蛋白质芯片技术手册 - raybiotech.cn · 使用raybiotech芯片产品部分参考文献...

蛋白质芯片技术手册

RayBiotech,Inc.the protein array pioneer company

2013-2014版


www.raybiotech.com 中国技术支持电话：400-008-5918 E-mail:[email protected]

目录

一什么是蛋白质芯片？ ...............................................................2

二蛋白质芯片是如何产生的？ .........................................................3

三蛋白质芯片有什么优点？ ...........................................................4

四蛋白质芯片都有哪些分类？ .........................................................5

五蛋白质芯片的应用有哪些方面？.....................................................6

六蛋白质芯片的原理是什么？ .........................................................7

七蛋白质芯片适合什么样品检测, 该如何收集样品？ ...................................9

八膜芯片都有哪些方法对结果进行拍照？.............................................12

九玻片芯片都有哪些仪器可以扫描结果？.............................................13

十蛋白质芯片的结果可以保存吗？能保存多久？该如何保存？ .........................15

十一蛋白质芯片操作复杂吗？有哪些注意事项？ ......................................16

十二蛋白质芯片得到大量数据该如何处理？ ..........................................20

十三 RayBiotech芯片常见疑问 .......................................................22

............................................................26

使用RayBiotech芯片产品部分参考文献 ..........................................28

十六 RayBiotech芯片新技术介绍 .....................................................30

十四蛋白质芯片的实物图

十五

1



一什么是蛋白质芯片？

蛋白质芯片是一种高通量的蛋白质免疫检测分析技术，可以简单的理解为多重ELISA检测技术。但是不同于

ELISA的是，它一次试验可以检测几百种目标因子，且只需10-100ul的样品。抗体芯片是蛋白质芯片中的主要类

型，抗体芯片是将多种不同的捕获抗体印制在固相支持物上，每种抗体孤立成点，抗体之间不相互影响，呈方阵

排列。抗体固定在固相支持物上以后，用封闭液进行封闭空余位点，然后将生物样品和芯片一起孵育，样品中特

异性的抗原与捕获抗体偶联，偶联到捕获抗体上的抗原再与生物素标记的检测抗体一起孵育，最后通过荧光剂-

链霉亲和素或者HRP-链霉亲和素和化学发光试剂进行荧光染色剂检测或者化学发光信号检测，得到芯片结果图

片，通过软件提取图片荧光值或灰度值，得到芯片数据，根据数据来比较目标因子信号差异和定量检测目标因子

含量。

载体

各

种

抗

体


2


二蛋白质芯片是如何产生的?

继人类基因组测序完成以后，研究人员已经能够分析

无数个疾病相关的基因表达。然而，由于异常的蛋白

表达、翻译后修饰或与其他生物分子相互作用导致的

许多疾病，仅仅从基因组的研究是不能获得对疾病状

态的全面了解的。只有高通量和高效率的蛋白质芯片

技术才是新药物靶标、疾病标志物和治疗药物的发现

的更有效、更有前景的研究方法。

蛋白质芯片是一个相对较新的技术，在2000年才出现

应用。这个概念是从基因表达芯片的应用发展而来，

且工作模式相似，但由于蛋白的特殊性，抗体芯片的

发展比DNA芯片的发展面临更多挑战，虽然困难重

重，但是抗体芯片技术仍以飞快的速度发展，已经成

为一个成熟的技术。

RayBiotech是全世界第一个将人类细胞因子抗体膜

芯片商业化的企业，十年品牌发展，已经开创出成

熟的膜抗体芯片平台、玻片抗体芯片平台、夹心法

抗体芯片平台、标记法抗体芯片平台、竞争法抗体

芯片平台、拟肽芯片平台、磷酸化抗体芯片平台、

定量抗体芯片平台以及蛋白芯片检测及数据分析服

务平台等，开发的产品和提供的技术服务遍布全世

界，全面应用于生物标志物发现和药物开发。目

前，抗体芯片在越来越多的领域都起到了重要的作

用，包括鉴定正常和疾病生理过程的关键因子、解

释药物机理、筛选生物标志物等，极大地促进了病

人的个性化医疗预言的实现。


3


三蛋白质芯片有什么优点？

�样品处理简单：可以直接用粗生物样品（血清、 �集成性：在同一系统中集发现和检测为一体；

血浆、尿、体液等）进行分析，只需经过离心处

�可定量检测:结合至芯片上的抗体通过标准曲线来理即可；

对测定抗原进行定量，但一般飞行质谱不用于定

量分析； �样品用量少:可以低至10μl-100μl样品检测；

�替代和互补传统检测方法：利用抗体芯片, 可替�高通量：一个样品一次试验可以检测多种因子(高

代 Western Blot；利用定量抗体芯片，可替代达成百上千种)，同时快速的发现多个生物标记

物，且几天可以完成上千个样品的检测； ELISA定量检测；抗体芯片可以互补流式细胞仪

不足的功能，如将细胞溶解，可测定细胞内的抗

�特异性和灵敏度高:单克隆抗体芯片特异性高，可原, 而且灵敏度远高于流式细胞仪；

鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的

工作量，且蛋白芯片的灵敏度高可以发现低丰度

蛋白质及生物标志物； �性价比高:利用定量芯片一次性检测大量目标因

子，平均定量每个因子所需的价钱远比ELISA便

�可以测定疏水蛋白质:与“双相电泳加质谱”相宜。比，除了有相似功能外，并可增加测定疏水蛋白

质的表达和功能；


4


根据应用：蛋白功能芯片和蛋白表达芯片

根据原理：夹心法芯片、标记法芯片、竞争法芯片

根据载体：玻片芯片、膜芯片、96孔板芯片

根据性能：定量芯片和半定量芯片

根据载体上捕获剂：抗体芯片、抗原（蛋白）芯片、小分子（反相）芯片、拟肽芯片

根据种属：人类抗体芯片、小鼠抗体芯片、大鼠抗体芯片、猪抗体芯片、猴抗体芯片

根据检测目标：

四蛋白质芯片都有哪些分类？

�细胞因子（Cytokine)抗体芯片

�凋亡因子（Apoptosis）抗体芯片

�肥胖因子（Adipokine)抗体芯片

�血管生成因子（Angiogenesis）抗体芯片

�炎症因子（Inflammation）抗体芯片

�动脉粥样硬化抗体芯片（Atherosclerosis）

�趋化因子（Chemokine)

�生长因子（Growth factor）抗体芯片

�基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase)抗体芯片

�白介素（Interleukin)抗体芯片

�磷酸化（Phosphorylation）抗体芯片

�急性肾损伤(Acute Kidney Injury)抗体芯片

三蛋白质芯片有什么优点？


5


蛋白质芯片能够用于研究蛋白质-蛋白质、期筛查，用于肿瘤分子流行病学调查及肿瘤生

物学研究等；DNA-蛋白质、RNA-蛋白质、蛋白-小分子之间

的相互作用，蛋白修饰作用、抗体特异性鉴

定、筛选药物作用的蛋白靶点，检测蛋白表达一次性对噬菌体抗体库上万

水平和抗体（自身抗体）水平，筛选肿瘤等疾个不同的抗体克隆进行检测；

病中的生物标志物等广泛领域。

毒理学、环境检测、食品

鉴定潜在的靶标分卫生安全的监测等。

子、研究药物作用、个性化药物治疗、细胞活

动分子机制研究等；

诊断、癌症发展的分子

机制、临床前研究、抗肿瘤药物的效应、临床

应用研究等；

用于肿瘤患者的辅助诊

断、疗效判断、病情检测、预后评估及判断肿

瘤有无复发和转移等，用于肿瘤高危人群的定

抗体筛查的应用：

其他方面的的应用：

在药物开发过程中的应用：

在癌症研究中的应用：

在肿瘤诊断中的应用：

五蛋白质芯片的应用有哪些方面？


6


六蛋白质芯片的原理是什么？

蛋白质芯片的检测原理主要是基于抗原抗体特异性

非共价结合。蛋白质芯片目前采用的检测方法主要

有双抗体夹心法检测和样品标记法检测。

夹心法抗体芯片是将捕获抗体预先固定在固相载体

上，生物样品加入到芯片上一起孵育反应后，其

特异性的抗原与捕获抗体结合，然后加入生物素标

记的检测抗体一起孵育，最后通过HRP-链霉亲和

素与化学发光底物、或者荧光染色剂-链霉亲和素

结合作为信号检测。基于“三明治”双抗体夹心法

建立的芯片，高品质的抗体对是此方法的关键，夹

心法有很高的灵敏度，检测浓度可以低至1-10

pg/mL;每增加检测一个蛋白，芯片上就需要增加一

个抗体对，这样可能出现交叉反应，因此需要将

每个抗体对与芯片上其他抗体对进行检测，验证是

否可以引入这个抗体对，且不对其他抗体对检测造

成干扰，通过优化筛选将交叉反应降到最小。

双抗体夹心法

由于抗体对之间可能存在的相互影响，夹心法抗体芯

片一次性检测蛋白的数量有所限制，但是可以用于蛋

白的定量检测。目前，RayBiotech验证配对的抗体对

有大于600种抗体对，基于双抗体夹心法开发的半定

量芯片有40多种，定量抗体芯片有大于45种，涵盖的

因子450多个，包括炎症因子、凋亡因子、生长因

子、肥胖因子、血管因子、信号转导磷酸化、白介素

等等各个疾病相关的因子。夹心法芯片具有特异性

好、灵敏度高、重复性和稳定性好的优点。


7


样品标记法

标记法芯片只需要一个捕获抗体，它用生物素标记样品

来代替标记检测抗体。将捕获抗体预先固定在固相载体

上，生物样品在检测前先进行蛋白生物素标记，将活化

的生物素与蛋白的氨基共价偶联，生物素标记后的样品

加入到芯片上一起孵育反应后，捕获抗体结合特异性的

蛋白，然后加入HRP-链霉亲和素与化学发光底物、或

者荧光染色剂-链霉亲和素结合作为信号检测。这种模

式可以检测那些没有合适的抗体对来建立双抗体夹心法

检测的分析物。因为溶液中没有自由的检测抗体与其

他抗体相互作用产生干扰，那么基于抗体相互作用产生

的交叉反应就可以避免，所以引入新的抗体到标记芯片

上比较容易，一个芯片上可以有几百个甚至几千个抗

体。目前RayBiotech开发的标记法芯片可以一次性筛选

1000个因子，且更大通量的标记法芯片正在研发中。

标记法芯片非常适合于大批量的筛选试验，但是相对于

夹心法芯片其CV略高，特异性略低。


8


七蛋白质芯片适合什么样品检测，该如何收集样品？

血清、血浆、细胞培养上清、细胞裂解液、组织裂

解液；除了这些常见的样品，全世界客户使用

RayBiotech抗体芯片产品检测成功的特殊样品还有

尿液、眼泪、唾液、痰、脑脊液、前列腺液、腹腔

注射液、奶水、初乳、支气管肺泡灌洗液、脓肿

液、中耳液、血小板释放物、骨头裂解液等。

组织裂解液一般比较容易造成芯片的背景较高，目

前有客户使用RayBiotech抗体芯片发表文献测试过

的组织裂解液有肺组织、支气管、子宫内膜组织，

肝脏组织，宫颈肿瘤、脾、脑组织、宫颈组织、囊

肿组织等，这些组织裂解液做出芯片结果的背景一

般都在可以接受的范围内，但是不能排除一些非常

罕见的组织裂解液对芯片信号背景影响较大。

1 适用于蛋白质芯片的常见样品 2 样品的收集方法

血清：

血浆:

尿液：

收集全血至普通离心管或者采血管（BD

vacutainer公司的红头真空采血管，不含抗凝

剂、防腐剂或者分离剂）,4 放置30-45min, 以

3000-5000rpm/min离心10min, 取上清检测或者

冻存（-20或-80℃）。

收集全血至BD vacutainer公司的EDTAK2、

肝素锂、或者枸橼酸钠等真空采血管，以3000-

5000rpm/min离心10min, 取上清检测或者冻存

（-20或-80℃）。

收集不添加稳定剂的尿液样本，高速离心

样本(如：10000 rpm离心 5min 或5000 rpm离心

10 min)，取上清分装，利用干冰或甲醇浴使样

本迅速结冻，储存于-80℃备用。

℃


9


细胞上清（条件培养基）：血清中含有部分细胞

因子，所以最好制备无血清或低血清条件培养

基。在第0天,于100mm培养皿中加入完全培养

6基，然后接种1X10 个细胞，培养第3天，倒掉培

养基，加入6-8ml低血清培养基(如含有0.2%牛血

清的培养基)；第5天，收集低血清的培养基于

15ml离心管中，2000rpm、4℃离心10min，收集

上清，分装于1.5ml EP管中，储存于-80℃中，

可以保存1年以上。不同细胞可根据生长状况确定

培养时间。


10

细胞上清归一化方法: 对于细胞上清的检测，接

种同样数量的细胞、加入同样体积培养基进行培

养刺激，如果细胞生长未受到影响，收集上清时

细胞数目不变，细胞上清可稀释同样的倍数来检

测；如果细胞数目有变化，样品之间归一化方法

建议有两种：

1 收集细胞上清后，对细胞进行计数，根据计数

的结果来调整细胞上清的上样比值，使不同样品

根据细胞数量归一化后上样检测，芯片检测所得

的细胞因子信号结果可进行对比；

2 收集细胞上清后，可将细胞裂解，然后蛋白浓

度定量，根据得到的蛋白浓度来调整细胞上清的

上样比值，使不同样品根据细胞裂解后蛋白浓度

来归一化后上样检测，芯片检测所得的细胞因子

信号结果可进行对比；



11

组织裂解液：将组织切成小块，转移至2ml离心

管，建议10mg组织加入500μl裂解液（或者参照您

购买的裂解液说明书),冰上静置15-25min,使用均

质机将组织打碎，14000 rpm 4℃离心混合液

细胞裂解液：细胞长满培养皿(d=10cm)时,(数量

6 8约为10 -10 )将上清吸掉，用PBS(4℃)清洗2次细

胞,加入200-500μl细胞裂解液,(或者参照您购买

的裂解液说明书)，快速将细胞从培养板刮下 ,收

集细胞裂解液，加入微量离心管中，使用涡旋振

荡器振荡混合30min。

14000 rpm 4℃离心混合液15-20 min,将清澈上清

转入干净的离心管中(确保只吸取上层清澈细胞裂

解液上清，如果上清出现絮状或者浑浊，将细胞

裂解液上清转入干净的离心管中，于 14000 rpm

4℃再次离心15-20 min后取上清)。建议裂解蛋白

浓度至少2mg/ml,上样时稀释倍数约5-10倍。

15-20 min,将清澈上清转入干净的离心管中（确保

只吸取顶层清澈细胞上清，如果上清出现絮状或者

浑浊，将细胞上清转入干净的离心管中，14000

rpm 4℃再次离心15-20 min后取上清)。


八膜芯片都有哪些方法对结果进行拍照？

1 化学发光成像系统拍照：化学发光成像系统主要的

组成部分是暗室和CCD相机(推荐UVP chemi doc

410)在膜芯片上加化学发光试剂孵育2min后，用镊子

托着膜的底部，将膜放在塑料片上，缓慢盖上另一张

塑料片，从一边慢慢驱赶气泡，避免压膜和反复摩

擦，操作过程要迅速；然后在化学发光成像仪上拍

照，化学发光成像仪可设置30s、1min、3min、5min连

续拍照得到系列图片；

2 胶片曝光成像：在膜芯片上加发光试剂后，可以使

用胶片曝光，推荐使用Kodak X-Omat™ AR胶片，x-

ray胶片连续曝光。膜曝光40s, 然后根据信号强度再次

曝光，如果信号太强（背景很高），减少曝光时间

（例如5-30秒），如果信号太弱，增加曝光时间（例

如5-20min或者过夜）。胶片曝光后显影，定影，晾

干的胶片在普通文件扫描仪扫描胶片后即得到芯片结

果图片；

3 比色法成像:膜芯片孵育HRP-Streptavidin

后，清洗后浸泡在 TMB显色液中， 15min-

30min后芯片上的点显示出蓝色，将芯片在洗液

II中清洗一次，将膜芯片从洗液II中捞出，夹在滤

纸中吸干洗液后，在普通文件扫描仪扫描膜芯片

后即得到芯片结果图片；

4 红外扫描法成像：用Infrare-Streptavidin代替

HRP-Streptavidin孵育膜芯片，清洗后直接用红

外扫描仪扫描即可得到芯片结果图片。


12


�玻片标准大小:25 mm x 75 mm

�玻片厚度:1 mm

�检测方向:芯片正面朝向光线和检测器

�扫描区域:22 mm x 73 mm

�对焦:自动对焦或可调(+/- 200 μm)

�激发光线:Cy3 (绿光) 532 nm通道

�分辨率:≤20 μm3

�动态范围:>10

�检测图片输出:16-bit TIFF格式图片

2 荧光扫描仪应具备的条件参数1 推荐的扫描仪

®�GenePix 4000A (Molecular Devices Corporation)

® � GenePix 4000B (Molecular Devices Corporation)

®� GenePix 4100A (Molecular Devices Corporation)

®� GenePix Professional 4200A (Molecular Devices Corporation)

®� ScanArray Lite (PerkinElmer, Inc.)

®� ScanArray Express (PerkinElmer, Inc.)

® �ScanArray Express HT (PerkinElmer, Inc.)

� LS Series Laser Scanner (Tecan Group AG)

� AlphaScan Microarray Scanner (Alpha Innotech)

�DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies*)

�The DNAscope LM (Biomedical Photometrics Inc.)

�The DNAscope IV & V (Biomedical Photometrics Inc.)

�Open Frame DNAscope (Biomedical Photometrics Inc.)

�Revolution 4200 Microarray Scanner (VIDAR Systems Co)

�aQuire 110V (Genetix)

�aQuire 240V (Genetix)

�VersArray ChipReader 5um System (Bio-Rad)�VersArray ChipReader 3um System (Bio-Rad)�InnoScan700 Microarray Scanner (Innopsys)

一般来说，大多数基因芯片扫描仪都可以使用，只要

具有一个Cy3标记（绿色）通道和≤20μm的像素分

辨率，并能够扫描标准大小的玻片即可。

九玻片芯片都有哪些仪器可以扫描结果？


13



143.多重PMT强度扫描玻片芯片：如果样品中不同细胞

因子的信号强度差距很大，例如用同一个PMT强度扫

描一张玻片（例如PMT=650 Genepix4000B,不同扫描

仪强度标准可能不同），如果某个细胞因子例如IL-6在

各样品中都已经达到信号强度饱和，可降低PMT强度

来扫描，使该因子信号处于直线检测范围内；如果某

个细胞因子例如MIG在各样品中信号都很弱(信号值可

能<200 or 500)可增加PMT强度来扫描，使得信号增

强。

4.玻片芯片数据提取注意事项：

1 提取信号数据，圈的直径可设置在 110-120um,且

全部信号都使用相同的直径圈读；

2 建议选用信号的Mdian值；

3 每个信号可扣除周边背景( local background)影

响；

4 如果信号点出现“蝌蚪小尾巴”可忽视其影响，正

常在正常信号位点上取值；

5 芯片上设置2-4个重复点，可去除明显的异常点后

进行数据分析；


1 对于玻片芯片如果当天做完实验，没时间扫描结

果，可将玻片离心甩干以后，放在试剂盒中配备的干

燥的30mL离心管中，拧好盖子，用铝箔纸将离心管包

裹起来避光，4度或者室温放置到第二天再扫描。扫描

后的玻片也可以按照同样的方法保存，-20度避光保存

的话可以存放1年以上，4度或者室温也可以存放半年以

上。

2 对于膜芯片加完检测试剂2min以后，要立即拍照或

者压片,检测试剂非常灵敏,但是时间持续比较短，一般

半个小时至一个小时信号就会消失。可以将膜芯片夹

在试剂盒配置的拍照用的塑料片中，避免折叠，将膜

芯片放置在-20度,可以存放几周至1个月,如果需要重新

显色拍照,可以将膜芯片拿出来以后放到洗液I里面浸泡

10min三次 ,洗液 II里面浸泡 5min两次 ,再加 HRP-

streptavidin浸泡 2小时,然后洗液 I里面浸泡 10min三

次,洗液II里面浸泡5min两次,重新加检测试剂2min后拍

照(按照说明书操作)。

干燥后放置在离心管将离心管用铝箔纸包裹放置到4度或者-20度冰箱

膜放置在拍照用的塑料片中将塑料片用保鲜膜包裹放置到4度或者-20度冰箱

十蛋白质芯片的结果可以保存吗？能保存多久？该如何保存？


15


1 玻片芯片的操作

芯片的操作与ELISA操作相似，首先加封闭液将芯片

封闭，抽去封闭液后加样品孵育，清洗，加二抗孵

育，清洗，加荧光剂，清洗后扫描即完成实验操作过

程。只是目前没有普及自动清洗系统，清洗步骤没有

ELISA自动洗板机那样方便，其余操作就和ELISA非

常相似。

A 玻片的干燥

B 样品的准备

将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡 20-

30min后,将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片

放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时,干燥不完全信

号点可能会产生小尾巴;

玻片芯片非常灵敏，吸附性很好，样品基质或者其

中的杂质非常容易引起玻片背景高，所以样品要首

先离心，最好是10000rpm 冷冻离心5min,将杂质沉

淀或者一些油脂层离心去掉，只抽取清亮的样品。

对于血清，要避免溶血，溶血的血清在玻片上会引起

很高的背景；

细胞培养上清，一般建议收集低血清培养基，可含有

0.2%的FCS, 当血清含量很高的时候，会产生高的背

景，且血清中的细胞因子影响细胞上清的结果，此时

建议含血清高的细胞培养上清可以稀释2-5倍。

由于玻片的强吸附性，细胞裂解液和组织裂解液在玻

片上最容易引起较高的背景，所以夹心法玻片芯片一

般推荐10-200µl总蛋白的细胞和组织裂解液，且要稀

释10倍以上。裂解液由于杂质多，但所含的细胞因子

浓度一般较低，所以一般建议裂解液总蛋白量100-

200ug, 样品4℃孵育过夜，且清洗时候要加长时间、

加强力度。但是不同样品类型裂解液，产生的影响不

同，很难规定一个蛋白量和稀释倍数来避免高背景，

对于特殊的样品，最好需要首先做个梯度稀释测定查

看背景。对于有些样品裂解液在玻片上很难避免高背

景。

十一蛋白质芯片操作复杂吗？有哪些注意事项？


16


D 玻片芯片拆框架和扫描

�不能触摸玻片的正面，因为玻片芯片非常灵敏，只能接

触玻片的边缘，将玻片两侧的搭扣边拆开后，从玻片芯

片的底部开始将框架和玻片分离，小心手不能接触到有

芯片的地方；

C 玻片芯片的孵育和清洗

�所有需要相互比较的样品，要在同一次相同条件的试验

中一起完成，如果样品量太大，无法一次操作完成时，

需要做一个参照样品，且尽量保持两次或者几次试验的

条件完全一致；

�操作实验时候，请戴上橡胶手套（不掉粉末），以免污

染试剂和玻片；

�样品和试剂加样过程中，保证样品和试剂快速的覆盖住

玻片，试验过程中不能使玻片干燥；

�孵育过程中避免产生气泡；

�孵育和初次样品清洗时避免附近孔的交叉污染，邻近孔

的液体避免溢出污染；

�玻片芯片的每次清洗都要将液体吸干净，不要残留在角

落，尤其是清洗样品的时候，一定要吸干净，否则残留

样品会引起高的背景，样品清洗步骤可以适当加长，比

如从10min加长到30min每次。


17


膜芯片的操作比Western Blot简单的多，不需要电

泳，转膜及其配胶配试剂等复杂的操作程序。操作

非常简单，首先加封闭液将芯片封闭，抽去封闭液

后加样品孵育，清洗，加二抗孵育，清洗，加HRP-

Streptavidin孵育，清洗加发光剂后拍照即完成实验

操作过程。膜芯片的操作比较难于自动化。

A 样品的准备

膜芯片的特殊材质PVDF或者NC膜使得样品基质或者杂

质对膜芯片的背景影响较小，但是样品也需要先离心，

最好是10000rpm 冷冻离心5min，将杂质沉淀或者一些

油脂层离心去掉，只抽取清亮的样品。对于一般的血清

血浆以及培养上清，膜芯片背景一般比较低，但是对于

裂解液，也要注意上样量，一般推荐100-200µl总蛋白

的细胞和组织裂解液，且要稀释10倍以上。裂解液由于

杂质多，但所含的细胞因子浓度一般较低，所以一般建

议裂解液总蛋白量100-200ug，样品4℃孵育过夜，但

是不同样品类型裂解液，产生的影响不同，很难规定一

个蛋白量和稀释倍数来避免高背景，对于特殊的样品，

最好需要首先做个梯度稀释测定看看背景。

2 膜芯片的操作


18


�在加发光剂的时候，要快速的将发光剂覆盖住整

个膜，且不断摇晃2min，保证发光剂覆盖均匀

（如果是胶片压片，保证发光剂浸到膜的每个角

落，且覆盖均匀）；

�所有一批试验的样品(或者一个组分的样品，这些

样品要在一起比较)要保证相同的曝光时间(最好

在同一张塑料片上同时拍照或者同一张胶片上一

起压片),不能一次完成，一定要保证同样的反应

时间和曝光时间。

C 膜芯片显色和拍照B 膜芯片的孵育和清洗

�所有需要相互比较的样品，要在同一次相同条件

的试验中一起完成，如果样品量太大，无法一次

操作完成时，需要做一个参照样品，且尽量保持

两次或者几次试验的条件完全一致；

�用镊子来进行膜的操作，用镊子夹住膜的边缘或

者用镊子托起膜，避免夹在膜上有抗体的地方，

膜比较脆，容易夹破，操作过程要保持轻柔；

�试验整个过程中膜芯片不能干燥；

�避免用手、枪头、或者任何尖锐的工具接触到

膜；样品或者试剂要将膜全部覆盖，孵育过程中

要将孵育盒的盖子盖上，可以使用塑料薄膜包住

孵育盒，避免灰尘和样品的蒸发；

�加样和孵育过程中避免气泡。

19



蛋白质芯片技术通常用于筛查疾病的生物标志物。在

许多蛋白质芯片实验中，研究者可能会得到成千上万

的数据点和几百种的潜在生物标志物，接下来的数据

分析是一个非常繁冗艰巨的任务，如何确定哪些是最

重要的生物标志物？如何建立正确诊断或疾病预测的

临界值( - ？如何从这些实验数据中挖掘更

多的信息？

目前国际上公认和受欢迎的研究生命科学的数据分析

方法是生物统计学与生物信息学处理方法，包括T检

验、方差分析、卡方检验、秩和检验等统计学分析，

以及深度的数据挖掘分析例如人工神经网络分析、系

统聚类分析、K-最邻近法、判别分析、分割点分数分

析等，这些数据分析方法都能帮助研究人员从大量数

据中提取出最有用的生物学信息，鉴定生物学意义，

且确定疾病（或生物标志物）的分子生物学特征等。

Cut off Value)

十二蛋白质芯片得到大量数据该如何处理？

20


RayBiotech的生物统计学与生物信息学服务平台

(BBP)都可以提供这些统计分析服务，快速识别潜在的

生物标志物，检测和提取误差和置信水平来评估蛋白表

达数据的质量。且可以协助试验设计、申报基金、探讨

生物标志物的生物学意义等。


1.芯片数据的归一化

RayBiotech 芯片设计几个控制点用于芯片间的归一

化：

1) Positive control:阳性控制点是生物素化的蛋白，可

用于归一化链霉亲和素孵育步骤，如果不同芯片上的

阳性控制点非常相似，用其来做归一化是非常简单及

有效的方法；

®2) Internal control:RayBio 抗体芯片也包含插入蛋白

作为内部控制点,内控蛋白不会和芯片上其他蛋白产生

交叉反应,IC 可以用于监控这个实验过程及用于样品之

间的归一化；

3) Negative control:阴性对照蛋白是BSA,一般来说，阴

性对照会有一个背景值,样品信号可扣除芯片背景得到

真实值。

2.芯片信号差异对比:

芯片上各因子的信号值，建议大于(Mean background

+2SD)的信号值为可信值；选取可信值进行数据分析

及对比,样品之间细胞因子信号比值≥2倍或者≤0.5倍

可视为有差异因子，也可根据实验要求设置其他阈

值；当样品量足够大时，可选择显著性差异分析及其

他判别分析、网络分析、聚类分析等。

21



十三 RayBiotech芯片常见疑问

一半定量和定量芯片的差异？

1 检测原理和载体的不同：

A 半定量芯片目前有夹心法和标记法半定量芯片，且载

体有膜的和玻片的。

半定量夹心法

玻片芯片半定量夹心法膜

芯片半定量标记法玻

片芯片半定量标记法膜

芯片

B 定量芯片目前只是采用夹心法，且载体只有玻片。

2 抗体阵列的数量：

定量芯片底部没有barcode(即白色的条码),且16个孔每

个孔都点有抗体阵列,而半定量芯片一般都是上半部分

8个孔点有抗体。

4 检测性能的差异：

半定量夹心法芯片和定量芯片检测原理都相同，唯一

的不同是定量芯片试剂盒中包含一个混合的标准品

（多种标准品混合在一起），如同ELISA一样将标准品

梯度稀释以后，在定量芯片上用8个孔检测梯度标准

品，其余8孔检测样品，试验操作完成后将标准品系列

中对应的每个因子的标准曲线画出来，与样品中每种

因子的信号值进行比对，完成定量。定量芯片就是多

重的ELISA,可以替代传统单一的ELISA。

半定量夹心法芯片与定量芯片试验操作完成后得到的

图像和从图像中提取的信号值都是相似的，但是半定

量芯片没有标准曲线，没有办法与标准曲线去比对得

到样品中因子的确切含量，但是半定量芯片的信号点

强弱及信号值可以表达出因子在样品中大致含量，

3 抗体重复点：

定量芯片每个点都是4个重复点，半定量芯片是2个重

复点。

22



以及可以比对样品之间因子含量是否有差异，得知因

子的大致含量以及不同样品之间的因子含量差异性及

比例，可以进一步选择合适的精确定量分析来验证。

二 Protein Array的原理？

蛋白芯片与其他抗体芯片系列不同的是蛋白芯片是将蛋

白多肽点在载体上的，而不是抗体。蛋白芯片主要是用

于检测蛋白-蛋白之间相互作用，蛋白-小分子相互作

用，抗体特异性和自身抗体的检测。

将蛋白点在载体上，有三种方式实现蛋白-蛋白相互作用

的检测：

(1)载体上的蛋白和样品中的游离蛋白结合，然后加入标

记的抗种属二抗（例如抗小鼠、抗大鼠、抗兔子、抗

人），最后通过化学发光或者荧光实现信号检测。

1 蛋白-蛋白相互作用：

蛋白-蛋白相互作用

样品中的蛋白

标记的二抗

（抗种属的二抗）

标签的抗体

生物素标记的蛋白

BB B

B

样品中融合蛋白

HRP/Fluor-链霉亲和素

B B B蛋白点在载体上实现信号检测

2 小分子-蛋白相互作用：

(1) 载体上的蛋白和样品中的游离小分子结合，然后加

入标记的抗小分子的抗体，最后通过化学发光或者荧光实现信号检测。

(2) 载体上的蛋白和样品中的与蛋白偶联的小分子结

合,通过抗蛋白的抗体实现信号检测。

(3) 载体上的蛋白和样品中标记的小分子结合,直接实现

小分子-蛋白相互作用

样品中小分子标记的抗小分子抗体

抗蛋白的抗体

标记的小分子

偶联蛋白的小分子

直接检测

蛋白点在载体上实现信号检测

23


(2) 载体上的蛋白和样品中的融合蛋白结合，融合蛋白

结合有tag, 通过抗tag的抗体实现信号检测。

(3) 载体上的蛋白和样品中生物素标记的蛋白结合，直

接通过HRP/Fluor-链霉亲和素实现信号检测。


抗体特异性和自身抗体的检测

标记的二抗（抗抗体）

标记的抗体

抗体

蛋白点在载体上实现信号检测

24


四芯片定制的流程是什么，定制芯片的价格如何？

3 抗体特异性和自身抗体的检测

(1) 载体上的蛋白和样品中的自身抗体结合，然后加入

标记二抗(抗抗体)，最后通过化学发光或者荧光实现信

号检测。

(2) 载体上的蛋白和样品中标记的抗体结合，直接实现

信号检测。

如果客户需要定制芯片，我们需要先问客户的信息是:

(1) 样品种属、样品类型、样品数量；

(2) 感兴趣的因子列表；

(3) 需要定制的芯片是定量芯片、夹心法的半定量芯

片、还是标记法半定量芯片；

如果客户想要定制定量芯片或夹心法半定量芯片，一般

就是只能选择现有的定制列表中的因子，且需要咨询技

术支持来核对这些因子是否没有交叉反应，能放在一张

芯片上。如果客户非常想要加上1、2个不在列表中的因

子，这时候首先需要和科学家确定是否能够加上。

如果客户想要定制标记法半定量芯片，是可以添加不在

RayBiotech定制的列表中的因子，也是需要科学家进行

确定是否可以添加。


一般定量芯片试剂盒的规格有1张，2张，4张玻片的规

格；1张玻片上可以做8个孔的标准曲线，其余8孔可以检

测样品；对于2张玻片，可以每张玻片都做标准曲线，

这样2张玻片就可以检测16个样品；或者2张玻片同时操

作，保持所有条件一致，可以在第一张玻片上只做一个

标准曲线，从第二张玻片上每张玻片上做一个空白

control和一个阳性质控(可选用standard3)其余孔可以用于检

测样品。

动态范围简单的理解就是能检测到的最大信号和最小信

号的范围。动态范围越大，所能检测的信号层次就越

4 5多。玻片芯片的动态范围比较大，可达到10 -10 , 也就

是说玻片芯片可能检测到的差异信号会相对多，且信号

值的差异会在数值上体现的较大；膜的动态范围相对较

3小，可以达到10 , 膜芯片上检测到的信号值差异在数值

上体现的较小。

基于细胞的磷酸化ELISA是将细胞在培养板上培养、刺

激、固定、通透，然后加入抗体来检测细胞内的蛋白磷

酸化水平，这种检测是半定量，不需要裂解细胞，但是

实验做完后细胞不能再使用了。Cell-based ELISA试剂

盒可以同时检测细胞对不同刺激的反应（如激活剂或者

抑制剂）；

不需要提取蛋白、WB或者体外激酶测试；检测比较精

确，因为避免了许多蛋白失活；大部分试剂盒可以同时

用于检测人类、小鼠和大鼠细胞系。

五动态范围是什么意思？

六定量芯片试剂盒中玻片的数量，规格，

可以检测几个样品？

七基于细胞的磷酸化 Cell-based)ELISA试

剂盒不需要裂解细胞，做完实验后细胞还能继

续使用吗？

(


25

同样对于4张玻片，可以检测的样品是32-52个样品。

当样品量很大的时候，建议做多个标准曲线，然后将所

有的标准曲线取平均值后一般都会得到非常好的曲线，

用这个平均的标准曲线来进行所有样品的定量。



27

高浓度

低浓度


26


样品 1 样品 2

样品1 样品2

十四蛋白质芯片的实物图


28


十五使用RayBiotech芯片产品部分参考文献

RayBiotech产品货号产品名称检测指标数样品类型文献影响因子

AAH-CYT-G4000 RayBio® Human Cytokine Array G4000 274 细胞上清

Ravid Straussman, Teppei Morikawa, Kevin Shee,et

al.Tumourmicro-environment elicits innate resistance to RAFinhibitors through HGF secretion.Nature (2012)doi:10.1038/nature11183

36.28

AAM-CYT-6 RayBio® Mouse Cytokine Array 6 97 血清Julia M. Ruckh et al.Rejuvenation of Regeneration in theAging Central Nervous System.Cell Stem Cell 10, 96–103,January 6, 2012

25.421

AAH-CYT-3,4,5 RayBio® Human Cytokine Array 3,4,5 158 细胞上清

Philip Owensa, Michael W. Pickupa, Sergey V,et al.Disruptionof bone morphogenet ic protein receptor 2 (BMPR2) in

mammary tumors promotes metastases through cellautonomous and paracrine mediators.PNAS February 21,2012 vol. 109 no. 8 2814-2819

9.681

AAH-BLM-1 RayBio® Label-based Human Antibody Array 1 507 细胞上清

Scheel C,Eaton EN,Li SH,Chaffer CL,Reinhardt F,etal.Paracrine and autocrine signals induce and maintain

mesenchymal and stem cell states in the breast.Cell 2011Jun 10;145(6):926-40

32.403

AAH-CYT-G2000 RayBio® Human Cytokine Array G2000 174 细胞上清

Sara Botto, Daniel N. Streblow, Victor DeFilippis,et al.IL-6 inhuman cytomegalovirus secretome promotes angiogenesisand survival of endothelial cells through the stimulat ion ofsurvivin.Blood January 6, 2011 vol. 117 no. 1 352-361

9.898

AAH-PRTK-1 RayBio® Human RTK Phosphorylation Array 1 71 细胞裂解液

Marisa C. Eisenberga, Yangjin Kimb et al.Mechanisticmodeling of the effectsof myoferlin on tumor cell invas ion.PNAS December 13, 2011vol. 108 no. 50 20078-20083

9.681

AAH-ANG-1000 RayBio® Human Angiogenesis Array C1000 43 血小板释放物

Elisabeth M. Battinelli, Beth A，et al.Release of angiogenesisregulatory proteins from platelet alpha granules:modulation ofphysiologic and pathologic angiogenesis.Blood August 4,2011 vol. 118 no. 5 1359-1369

9.898



29

RayBiotech产品货号产品名称检测指标数样品类型文献影响因子

AAH-CYT-1000 RayBio® Human Cytokine Array C1000 120 细胞上清Shoshana Greenberger, M.D., Ph.D,et al.CorticosteroidSuppression of VEGF-A in Infantile Hemangioma-DerivedStem Cells.N Engl J Med 2010;362:1005-13.

53.298

AAH-BLM-1 RayBio® Label-based Human Antibody Array 1 507 血清S. Ang, W. Wang, Y. Soe, C. Tan,et al. Ident if ication of threepotential biomarkers in early resectable hepatocellular

carcinoma. J Clin Oncol. May 2010 vol. 28.no. 1518.372

AAH-CYT-5,9,10 RayBio® Human Cytokine Array 5,9,10 180 细胞上清Mi-Young Kim,1 Thordur Oskarsson,1 Swarnali Acharyya,etal.Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.Cell 139,1315–1326, December 24, 2009

32.403

AAH-GF-1&AAH-PER-1RayBio® Human Growth Factor Array 1 RayBio

® Human EGFR Phosphorylation Array 141&17 细胞裂解液

Zhang J., Ji J., Yu M., Overholtzer M., Smolen G. A., WangR., Brugge J. S., Dyson N.J . and Haber D. A. YAP-dependentinduction of amphiregulin identifies a non-cell autonomous

component of the Hippo pathway. Nature Cell Biol, 11 (12):1444-50, 2009

19.488

QAH-INF-1 Quantibody® Human Inflammation Array 1 10 细胞裂解物

Yuxin Zhai, Zhenping Zhong, Chyi-Ying A. Chen,etal.Coordinated Changes in mRNA Turnover, Translat ion, and

RNA Processing Bodies in Bronchial Epithelial Cells followingInflammatory St imulation.Mol Cell Biol.2008;28(24):7414-7426.

6.057

AAH-CYT-2000 RayBio® Human Cytokine Array C2000 174 细胞上清

S. H. Jafri, J. Glass, R. Shi and H. Kleiner.Evaluation ofthymoquinone (TQ) as an antiproliferative, proapoptot ic, and

immunomodulatory agent in a non-small cell lung cancer cell(NSCLC) line.J Clin Oncol.May 2009 vol. 27 no. 15S e14644

18.372

AAM-CYT-G1000 RayBio® Mouse Cytokine Array G1000 96 脑组织裂解物

Vanessa Brochard, Béhazine Combadière，et al. Inf iltration ofCD4+ lymphocytes into the braincontributes to neurodegeneration in a mousemodel of Parkinson disease.J. Clin. Invest. 119:182–192(2009).

15.387

AAH-CYT-5 RayBio® Human Cytokine Array 5 80 细胞上清Juan C. Acosta, Ana O’Loghlen et al.ChemokineSignaling viatheCXCR2ReceptorReinforces Senescence.Cell 133, 1006–1018, June 13, 2008

32.403

AAH-CYT-1000 RayBio® Human Cytokine Array C1000 120 血浆Sandip Ray, Markus Britschgi,et al.Classification and

prediction of clinical Alzheimer’s diagnos is based on plasmasignaling proteins.Nature Med.2007;13(11):1359-1362

27.136


30


十六 RayBiotech芯片新技术介绍

（一）、RayBio® Peptoid Array 拟肽芯片

近20年来，肽被认为是一种很有前途的一类药物，但

是在实践中，大多数肽类药物也遇到很多困难，例如容易

水解，在体内的半衰期相对较短；口服和组织的生物利用

度低；为了克服这些缺陷，研究人员研究许多潜在的肽的

模拟物，发现了一些最有前途的肽类化合物---拟肽。

拟肽可以代替许多肽的性质，但有明显的优势：拟肽

具有较长的半衰期；抗水解，优于肽渗透细胞膜，生物利

用度更好；拟肽比同长度的肽有更多数量构象可以提高灵

敏度。

拟态和肽的结构区别

拟态芯片的原理（见第23页蛋白芯片原理）：



31

拟态芯片检测的样品种属不受限制；

拟态检测种类远远多于蛋白芯片，目前库存可筛选5600个不同拟态；

拟态芯片检测原理与蛋白芯片检测原理相同；

拟态芯片检测后需要测定目标拟态序列；

拟态定制芯片更为灵活，且可定制的种类可更加多；

拟态芯片 vs 蛋白芯片（抗原芯片）


• 每个peptoid两个重复点；

• 可以检测人、小鼠、大鼠和其他物种样品；

• 灵活定制，我们有强大的拟肽库供您定制，通过选择

氨基酸种类、选择长度、取代基可以定制出您所需的

拟态芯片。

（二）、竞争法抗体芯片

Human/Mouse/Rat Obesity Array E1（EAA-ADI-E1）

Human/Mouse/Rat Quantitative Obesity Array E1 （QEA-ADI-E1）32


检测原理

竞争性抑制：目标分子的浓度与信号值反比例关系

灵敏度高：使用多肽做定量标准曲线

种属灵活性：人、小鼠、大鼠等都可以检测

代表图示


RayBiotech,Inc.

广州瑞博奥生物科技有限公司

广州华南生物芯片研究中心

欢迎访问

www.raybiotech.com

400-008-5918

[email protected]

蛋白质芯片技术手册 - raybiotech.cn · 使用raybiotech芯片产品部分参考文献...

Documents