連続戻し交雑による品種育成におけるDNAマーカー選抜の効率的適用に関する一考

齊藤　美香＊１）・小林　史典＊２）・伊藤　裕之＊１）・新畑　智也＊２）

乙部千雅子＊３）・石川　直幸＊４）・藤田　雅也＊５）・石川　吾郎＊１）

中村　俊樹＊１）

抄　録：３つのWxタンパク質と３つのSSIIaタンパク質を欠く甘味種コムギおよびその育成過程で分離してくる姉妹系統は、新たな食品素材として期待されており、早期の品種育成が望まれている。そのため、DNAマーカーを用いた効率的な連続戻し交雑により国内各地域に適するそれらの実用品種の迅速な育成を進めている。短期間で品種育成を進めるために、DNAマーカーを用いた連続戻し交雑の効率性について検討した。その結果、変異型GBSSI、SSIIaそれぞれ３遺伝子ずつを導入し、それぞれの準同質遺伝子系統同士を交雑する方法が、交配および選抜の作業効率が良いと考えられた。また、播性の高い系統を反復親とした場合、未熟胚を発芽させることで１回の戻し交雑期間を短縮させ、年3回の交雑が可能になった。さらに、DNAマーカー選抜の効率化に資するマルチプレックスPCR用のマーカーを開発した。キーワード：コムギ、DNAマーカー選抜、連続戻し交雑

A Study of the Application of Recurrent Backcrossing using DNA Marker Selection to a WheatBreeding Program : Mika SAITO＊１），Fuminori KOBAYASHI＊２），Hiroyuki ITO＊１），Tomoya SHIMBATA＊２），Chikako OTOBE＊３），Naoyuki ISHIKAWA＊４），Masaya FUJITA＊５），Goro ISHIKAWA＊１）and Toshiki NAKAMURA＊１）

Abstract : Sweet wheat（SW）was selected from a cross between two starch mutants, waxy（Wx）and high amylase（HA）．Wx and HA lack the functions of three homoeologous GBSSI and SSIIagenes, respectively, and SW possesses six totally null alleles, three null alleles for each of the twogenes. SW was selected by using six co-dominant markers to detect each null allele. Its seed compo-sitions are very distinct features mainly characterized by high sugar content. In addition, from thecrossing, not only SW but 63 other haplotypes with different combinations of wild and null alleles ofthe two genes are selected by the markers. It was revealed that some of the haplotypes also possessstarch with unique properties. Along with SW, these new lines were thought to be useful materialsfor food industries throughout the world. However, to prove this possibility, it is necessary to devel-op new commercial cultivars adaptable to a wide range of Japanese environments and provide theirflour to food industries as soon as possible. Therefore, we planned to use recurrent backcrossingwith marker-assisted selection（MAS）and conducted several trials to adapt the MAS breeding forthis selection effectively. We discussed the following three points: first, the number of flowersrequired to be crossed to save labor; second, how to save the time needed for one generation of win-ter wheat, which requires a long low-temperature treatment for vernalization; third, the re-design ofprimers for multiplex PCR to save time and cost in the marker selection process. In this case, weconcluded that introgression of the three null alleles, either Wx or HA, separately into the same

＊１）農研機構　東北農業研究センター（NARO Tohoku Agricultural Research Center, Morioka, Iwate 020-0198,Japan）

＊２）日本製粉株式会社（Nippon Fluor Mills Co. Ltd., Atsugi, Kanagawa 243-0041, Japan）＊３）農研機構　作物研究所（NARO Institute of Crop Science, Tsukuba, Ibaraki 305-8518, Japan）＊４）農研機構　近畿中国四国農業研究センター（NARO Western Region Agricultural Research Center, Fukuyama,

Hiroshima 721-8514, Japan）＊５）農研機構　九州沖縄農業研究センター（NARO Kyusyu Okinawa Agricultural Research Center, Chikugo,

Fukuoka 833-0041, Japan）2011年11月２日受付、2012年１月16日受理

55東北農研研報　Bull. Tohoku Agric. Res. Cent. 114, 55－65（2012）

東北農業研究センター研究報告　第114号（2012）56

Ⅰ 緒　　　言

農研機構・東北農業研究センターにおいて、コムギ（Triticum aestivum L.）胚乳デンプン中のアミロース合成を司る顆粒結合型デンプン合成酵素I型（Granule-bound Starch synthase I; GBSSI）３種を欠くモチコムギ（Wx）およびアミロペクチン合成に関与する可溶性デンプン合成酵素IIa型（StarchSynthase IIa; SSIIa）３種を欠く高アミロースコムギ（high amylose；HA）の交雑により、計６つの酵素を欠失した甘味種コムギ（sweet wheat；SW）を開発した（Nakamura et al. 2006）。このSWは皺粒になり、マルトースや多糖類のフルクタンおよび遊離アミノ酸を多く含むという従来のコムギにない特徴を持つ（Nakamura et al. 2006、Shimbata etal. 2011）。さらに、WxとHAの交雑の過程において、各酵素の有無により64タイプのコムギができる（図１）。SWの育成過程で得られる姉妹系統には、そ

れぞれ３つのGBSSIおよびSSIIaの発現の組み合わせの違いによりデンプン特性が微妙に異なるものが存在し、その詳しい特性解明が進められ、用途開発が期待されている（新畑・中村　2010）。このように、SWおよび姉妹系統はコムギの新たな需要を生み出す可能性があるものの、これらはまだ実験系統であり、耐病性や収量性などの農業特性に関しては不十分な状態である。そのため、用途開発を進める上で実用品種の迅速な育成が望まれている。迅速に品種育成を行う方法の一つとして、戻し交雑育種法がある。この方法は、優良品種の遺伝子をほぼそのままにして、ピンポイントで形質を改良したい場合に有効である。イネではササニシキやコシヒカリにいもち病抵抗性遺伝子や早生化のための遺伝子領域を導入するために同手法が用いられ、実用品種が育成されている（佐々木ら　2002、小島ら2003、竹内ら　2008、石崎　2007）。また、戻し交雑育種法の長所として、扱う個体数が比較的少なくて済み、労力を節約できるという点が挙げられる。この利点を生かし、温室等での栽培により世代促進をすることで、育種年限の短縮が可能となる。近年、コムギにおいて利用できるDNAマーカー

の数は増加し、品種育成の際の選抜への利用が増えている。SWの育成にも、３つのGBSSIおよび３つのSSIIaをコードする遺伝子に生じた変異部分を検出可能なDNAマーカーが選抜に用いられた（Nakamura et al. 2006）。DNAマーカー選抜（marker-assisted selection; MAS）の利点の一つとして、表現型による選抜をすることなく、目的の形質を持つ個体を選抜できることが挙げられる。例えば、小麦粉の品質に関わる成分や、病害抵抗性などの選抜は、胚乳成分の分析や、圃場試験や接種試験による検定が必要であり手間と時間がかかるが、

recurrent parent could save labor in the crossing compared with simultaneous introgression of thesix alleles using SW as a donor parent. Whereas low vernalization cultivars（class I or II）could runthree generations in a year without any rescue process, in a variety that required high vernalization（class V），the germination of immature embryos, 14 days after crossing, on agar medium made itpossible to reduce the time required to run a single generation from six months to around fourmonths. Furthermore, although a multiplex PCR assay for all six loci could not be performed, successin a multiplex assay for three SSIIa loci reduced the total number of PCRs from five to three in asingle generation and could save time and cost in the screening process.Key Words : Wheat, Marker-assisted selection, Recurrent backcrossing

図１

SW

注．＋、－はそれぞれ野生型、変異型を表す。

HA

野生型

GBSSI- A1,B1,D1SSIIa-A1,B1,D1

Wx

モチコムギ（Wx）と高アミロースコムギ（HA）の交雑により得られる甘味種コムギ（SW）と姉妹系統

齊藤ほか：連続戻し交雑による品種育成におけるDNAマーカー選抜の効率的適用に関する一考 57

MASを用いることで、植物組織を選ばず、幼苗などから抽出したDNAを用いて選抜ができる。また、測定誤差も生じないことから正確な選抜ができ、初期世代においても個体選抜が可能となる。さらに、DNAは一度抽出すると、複数の形質の選抜が可能であり、効率的である。以上から、DNAマーカーは品種育成において欠かすことのできないツールになりつつある。DNAマーカーのもう一つの利点として、共優性

マーカー化が可能となり、ヘテロ接合体を正確に判定できる点も挙げられる。前述の戻し交雑育種法において、導入する形質が１遺伝子支配の優性形質であればBCnF1世代での表現型による選抜が可能であるが、SWのように劣性遺伝子が原因の劣性形質の場合、目的とする遺伝子型についてBCnF2世代を用いた後代検定により確かめる必要がある。しかしながら、共優性のDNAマーカーを用いることで劣性形質であってもBCnF1世代でのヘテロ接合体の選抜が可能となり、連続戻し交雑に供することができ、育成期間の短縮に有効である。以上より、共優性のDNAマーカーを用いた連続

戻し交雑育種法（Marker-assisted backcrossing；MABC）は、SWおよびその姉妹系統の迅速な品種育成に有効な手段と考えられた。そこで我々は、農研機構・東北農業研究センター、作物研究所、近畿中国四国農業研究センター、九州沖縄農業研究センターと共同で、それぞれの地域に適した品種・系統を反復親としてMABCにより迅速な実用品種の育成を計画した。しかしながら、その効率的適用にあたり、いくつかの考慮すべき点が浮かび上がってきた。第一に、１回の戻し交雑あたりの導入遺伝子数および１回の戻し交雑における交配頴花数である。選抜対象遺伝子数（マーカー数）が増えると同時に、それによって必要な交雑頴花数が増加する。この問題に関しては、戻し交雑において導入遺伝子をヘテロに持つ個体の頻度をｐとすると、αの確率で少なくとも1個体以上のヘテロ型を含むために必要な個体数（m）は m >－ log（1－α）/log（1－ｐ）により求められるという報告がある（菊池・藤巻　1974）。コンピュータシミュレーションによる導入遺伝子数や交雑手順の指標が提唱されている（Ishii andYonezawa 2007）が、コムギにおいてその実証はされていない。事業育種にこの手法を適用するためには、より効率的に作業を進めるための交配作業量

やMASの作業量に関する考慮は必要不可欠であり、そのような体系を確立する必要がある。第二に、従来の育種においても連続戻し交雑を行う場合に利用される世代促進に関しての考慮である。コムギの世代促進としては、播性が低い場合は年３世代程度の世代促進が可能である。しかしながら、北海道や東北地域で栽培される秋播き品種・系統は、高い播性を持っており、低温処理に必要な日数が長期化することにより、播性が低い品種系統と同様な世代促進効果は望めない。これは、寒冷地の場合、温暖地に比べ、MABCを用いれば迅速な品種育成を図れるという利点を最大限に活用することができないということになる。第三として、MASを行う際に、用いるマーカーの数が作業効率やコストに影響を与える点が挙げられる。現在広範囲に用いられているPCRによるマーカーを考えた場合、それぞれの選抜マーカー毎に遺伝子型判定を行えば、PCR作業及びその結果の解析回数がマーカー数とともに増加し、それに応じて作業時間やコストも大きくなるという問題が予想される。特に、コムギはA、B、Dゲノムからなる６倍体のため、WxやHAのように一つの形質の発現に３つの遺伝子が関与する場合が多く、一つの形質の発現を確認するのに３つのマーカーが必要になる。また、今後マーカーによる選抜可能な形質も増えることが予想される。そこで一度のPCRで複数の遺伝子型を判定できるDNAマーカーのマルチプレックス化は選抜の効率化に大きな役割を果たすものと考えられる。本稿では、以上の点について効率化を検討し、その結果を踏まえて行った実用品種の育成経過について報告する。本研究は農林水産省｢新農業展開ゲノムプロジェ

クト（FBW1203）｣の支援を受けて実施した。

Ⅱ 材料と方法

１．植物材料

一度に６遺伝子座の選抜を行った場合の交配数と選抜個体数の関係に関しては、実験系統である｢Chinese Spring（CS）｣（播性Ⅰ～Ⅱ）を反復親に、甘味種小麦を１回親として用いた。戻し交雑種子は、96穴のセルトレイに播種し、その実生を遺伝子型調査に用いた。甘味種およびその姉妹系統の育成には、東北農業研究センター、作物研究所、近畿中国四国農業研究

東北農業研究センター研究報告　第114号（2012）58

センターおよび九州沖縄農業研究センターにおいて、それらの地域に適した主要品種・系統を反復親とし、WxあるいはHA系統を１回親として用いた（表１）。２．連続戻し交雑

連続戻し交雑は図２に示す手順で行った。BCｎF１について、DNAマーカーにより、GBSSI、SSIIaの６遺伝子座全てヘテロ接合体（１回親がSWの場合）、または３つのGBSSI（１回親がWx）もしくはSSIIa（１回親がHA）遺伝子座が全てヘテロ接合の個体を選抜し、次の花粉親とした。BCn─1F２において３遺伝子全てヘテロ接合の個体が得られなかった場合、３遺伝子全てヘテロ接合のBCn─1F２より３遺伝子のnull変異個体を選び出し花粉親として用いることでBCｎF１種子を得た。材料の栽培は温室内で行い、およそ４か月のサイクルで播種から交配、収

穫を進めた。なお、作物研究所のWx準同質遺伝子系統（near-isogenic line；NIL）の育成については、モチ品種である「あけぼのもち」を１回親、バンドウワセを反復親としたNILが先行して育成されていたため、本研究での戻し交雑および選抜は行わなかった。また、「シロガネコムギ」を反復親としたHA系統については、先行して戻し交雑を１回行い、変異型SSIIa遺伝子であることを確認済みのBC１F４をBC２F１の花粉親として用いた。３．世代促進のための改良

播性Vの「盛系D-B004」系統に関しては、他の系統に合わせて年３回の戻し交雑を行うために、世代促進法の改良を図った。交雑後14～20日目の種子を1.5%次亜塩素酸ナトリウムにより滅菌し蒸留水で洗浄した後、胚を取り出し、MS培地上に無菌的に置床した。胚は23℃、24時間照明のインキュベーター

表１ 連続戻し交雑に用いたコムギ品種・系統

育成研究所 反復親 播性 Wx形質供与品種・系統 HA形質供与系統東北農研作物研近中四農研九州沖縄農研

盛系D-B004バンドウワセミナミノカオリシロガネコムギ

VⅠ~ⅡⅠⅡ

もち姫あけぼのもちモチ性春のあけぼのモチ性チクゴイズミ

東北農研育成実験系統東北農研育成実験系統東北農研育成実験系統東北農研育成実験系統

Wx：モチHA：高アミロース

図２

SW：甘味種コムギ、 Wx：モチコムギ、 HA：高アミロースコムギa： 6 遺伝子全てがヘテロ接合である個体が得られる確率b： 3 遺伝子全てがヘテロ接合である個体が得られる確率

Wx HA

F1 F1

BC1F1 BC1F1

BCnF1 BCnF1

F1

BC1F1

BCnF1

F1

BCnF2以降

GBSSI-A1GBSSI-B1GBSSI-D1SSIIa-A1SSIIa-B1SSIIa-D1

GBSSI-A1GBSSI-B1GBSSI-D1

SSIIa-A1SSIIa-B1SSIIa-D1

3 遺伝子導入 3遺伝子導入

6遺伝子導入

反復親反復親

BC2F1 BC2F1BC2F1

F2以降新規甘味種系統

新規甘味種系統

1/64a 1/8b 1/8bBCnF2 BCnF2

交雑組み合わせによる導入遺伝子数とヘテロ接合体出現率

SW

齊藤ほか：連続戻し交雑による品種育成におけるDNAマーカー選抜の効率的適用に関する一考 59

内において発芽させた。20日程度培地上で生育を続け、３～４葉が展開した後、園芸用粒状培土に移植した。生育の状況を見て、移植後約10日から15日に低温処理（10℃、９時間、７℃、15時間）を開始した。低温処理終了後、ガラス室において長日条件下（16時間日長）で栽培した。上記系統の春化に必要な最適期間の検討には、25、30、35、40、45日間の低温処理の後、長日条件下（16時間日長）で栽培し、出穂までの日数を算定した。４．DNAマーカーの改良および選抜

３葉期のコムギからのDNA抽出は、Gene PrepStar PI-80X（クラボウ）を用いた。3GBSSI遺伝子の選抜は、Nakamura et al.（2002）、Saito et al.（2009）にて報告されているマーカーおよび反応条件により行った。SSIIa-A1、-B1、-D1遺伝子の選抜は、Shimbata et al.（2005）の塩基配列情報より、一部のプライマーを新たに設計し、マルチプレックスPCR用のマーカーとした（表２）。PCRは、25μLあたり50ng DNA、1×ExTaq Buffer、0.2mMdNTPs、0.05％DMSO、0.625U ExTaq Hot StartVersion（Takara）、0.4μM SSII-AF1、0.4μMSSII-AR5、0.28μM SSII-BF1L、0.28μM SSII-BR4、0.2μM SSII-DF2、0.2μM SSII-DR2を含む反応系で行った。反応サイクルはGBSSI遺伝子判定用マーカーと同じ条件を用いた。PCR産物の確認は、４％（GBSSI）または２％（SSIIa）アガロースゲルを用いた電気泳動により行った。

Ⅲ 結　　　果

１．６遺伝子導入における必要頴花数の検討

MABCによる品種育成において複数の遺伝子を導入する場合、１回の戻し交雑で導入する遺伝子数と、それに応じて、目的の遺伝子を持つ個体を得るために必要な交配数が、育成期間や交配作業の効率性に大きく影響することが予想される。そこで、甘

味種コムギを１回親として３つのGBSSI遺伝子および３つのSSIIa遺伝子の計６遺伝子を「CS」に戻し交雑により導入する場合について検討した（図２A、表３）。選抜に用いた交雑種子数は１回あたり188～382

（平均282.8）個であり、６遺伝子ヘテロ個体は４～12個得られた。１遺伝子座の野生型：ヘテロ接合の割合は１遺伝子（BC４F１のGBSSI-B1座）を除く全ての世代で１：１に分離している（データ省略）。また、全遺伝子座ヘテロ接合である個体の出現率は、BC４F１、BC５F１およびBC６F１では1/64に適合し（P＞0.05）、またBC２F１およびBC３F１においては有意水準１％ではあるものの上記分離比に適合していると考えられた。（表３）。表３に示す通り、遺伝子型決定の際に96個体毎に管理したセルトレイ別に結果を検証すると、６遺伝子ヘテロ接合体が５個体得られた場合があったが、１個体も得られない場合も見受けられた。２．未熟胚利用による交配期間の短縮

上記で反復親として用いた「CS」は播性がⅠ～Ⅱと低く、また、品種育成に用いた関東以南の反復親についても全て播性Ⅰ～Ⅱであり、年３回の戻し

表２ SSIIa 遺伝子変異判定用プライマーセット

遺伝子 プライマー名 塩基配列（5’－3’）SSIIa-A1

SSIIa-B1

SSIIa-D1

SSII-AF1a）SSII-AR5SSII-BF1LSSII-BR4SSII-DF2SSII-DR2

GCGTTTACCCCACAGAGCAGGTCCGGAATCATGGTTCTGGTGAACAGTTATTCATTTCTTCGGTACACCATTGGCTAGCTTGCCGGAGTCCAGCGTCCCAAGGGGAGCTGAAATTTTATTGCTTATTGTCAGGTTGTCAATTGAGTTGGAGAGATACCTCA

注．a） Shimbata et al. （2005）et al.

SSIIa

表３

1a） 2 3 4 計 Pc）BC2F1BC3F1BC4F1BC5F1BC6F1

1/96b）3/961/951/960/96

4/954/924/942/963/96

0.0130.0170.7890.0920.891

5/96

0/955/941/82

2/95 12/3827/1885/2848/2864/274

注．a）　　b）

　　c）

戻し交雑種子を播種したトレイの整理番号GBSSI-A1、 GBSSI-B1、GBSSI-D1、SSIIa-A1、SSIIa-B1 ならびに SSIIa-D1 が全て 6 遺伝子ヘテロ接合体数 /分析個体数6 遺伝子座について期待値を野生型：ヘテロ接合＝63：1 とした場合のχ二乗検定による確率

6 遺伝子導入時の分析個体数と全遺伝子ヘテロ接合体数

SSIIa-B1GBSSI-A1、 GBSSI-B1、GBSSI-D1、SSIIa-A1、

SSIIa-D1

東北農業研究センター研究報告　第114号（2012）60

交雑を行うことが可能である。ところが、東北農業研究センターにおいて反復親として用いた｢盛系D-B004｣は播性Ⅴであることから、他の品種に比べ長期間の低温処理を必要とする。そのため、通常は播種から交配、採種まで５か月～６か月程度を要し、他の反復親を使った系統に比べ育成が大幅に遅れることが予想された。これは、MABCが迅速に進められるという利点の制約となる部分である。そこで、この問題を解決するために、１回の戻し交雑期間の短縮を目的に、交配後の未熟胚を培地上に置床し発芽させることで登熟期間の短縮を図った（図３）。交配後14日目の胚を培地上で発芽させることで、完熟に要する期間のうち約１か月を短縮することができた。また、「盛系D-B004」の春化に要する日数を正確

に把握するため、25日～45日の低温処理を行った後、出穂までの日数を調査した。表４に示す通り、35日間の低温処理を行ったものが、低温処理開始から出穂までの日数が74日と最も短いことが判明した。以上により、「盛系D-B004」を反復親に用いる場

合においても、未熟胚からの発芽と適切な低温処理期間を組み合わせることにより、１世代が123日～

126日程度となり、年に３回の交雑が可能となった。３．SSIIa遺伝子選抜用マーカーの改良

本研究で用いたGBSSI-B1およびGBSSI-D1遺伝子選抜用マーカーは、マルチプレックスPCRにより１度のPCRで両遺伝子座の判別が可能である。一方、従来の３種のSSIIa遺伝子選抜用マーカー（Shimbata et al. 2005）を用いてマルチプレックスPCRを試みた結果、増幅が不均一であった（データ省略）。そこで、遺伝子配列情報を基に、同一のアニーリング温度で利用可能なマルチプレックスPCR用の新たなプライマーを設計した（表２）。これらのプライマーによりSSIIa-A1の野生型では1149bp、null変異型で868bp、SSIIa-B1の野生型で482bp、null変異型で657bp、SSIIa-D1の野生型で350bp、null変異型で287bpの断片が増幅される（図４）。こ

図３

a： 過酸化水素を用いた休眠打破により短縮可能未熟胚利用による交配期間の短縮

45～50日

10日（3葉期）発芽

出穂

完熟

播種休眠期間a

5日

35～40日7～10日

35日～

start30～40日

未熟胚のMS培地上への無菌置床

温室移動

2日 遺伝子型判定

グロースキャビネットにおける春化処理

（10℃･ 9時間, 7℃･ 15時間）14日

開花交配

図４

W H：：

SSII-A1 wild（1149 bp）

SSII-A1 null（868 bp）

SSII-B1 wild（482 bp）

SSII-B1 null（657 bp）

SSII-D1 wild（350 bp）

SSII-D1 null（287 bp）

M W N H

SSIIa 遺伝子型のマルチプレックス PCR による判定SSIIa

3 遺伝子ともに野生型、N： 3 遺伝子ともに変異型、3 遺伝子ともにヘテロ接合、M：2-Log DNA Ladder （NEB）。

表４

低温処理（日数）

低温処理終了－出穂（日数）

低温処理開始－出穂（日数）

2530354045

7878748082

5348394037

低温処理日数を変化させた場合に出穂に要する日数

齊藤ほか：連続戻し交雑による品種育成におけるDNAマーカー選抜の効率的適用に関する一考 61

れにより、SSIIa-A1、-B1、-D1遺伝子全ての遺伝子型を１度のPCRで判定することが可能であり、また、ヘテロ接合体も正確に判定できた。４．甘味種および姉妹系統の育成におけるMABC

利用

前述のとおり、SWを１回親とし、一度に６遺伝子の導入を図った場合、その交配作業や選抜に多大の労力を必要とするため非効率的であると考えられた。そこで、実用品種の育成においては作業の効率性を重視し、Wx、HA系統を１回親として用い、３遺伝子ずつの導入を行い、最終的な両者のNILの交雑によりSW、および姉妹系統を選抜するという手順を計画した（図２B）。この中で、全ての交雑組み合わせで年３回のMABCを行い、３年で５回以上の戻し交雑を行ったWx、HA特性を持つNILを作出できるか検討した。反復親は各育成者により選定されたそれぞれの地域に適した主要品種・系統を用い、各育成地で戻し交雑・採種を進め、東北農業研究センターもしくは日本製粉にてDNAマーカー選抜を行った。17粒～125粒の交雑種子から、２つの交配組み合わせ（反復親が｢盛系D-B004｣、１回親が｢もち姫｣のBC４F１および反復親が｢バンドウワセ｣、１回親が｢高アミロース実験系統｣のBC４F１とBC６F１）を除いた全ての組み合わせで、１～21個体の３遺伝子のヘテロ接合体が得られた（表５）。なお、「盛系D-B004」のWx_BC４F１については、余剰のBC３F１種子を用いて戻し交雑を再度行い、３遺伝子ヘテロ接合体が６個体得られた（表５）。また、｢バンドウワセ」のBC４F１およびBC６F１に関しては、それぞれBC３F３およびBC５F２より３つの変異型SSIIa遺伝子をホモ接合で持つ個体を選抜し、それらを「バンドウワセ」との交配で花粉親として用いることでBC４F１およびBC６F１とした。一遺伝子座について野生型ホモ接合体：ヘテロ接合体の分離比は、一部系統・世代を除き、期待値に適合した（表５）。また、GBSSI遺伝子座またはSSIIa遺伝子座における３遺伝子座全てヘテロ接合体である確率は、期待通り1/8であった。交配の失敗や３遺伝子座について全てヘテロ接合である個体が得られなかった場合を除き、全ての組み合わせにおいて１世代あたり約４か月のサイクルで連続戻し交雑を進めることができた。例として表６に播性Ⅴの「盛系D-B004」および播性Ⅰの「ミ

ナミノカオリ」系統の戻し交雑の工程を示した。両者ともに３年間で５回以上の戻し交雑を終えたWxおよびHAに関するNILを作出、および甘味種および姉妹系統作成のための交雑まで進めることができた。

Ⅳ 考　　　察

連続戻し交雑は、有用形質を優良品種・系統に迅速に導入するための方法として有効である。近年、コムギにおいてさまざまな形質の原因遺伝子もしくは連鎖する領域が明らかになり、それらの形質を判別できるDNAマーカーの開発が進められていることから、マーカー選抜により複数の形質（遺伝子）を集積することが可能となっている（Gupta et al.2010）。このような集積系統を1回親とし、栽培する地域に適した品種・系統を用いてMABCを行うことにより、複数の有用形質（遺伝子）を一度に導入することができ、迅速に品種育成が進められる。本研究ではMABCを実際の品種育成に適用するに当たり、その効率性を上げることを目的に問題点を考慮した交配および選抜手順を検討した。今回の場合に考慮すべき点の一つとして、導入する遺伝子数が挙げられる。導入遺伝子が1、2、3、・・・、nと増えるに従い、目的の遺伝子型の頻度は1/2、（1/2）２、（1/2）３、・・・、（1/2）ｎと減少する。ゆえに、導入遺伝子数の増加に伴い、交雑頴花数を相乗的に増やす必要がある。本研究において、６遺伝子を導入する場合、１回親の数としては最大で目的遺伝子を１つずつ持つものを６個体、最小で６つ持つ１個体の使用が考えられたが、既に６遺伝子変異が集積された甘味種コムギ、もしくは３遺伝子変異が集積されたWx、HA系統をそれぞれ１回親として利用することができたため、両者の検討のみ実施した。また、１もしくは２遺伝子を持つ１回親を３～６個体使う場合に比べ、３もしくは６遺伝子の集積系統を１、２個体用いる方が目的系統の育成に必要な世代数が少なくて済むことから、迅速な品種育成を行うという点で前者の検討をする必要はないと判断した。ただし、あらかじめ集積系統が存在していない場合には、遺伝子の集積作業に入る前に各系統別に戻し交雑を並列に進める方法が効率的であろう（Ishii andYonezawa 2007）。本研究において、全ての目的遺伝子でヘテロ接合体が得られる確率は６遺伝子導入で1/64、３遺伝子導入で1/8と期待値通りであった（表３、表５）。

東北農業研究センター研究報告　第114号（2012）62

表５ 戻し交雑第 1世代におけるGBSSIGBSSI 及び SSIIaSSIIa 各遺伝子型の個体数

反復親 遺伝子 世代 分析数 全へテロ個体a） Pb）

A1HW

Pc）B1HW

Pc）D1HW

Pc）

盛系D-B004

バンドウワセ

ミナミノカオリ

シロガネコムギ

BC1F1BC2F1BC3F1BC4F1

BC5F1BC6F1BC7F1

BC1F1BC2F1BC3F1BC4F1BC5F1BC6F1BC7F1BC8F1

BC1F1BC2F1BC3F1BC4F1d）BC5F1BC6F1e）BC7F1

BC1F1BC2F1BC3F1BC4F1BC5F1BC6F1BC7F1BC8F1

BC1F1BC2F1BC3F1BC4F1BC5F1BC6F1BC7F1BC8F1

BC1F1f）BC2F1BC3F1BC4F1BC5F1BC6F1BC7F1

BC3F1BC4F1BC5F1BC6F1BC7F1BC8F1BC9F1

7244351737424632

6039352146404745

372520

63

17

1201241231251201209390

1201151231251201209690

324037324443

62744039384438

96106347

710436875

452

7

1

12132011141298

111915171021810

3473108

713534107

1.000.830.110.140.520.330.470.11

0.860.020.860.820.920.180.640.78

0.770.290.75

0.76

0.44

0.440.530.240.240.800.440.440.33

0.300.220.920.730.200.120.250.71

0.620.650.270.620.060.26

0.790.221.000.400.730.060.30

4029201517252415

252021920182524

2696

37

11

6162636864653748

6848556260525543

182614191817

33341519181818

321515220172217

3519141226222221

111612

26

6

5962605756555642

5267686360684147

141423132626

29402520202620

0.350.030.400.000.6200.220.770.72

0.200.870.240.510.380.530.670.66

0.010.160.16

0.17

0.23

0.861.000.790.330.470.360.080.53

0.140.080.240.931.000.140.150.67

0.480.060.140.290.230.17

0.610.490.110.870.750.230.75

321918818242312

42811628152323

19911

37

11

6658577361534744

6557666461654645

181819182220

27302924241612

402517919182320

1831241518252422

17169

26

6

5466665259674646

5558576159555045

142218142223

35441115142826

0.350.370.870.810.870.351.000.16

0.000.000.010.050.140.110.880.88

0.710.160.65

0.17

0.23

0.270.470.420.060.860.200.920.83

0.360.930.420.790.860.360.681.00

0.480.530.870.481.000.65

0.310.100.000.150.100.070.02

401722619242212

3019171325162224

201112

30

10

7272625661574944

5752575456515045

172415191621

31382120232421

3227131118182420

302018821242521

17148

33

7

4852616959634446

6363667164694645

151622132822

31361919152017

0.350.130.130.230.870.350.770.16

1.000.870.870.280.560.210.660.66

0.620.550.37

0.71

0.47

0.030.070.930.240.860.580.600.83

0.580.310.420.130.470.100.681.00

0.720.210.250.290.070.88

1.000.820.750.870.190.550.52

注．a）　　b）　　c）　　d）　　e）　　f）　　W：野生型　　H：ヘテロ接合

3つの GBSSI もしくは SSIIa 遺伝子がヘテロ接合である個体数3遺伝子座について期待値を野生型：ヘテロ接合＝7：1とした場合のχ二乗検定による確率1遺伝子座について期待値を野生型：ヘテロ接合＝1：1とした場合のχ二乗検定による確率BC3F3 より選抜したHA個体を花粉親としたため、全てヘテロ接合BC5F2 より選抜したHA個体を花粉親としたため、全てヘテロ接合F2 より選抜したWx個体を花粉親としたため、全てヘテロ接合

GBSSI

SSIIa

SSIIa

GBSSI

SSIIa

GBSSI

SSIIa

SSIIaGBSSI

GBSSI SSIIa

P PPP

齊藤ほか：連続戻し交雑による品種育成におけるDNAマーカー選抜の効率的適用に関する一考 63

99％の確率で６遺伝子または３遺伝子座のヘテロ接合体を少なくとも１個体得るためには、前出の計算式（菊池・藤巻　1974）により、それぞれ293個体、35個体の交雑種子が必要であると試算される。実際には６遺伝子を導入する場合においては200粒弱の交雑種子からも目的個体が得られた。しかし、選抜に用いた個体数を比較すると、次の戻し交雑に用いる個体を確実に選抜するためには、６遺伝子導入系統では３遺伝子導入系統に対して５倍以上の多くの交雑種子が必要であった（表３、表５）。交配による結実数を１穂あたり10から20粒程度を前提とすると、６遺伝子導入系統では最低でも15～30穂以上の交配が必要であるのに対し、３遺伝子導入系統では各系統２～４穂（２系統合わせて４～８穂）以上の交配で失敗なく次の戻し交雑に必要な個体が得られ、より省力的であることがわかる。MASを用いない戻し交雑によるNILの育成（藤

田ら　1995）には、温室での世代促進を組み合わせても、最初の交配からBC５F２を得るまでに約５年を要した。これは、F２もしくはF３世代を用いた後代検定を行った結果によるもので、本研究では、２年以内で５回の戻し交雑を完了できた（表６）。WxやHAのような劣性形質を戻し交雑により導入する場合は、後代検定による劣性遺伝子の確認が必須であったが、MASを用いることでその作業が不要となり、連続的な戻し交雑を進めることができた。そのため、研究開始３年半の現在、５回以上の戻し交雑により遺伝的背景が反復親の90％以上まで置換されたWx、HAのNIL同士を交雑したF２が得られており、目標のSW及びその姉妹系統の選抜が可能となっている。従って、今回の方法が育種現場のコムギの品種育成期間の短縮に大いに役立つ手法と確信する。MABCにより迅速に品種を育成するに当たり、

もう一つ大きな問題点がある。前述の通りDNAマーカーを使うことで、圃場検定や後代検定をする必要がないため世代促進に有効であるが、播性程度がそのスピードの制約事項となる。本研究では、播性Vの｢盛系D-B004｣において、未熟胚を培地上で発芽させることで１世代の生育期間を短縮させ、約４か月で次の交配に供することができた。百足ら（1975）により、播性Ⅳの「アオバコムギ」を反復親とした連続戻し交雑において、高温による強制的な登熟、過酸化水素による発芽、ならびに１葉期緑体春化処理などを組み合わせることによって、１世代を平均79日で年間4.5世代進められたことが報告されている。また、上記の春化方法よりも止葉展開までの日数が少ない種子－緑体春化法により、促進世代数をさらに高めることができる可能性を示唆している。これらの方法は、世代促進には有効であるが、１穂あたりの採種数が極端に少なく（平均4.2粒程度）、また、反復親である｢盛系D-B004｣を用いた予備調査により発芽率が低いことが判明し、本研究における連続戻し交雑にそのまま適用できないと判断されたため、培地上での発芽法を採用した。しかしながら、上記方法を改良することで、１世代の育成期間を短縮し、かつ十分な量の種子を得ることが可能になるであろう。このような方法は、播性の高い東北の品種・系統を反復親に用いる場合、播性程度の低いものと同じスピードでMABCを進めるための一助になると考えられる。MASによる育種を行う場合、複数の形質（遺伝

子）を同じDNAサンプルを用いて選抜できるという利点があるが、マーカー数が増えるにつれ、そのコストや作業時間が増えるという問題が出てくる。複数遺伝子の同時選抜には、マルチプレックスPCRによりPCRと電気泳動の回数を減らすことで低コスト化・省力化を図ることができ、実際にマルチ

表６ 「盛系D-B004」および「ミナミノカオリ」系統の戻し交雑行程

F1交配年月

盛系D-B004WxHAミナミノカオリWxHA

2008.62008.6

2008.62008.6

BC1F1

2008.102008.10

2008.92008.9

BC2F1

2009.22009.2

2009.12009.1

BC3F1

2009.82009.8

2009.52009.5

BC4F1

2010.52009.12

2009.92009.9

BC5F1

2010.9a）2010.5

2010.12010.1

BC6F1

2010.9a）

2010.5b）2010.5b）

注．a）　　b）

Wx_BC5F1/HA_BC6F1より甘味種および兄弟系統を作出BC6F2よりWx、HAの準同質遺伝子系統を選抜

東北農業研究センター研究報告　第114号（2012）64

プレックスPCRに適したマーカーが開発されている（Zhang et al. 2008、Wang et al. 2010）。マルチプレックスPCRを行う際には、それぞれのプライマーセットから増幅される断片がアガロースゲルで簡単に分離できること、単一のアニーリング温度で利用可能なプライマーを用いること、それぞれのプライマー量が最適化されていることが重要な点である（Zhang et al. 2008）。本研究においても、上記条件を満たす３遺伝子を一度のPCRで判定できるマーカーを作成できた（図４）。これにより、通常３回のPCRの後に３回の電気泳動により遺伝子型判定を行うところを、３分の１に減らすことでコストの削減および作業効率の向上を図ることができた。また、アガロースゲルを用いた電気泳動に比べ多少コストがかかるものの、遺伝子型の判定をQIAxcel（QIA-GEN）などのDNA電気泳動自動化装置を用いることで作業効率はさらに上がり、分析個体数の増加にも耐えられると考える（Saito et al. 2011）。以上より、本研究では既に３遺伝子ずつの集積系統を１回親として利用可能なこと、また、マルチプレックスPCRによる選抜が可能になったことを考慮すると、３遺伝子ずつ並列に戻し交雑を進め、最終的に６遺伝子を集積する方法が、扱う個体数が少なく、より迅速に育成を進められるという点で効率的であると結論付けられた。数多くの系統、世代を同時に扱う現在の品種育成の現場における交配作業の効率性と品種育成のスピードのバランスを考慮すると、この方法が実情に即したものであると考えられる。戻し交雑による品種育成では、反復親の一部を改良することを目的に１回親に由来する優良遺伝子を導入するため、できるだけ反復親に遺伝的背景を近づけ、目的優良遺伝子に関係のない１回親のゲノム領域を排除し、不良形質を持ちこまないことが重要となる。近年、染色体全域に分布するDNAマーカーを用いた選抜法（marker-assisted backgroundselection；MABS）を用いた海外におけるコムギ品種育成法が報告されている（Kumar et al. 2010、Randhawa et al. 2009、Xue et al. 2010）。通常、2回の戻し交雑における１回親に由来する染色体領域は12.5%であり、反復親への置換程度は87.5％である。しかし、MABSにより目的遺伝子に加え、多数のマーカーにより反復親に由来する染色体領域を選抜することで、２回の戻し交雑で97％の反復親ゲ

ノムを持つ個体を選抜できる（Randhawa et al.2009）など、少ない回数の戻し交雑で理想とする反復親ゲノムをより多く持つ系統を選抜でき、既存優良品種を用いて新たな形質を付与した品種育成を迅速に進めることが可能になる。しかしながら、この手法を国内のコムギ品種育成に適用するためには、染色体全体のマーカー情報と、低コストかつ高効率な選抜方法が必要不可欠である。国内においては、「コシヒカリ関東HD1号」（竹内ら　2008）など水稲品種での適用例はあるものの、コムギでの報告はなされていない。SWおよびその姉妹系統の育成にあたっては、各育成地で戻し交雑を行い、DNAの抽出から遺伝子型の判定は1か所で行うことで、育成者の負担が少なくコストの面でも効率的に進められたと感じる。今後、MABSのようにさらに進んだゲノム情報に基づく選抜方法を利用した品種育成法の発展が予想され、国内の事業育種にそれらを適用していくためには、育成部門とMASを専門に行う部門の分業体制の必要性が考えられる。高額な分析機器に関しては、後者に集約し各育成系統のMASを行うことで、育成者は少ない負担で効率的な選抜法を利用でき、品種育成がより加速すると予想される。

引 用 文 献

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