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博 士 后 研 究 工 作 报 告

几种香豆素类化合物的分离、纯化、结构修饰及其防

污活性研究

王湛昌

工作完成日期 2013 年 10 月

报告提交日期 2013 年 11 月

厦门大学

2013 年 11 月

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题名页

几种香豆素类化合物的分离、纯化、结构修饰及其防污活性研究

Isolation, purification, structural modification of several coumarins and

their antifouling activities

博 士 后 姓 名 王湛昌

流动站（一级学科）名称 海洋学

专 业（二级学科）名称 海洋生物技术

研究工作起始时间 2009 年 5月

研究工作期满时间 2013年 11月

厦 门 大 学

2013年 11月

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利目的的少量复制并允许该报告进入学校图书馆被查阅，有

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作报告在解密后适用本规定。

本研究报告属于： 1、保密（ ）， 2、不保密（ ）

纸本在 年解密后适用本授权书；

电子版在 年解密后适用本授权书。

（请在以上相应括号内打“√”）

作者签名： 日期： 年 月 日

导师签名: 日期： 年 月 日

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摘要

寻找新的环境友好型防污剂是目前海洋防污研究工作的一个热点，而天然

防污活性物质及其结构类似物是最有可能的环保防污剂。本文以白脊藤壶和多

室草苔虫活性检测模型研究了蛇床子中的5种天然产物。对其中的蛇床子素进行

了结构修饰，获得8个衍生物，并利用白脊藤壶和多室草苔虫活性检测模型检测

了它们的活性。对其中的欧前胡素进行了结构修饰，获得了9个衍生物，并利用

细菌、硅藻活性模型检测了它们的活性。并且对这些香豆素类化合物及其衍生

物的活性与化学结构之间的构效关系作为分析。主要结果如下：

1、 本文从蛇床子的提取物中分离得到了五种纯化合物并确定其结构为β-谷甾

醇（β-stitosterol）、蛇床子素（Osthole）、欧前胡素（Imperatorin）、异茴芹内酯

（Isopimpinellin）和橙皮油内酯烯酸（Auraptenol）。其中β-谷甾醇未表现出防污

活性，而其他四种化合物属于香豆素类化合物，表现出显著的防污活性。本文

获得的四种香豆素类化合物都能抑制白脊藤壶金星幼体的附着，蛇床子素、欧

前胡素、橙皮油内酯烯酸和异茴芹内酯的半抑制浓度分别为 4.64、3.39、3.38、

11.31µg mL-1。对于另一个活性模型多室草苔虫的幼体附着，蛇床子素

（EC50=7.56µg mL-1）和橙皮油内酯烯酸（EC50=22.59µg mL-1）表现出抑制活性，

而欧前胡素和异茴芹内酯则未表现出抑制活性。蛇床子素和橙皮油内酯烯酸属

于简单香豆素，能抑制两种污损生物，防污活性比较广谱；欧前胡素和异茴芹

内酯属于呋喃香豆素，只能抑制藤壶幼体，活性比较专一，这与其母核是否与

呋喃环相连有关。在对藤壶的抑制活性中，三个带有异戊烯基侧链的香豆素（蛇

床子素、欧前胡素和橙皮油内酯烯酸）活性较好且数值接近，而不带异戊烯基

侧链的化合物异茴芹内酯则活性较弱，这提示了异戊烯基侧链对化合物的防污

活性也具有重要的意义。

2、 对蛇床子素进行结构修饰，一共获得 8个衍生物（化合物 6-13），并利用

白脊藤壶和多室草苔虫两种防污活性检测模型分别检测了这 8种化合物的活性。

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对于藤壶活性模型，化合物 2、6、8、9、10和 13的半抑制浓度低于 15 μg/ml，

化合物 11和 12的半抑制浓度介于 15μg/ml到 25 μg/ml之间，而化合物 7半抑制

浓度高于 25 μg/ml。对于草苔虫活性模型，化合物 2、8、9和 10的半抑制浓度

低于 15 μg/ml，化合物化合物 7、11和 12的半抑制浓度介于 15μg/ml到 25 μg/ml

之间，而化合物 6和 13半抑制浓度高于 25 μg/ml。因此这 8个化合物都具有防

污活性，但活性的高低以及能够抑制的目标生物不尽相同，并且这些活性与其

侧链的官能团有关。

3、 通过结构修饰，一共获得 9个欧前胡素的活性衍生物。利用抑制附着性硅

藻模型和抑菌模型分别检测了欧前胡素及其衍生物的活性，证实了对硅藻模型，

化合物 3、16 和 17 具有良好的抑制活性，其半抑制浓度分别为 1.44，0.67 和

0.60ppm；对革兰氏阳性菌，化合物 18 和 19 表现出抑制活性，其他化合物未变

现出抑制活性；对革兰氏阴性菌，这一类化合物均未表现出抑制活性。通过构

效关系分析证实，化合物侧链双键是抑制硅藻附着活性官能团，溴和侧链末端

醛基协同作用于抑菌活性。

关键词：防污活性；香豆素；结构修饰；构效关系

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AbstractThe research on efficient and environmentally friendly antifouling agents is a hot

topic in the field of marine antifouling research. The natural products and analogues

were potential environment-friendly antifouling(AF) agents. In the present study, five

natural products were isolated from Cnidium monnieri, and their AF activities were

tested against Balanus albicostatus and Bugula neritina. Eight derivatives were

synthesized from Osthole, and their AF activities were tested against B. albicostatus

and B. neritina. Furthermore, nine derivatives were synthesized from Imperatorin,

and their activities against bacteria and diatoms were screened. The structure-activity

relationships of these coumarins and their derivatives were examined. The main

results were shown as followed.

1、 Five compounds including β-stitosterol(1), Osthole(2), Imperatorin(3),

Isopimpinellin(4) and Auraptenol(5) were isolated from the herbal plant c. monnieri.

The β-stitosterol showed no significant antifouling activity, and other four

coumarins(2-5) were proved to be antifouling agents. Compounds 2, 3, 4 and 5

showed significant antifouling activities against larval settlement of B. albicostatus

with EC50 values of 4.64, 3.39, 3.38, 11.31µg mL-1. It was suggested that the

isopentenyl and methyl groups should have different effects on the AF activities

against B. albicostatus. Osthole(2) and Auraptenol(5) could also inhibit larval

settlement of B. neritina, but Imperatorin(3) and Isopimpinellin(4) showed no

significant activity. It was suggested that the former two compounds, which were

simple coumarins might have broader AF activities spectrum than the latter two linear

furanocoumarins.

2、 Eight derivatives were synthesized from Osthole and exhibited different AF

activities against B. albicostatus and B. neritina. The EC50 values of compounds 2, 6,

8, 9, 10 and 13 against B. albicostatus larvae were lower than 15 µg mL-1, the EC50

values of compounds 11 and 12 against B. albicostatus larvae were between 15 and

25 µg mL-1, and the EC50 values of compounds 7 against B. albicostatus larvae were

higher than 25 µg mL-1. The EC50 values of compounds 2, 8, 9 and 10 against B.

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neritina larvae were lower than 15 µg mL-1, the EC50 values of compounds 7, 11 and

12 against B. neritina larvae were between 15 and 25 µg mL-1, and the EC50 values of

compounds 6 and 13 against B. albicostatus larvae were higher than 25 µg mL-1. The

AF activities of these derivatives showed significant variation between different

functional groups.

3、 Nine derivatives were synthesized from Imperatorin, and their activities against

bacteria and diatoms were screened. Compounds 3, 16 and 17 showed significant

activity against the settlement of diatoms with EC50 values of 1.44, 0.67, and 0.60ppm.

Compounds 18 and 19 showed significant activity against Gram - positive bacteria.

The structure-activity relationship was discussed. The double bond of side-chain was

related to activity against settlement of diatoms, but the Br and aldehyde group were

related to activity against Gram - positive bacteria.

Keywords: antifouling activity; coumarins; structural modification; structure-activity

relationship

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I

目 录

第一章 蛇床子中天然防污活性物质研究…………………………………1

1.1 引言…………………………………………………………………1

1.2 实验部分………………………………………………………………3

1.2.1 实验仪器………………………………………………………………3

1.2.2 实验试剂……………………………………………………………3

1.2.3 实验材料……………………………………………………………3

1.2.4 实验方法………………………………………………………………4

1.3 实验结果……………………………………………………………8

1.3.1 化合物β-谷甾醇的结构鉴定及其防污活性…………………………8

1.3.2 化合物蛇床子素的结构鉴定及其防污活性………………………11

1.3.3 化合物欧前胡素的结构鉴定及其防污活性………………………14

1.3.4 化合物异茴芹内酯的结构鉴定及其防污活性……………………17

1.3.5 化合物橙皮油内酯烯酸的结构鉴定及其防污活性………………20

1.4 讨论………………………………………………………………………24

第二章 蛇床子素衍生物的防污活性研究…………………………………27

2.1 引言…………………………………………………………………27

2.2 实验部分………………………………………………………………29

2.2.1 实验仪器……………………………………………………………29

2.2.2 实验试剂……………………………………………………………29

2.2.3 实验材料……………………………………………………………29

2.2.4 实验方法…………………………………………………………… 30

2.3 实验结果……………………………………………………………34

2.3.1 化合物 8-epoxypentylcoumarin的结构鉴定及其防污活性………34

2.3.2 化合物Meranzin hydrate的结构鉴定及其防污活性………………38

2.3.3 化合物 8-methylbutenalcoumarin的结构鉴定及其防污活性…… 42

2.3.4 化合物Micromarin-F的结构鉴定及其防污活性…………………46

2.3.5 化合物 2'-deoxymetranzin hydrate的结构鉴定及其防污活性……50

2.3.6 化合物 3' - methoxyl - 2'-deoxymetranzin hydrate的结构鉴定及其防

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II

污活性…………………………………………………………… 54

2.3.7 化合物 3' - oxethyl - 2'-deoxymetranzin hydrate的结构鉴定及其防污

活性……………………………………………………………… 58

2.3.7 化合物 2' – brommetranzin hydrate 的结构鉴定及其防污活

性………………………………………………………………… 62

2.4 讨论………………………………………………………………………66

第三章 欧前胡素衍生物的防污活性研究…………………………………69

3.1 引言…………………………………………………………………69

3.2 实验部分………………………………………………………………71

3.2.1 实验仪器……………………………………………………………71

3.2.2 实验试剂……………………………………………………………71

3.2.3 实验材料……………………………………………………………71

3.2.4 实验方法…………………………………………………………… 72

3.3 实验结果………………………………………………………………… 76

3.3.1 欧前胡素衍生物的结构表征………………………………76

3.3.2 欧前胡素及其衍生物的活性测定…………………………………95

3.4 讨论………………………………………………………………………100

参考文献……………………………………………………………………101

致谢……………………………………………………………………10 9

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III

CONTENT

Chapter 1 Researches on natural antifoulants from Cnidium

monnieri ……………………………………………………………………1

1.1 Introduction………………………………………………………………1

1.2 Experiments………………………………………………………………3

1.2.1 Apparatus……………………………………………………………3

1.2.2 Reagents……………………………………………………………3

1.2.3 Materials……………………………………………………………3

1.2.4 Methods……………………………………………………………… 4

1.3 Results……………………………………………………………8

1.3.1 Structural indentification and antiflouling activities of β-stitosterol……8

1.3.2 Structural indentification and antiflouling activities of Osthole………11

1.3.3 Structural indentification and antiflouling activities of Imperatorin… 14

1.3.4 Structural indentification and antiflouling activities of Isopimpinellin17

1.3.5 Structural indentification and antiflouling activities of Auraptenol… 20

1.4 Discussion………………………………………………………………24

Chapter 2 Researches on antifouling activities of derivatives from

Osthole……………………………………………………………………… 27

2.1 Introduction………………………………………………………………27

2.2 Experiments………………………………………………………………29

2.2.1 Apparatus……………………………………………………………29

2.2.2 Reagents……………………………………………………………29

2.2.3 Materials……………………………………………………………29

2.2.4 Methods…………………………………………………………… 30

2.3 Results……………………………………………………………………34

2.3.1 Structural indentification and antiflouling activities of

8-epoxypentylcoumarin……………………………………………………34

2.3.2 Structural indentification and antiflouling activities of Meranzin

hydrate………………………………………………………………………38

2.3.3 Structural indentification and antiflouling activities of

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IV

8-methylbutenalcoumarin………………………………………………… 42

2.3.4 Structural indentification and antiflouling activities of Micromarin-F 46

2.3.5 Structural indentification and antiflouling activities of

2'-deoxymetranzin hydrate………………………………………………… 50

2.3.6 Structural indentification and antiflouling activities of 3' - methoxyl -

2'-deoxymetranzin hydrate……………………………………… 54

2.3.7 Structural indentification and antiflouling activities of 3' - oxethyl -

2'-deoxymetranzin hydrate……………………………………… 58

2.3.7 Structural indentification and antiflouling activities of 2' –

brommetranzin hydrate…………………………………………… 62

2.4 Discussion…………………………………………………………………66

第三章 欧前胡素衍生物的防污活性研究…………………………………69

3.1 Introduction…………………………………………………………………69

3.2 Experiments………………………………………………………………71

3.2.1 Apparatus……………………………………………………………71

3.2.2 Reagents……………………………………………………………71

3.2.3 Materials……………………………………………………………71

3.2.4 Methods……………………………………………………………… 72

3.3 Results………………………………………………………………………76

3.3.1 Structural indentification of Imperatorin and its derivatives…………76

3.3.2 Activities of Imperatorin and its derivatives………………………… 95

3.4 Discussion…………………………………………………………………100

References………………………………………………………………………101

Acknowledgements…………………………………………………………………109

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1

第一章 蛇床子中天然防污活性物质研究

1.1 引言

海洋污损生物（fouling organisms）是指栖息在各种海中设施表面，对人类

的海洋活动产生不利影响的动物、植物和微生物的总称，它影响海洋设施使用安

全和使用寿命，危害海水养殖、船舶运输、沿海工厂和开采平台等几乎所有的海

洋经济、军事等活动，（Horne,1969; 严涛等，2002）。自人类开始接触海洋以来，

污损问题就是人类所关注的难题，在世界范围内，污损生物的生长导致了严重的

环境和技术问题，并且随着人类的海洋活动的越来越频繁而愈加凸显（Lewis,

1998; Rittschof ,2000; Townsin，2003; Yebra,2004; Krug , 2006; Ralston, 2009）。目

前据估计，海洋污损生物每年造成的损失高达数百亿美元，因此研究针对它们的

防除技术一直受到世界各个海洋国家的普遍重视。

20世纪初，技术人员开发了汞、砷、锡、铜等为主要成分的防污涂料，来应

对海洋污损生物的附着。20世纪70年代以后，含汞、砷等成分的防污剂逐渐被禁

用，80年代以后研究发现有机锡具有极强的环境毒性（Ellis, 1991; Abbot, 2000;

Champ, 2000），并被国际海事组织立法于2003年后禁用（Rittschof, 2001）。含

铜的防污剂目前仍在使用，但是其环境负面效应日益凸显，对其立法禁用的呼声

越来越高。因此对环境友好型防污活性物质的研究成为目前世界范围内的研究热

点。

目前实验室内检测污损活性的生物检测模型主要有海洋微生物抑制实验、大

型藻类孢子附着抑制实验、草苔虫幼体附着抑制实验和藤壶幼体附着抑制实验

等。白脊藤壶是东亚海域中的一种主要的污损生物，对海水养殖设施、航运设施、

船舶和海水管道具有相当大的危害[Utinomi, 1968; Newman,1982; Lee , 1991]。多

室草苔虫是热带和温带海域重要的污损物种，每年在特定季节大量繁殖于鱼排、

网箱、浮标、码头桩柱等设施上，造成一定的危害[Woollacott, 1971; Walters,

1992 ]。这两种实验模型特别是藤壶检测模型，因为其普遍性和代表性，被认为

是最重要的实验室内防污检测模型。本章节主要采用白脊藤壶幼体附着抑制实验

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2

和多室草苔虫幼体附着抑制实验作为检测模型。

到目前为止，大部分天然防污活性物质都是从海洋生物中获得[Sears, 1990;

Fusetani, 1996; Clare, 1999; Rittschof, 1999, 2001; Cho, 2005; Qi , 2006, 2008; Wang,

2009]，但是也有一些来源于陆地植物的活性物质被证明具有防污活性[Feng,

2009; Zho, 2009]。与海洋生物相比，陆地植物的采集较为方便，也更容易通过种

植等方式大量获得[Yang, 1999]。因此相对于海洋天然产物，陆地天然产物具有

更为实际的应用潜力。因此我们实验室特别关注陆地植物中有效成分的防污活性

研究。在先前的研究中，已经证实了大量的陆地植物提取物具有良好的防污活性，

并获得了数个陆地来源的防污活性纯化合物[Feng, 2009]。本文重点针对中药植

物蛇床的果实蛇床子，从它的提取物中筛选出防污活性高的纯化合物，确定其化

学结构，并对防污活性进行测定，同时讨论其防污活性与化学结构直接的关系，

本章节的目的是获得具有较高活性的防污物质，为进一步的环境友好型的防污剂

的开发提供备选化合物，同时获得可供结构改造的防污活性先导化合物。

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3

1.2 实验部分

1.2.1 实验仪器

R205CE 型旋转蒸发仪（上海洪纪仪器设备有限公司）

ZWF-6 型三用紫外分析仪（上海金达生化仪器有限公司）

XTS-20 型体视显微镜（北京泰克仪器有限公司）

玻璃层析柱（如东县砂芯玻璃仪器有限公司）

BSZ-100 自动部分收集器（上海精科实业有限公司）

AB 3200Q TRAP 质谱仪（AB SCIEX 公司）

Bruker Avance-600 FT 核磁共振仪（Bruker 公司）

1.2.2 实验试剂

柱层层析硅胶（100-200 目，200-300 目），自青岛海洋化工厂购买。

薄层层析硅胶（GF254，HF254），自青岛海洋化工厂购买。

薄层层析硅胶板（GF254型，HF254型），自青岛海洋化工厂购买。

羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）,自 GE 公司 Pharmacia 购买。

薄层层析通用显色剂，15%硫酸-乙醇溶液，实验室自配。

石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇等试剂，国产分析纯。

1.2.3 实验材料

蛇床子（Cnidium monnieri）自市场采购，产地浙江省。

白脊藤壶（Balanus albicostatus）成体采自福建省厦门市思明区白城海岸礁

石及桥墩。

多室草苔虫（Bugula neritina）成体采自福建省漳州市龙海市破灶岛附近鱼

排。

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4

1.2.4 实验方法

1.2.4.1 实验流程

蛇床子的乙醇提取物能够有效得抑制白脊藤壶幼体附着，对总室草苔虫的幼

体附着也有抑制效果。本文以防污活性检测为导向，对蛇床子的乙醇提取物进行

活性追踪，分离纯化具有防污活性的天然产物，并对防污活性化合物进行结构鉴

定。

图 1.1 实验流程图

Figure 1.1 Experiment process

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5

1.2.4.2 防污活性检测模型

本章节以白脊藤壶金星幼体附着抑制实验和多室草苔虫幼体附着抑制实验

作为防污活性的检测模型。

1.2.4.2.1 白脊藤壶金星幼体的获得

白脊藤壶多生活于潮间带的礁石、码头、桥墩、木桩等处。根据厦门半日潮

低潮时间，在低潮时，于厦门白城海边礁石和桥墩处采集完整的白脊藤壶成体。

成体带回实验室后，置于荫蔽通风处阴干。次日，将白脊藤壶成体放入到新鲜的

砂滤海水中，并用光照（日光或白炽灯光）诱导。1～2h 后，在新鲜海水和光照

的刺激下，白脊藤壶成体会释放出无节幼体。用筛绢网收集无节幼体，并将其放

入膜滤海水（控制温度 25～30℃，盐度 27～30）中培养，幼体密度大约 500 只

/L。以牟氏角毛藻（ Chaetoceros muelleri）、湛江等鞭金藻（Dicrateria

zhanjiangensis）或亚心形扁藻（Platymonas subcordiformis）作饵料，饵料浓度为

2.5×105 cells/ml，每天换水并投饵料一次。培养 5~10天后，无节幼体变态发育为

金星幼体。在变态后 24h内用筛绢网收集金星幼体，保存在 4℃冰箱内，在一周

内，可供防污检测实验使用。

1.2.4.2.2 多室草苔虫幼体的获得

多室草苔虫多生活于沿岸浅海，常附着于鱼排、浮标、船舶、电缆、平台等

水下设施上。实验用的多室草苔虫成体采自漳州龙海市破灶岛附近的鱼排。带回

实验室后，放入新鲜的砂滤海水中，遮光培养。实验时，将多室草苔虫成体取出，

放入透明玻璃缸中，暴露在日光或白炽灯光下，成体会立即释放出幼体。用滴管

小心收集幼体，并立刻供防污检测实验使用。

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