）

列文虎克最早发现了精子

1670年，荷兰科学家列

文虎克最早发现了精子，他最初认为是精液中的寄生虫，随后又认为它们是动物的“种子”，

存在 个 胎里面存在一个胚胎的雏形。而雌性只不过是供“种子”生长的土壤。这就是早期胚胎学中所谓“精源学说”——认

为新生命源于父方。该学说最早由古希腊哲学家亚里士多德于两千多年以前提出。

精子结构 精子发生过程示意图

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精子形成（spermiogenesis）

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重点：1：高尔基体形成顶体2：从中心体长出尾巴3：细胞核高度凝集

睾丸和附睾简介

睾丸：曲细精管（seminiferous tubule）是睾丸的基本结构和功能单位、精子发生的场所。人类的曲细精管总长度达到200‐300米。

睾丸中的三种主要细胞类型：1：雄性生殖细胞（精原细胞、精母细胞、精子细胞、成熟精子）2：支持细胞（Sertoli cell）：构成曲细精管壁，支持精子发生支持细胞 构成曲细精管 支持精子发3：间质细胞（Lydig cell）：位于曲细精管之间，分泌雄激素

附睾（epididymis）：

精子进一步成熟和储存的场所，由一条曲折、细小的管子构成，上端连接着睾丸的曲细精管，下端连接着输精管(Ductus deferens)。人的附睾管长约4‐5米。

附睾分成附睾头、附睾体、附睾尾

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小鼠精子发生过程Day3：精原干细胞开始增殖； Day9：开始进入减数分裂

小鼠精子发生过程~3 week old：第一波精母细胞减数分裂进入粗线期

小鼠精子发生过程Day35：第一波精子形成； 7~8 week：开始具有生殖能力

Ddb1 conditional KO males do not make sperms

All germ cells are lost in the testis of Ddb1f/f;Ddx4‐Cremice

Germ cell marker

Sertoli cell marker

雄性不育的小鼠睾丸

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处于第一次减数分裂前期的精母细胞铺片

精子发生过程中的同源重组

成熟精子在附睾中贮存

附睾头 附睾体 附睾尾

Ddb1 conditional KO males do not make sperms

第三节：雌性生殖细胞发育——卵子发生

卵子发生的关键事件：

有丝分裂

卵原细胞 卵母细胞进入减数分裂

卵细胞完成减数分裂

受精

合子（zygote）

（经典的雌性生殖细胞发育过程，如海胆）

卵子发生中的关键事件

原始卵泡的维持和激活

卵泡的生长和排卵

卵母细胞减数分裂细胞周期的调控

卵母细胞纺锤体组装、染色体分离和极体排放

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Primary follicle

oocyte

cumulus cells

卵泡是哺乳动物卵巢的基本功能单位

Secondary follicle

Granulosa cells

Theca cells

哺乳动物雌性生殖细胞的发育

LH

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哺乳动物雌性生殖细胞的发育

卵原细胞

有丝分裂

卵母细胞进入减数分裂

（发生在胚胎发育阶段）（小鼠：D12.5‐13.5；人：5个月）

卵细胞(MII)完成减数分裂

受精

(12 h)

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合子（zygote）有丝分裂

（卵裂）

二细胞胚胎三细胞四细胞

八细胞 桑葚胚 囊胚 着床

（二细胞阻滞）

（致密化）

(Day 1)

(Day 2 morning)

(Day 2 evening)

(Day 3)

(Day 4) (Day 4  23:00)

雌雄生殖细胞发育的比较

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哺乳动物卵母细胞GV MII MII

Fertilizing COCs

卵泡形成、卵泡激活和卵泡闭锁

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促性腺激素促进有腔卵泡发育

FSH

LH

eCG

hCG

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CorpusLuteum

LuteinizationOvulation

Apoptosis(Follicle Atresia)

原始卵泡激活

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转录因子与原始卵泡维

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始卵泡维持

PI3K信号通路与

原始卵泡激活

小鼠卵泡发育PD3：原始卵泡形成

小鼠卵泡发育PD5：初级卵泡开始形成

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正常卵巢 抗癌药物处理后

研究意义：女性生殖力保护

由于环境污染和人工化合物滥用，青少年癌症患者的人数在逐年增加。

青少年女性癌症患者在放化疗之后往往造成不育。

这是因为抗癌药物在杀灭癌细胞的 时 在生殖细 中造的同时，在生殖细胞中造成不可修复的DNA损伤和细胞凋亡。

    W

T

原始卵泡的维持：DDB1

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Ddb1cKO             

原始卵泡的维持：DDB1WT                             Ddb1fl/fl;Gdf9‐Cre     

EGF-like factors

黄体生成素诱导排卵 LH

FSH

Oocyte-derived factors

In situ hybridization of Lhcgr

AmphiregulinEpiregulinBetacellulin

meiotic maturation

FSH/LH

Ras

EGFR                       

PP Gs AC

PIP2         PIP3                  PIP2

PI3K

Pten

P PP

AKTPDK1

PI3K信号通路与卵泡发育

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P

RAF1

MEK1/2

ERK1/2P

P

cAMP

PKA

PP

Cell proliferationCell survival

FOXO1

P P P

LH or hCG

(in vivo)

卵丘扩展是哺乳动物排卵的重要环节

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FSH, PGE2EGF-like factors

(AREG)

(in vitro)

Has2, Tnfaip6, Ptx3, Ptgs2

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促性腺激素诱导排卵的机理

61Fan et al, Science, 2009

FSH/LH

Ras

EGFR

PP Gs AC

促性腺激素在颗粒细胞中激活RAS/ERK pathway

RAF1

P

ERK1/2PP

cAMPRAF1

MEK1/2PKA

Fan et al, Science, 2009

卵母细胞减数分裂成熟过程

LH fertilization

Maturation Activation

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GV           GVBD          MI              AI              MII             AII             PN                      2‐cell

GV‐arrest                                           MII‐arrest

（出生‐排卵） （排卵‐受精）

Zygote                   Embryo

GV           GVBD          MI              AI              MII             AII             PN                      2‐cell

Maturation Activation

Zygote Embryo

卵母细胞减数分裂成熟过程

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GV‐arrest                                           MII‐arrest

Zygote                   Embryo

维持GV期阻滞的分子机制

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卵母细胞成熟的机理

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促性腺激素诱导GVBD的分子机制 减数分裂细胞周期的调控：成熟促进因子（maturation‐promoting factor, MPF）

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Nature Review 2002

While animal eggs await fertilization, their cell cycle needs to be halted. The molecule 

（增井贞夫）

细胞静止因子（cytostatic factor, CSF）维持MII期阻滞

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gg , yresponsible for this arrest — the cytostatic factor —was first described in 1971. But its identity was not revealed until 1989, and even now questions remain about this elusive factor.

Changes in activity of MPF and CSF duringoocyte maturation, fertilization and cleavage

GV                        GVBD                       Pre‐MI

卵母细胞减数分裂

Metaphase I              Anaphase I            Telophase I

Metaphase II              Anaphase II           Telophase II

排卵、受精

卵母细胞减数分裂成熟过程

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研究意义：生殖细胞减数分裂缺陷与人类生殖健康

自发流产的非整倍体胚胎：75％以上源于卵子发生过程中染色体分离异常

辅助生殖治疗患者接近一半(46.8%) 卵母细胞染色体异常

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唐氏综合征45岁，1/2535岁，1/350

＜24岁，1/1300

小鼠卵母细胞减数分裂染色体

TOP2/CREST/DAPI

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MI (4n)                              MII (2n)                             MIII (1n)

Shugoshin protects centromeric Rec8 during meiosis I

Cohesin控制染色体精确分离

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女性年龄增长导致染色体不能精确分离

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童第周教授，享誉海内外的卓越的生物学家、教育家；中国实验胚胎学的主要奠基人，20

世纪生物科学研究的杰出领导者。生前曾担任过中国科学院副院长、山东大学副校长、动物研究所所长。

秦鹏春教授我国著名动物组织胚胎学专家

东北农业大学生命学院的创建者

陈大元研究员

中国科学院动物研究所。中国体细胞克隆动物的先驱者。

（1902‐1978）

致谢：

先生之风，山高水长！

者。

孙青原研究员杨增明教授

范衡宇

Prof. JoAnne RichardsThe godmother of ovarian biology

实验室同学

线虫（C. elegans）的性腺发育

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线虫的早期胚胎发育

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卵母细胞减数分裂及卵子激活: a retelling old legend in animal kingdom

蠕虫 昆虫 脊椎动物 海胆

83

缺失精子时，秀丽隐杆线虫( C. elegans )的卵母细胞阻滞在减数第一次分裂前期。由精子分泌的MSP短肽激活卵母细胞成熟、排卵和第一次减数分裂。受精触发第二次减数分裂的恢复和有丝分裂的发生。