耐熱性モロニーマウス白血病ウイルス 逆転写酵素の …97.2 66.4 44.3 29.0 wt...
TRANSCRIPT
1
京都大学大学院農学研究科
食品生物科学専攻
准教授 保川 清
耐熱性モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素の作製とその応用
2
DNA 合成酵素(DNA polymerase)
RNA
DNA primer
DNA依存性 DNA 合成酵素(DNA polymerase)
RNA依存性 DNA 合成酵素(Reverse transcriptase, 逆転写酵素)
DNA
DNA primer
逆転写酵素はRNAを鋳型としてDNAを合成する。
3
逆転写活性
逆転写酵素がもつ2つの活性
RNA
DNA
RNase H活性
RNA-DNA ヘテロ二本鎖
DNA primer
逆転写酵素は逆転写活性と RNase H活性をもつ。
4
逆転写酵素の活性部位
Palm
Fingers
RNase H
Connection
Thumb
逆転写活性の活性部位
RNase H 活性の活性部位
5
・in vitroでのDNA合成に利用された。・耐熱性酵素が好熱菌で発見された。
DNA 合成酵素(DNA polymerase)の歴史
1950年
1960年
1970年
1980年
1990年
2000年
・RNAウイルスで発見された。
・PCRが開発された。
・大腸菌で発見された。
・RNA増幅法が開発された。
・in vitroでのcDNA合成に利用された。
DNA依存性 DNA合成酵素(DNA ポリメラーゼ)
RNA依存性 DNA 合成酵素(Reverse transcriptase, 逆転写酵素)
耐熱性の逆転写酵素は発見されていない。
6
RNA増幅法
逆転写酵素
RNAポリメラーゼ
PCR
DNAポリメラーゼ
標的DNA標的DNA 標的RNA
RNA分解
標的RNA
RNA分解
95℃
72℃
40℃
7
モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(MMLV RT)
トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(AMV RT)
モノマー α, βヘテロダイマー
NH2
NH2
COOH
COOH
α
β
NH2 COOH
Palm
Fingers
RNase H
Connection
Thumb
実用化されている逆転写酵素
MMLV RTとAMV RTが分子生物学的研究や臨床診断に実用化されている。
Pal
mFi
nger
s
RN
ase
HC
onne
ctio
nTh
umb
Inte
gras
e
8
高温ではRNAは二次構造をとらない。しかし、逆転写酵素の熱安定性が低いため高温で反応できない。したがって、逆転写酵素の熱安定化が望まれる。
ATGCGCAT
RNAの二次構造
TACGCGTA
AMV RT
MMLV RT
10分間の熱処理で活性が50%に低下する温度 (T50 )
47°C
44°C
K. Yasukawa et al. J. Biochem. (2008) 143, 261-268
RNAの二次構造と逆転写反応
×cDNA合成反応が止まる
9
タンパク質工学によるタンパク質の熱安定化
T4ファージ リゾチ-ム
W. A. Basse et al. (2010)Protein Sci.19,631-641
サーモライシン
K. Yasukawa and K. Inouye (2007) Biochim. Biophys. Acta1774, 1281-1288
あらゆる残基に変異が導入された。熱安定性をあげる変異はわずかでその効果も小さい。しかし、変異を組み合わせると効果が大きくなる。
変異(S-S結合導入、静電結合導入、疎水性コアの高密度化)を組み合わせると、熱安定性が大きく向上した。(逆転写酵素はこれらの方法では熱安定化されなかった。)
10
AMV RT
MMLV RT
鋳型プライマー非存在下 鋳型プライマー存在下
47°C
44°C
逆転写酵素の熱安定性
52°C
47°C
(+5ºC)
(+3ºC)
T50
鋳型プライマーはAMV RTとMMLV RTの熱安定性を向上させた。このことから、逆転写酵素の熱安定性は、鋳型プライマーとの結合が強くなれば向上すると考えた。
K. Yasukawa et al. J. Biochem. (2008) 143, 261-268T50 :10分間の熱処理で活性が50%に低下する温度
11
O
O
P
Base
O O O
OH
O
PO
O
Base
O
OH
–
O–
O
Base
O
OHO
OH
O
PBase
OOO–
O
O
PBase
OOO–
DNA
RNA 鋳型プライマー
鋳型プライマーはリン酸基をもつため負電荷を帯びている。
DNA RNA
12
部位特異的変異によるMMLV RTの熱安定化
MMLV RTの鋳型プライマーとの結合部位に正電荷を導入すると、鋳型プライマーとより強く結合し、熱安定性が向上すると考えた。
MMLV RT MMLV RT
鋳型プライマー
13
D108
E117D114
Q84
E123
D124
E302
E286
W313
L435
E69
D108
E117D114
Q84
E123
D124
E302
E286
W313
N454L435
鋳型プライマーと相互作用する部位に位置する12アミノ酸残基がそれぞれリシン(K)、アルギニン(R)、アラニン(A)に置換された合計36種の変異型MMLV RTを作製した。
変異を導入したアミノ酸残基
アミノ酸残基の略称
E:グルタミン酸D:アスパラギン酸Q:グルタミンW:トリプトファンL:ロイシンN:アスパラギン
14
E69A, E69K, E69R,Q84A, Q84K, Q84R,D108A, D108K, D108R,D114A, D114K, D114R,E117A, E117K, E117R,E123A, E123K, E123R,D124A, D124K, D124R,E286A, E286K, E286R,E302A, E302K, E302R,W313A, W313K, W313R,N454A, N454K, N454R,L435A, L435K, L435R,D524A
作製した変異型MMLV RT
Palm
Fingers
RNase H
Connection
Thumb
D524は524番目のアスパラギン酸残基。RNase H活性に必須。この残基に変異が導入されると、
RNase H活性が消失するとともに、熱安定性が向上することが知られている。
15
変異型酵素の逆転写活性
0
2
4
6
8
WT
D52
4AE6
9AE6
9KE6
9RQ
84A
Q84
KQ
84R
D10
8AD
108K
D10
8RD
114A
D11
4KD
114R
E117
AE1
17K
E117
RE1
23A
E123
KE1
23R
D12
4AD
124K
D12
4RE2
86A
E286
KE2
86R
E302
AE3
02K
E302
RW
313A
W31
3KW
313R
L435
AL4
35K
L435
RN
454A
N45
4KN
454R
比活性x 10-4(units/mg)
ほとんどの変異型酵素が野性型酵素(WT)と同じ活性を有した。
16
変異型酵素の熱安定性
24種の変異型酵素が野性型酵素(WT)より高い熱安定性を有した。さらに、6種の変異型酵素がD524Aより高い熱安定性を有した。
0
5
10
15
20
25
1
WTD524AE69AE69KE69RQ84AQ84KQ84RD108AD108KD108RE114AE114KE114RE117AE117KE117RE123AE123KE123RD124AD124KD124RE286AE286KE286RE302AE302KE302RW313AW313KW313RL435AL435KL435RN454AN454KN454R
WT
D52
4AE6
9AE6
9KE6
9RQ
84A
Q84
KQ
84R
D10
8AD
108K
D10
8RE1
14A
E114
KE1
14R
E117
AE1
17K
E117
RE1
23A
E123
KE1
23R
D12
4AD
124K
D12
4RE2
86A
E286
KE2
86R
E302
AE3
02K
E302
RW
313A
W31
3KW
313R
L435
AL4
35K
L435
RN
454A
N45
4KN
454R
25
0
10
5
20
15
熱処理後の残存活性(%)
17
多重変異による熱安定化
0
5
10
15
20
25
1
WTD524AE69AE69KE69RQ84AQ84KQ84RD108AD108KD108RE114AE114KE114RE117AE117KE117RE123AE123KE123RD124AD124KD124RE286AE286KE286RE302AE302KE302RW313AW313KW313RL435AL435KL435RN454AN454KN454R
WT
D52
4AE6
9AE6
9KE6
9RQ
84A
Q84
KQ
84R
D10
8AD
108K
D10
8RE1
14A
E114
KE1
14R
E117
AE1
17K
E117
RE1
23A
E123
KE1
23R
D12
4AD
124K
D12
4RE2
86A
E286
KE2
86R
E302
AE3
02K
E302
RW
313A
W31
3KW
313R
L435
AL4
35K
L435
RN
454A
N45
4KN
454R
25
0
10
5
20
15
熱処理後の残存活性(%)
•WT(野性型酵素)•D524A•MM3:E286R/E302K/L435R•MM4:E286R/E302K/L435R/D524A
Mar
ker
kDa
97.266.4
44.3
29.0
WT
D52
4AM
M3
MM
4
熱安定性を向上させる変異を組み合わせ、MM3とMM4を作製した。
精製した酵素の電気泳動
18
0
20
40
60
80
100
120
WT、D524A、MM3、MM4の活性と熱安定性
MM3とMM4はWTに比べ顕著に高い熱安定性を有した。
(WTの比活性を100%としたときの相対活性)
活性 熱安定性
(熱処理前の活性を100%とした時の相対活性)
相対活性(%)
相対活性(%)
D524A
WT
MM3
MM4
D524A
WT
MM3
MM4
0
20
40
60
80
100
120
1.414
63
102
19
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25
反応初速度の鋳型プライマー濃度依存性
MM3とMM4のKm(ミカエリス定数)は野性型酵素(WT)の30-40%であった。したがって、MM3とMM4の鋳型プライマーとの親和性はWTよりも高いと考えられる。
鋳型プライマー (μM)
初速度(nMs-1)
Km kcat kcat/Km(μM) (s-1) (μM-1 s-1)
WT 8.4 ± 2.0 (1.0) 13.0 ± 1.2 (1.0) 1.5 ± 0.2 (1.0)
D524A 5.2 ± 1.2 (0.6) 9.2 ± 0.7 (0.7) 1.8 ± 0.3 (1.2)
2.2 ± 1.1 (0.3) 5.6 ± 0.6 (0.4) 2.5 ± 1.1 (1.7)3.3 ± 0.7 (0.4) 6.6 ± 0.4 (0.5) 2.0 ± 0.3 (1.3)
MM3MM4
○:WT、△:D524A、 ●:MM3、▲:MM4
カッコ内の数値はWTを100%としたときの相対値
Km:ミカエリス定数。値が小さいほど、鋳型プライマーとの親和性が強いことを示す。kcat:分子活性。基質が十分存在するときの酵素の活性を示す。
20
熱失活
2
3
4
5
0 5 10 15
ln[相対活性
(%)]
熱処理時間 (分)
48ºC
2
3
4
5
0 5 10 15
50ºC 52ºC
2
3
4
5
0 5 10 15
100%
33%
10%
熱処理時間 (分) 熱処理時間 (分)
2
3
4
5
0 5 10 15
2
3
4
5
0 5 10 15
54ºC 56ºC 58ºC
2
3
4
5
0 5 10 15
ln[相対活性
(%)]
熱処理時間 (分) 熱処理時間 (分) 熱処理時間 (分)
100%
33%
10%
○:WT、△:D524A、 ●:MM3、▲:MM4
熱安定性はMM4>MM3>D524A>WTであった。
21
熱失活(アレニウスプロット)
MM4
熱安定性はMM4>MM3>D524A>WTであった。
ln[kobs(s-1)]
1/T x 103 (K-1)
温度 (⁰C)
58 56 54 52 50 48
-9
-8
-7
-6
-5
-4
3.02 3.04 3.06 3.08 3.10 3.12
T50 (℃) Ea (kJ mol-1)
WT 45.1 ± 4.2 241 ± 46
D524A 47.5 ± 1.1 279 ± 15
54.2 ± 3.1 298 ± 42
55.9 ± 1.5 322 ± 22
MM3MM4
T50 (℃) Ea (kJ mol-1)
WT 45.1 ± 4.2 241 ± 46
D524A 47.5 ± 1.1 279 ± 15
54.2 ± 3.1 298 ± 42
55.9 ± 1.5 322 ± 22
MM3MM4
T50 :10分間の熱処理で活性が50%減少する温度
Ea :熱失活における活性化エネルギー
WT
D524AMM3
kobs:熱失活の速度定数。この値が大きいほど熱失活が速いことを意味する。
22
cDNA合成活性の測定
cDNA合成: 27 pg/ml RNA、1 mg/ml E. coli RNA、0.2 mM プライマー、200 mM(each) dNTP、25 mM Tris-HCl (pH 8.3)、50 mM KCl、2 mM DTT、5 mM MgCl2、5 nM AMV RT or 15 nM MMLV RT、 46-64℃ 30分間
5’ 3’
PCR: 95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 60秒、30サイクル
3’ 5’
2%アガロース電気泳動
RNA:インビトロ転写で合成したcesA RNA(Bacillus cereusの毒素合成遺伝子のmRNAの一部、1014 塩基) をモデルRNAとして使用
RNA5’ 3’ 5’
GATGCACGACAATGCCACTAACGCTGTGGCGAGTGTTAAGGTGT
3’
K. Yasukawa et al. (2010) Enz. Microb. Technol. 46, 391-396K. Yasukawa et al (2010) Biosci. Biotechnol. Biochem. in press
23
cDNA合成活性の反応温度依存性
WT
D524A
MM4
44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64
[E]o = 5 nM温度(℃)
MM3とMM4を用いることにより、WTよりも高温でcDNAが合成できた。
MM3
24
従来の高性能MMLV RT
製品名 開発企業
AffinityScript RT Agilent Technologies/Stratagene
SuperScript II RT Life Technologies
SuperScript III RT Life Technologies
25
高性能MMLV RT
耐熱化の方法/忠実化の方法 変異の内容
M5 WTへのランダム変異による耐熱化 E69K/E302R/W313F/L435G/N454K
M6 M5のRNase H活性消失による耐熱化 E69K/E302R/W313F/L435G/N454K/D524N
Mut2 RNase H活性消失による耐熱化 D524G/E562Q/D583N
Mut3 Mut2への変異による忠実化 不明
MM3 正電荷導入による耐熱化 E286R/E302K/L435R
MM4 MM3のRNase H活性消失による耐熱化 E286R/E302K/L435R/D524A
製品名 学術論文*での名称
AffinityScript RT M5, M6
SuperScript II RT Mut2
SuperScript III RT Mut3
*Arezi et al. (2010) Anal. Biochem. 400, 301-303
26
各MMLV RTの比較•耐熱性: MM4 > MM3, M6 > M5
•忠実度: 不明 (WTの読み間違いは30,000回に1回)
•RNA増幅法(RNase H活性が必須)への使用:可: MM3, M5不可: MM4, M6, Mut2, Mut3
0
20
40
60
80
100
120
WT D524A NM4 NM5 MM3 MM4
残存活性(%)
120
0
60
40
100
80
20残存活性(%)
WT D524A MM3 MM4 M5 M6
50℃で15分間熱処理したときの残存活性
TP-
TP+製品名 学術論文での名称
AffinityScript RT M5, M6
SuperScript II RT Mut2
SuperScript III RT Mut3
27
実用化に向けた課題
• MM3、MM4の性能評価• cDNA合成反応の忠実度• cDNA合成反応の至適温度•有機溶媒による阻害•鋳型プライマーとの親和力•生産性•保存安定性
•新たな耐熱性MMLV RTの取得
28
想定される用途・業界
• 酵素メーカー:
耐熱性MMLV RTを生産し販売する。
• 診断薬メーカー:
耐熱性MMLV RTを使用した検査薬を開発・販売する。
企業への期待
•開発: MM3、MM4の性能評価、販売
•共同研究:•新たな耐熱型MMLV RTの取得•他の核酸関連酵素の耐熱化
29
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 :変異型逆転写酵素、それをコードす
る核酸、変異型逆転写酵素の製造
方法、核酸関連酵素の熱安定性の
向上方法、逆転写方法、逆転写反
応キットおよび検査キット
• 出願番号 :特願2010-●●●●• 出願人 :京都大学
• 発明者 :保川 清
30
産学連携の経歴
• 2007年-2008年 JSTシーズ発掘試験に採択
お問い合わせ先
関西TLO株式会社
アソシエイト 橋本 和彦
TEL 075-753-9150
FAX 075-753-9169
e-mail [email protected]