EE - EP 1 417 305 B1

KIRJELDUS

[0001] Käesolev leiutis käsitleb nukleiinhappe molekuli, mis sisaldab või koosneb soole

laktaas-florisiini hüdrolaasi (LPH) geeni 5'-osa(st), mis aitab kaasa või viitab täiskasvanu

tüüpi hüpolaktaasiale, kusjuures nimetatud nukleiinhappe molekuli iseloomustatakse lisatud

patendinõudluses. Käesolev leiutis käsitleb ka täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia esinemise või

eelsoodumuse testimise meetodeid, mis põhinevad eespool nimetatud nukleiinhappe mole-

kulis sisalduva SNP analüüsil. Lisaks käsitleb käesolev leiutis diagnostilist kompositsiooni ja

komplekti, mis on kasulikud täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia esinemise või eelsoodumuse

tuvastamiseks.

[0002] Laktaas-florisiini hüdrolaasi ensüüm (LPH), mida ekspresseeritakse ainult soole epi-

teelirakkudes, hüdrolüüsib laktoosi, mis on piimasuhkur, glükoosiks ja galaktoosiks1. LPH

ensüümi ekspressioon väheneb imetajatel järsult väga madalate tasemeteni võõrutusperioodil,

kui laktoos ei ole enam oluliseks osaks toidust. Inimestel mõjutab seisund, mis on tuntud kui

täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia või laktaasi mittepüsivus (lactase non-persistence), enamust

populatsioonidest ja piirab laktoositalumatuse tõttu täiskasvanute hulgas oluliselt rõõsa piima

kasutamist. Vanus laktaasipuudulikkuse seisundi ilmnemisel (onset) varieerub populatsioo-

niti, ulatudes 1-2 aastastest tailaste hulgas kuni 10-20 aastasteni soomlaste hulgas2-3. Kuid

Põhja-Euroopas ja mõnedel teistel väikestel etnilistel rühmadel püsib LPH aktiivsus ena-

musel täiskasvanutest kogu elu, sellist seisundit nimetatakse laktaasi püsivuseks (lactase

persistence). On näidatud, et laktaasi püsivuse/mittepüsivuse fenotüüp on geneetiliselt määra-

tud, püsiv seisund on mittepüsiva seisundi suhtes domineeriv4-6.

[0003] Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia nüüdisaegse diagnoos põhineb laktoositaluvuse

testil (LTT). Hommikul manustatakse tühja kõhuga (söömisest on möödunud 10 tundi)

1 g/kg kehamassi kohta laktoosi 12,5% lahusena, maksimaalseks annuseks on 50 g. Enne

ning 20 ja 30 min pärast laktoosi manustamist võetakse kapillaarvere proov. Glükoosi kont-

sentratsioon määratakse glükoosi oksüdaasi meetodil (Hjelm, de Verdier, 1963). LTT päeval

märgitakse seedetraktiga seotud sümptomid. Märgiks laktoosi imendumishäirest võeti glü-

koosi kontsentratsiooni maksimaalne tõus veres 1,1 mmol/l või enam (Gudman-Hoyer,

Hamum, 1968, Jussila, 1970, Sahi, 1972). LTT sisaldab valepositiivseks ja valenegatiivseks

diagnoosiks10% riski, st LTT tundlikkus ja spetsiifilisus on umbes 90% (Isokoski et al.,

1972, Newcomer et al., 1975, Sahi, 1983).

EE – EP 1 417 305 B1

2

LTT täpsust saab parandada, andes 0,3 g/kg kehamassi kohta etanooli, mis inhibeerib maksas

galaktoosi metabolismi (Tygstrup, Lundqvist, 1962), ning 15 min hiljem 1 g/kg kehamassi

kohta laktoosi 12,5% lahusena.

[0004] Lapsed, kelle esmase või korduva LTT maksimaalne tõus on alla 0,2 mg / 100 ml,

saadeti peensoolebiopsiale, mis võetakse gastroskoopia teel. See on invasiivne protseduur,

mis nõuab kogemusi ja mida tehakse tavaliselt ülikooli haiglates ainult gastroenteroloogia

spetsialistide poolt. Biopsiaproove uuritakse stereomikroskoobiga (dissection microscope) ja

histoloogiliselt ning määratakse limaskesta maltaasi, sahharaasi ja laktaasi aktiivsus

(Launiala et al., 1964). On näidatud, et hüpolaktaasia diagnoos lastel on õigustatud, kui

soolestikubiopsia histoloogia on normaalne ja laktaasi aktiivsus on väiksem kui 20 U/g valku

ning laktaasi/sahharaasi suhe on väiksem kui 0,30 või etanooli manustamisega LTT puhul on

vere glükoosi kontsentratsiooni maksimaalne tõus alla 20 mg / 100 ml ja galaktoosi kont-

sentratsiooni maksimaalne tõus 5 mg / 100 ml või väiksem (Sahi et al., 1972). Nagu eespool

on kirjeldatud, on praegused täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia diagnoosimise meetodid tööma-

hukad. LTT on ebatäpne ja seetõttu invasiivne protseduur, enne diagnoosi kindlakstegemist

on vaja gastroskoopiat. Kuna täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia on väga levinud ja mittespet-

siifiliste seedetraktisümptomite peamiseks põhjuseks (üks kolmandik patsientidest kaebab

kõhuvalu), esineb selge vajadus parandada selle levinud terviseprobleemi diagnostikat.

[0005] Ent siiani pole välja töötatud biokeemilist testi, mida on lihtne käsitseda ning mis

samal ajal tagab kiired ja täpsed tulemused. Haiguse põhjuse selgitamine genoomse DNA /

ekspressiooni tasemel pole samamoodi soovitud tulemust andnud. Seega pole LPH geeni

kodeerivate piirkondade ja promootorpiirkondade sekveneerimine täiskasvanutel näidanud

DNA muutusi, mis on korrelatsioonis laktaasi püsivuse/mittepüsivusega, samuti puuduvad

tõendid selle tunnusega seotud splaissimise variantidest või mRNA järjestuse redigeerimise

(mRNA editing) variantidest7-8. Varasemates uuringutes on näidatud, et laktaasi püsivuse/mit-

tepüsivuse tunnust kontrollib (kontrollivad) tõenäoliselt laktaasi geeni sees või vahetus lähe-

duses asuv(ad) cis-asendis toimiv(ad) element (elemendid) ning üle kogu 70 kB suuruse

haplotüübi, mis hõlmab laktaasi geeni, on täheldatud tugevat ahelduse tasakaalustamatust

(LD)9,10. Mitmed uuringud teatavad tõendist, et LPH geeni ekspressiooni peamine kontroll

toimub transkriptsiooni regulatsiooni tasemel11-13. Samas on oletatud, et muutus, mis mõjutab

LPH geeni ekspressiooni nii transkriptsioonilist kui ka posttranskriptsioonilist kontrolli, võib

olla seotud täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia põhjusega14-15.

EE – EP 1 417 305 B1

3

[0006] Pidades silmas eespool toodut, oli käesoleva leiutise aluseks olevaks tehniliseks

probleemiks pakkuda vahendeid ja meetodeid, mis võimaldavad täiskasvanu tüüpi hüpolak-

taasia või selle haiguse eelsoodumuse täpset ja käepärast diagnoosi.

[0007] Nimetatud tehnilise probleemi lahendus on saavutatud teostuste kaudu, mida ise-

loomustatakse patendinõudluses.

[0008] Seega käsitleb käesolev leiutis nukleiinhappe molekuli, mis sisaldab või koosneb

soole laktaas-florisiini hüdrolaasi (LPH) geeni 5'-osa(st), mis aitab kaasa või viitab täiskas-

vanu tüüpi hüpolaktaasiale, milles nimetatud nukleiinhappe molekuli iseloomustatakse lisa-

tud patendinõudluses.

[0009] Leiutise kohaselt tähistab mõiste "soole laktaas-florisiini hüdrolaasi (LPH) geen"

geeni, mis kodeerib ensüümi, millel on laktoosi hüdrolüüsimise aktiivsus selle komponen-

tideks glükoosiks ja galaktoosiks. Ensüümi iseloomustab kood E.C. 3.2.1.23.62.

[0010] Termin "täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia" viitab seisundile, mis on tuntud ka kui

laktoositalumatus, mis on autosoomne retsessiivne seisund, mis tuleneb laktaas-florisiini

hüdrolaasi (LPH) ensüümiaktiivsuse "füsioloogilisest" langusest soolerakkudes olulisel osal

maailma elanikkonnast.

[0011] Termin "aitab kaasa või viitab täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale" viitab faktile, et

leitud SNP-d ja seega vastava nukleiinhappe molekulid osundavad seisundile ja võimalik, et

on seetõttu ka selle põhjuseks. Seega see mõiste ei nõua tingimata, et nimetatud 5'-positsioon

viitaks seisundile. Teisalt ei tähenda nimetatud termin tingimata, et 5'-osa on põhjuslik või

aitab kaasa seisundi tekkimisele. Seega, nimetatud termin ei välista kas ühe või mõlema SNP

põhjustavat või soodustavat rolli.

[0012] Termin "mis hübridiseerub rangetes tingimustes" viitab hübridisatsioonitingimustele,

mis on hästi teada või mida eriala asjatundja saab kindlaks teha vastavalt tavapärastele

protokollidele. Kõige eelistatumalt viitab termin väga rangetele tingimustele. Asjakohase

rangusega tingimusi võib iga järjestuse tarvis kehtestada tuntud parameetrite, nagu näiteks

temperatuur, nukleiinhappe molekulide koostis, soola tingimused jne põhjal, vt näiteks

Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"; CSH Press, Cold Spring

Harbor, 1989 või Higgins, Hames (toim.), "Nucleic acid hybridization, a practical approach",

IRL Press, Oxford 1985 (viide 54), eriti peatükk "Hybridization Strategy", Britten &

Davidson, 3 kuni 15). Tüüpilised (väga ranged) tingimused hõlmavad hübridisatsiooni tem-

peratuuril 65 °C 0,5-kordses SSC-s ja 0,1% SDS-s või hübridiseerimist temperatuuril 42 °C

EE – EP 1 417 305 B1

4

50% formamiidis, 4-kordses SSC-s ja 0,1% SDS-s. Tavaliselt järgneb hübridisatsioonile

pesemine mittespetsiifilise signaali eemaldamiseks. Pesemise tingimused sisaldavad tingi-

musi, nagu näiteks temperatuur 65 °C, 0,2-kordne SSC ja 0,1% SDS või 2-kordne SSC ja

0,1% SDS või 0,3-kordne SSC ja 0,1% SDS temperatuuril 25 °C kuni 65 °C.

[0013] Nagu siin on avaldatud, käsitleb käesolev leiutis ka vähemalt 20 nukleotiidi pikku-

sega nukleiinhappe molekulide hübridiseerimist, nagu on esitatud lisatud patendinõudluses.

Siiski käsitleb käesolev leiutis ka nukleiinhappe molekuli pikkusega vähemalt 50, vähemalt

100, vähemalt 150 või vähemalt 200 nukleotiidi. Eelistatult sisaldavad nimetatud hübridi-

seeruvad fragmendid vähemalt 25, vähemalt 50 või vähemalt 75 nukleotiidi, vähemalt 100

nukleotiidi positsioonist -13910 5'- ja 3'-suunas, nagu on määratletud lisatud patendinõud-

luses, või positsioonist -22018 5'- ja 3'-suunas, nagu on määratletud lisatud patendinõudluses.

[0014] Termin "nukleiinhappe molekul" viitab nii looduslikult esinevatele kui ka loodusli-

kult mitteesinevatele nukleiinhappe molekulidele. Looduslikult mitteesinevate nukleiinhappe

molekulide hulka kuulub cDNA, samuti derivaadid nagu näiteks PNA.

[0015] Termin "nukleiinhappe molekul [...], mis sisaldab SEQ ID nr: nukleiinhappe

järjestust" viitab läbi kogu kirjelduse nukleiinhappe molekulidele, mis on vähemalt 1 nuk-

leotiidi võrra pikemad kui SEQ ID nr poolt määratud nukleiinhappe molekul. Samal ajal

pikendatakse neid nukleiinhappe molekule leiutises näiteks SEQ ID nr 2 või 1, 3 või 4 poolt

määratletud nukleiinhappe molekuli 5'- ja/või 3'-otsast maksimaalselt 30000 nukleotiidi

võrra.

[0016] Üllatuslikult leiti vastavuses käesoleva leiutisega, et kaks hüpolaktaasiaga seotud

varianti asuvad LPH geenist märkimisväärselt kaugel, paiknedes MCM6 geeni erinevates

intronites. MCM6 kuulub geeniperekonda (MCM 2-7), mis on vajalik DNA replikatsiooni

alustamiseks, tagades, et see toimub ainult üks kord rakutsükli vältel31. MCM6, erinevalt

LPH-st, ei piirdu selle jaotumisega kudedes ning MCM6 tasemete ja LPH transkriptide vahel

korrelatsioon puudub18. Need leiud viitavad, et neil kahel geenil ei ole koespetsiifilisust või

arengu reguleerimist võimaldavaid ühiseid, funktsionaalselt mis tahes olulisi cis-positsioonis

toimivaid elemente18. Kõige tõenäolisemalt on tuvastatud variantidel LPH ja MCM6 geenide

ekspressiooniks erinev funktsionaalne tähtsus. Edasi on üllatav, et põhinedes täielikul seosel

hüpolaktaasiaga, on nad (või üks neist) seotud LPH geeni vanusest sõltuva transkriptsiooni-

taseme allareguleerimisega soolestiku epiteelis, kuid mõju MCM6 transkriptsioonile on väike

või puudub üldse.

EE – EP 1 417 305 B1

5

[0017] Katseliselt kitsendati läbiviidud alleelse seostamise ja laiendatud haplotüübiana-

lüüsiga üheksal laiendatud Soome perekonnal, kasutades aheldumist, täiskasvanu tüüpi hüpo-

laktaasia lookus 47 kb suuruse vahemikuni 2q21-s. Piirkonna järjestuse analüüs näitas ühe

nukleotiidi polümorfismi (SNP) C/T-13910, mis kõikides Soome perekondades ja 236 neljast

erinevast populatsioonist isiku valimis täielikult ko-segregeerusid täiskasvanu tüüpi hüpolak-

taasiaga. Teine SNP G/A-22018, mis asub alates C/T -13910 8 kb telomeerselt, oli kõikidel

juhtudel seotud tunnusega, kuid esines vaid 7 haigusjuhtumi korral. C/T -13910 SNP levimus

1047 DNA proovis kajastab teatatud täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia levimust kolmes erine-

vas populatsioonis, andes selle tunnuse olulisuse kohta täiendavat tõendusmaterjali.

[0018] Eespool nimetatud üllatav leid võimaldab esimest korda kehtestada testsüsteemid,

mis põhinevad LPH geenist vastassuunas asuvate nimetatud ühe nukleotiidi polümorfismide

molekulaarsel analüüsil. Arvestades, et mõlemad SNP-d võimaldavad täiskasvanu tüüpi

hüpolaktaasia diagnoosiks või täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia eelsoodumuse diagnoosiks

kindlat alust, on eelistatav, et analüüsitakse nukleotiidi positsioonis -13910, kas ainsana või

kombinatsioonis nukleotiidiga positsioonis -22018. Seda seetõttu, et SNP positsioonis -13910

oli 100% analüüsitud juhtudest seotud haigusega, samas oli SNP positsioonis -22018 täis-

kasvanu tüüpi hüpolaktaasiaga seotud vaid 98% kõigist juhtudest. Siiski pakuvad ka ainult

nukleotiidi positsiooni -22018 analüüsid tavaliselt kindlat alust täiskasvanu tüüpi hüpolak-

taasia diagnoosiks või täiskasvanu-tüüpi hüpolaktaasia eelsoodumuse diagnoosiks.

[0019] Tänu arvukatele SNP-de esinemise hindamiseks loodud meetoditele on nüüd või-

malik diagnoosida geneetilist eelsoodumust täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiaks mugavalt,

lühikese aja vältel, madala hinna, kõrge täpsusega ja uuritava isiku jaoks märkimisväärse

ebamugavuseta.

[0020] Leiutis käsitleb lisaks nukleiinhappe molekuli, mis sisaldab või koosneb soole

laktaas-florisiini hüdrolaasi (LPH) geeni 5'-osa(st), kusjuures nimetatud nukleiinhappe mole-

kuli iseloomustatakse lisatud patendinõudluses.

[0021] Leiutise seda teostust võib sobivalt kasutada, näitamaks, et inimene ei põe täiskas-

vanu tüüpi hüpolaktaasiat ja tal puudub selleks eelsoodumus. Lisaks võib seda nukleiinhappe

molekuli, mis kajastab positsioonide -13910 või -22018 LPH geenist vastassuunas "metsik-

tüüpi" olukorda, kasutada kontrolleesmärkidel katsetes, milles testitakse eelsoodumust täis-

kasvanu tüüpi hüpolaktaasiaks.

EE – EP 1 417 305 B1

6

[0022] Testimiseks võib kasutada meetodeid, mida on kirjeldatud kogu käesolevas kirjeldu-

ses.

[0023] Leiutise eelistatud teostuses on nukleiinhappe molekul genoomne DNA.

See leiutise eelistatud teostus kajastab asjaolu, et tavaliselt teostatakse analüüs uuritava isiku

kehavedelikest, rakkudest või kudedest eraldatud genoomse DNA põhjal.

[0024] Leiutisekohase nukleiinhappe molekuli veel ühes eelistatud teostuses on nimetatud

genoomne DNA osa geenist.

Leiutise kohaselt on eelistatud, et analüüsitakse vähemalt ühte MCM6 geeni intronitest, mis

asub LPH geeniga võrreldes positsioonis -13910 või positsioonis -22018.

[0025] Lisaks käsitleb leiutis siin eespool kirjeldatud nukleiinhappe molekuli fragmenti pik-

kusega vähemalt 14 nukleotiidi, kusjuures nimetatud fragment sisaldab LPH geeni nukleo-

tiidi positsioonis -13910 või nukleotiidi positsioonis -22018 (vastassuunas). Leiutisekohane

fragment võib olla nii loodusliku kui ka (pool)sünteetilise päritoluga. Seega võib fragment

olla näiteks nukleiinhappe molekul, mis on sünteesitud orgaanilise keemia tavapäraste ees-

kirjade kohaselt. Oluline on, et leiutisekohane nukleiinhappefragment sisaldab vastassuunas

LPH geeni nukleotiidi positsioonis -13910 või nukleotiidi positsioonis -22018. Nendes posit-

sioonides võib fragment olla kas metsiktüüpi nukleotiid või nukleotiid, mis aitab kaasa või

viitab täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale (nimetatakse ka "mutant"-järjestuseks). Seega võib

leiutisekohast fragmenti kasutada näiteks analüüsides, eristamaks metsiktüüpi ja mutantjär-

jestust.

Lisaks sellele on eelistatud, et leiutisekohane fragment sisaldab vähemalt 17 nukleotiidi,

enam eelistatult vähemalt 21 nukleotiidi ning enim eelistatult vähemalt 25 nukleotiidi, näiteks

30 nukleotiidi.

[0026] Lisaks käsitleb leiutis nukleiinhappe molekuli, mis on siin eespool kirjeldatud nuk-

leiinhappe molekuliga komplementaarne.

[0027] Leiutise see teostus, mis sisaldab vähemalt 14 nukleotiidi ja hõlmab vähemalt LHP

geeni järjestuse positsioonist -13910 või positsioonist -22018 vastassuunas, on loetletud

positsioonides eriti kasulik hübridisatsioonitestides geneetilise valimi analüüsil. Seega võib

polümorfide variantide eristamiseks kasutada kas metsiktüüpi järjestuse (st T positsioonis

-13910 või positsioonis -22018) või variantidega, mis aitavad kaasa või viitavad täiskasvanu

tüüpi hüpolaktaasiale (st C positsioonis -13910 või G positsioonis -22018), täpselt komple-

mentaarset, näiteks pikkusega 15-mer (bp). Seda seetõttu, et kui on valitud sobivad hübridi-

EE – EP 1 417 305 B1

7

satsiooni ja pesemise tingimused, ei tekita tuvastatava märgisega märgistatud nukleiinhappe

molekul, mis ei ole analüüsitud proovi DNA-ga täpselt komplementaarne, tuvastatavat sig-

naali.

[0028] Sellega seoses on oluline märkida, et leiutisekohast nukleiinhappe molekuli, selle

fragmenti, samuti komplementaarset nukleiinhappe molekuli võib tuvastatavalt märgistada.

Tuvastatavate märgiste hulka kuuluvad radioaktiivseid märgised, näiteks 3H või 32P või

fluorestseeruvad märgised. Nukleiinhapete märgistamine on tehnika tasemest hästi teada ja

kirjeldatud, vaadake näiteks viidet Sambrook et al., loc. cit..

[0029] Lisaks käsitleb leiutis siin eespool kirjeldatud nukleiinhappe molekuli sisaldavat

vektorit. Leiutisekohane vektor võib sisaldada kas metsiktüüpi järjestust (järjestusi) hõlmavat

nukleiinhappe molekuli või see võib sisaldada mutantjärjestust (-järjestusi) hõlmavat nuk-

leiinhappe molekuli.

Vektorid võivad olla eelkõige geenitehnoloogias tavapäraselt kasutatavad plasmiidid, kos-

miidid, viirused või bakteriofaagid, mis sisaldavad leiutisekohast nukleiinhappe molekuli.

Eelistatult on nimetatud vektor ekspressioonivektor ja/või geeni ülekande- või sihtmärk-

vektor. Viirustest, näiteks retroviirustest, vaktsiiniaviirusest, adeno-assotsieerunud viirusest,

herpesviirustest või veise papilloomiviirustest saadud ekspressioonivektoreid võib kasutada

leiutisekohase nukleiinhappe molekuli kohaletoimetamiseks eesmärgiks seatud rakupopulat-

siooni. Meetodeid, mis on eriala asjatundjatele hästi teada, võib kasutada rekombinantsete

viirusvektorite konstrueerimisel, vaadake näiteks metoodikaid, mida on kirjeldatud viites

Sambrook et al., loc. cit., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green

Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Alternatiivselt võib leiutise-

kohaseid nukleiinhappe molekule ja vektoreid lahustada sihtmärkrakkudesse toimetamise

eesmärgil liposoomidesse. Leiutisekohaseid nukleiinhappe molekule sisaldavaid vektoreid

võib üle kanda peremeesrakku, kasutades hästi teada meetodeid, mis varieeruvad sõltuvalt

vastuvõtva raku tüübist. Näiteks on kaltsiumkloriidi transfektsioon tavaliselt kasutatav proka-

rüootsetes rakkudes, samas võib teiste peremeesrakkude puhul kasutada näiteks kaltsiumfos-

faadi või DEAE-dekstraani vahendatud transfektsiooni või elektroporatsiooni, vt Sambrook,

supra.

Sellised vektorid võivad sisaldada täiendavaid geene, näiteks markergeene, mis võimaldavad

nimetatud vektori selekteerimist sobivas peremeesrakus ja sobivates tingimustes. Eelistatult

on leiutisekohane nukleiinhappe molekul ekspressiooni kontrollivate järjestustega toimivalt

EE – EP 1 417 305 B1

8

ühendatud, võimaldamaks ekspressiooni prokarüootsetes või eukarüootsetes rakkudes. Nime-

tatud polünukleotiidi ekspressioon hõlmab polünukleotiidi transkriptsiooni transleeritavaks

mRNA-ks. Regulaatorelemendid, mis tagavad ekspressiooni eukarüootsetes rakkudes, eelis-

tatult imetajarakkudes, on eriala asjatundjale hästi teada. Tavaliselt sisaldavad need regula-

toorseid järjestusi, mis tagavad transkriptsiooni alustamise, ja valikuliselt polü-A signaali,

mis tagab transkriptsiooni lõpetamise ja transkripti stabiliseerumise, ja/või intronit nimetatud

polünukleotiidi ekspressiooni täiendavaks võimendamiseks. Täiendavate regulatoorsete ele-

mentide hulka võivad kuuluda transkriptsiooni võimendajad, samuti translatsiooni võimen-

dajad ja/või looduslikult seotud või heteroloogsed promootorpiirkonnad. Võimalike regulaa-

torelementide hulka, mis võimaldavad ekspressiooni prokarüootsetes peremeesrakkudes,

kuuluvad näiteks PL-, lac-, trp- või tac-promootor E. coli-s, ja näidete hulka regulaator-

elementidest, mis võimaldavad ekspressiooni eukarüootsetes peremeesrakkudes, kuuluvad

AOX1- või GAL1-promootor pärmis või CMV-, SV40-, RSV-promootor (Rousi sarkoomi-

viirus), CMV võimendaja, SV40 võimendaja või globiini intron imetajates ja muudes loom-

setes rakkudes. Kõrvalelemendid, mis vastutavad selliste regulaatorelementide transkript-

siooni alustamise eest, võivad sisaldada ka transkriptsiooni lõpetamise signaale, näiteks

SV40-polü-A kohta või tk-polü-A kohta polünukleotiidist pärisuunas. Valikuliselt võib hete-

roloogne järjestus kodeerida sulandvalku, sealhulgas C-või N-terminust äratundvat peptiidi,

mis edastab soovitud omadusi, näiteks stabiliseerimist või ekspresseeritud rekombinantse

toote lihtsustatud puhastamist. Selles kontekstis on sobivad ekspressioonivektorid tehnika

tasemest tuntud kui Okayama-Bergi cDNA ekspressioonivektor pcDV1 (firma Pharmacia),

pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3, Echo™ Cloning System (firma Invitrogen),

pSPORT1 (firma Gibco BRL) või pRevTet-ONpRevTet-Off või pCl (firma Promega).

Eelistatult on ekspressiooni kontrollivad järjestused eukarüootsed promootorsüstemid vekto-

rites, mis on võimelised transformeerima või transfekteerima eukarüootseid peremeesrakke,

kuid võib kasutada ka prokarüootsete peremeesrakkude kontrolljärjestusi.

Nagu eespool on mainitud, võib leiutisekohane vektor olla ka geeniülekande- või sihtmärk-

vektor. Geeniteraapia, mis põhineb raviotstarbel kasutatavate geenide ex vivo või in vivo

rakkudesse viimise meetoditel, on üks kõige olulisemaid geeniülekande rakendusi. Sobivaid

vektoreid ja meetodeid geeniteraapiaks in vitro või in vivo on kirjeldatud kirjanduses ja need

on eriala asjatundjatele teada; vt nt Giordano, Nature Medicine, 2 (1996), 534-539; Schaper,

Circ. Res., 79 (1996), 911-919; Anderson, Science, 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet, 348

EE – EP 1 417 305 B1

9

(1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res., 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine, 2

(1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, Schaper, Current Opinion in Biotechnology,

7 (1996), 635-640, või Kay et al., (2001) Nature Medicine, 7, 33-40, ja nendes tsiteeritud

viiteid. Leiutisekohaseid polünukleotiide ja vektoreid võib kavandada otseseks rakku intro-

dutseerimiseks või liposoomide kaudu või viirusvektorite (nt adenoviiruse, retroviiruse)

kaudu introdutseerimiseks. Eelistatult on nimetatud rakk idutee rakk, embrüonaalne rakk või

munarakk või neist pärinev rakk, enim eelistatult on nimetatud rakk tüvirakk. Geeniteraapia

kavandatakse ainult metsiktüüpi nukleiinhappe molekuliga.

[0030] Leiutis käsitleb ka praimerit või praimerite paari, kusjuures praimer või praimerite

paar hübridiseerub (väga) rangetes tingimustes siin eespool kirjeldatud nukleiinhappega, mis

sisaldab LHP geeni positsioonis -13910 või -22018 nukleotiidi või selle komplementaarset

ahelat.

Eelistatult on leiutisekohased praimerid pikkusega vähemalt 14 nukleotiidi, näiteks 17 või 21

nukleotiidi. Lisaks sellele on eelistatud, et praimerite maksimumpikkuseks on 24 nukleotiidi.

Polümorfsete variantide eristamiseks võib koos asjakohase tuvastamismeetodiga, näiteks

pikendamisreaktsiooni või amplifitseerimisreaktsiooniga, kasutada praimeri sobivates tingi-

mustes hübridiseerimist või hübridisatsiooni puudumist positsiooni -13910 või positsiooni

-22018 sisaldava genoomse järjestusega ning seejärel teha näiteks järeldused uuritava isiku

soodumuse suhtes täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale. Käesolev leiutis näeb ette kahte tüüpi

praimereid / praimerite paare. Ühte tüüpi praimer hübridiseerub mutantjärjestust sisaldava

järjestusega. Teisisõnu, praimer on täpselt komplementaarne järjestusega, mis sisaldab C-d

positsioonis -13910 või G-d positsioonis -22018, või selle komplementaarse ahelaga. Teist

tüüpi praimer on täpselt komplementaarne järjestusega, mis sisaldab T-d positsioonis -13910

või A-d positsioonis -22018, või selle komplementaarse ahelaga. Kuna hübridisatsiooni

tingimused peaks valima eelistatavalt piisavalt ranged, kontakteerides näiteks praimeri, mis

on mutantjärjestusega täpselt komplementaarne, metsiktüüpi alleeliga, ei tooks see kaasa

efektiivset hübridiseerumist valepaardumiste moodustumise tõttu. Pärast pesemist praimeri

eemaldamise tõttu signaali ei tuvastataks.

[0031] Lisaks käsitleb leiutis siin eespool kirjeldatud leiutisekohase mitteinimpäritolu (non-

human) vektoriga transformeeritud peremeest (host). Peremees võib sisaldada kas mutant-

või metsiktüüpi järjestust. Pärast paljundamist jne võib peremees olla ühe või mõlema SNP

suhtes heterosügootne või homosügootne.

EE – EP 1 417 305 B1

10

Leiutisekohane peremees võib sisaldada leiutisekohast vektorit kas transientselt või stabiilselt

genoomi integreerituna. Leiutisekohase mitteinimpäritolu peremehe tekitamise meetodid on

tehnika tasemes hästi teada. Näiteks võib transformeeritud bakterite (näiteks E. coli) või

transformeeritud pärmide tekitamiseks kasutada tavapäraseid transfektsioonieeskirju, mida on

kirjeldanud Sambrook et al., loc. cit.. Leiutisekohast mitteinimpäritolu peremeest võib kasu-

tada näiteks täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia ilmnemise selgitamiseks.

[0032] Leiutise eelistatud teostuses on mitteinimpäritolu peremees bakter, pärmirakk, putu-

karakk, seenerakk, imetajarakk, taimerakk, transgeenne loom või transgeenne taim.

Samal ajal kui eelistatud bakteriks on E. coli, on eelistatud pärmirakkudeks S. cerevisiae või

Pichia pastoris’e rakud. Eelistatud seenerakkudeks on Aspergillus’e rakud ja eelistatud putu-

karakkude hulka kuuluvad Spodoptera frugiperda rakud. Eelistatud imetajarakkudeks on

käärsoolekartsinoomi rakuliinid, mis näitavad LPH ensüümi ekspressiooni ja mis sisaldavad

CaCo2-rakke.

[0033] Transgeense mitteinimpäritolu looma, näiteks transgeense hiire tootmise meetod

hõlmab eespool nimetatud polünukleotiidi või sihtmärgile suunatud vektori introdutseerimist

sugurakku, embrüonaalsesse rakku, tüvirakku või munasse või nendest pärinevatesse rakku-

desse. Mitteinimpäritolu looma on võimalik kasutada leiutise siin kirjeldatud sõelumismee-

todi kohaselt. Transgeensete embrüote tootmist ja nende sõelumist võib teostada näiteks nii,

nagu on kirjeldatud viites A. L. Joyner, toim., Gene Targeting, A Practical Approach (1993),

Oxford University Press. Embrüote embrüonaalsete membraanide DNA-d võib analüüsida,

kasutades näiteks Southern blottimist sobiva komplementaarse nukleiinhappe molekuliga, vt

supra. Transgeense mitteinimpäritolu looma tegemise üldmeetod on tehnika tasemes kirjelda-

tud, vt näiteks WO 94/24274. Mitteinimpäritolu transgeensete organismide (mille hulka

kuuluvad homoloogselt eesmärgiks seatud mitteinimpäritolu loomad) valmistamiseks eelista-

takse embrüonaalseid tüvirakke (ES-rakke). Homoloogse geeni suunamiseks võib kasutada

närilise (murine) ES-rakke, näiteks AB-1-liini, mida kasvatatakse mitootiliselt inaktiivsete

SNL76/7-rakkude toitekihtidel (McMahon, Bradley, Cell, 62:1073-1085 (1990)) praktiliselt

nii, nagu on kirjeldatud järgnevas viites Robertson, E. J. (1987), Teratocarcinomas and

Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, toim. (Oxford: IRL Press),

71-112). Muude sobivate ES-rakuliinide hulka kuuluvad, kuid ei piirdu nendega, E14-liin

(Hooper et al., Nature, 326:292-295 (1987)), D3-liin (Doetschman et al., J. Embryol. Exp.

Morph., 87:27-45 (1985)), CCE-liin (Robertson et al., Nature, 323:445-448 (1986)), AK-7-

EE – EP 1 417 305 B1

11

liin (Zhuang et al., Cell, 77:875-884 (1994)). Edu ES-rakkudest spetsiifilist suunatud

mutatsiooni sisaldava hiireliini tekitamisel sõltub ES-rakkude pluripotentsusest (st nende

võimest süstituna peremehe arenevasse embrüosse, näiteks blastotsüsti või moorulasse, osa-

leda embrüogeneesis ning võimest saadava looma sugurakkude arengule kaasa aidata).

Süstitud ES-rakke sisaldavatel blastotsüstidel lastakse areneda pseudotiine mitteinimpäritolu

emaslooma emakas ja sünnivad kimäärsed hiired. Saadud transgeensed hiired, kes on soovi-

tud nukleiinhappe molekuli sisaldavate rakkude poolest kimäärsed, ristatakse tagasi ja

sõelutakse õigesti suunatud transgeeni(de) esinemise suhtes järglaste sababiopsia DNA PCR

või Southern blot analüüsi abil, et teha kindlaks transgeensete hiirte heterosügootsus leiutise-

kohase nukleiinhappe molekuli suhtes.

[0034] Mitteinimpäritolu transgeensed loomad võivad olla näiteks transgeensed hiired, rotid,

hamstrid, koerad, pärdikud (ahvid), küülikud, sead või veised. Eelistatult on nimetatud trans-

geenne mitteinimpäritolu loom hiir. Leiutisekohased transgeensed loomad on muu hulgas

kasulikud fenotüübi avaldumise / leiutisekohaste nukleiinhapete ja vektorite väljundite uuri-

miseks. Lisaks on leiutisekohased transgeensed loomad kasulikud LPH ensüümi ekspressioo-

ni uurimiseks arengu kestel, näiteks näriliste sooles. Lisaks on kavandatud, et leiutisekoha-

seid mitteinimpäritolu transgeenseid loomi võib kasutada raviainete/kompositsioonide või

muude võimalike ravide, mis on kasulikud täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia leevendamiseks,

testimiseks.

[0035] Lisaks käsitleb leiutis antikeha või aptameeri või faagi, mis seondub spetsiifiliselt

leiutisekohase mutantse nukleiinhappe molekuliga, kuid ei seondu vastava metsiktüüpi nuk-

leiinhappe molekuliga.

Antikeha võib kontrollida seondumise suhtes ja kasutada tehnika tasemes hästi teada mis-

tahes seroloogilises meetodis nagu näiteks aglutinatsioonimeetodid katseklaasides, geelides,

tahkes faasis, ja püüdmise meetodid sekundaarse antikehaga või selleta või voolutsütomeetria

immunofluorestsentsi võimendusega või selleta (vaadake näiteks kirjeldatud meetodeid

Harlow, Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, USA,

1988 (vaadake viidet 53)).

[0036] Kooskõlas leiutisega tunneb antikeha spetsiifiliselt ära epitoobi, mis sisaldab posit-

siooni -13910 (milles nukleotiid on C) või positsiooni -22018 (milles nukleotiidi on G). See

ei reageeri või praktiliselt ei reageeri ristuvalt epitoobiga, mis sisaldab positsiooni -13910,

kui T on selles positsioonis, ega epitoobiga, mis sisaldab positsiooni -22018, kui G on selles

EE – EP 1 417 305 B1

12

positsioonis. Antikeha, mida võib tekitada vastavalt standardprotokollidele, spetsiifilisust

võib kontrollida, kontakteerides selle metsiktüüpi ja mutantjärjestust sisaldavate DNA mo-

lekulidega näiteks ELISA analüüsil. Valitakse ainult need antikehad, mis mutantjärjestusega

toodavad taustast tugevama signaali, kuid metsiktüüpi järjestusega taustast tugevamat sig-

naali ei toodeta.

[0037] Leiutisekohane antikeha võib olla monokloonne antikeha või polükloonsest antisee-

rumist saadud või polükloonses antiseerumis sisalduv antikeha. Termin „antikeha“ hõlmab

käesoleva leiutise kohaselt kasutatuna lisaks nimetatud antikeha fragmente, näiteks Fab-,

F(ab')2-, Fv- või scFv-fragmente; vaadake näiteks Harlow, Lane53, loc. cit.). Antikeha või

selle fragment võib olla loodusliku päritoluga või võib olla (pool)sünteetiliselt toodetud.

Sellised sünteetilised tooted sisaldavad ka mittevalgulisi, pooleldi valgulisi aineid, millel on

sama või praktiliselt sama seondumise spetsiifilisus kui leiutisekohasel antikehal. Selliseid

tooteid võib saada näiteks peptidomimeetikute abil.

[0038] Termin „aptameer“ on tehnika tasemes hästi teada ja määratletud näiteks järgnevates

viidetes Osbome et al., Curr. Opin. Chem. Biol. I (1997), 5-9 (vt viidet 51) või Stall, Szoka,

Pharm. Res., 12 (1995), 465-483 (vt viidet 52)).

[0039] Lisaks käsitleb leiutis antikeha või aptameeri või faagi, mis seondub spetsiifiliselt siin

eespool kirjeldatud metsiktüüpi nukleiinhappe molekuliga, kuid ei seondu vastava mutant-

järjestusega, mis aitab kaasa või viitab täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale. Avaldusi, mis on

tehtud mutantjärjestuse suhtes spetsiifilise antikeha spetsiifilisuse jne kohta, kohaldatakse siin

mutatis mutandis.

[0040] Lisaks käsitleb leiutis farmatseutilist kompositsiooni, mis sisaldab siin eespool kir-

jeldatud metsiktüüpi nukleiinhappe molekuli.

[0041] Leiutisekohast farmatseutilist kompositsiooni võib kasutada geeniteraapia meetodi-

tes, eriti somaatilises geeniteraapias.

Eespool nimetatud ja leiutisekohases farmatseutilises kompositsioonis sisalduvat metsiktüüpi

nukleiinhappe molekuli võib kombineerida farmatseutiliselt vastuvõetava kandja ja/või lah-

jendiga.

Näited sobivatest farmatseutilistest kandjatest on tehnika tasemes hästi teada ja hõlmavad

fosfaatpuhverdatud soolalahuseid, vett, emulsioone, näiteks õli-vees emulsioone, erinevaid

niisutavaid aineid, steriilseid lahuseid jne. Selliseid kandjaid sisaldavaid kompositsioone võib

valmistada ka hästi teadaolevate tavapäraste meetoditega. Nimetatud farmatseutilisi kompo-

EE – EP 1 417 305 B1

13

sitsioone võib isikule manustada sobivas annuses. Sobivate kompositsioonide manustamine

võib toimuda eri viisidel, näiteks intravenoosselt, intraperitoneaalselt, subkutaanselt, intra-

muskulaarselt, paikselt, nahasiseselt, nina kaudu või bronhide kaudu manustades. Annusta-

misskeemi määravad raviarst ja kliinilised tegurid. Meditsiinis on hästi teada, et mis tahes

patsiendile sobivad annused sõltuvad paljudest teguritest, sealhulgas patsiendi suurusest,

keha pinnast, vanusest, konkreetsest manustatavast ühendist, soost, manustamise ajast ja

manustamisviisist, üldisest tervislikust seisundist ja teistest samaaegselt manustatavatest ravi-

mitest. Tavaline manustatav annus ekspressiooniks või ekspressiooni inhibeerimiseks võib

olla näiteks vahemikus 0,001 kuni 1000 µg nukleiinhapet, kuid mõeldavad on ka sellest

näitlikust vahemikust väiksemad või suuremad annused, eriti eespool nimetatud tegureid

arvestades. Annused varieeruvad, kuid eelistatud annuseks on DNA intravenoossel manusta-

misel ligikaudu 106 kuni 1012 DNA molekuli koopiat. Edusamme saab jälgida regulaarse

hindamise abil. Leiutisekohaseid kompositsioone võib manustada paikselt või süsteemselt.

Manustamine on tavaliselt parenteraalne, näiteks intravenoosne, DNA-d võib manustada ka

otse sihtkohta, näiteks biolistilise kohaletoimetamise abil sisemisse või välimisse sihtkohta

või kateetri abil arteris asuvasse kohta. Parenteraalselt manustatavad preparaadid hõlmavad

steriilseid vesi- või mittevesilahuseid, suspensioone ja emulsioone. Näideteks mittevesilahus-

test on propüleenglükool, polüetüleenglükool, taimsed õlid, näiteks oliiviõli, ja süstitavad or-

gaanilised estrid, näiteks etüüloleaat. Veepõhiste kandjate hulka kuuluvad vesi, alkoholi-/-

vesilahused, emulsioonid või suspensioonid, sealhulgas soolalahused ja puhverlahused. Par-

enteraalsete vehiikulite hulka kuuluvad naatriumkloriidi lahus, Ringeri dekstroosilahus, glü-

koos ja naatriumkloriid, Ringeri laktaadilahus või mittelenduvad õlid. Intravenoossete vehii-

kulite hulka kuuluvad vedeliku ja toitainete taastajad, elektrolüütide taastajad (näiteks selli-

sed, mis põhinevad Ringeri dekstroosilahusel) ja muud sellised. Neis võivad sisalduda ka

säilitusained ja muud lisaained, näiteks antimikroobsed ained, antioksüdandid, kelaativad

ained ja inertgaasid ja muud sellised.

[0042] Lisaks sellele käsitleb leiutis diagnostilist kompositsiooni, mis sisaldab siin eespool

kirjeldatud nukleiinhappe molekuli, siin eespool kirjeldatud vektorit, siin eespool kirjeldatud

praimerit või praimerite paari ja/või siin eespool kirjeldatud antikeha aptameeri ja/või faagi.

Diagnostiline kompositsioon on kasulik isiku geneetilise seisundi hindamisel tema eelsoo-

dumuse suhtes täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia tekkimiseks või seoses ägeda seisundi diag-

noosiga. Diagnostilise kompositsiooni võimalikud erinevad komponendid võivad olla paken-

EE – EP 1 417 305 B1

14

datud ühte või mitmesse viaali, olla lahustis või muul viisil, näiteks lüofiliseeritud kujul.

Lahustis lahustatuna on diagnostiline kompositsioon eelistatult jahutatud temperatuurini

vähemalt +8 °C kuni +4 °C. Teistel juhtudel võib eelistada sügavkülmutamist.

[0043] Leiutis käsitleb ka täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia või selle eelsoodumuse või sellega

seotud tunnuse esinemise kontrollimise meetodit, hõlmates tulevaselt patsiendilt või isikult,

kellel kahtlustatakse sellist eelsoodumust, saadud proovi testimist siin eespool kirjeldatud

homosügootses või heterosügootses vormis nukleiinhappe molekuli esinemise suhtes. Erine-

vates teostustes võib testida kas metsiktüüpi järjestus(t)e või mutantse(te) järjestus(t)e esi-

nemist.

[0044] Leiutisekohane meetod on kasulik nimetatud isiku/patsiendi geneetilise ülesehituse

tuvastamiseks ja asjakohaste järelduste tegemiseks, kas seisund, mille all nimetatud patsient

kannatab, on täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia. Alternatiivselt võib hinnata, kas inimesel, kes

seisundi all ei kannata, on eelsoodumus täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale. Seoses posit-

siooniga -13910 LPH geenist vastassuunas võiks täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiat või vas-

tavat eelsoodumust diagnoosida vaid siis, kui leitakse homosügootses vormis avalduv tsüto-

siin. Teisalt, kui leitakse homosügootses vormis avalduv tümidiin või kui isik on heterosü-

gootne (C/T), võib järeldada, et seisund, mille all patsient kannatab, ei ole täiskasvanu tüüpi

hüpolaktaasiaga seotud ja lisaks, et patsiendil puudub eelsoodumus nimetatud seisundi

tekkimiseks. Siiski võib järeldada, et heterosügootse genotüübiga isikute lastel võib seisund

tekkida, kui C-jääki kandev kromosoom paarduks vastava teiselt vanemalt pärit kromosoo-

miga.

[0045] Sarnane olukord ja praktiliselt samad järeldused kehtivad positsioonis -22018 asuva

SNP analüüsi kohta. Homosügootselt avalduv G-jääk tähistab täiskasvanu tüüpi ägeda hüpo-

laktaasia eelsoodumust või esinemist. Heterosügootne G/A vorm korreleerub suure tõenäo-

susega seisundi mittetekkimisega. Isikutel, kellel on homosügootses vormis A, ei ole seisundi

tekkimist oodata. Samuti võiks seisundi all kannatavaid patsiente diagnoosida selles suhtes,

kas nad põevad täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiat.

[0046] Leiutisekohase meetodi eelistatud teostuses hõlmab nimetatud testimine siin eespool

kirjeldatud komplementaarse nukleiinhappe molekuli, mis on komplementaarne nukleiinhap-

pe molekuliga, mis aitab kaasa või viitab täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale, või siin eespool

kirjeldatud nukleiinhappe molekuli, mis on komplementaarne metsiktüüpi järjestusega, hübri-

EE – EP 1 417 305 B1

15

diseerumist sondina (väga) rangetes tingimustes nukleiinhappe molekulidega, mis sisalduvad

nimetatud proovis, ja nimetatud hübridisatsiooni tuvastamist.

Jällegi, sõltuvalt kasutatavast nukleiinhappe sondist tuvastatakse kas metsiktüüpi või mutant-

järjestused (st järjestused, mis aitavad kaasa või viitavad täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale).

On arusaadav, et hübridisatsiooni tingimused võiks valida sellised, et metsiktüüpi järjestus-

tega komplementaarne nukleiinhappe molekul ei hübridiseeruks või praktiliselt ei hübridi-

seeruks mutantjärjestusega. Samuti et mutantjärjestustega komplementaarne nukleiinhappe

molekul ei hübridiseeruks või praktiliselt ei hübridiseeruks metsiktüüpi järjestusega. Erista-

maks leiutisekohaste hübridisatsioonimeetoditega saadud homosügootsete ja heterosügoot-

sete genotüüpide tulemusi, võib näiteks pärast hübridisatsiooni jälgida/tuvastada vastava

tuvastatava signaali tugevust/intensiivsust. Eristamaks leiutisekohaste hübridisatsioonimee-

toditega metsiktüüpi homosügootseid, heterosügootseid ja/või mutantseid homosügootseid

alleele, võib analüüsi lisada vastavate genotüüpide sisekontrolliproove.

[0047] Veel ühes eelistatud teostuses hõlmab leiutisekohane meetod lisaks nimetatud hübri-

disatsiooniprodukti lõikamist restriktaasiga või nimetatud hübridisatsiooniprodukti allutamist

restriktaasiga lõikamisele, ja nimetatud lõikamise produkti analüüsimist.

See eelistatud leiutisekohane teostus võimaldab mugavate vahenditega eristada efektiivset

hübridisatsiooni ja ebaefektiivset hübridisatsiooni. Näiteks kui positsiooni -13910 või posit-

siooni -22018 kõrval asuv DNA-järjestus sisaldab restriktsioonisaiti, on hübridisatsioonipro-

dukt pärast efektiivset hübridiseerumist lõigatav sobiva restriktsiooniensüümiga, samas hüb-

ridiseerumise puudumisel kaheahelalist produkti ei teki või äratuntavat restriktsioonisaiti ei

sisaldu ja järelikult seda ei lõigata. DNA variandi C/T-13910 järjestuse suhtes spetsiifiliseks

restriktsiooniensüümiks on eelkõige CviJ I, DNA variandi G/A-22018 järjestuse suhtes spetsii-

filisteks restriktsiooniensüümideks on Hhal ja Aci I. Nimetatud restriktsiooniensüümid, mis

lõikavad rg/cy, leiti programmi Webcutter kasutades. Lõikamisprodukti analüüs võib toi-

muda tavapärasel viisil, näiteks geelelektroforeesi teel, mida võib valikuliselt kombineerida

nukleiinhappe värvimisel näiteks etiidiumbromiidiga. Ette on nähtud ka kombinatsioonid

täiendavate meetoditega, näiteks Southern blottimisega.

[0048] Nimetatud hübridisatsiooni tuvastamine võib toimuda näiteks DNA-vastase kaheahe-

lalise antikeha abil või märgistatud oligonukleotiidi kasutades. Leiutisekohast meetodit võib

mugavalt kasutada koos kihttehnikatega, näiteks Southern või Northern blottimisega ja

sarnaste meetoditega. Märgistamine võib toimuda näiteks standardprotokollide abil ja nende

EE – EP 1 417 305 B1

16

hulka kuuluvad märgistamine radioaktiivsete markerite, fluorestseeruvate, fosforestseeruvate,

kemoluminestseeruvate, ensümaatiliste märgistega jne (vt ka eespoolt).

[0049] Eespool tooduga kooskõlas märgistatakse nimetatud sond leiutisekohase meetodi

teises eelistatud teostuses tuvastataval viisil, näiteks siin eespool kirjeldatud meetodite ja

märgiste abil.

[0050] Leiutisekohase meetodi veel ühes eelistatud teostuses hõlmab nimetatud testimine

siin eespool kirjeldatud nukleiinhappe molekulist vähemalt osa nukleiinhapete järjestusest

määramist, nimetatud osa sisaldab LPH geeni nukleotiidi positsioonis -13910 ja/või nukleo-

tiidi positsioonis -22018.

Nukleiinhappe molekuli määramine võib toimuda vastavalt ühele tavapärastest eeskirjadest,

näiteks vastavalt Sangeri või Maxami/Gilberti eeskirjadele (täiendavateks juhisteks vaadake

Sambrook et al., loc. cit.).

[0051] Leiutisekohase meetodi veel ühes eelistatud teostuses toimub nukleiinhapete järjes-

tuse määramine tahke faasi minisekveneerimise teel. Tahke faasi minisekveneerimine põhi-

neb metsiktüüpi ja mutantse nukleotiidi kvantitatiivsel analüüsil lahuses. Kõigepealt amplifit-

seeritakse mutatsiooni sisaldav genoomi piirkond PCR teel, kasutades ühte biotinüülitud ja

biotinüülimata praimerit, milles biotinüülitud praimer on kinnitatud streptavidiiniga (SA)

kaetud plaadile. PCR produkt denatureeritakse üheahelaliseks vormiks, võimaldamaks mini-

sekveneerimise praimeril selle ahelaga seondumist just enne mutatsioonikohta. Minisekve-

neerimise reaktsioonisegule lisatakse triitiumi (H3) või fluorestsentsmärgisega märgistatud

muteeritud ja metsiktüüpi nukleotiidid koos märgistamata dNTP-dega ning sekveneeritakse,

kasutades Taq-polümeraasi. Tulemus põhineb metsiktüüpi ja mutantsete nukleotiidide kogu-

sel reaktsioonis, mõõdetuna beeta-loenduri või fluoromeetri abil ja väljendatuna R-suhtena.

Vaadake ka Syvanen A. C., Sajantila A., Lukka M., Am. J. Hum. Genet., 1993, 52:46-59 ja

Suomalainen A., Syvanen A. C., Methods Mol. Biol., 1996, 65:73-79).

Leiutisekohase meetodi eelistatud teostus hõlmab enne nimetatud nukleiinhapete järjestuse

määramist lisaks nimetatud nukleiinhappe molekuli vähemalt nimetatud osa amplifitseeri-

mist.

Eelistatult toimub amplifitseerimine polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) teel. Rakendada võib

ka muid amplifitseerimise meetodeid, näiteks ligaasi ahelreaktsiooni.

[0052] Leiutisekohase meetodi eelistatud teostuses hõlmab nimetatud testimine amplifikat-

sioonireaktsiooni läbiviimist, milles vähemalt üks nimetatud amplifikatsioonireaktsioonis

EE – EP 1 417 305 B1

17

kasutatud praimeritest on siin eespool kirjeldatud praimer või kuulub siin eespool kirjeldatud

praimerite paari, ning hõlmab ka amplifikatsiooniprodukti analüüsimist. Selles teostuses ja

sõltuvalt informatsioonist, mida uurija/arst soovib saada, võib kasutada kas metsiktüüpi või

mutantjärjestustega hübridiseeruvad praimerid.

[0053] Leiutisekohase meetodi tulemuseks on ainult sihtmärkjärjestuse amplifitseerumine

juhul, kui nimetatud sihtmärkjärjestus sisaldab järjestust, mis on hübridisatsiooniks kasutatud

praimeriga täpselt komplementaarne. Seda seetõttu, et oligonukleotiidpraimer ei hübridiseeru

eelistatult (väga) rangetes hübridisatsioonitingimustes metsiktüüpi/mutantjärjestusega – sõl-

tuvalt sellest, millist praimerit kasutatakse - (mille tagajärjel amplifikatsiooniprodukti ei

saada), vaid ainult täpselt sobiva järjestusega. Loomulikult võib kasutada mõlema SNP-ga

hübridiseeruvate praimerite paaride kombinatsioone. Sel juhul eeldatakse amplifikatsiooni-

produktide (mida võib olla mitte ühtegi, üks, kaks, kolm või neli amplifikatsiooniprodukti,

kui teine, mitte-eristatav praimer on iga lookuse jaoks sama) analüüsi, mis annab teavet

mõlema positsiooni, - 13910 ja -22018, geneetilise seisundi kohta.

[0054] Leiutisekohase meetodi eelistatud teostuses teostatakse nimetatud amplifikatsioon

polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil või nimetatud amplifikatsioon on polümeraasi ahel-

reaktsioon (PCR).

PCR on tehnika tasemes hästi teada. Tüüpilised tingimused, mida tuleb leiutise kohaselt

kasutada, on näiteks kokku 35 tsüklit kogumahu 50 µl puhul, iseloomulikud on denatu-

reerimisetapp temperatuuril 93 °C 3 min, anniilimisetapp temperatuuril 55 °C 30 s, piken-

damisetapp temperatuuril 72 °C 75 s ja lõplik pikendamisetapp temperatuuril 72 °C 10 min.

[0055] Lisaks käsitleb leiutis täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia või eelsoodumuse esinemise

testimise meetodit, mis hõlmab inimeselt saadud proovi hindamist spetsiifilise seondumise

suhtes siin eespool kirjeldatud antikeha või aptameeri või faagiga. Selles kontekstis osutab

leiutisekohase antigeeni nõrgem värvumine võrreldes homosügootsete metsiktüüpi kontroll-

proovidega (sisaldavad kahte püsivat alleeli) heterosügootse metsiktüübi (ühe püsiva alleeli

ja ühe laktoositalumatust põhjustava alleeliga) esinemisele, arvestades, et sobiva antikeha

kasutamisel ei ole oodata värvuse muutust homosügootse laktoositalumatusega isiku proovis.

Eelistatult teostatakse leiutisekohane meetod kontrollproovide, mis vastavad kõigile kolmele

võimalikule alleelsele kombinatsioonile kui sisekontrollidele, juuresolekul. Testimise võib

läbi viia antikehaga vms, mis on metsiktüüpi järjestuse suhtes spetsiifilised või mutantjär-

EE – EP 1 417 305 B1

18

jestuse suhtes spetsiifilised. Seondumise testimiseks võib taas rakendada standardmeetodeid,

näiteks ELISA-t, vaadake näiteks Harlow ja Lane53, loc. cit.

[0056] Leiutisekohase meetodi eelistatud teostuses on nimetatud antikeha või aptameer või

faag tuvastatavalt märgistatud.

Arvestades, et aptameerid on eelistatult radioaktiivselt märgistatud 3H või 32P või fluorest-

seeruva markeriga, nagu eespool on kirjeldatud, võib faag või antikeha olla märgistatud kas

samasugusel viisil (eelistatud on radioaktiivne märgis 131I-ga) või olla märgistatud tag-ga,

näiteks His-tag-i, FLAG-tag-i või myc-tag-ga.

[0057] Leiutisekohase meetodi veel ühes eelistatud teostuses on testiks immuunanalüüs.

[0058] Leiutisekohase meetodi ühes teises eelistatud teostuses on nimetatud prooviks veri,

seerum, plasma, lootekude, sülg, uriin, limaskest, lima, vaginaalkude, tupest saadud loote-

kude, nahk, juuksed, karvanääps või inimese muu kude.

[0059] Leiutisekohase meetodi veel ühes eelistatud teostuses on nimetatud proovist saadud

nimetatud nukleiinhappe molekul kinnitatud tahkele toele.

[0060] Nukleiinhappe molekuli kinnitamine tahkele toele võimaldab testanalüüsi lihtsat

läbiviimist ning lisaks võimaldavad vähemalt mõningad tahked toed, näiteks kiibid, räni-

kettad (silica wafers) või mikrotiiterplaadid, suurema hulga proovide üheaegset analüüsimist.

Ideaalolukorras võimaldab tugev tugi automatiseeritud testimise rakendamist, kasutades näi-

teks robotseadmeid.

[0061] Leiutisekohase meetodi eriti eelistatud teostuses on nimetatud tahke tugi kiip,

räniketas, helmes või mikrotiiterplaat.

[0062] Lisaks käsitleb leiutis siin eespool kirjeldatud nukleiinhappe molekuli kasutamiseks

täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia või eelsoodumuse esinemise analüüsis.

Nukleiinhappe molekul võimaldab analüüsida korraga nii seisundi puudumist kui ka eel-

soodumust seisundile, nagu on üksikasjalikult kirjeldatud siin eespool.

[0063] Lisaks käsitleb leiutis komplekti, mis sisaldab ühes või mitmes mahutis siin eespool

kirjeldatud nukleiinhappe molekuli, siin eespool kirjeldatud praimerit või praimerite paari,

siin eespool kirjeldatud vektorit ja/või siin eespool kirjeldatud antikeha aptameeri ja/või

faagi.

[0064] Siin kirjeldatakse ka siin eespool kirjeldatud nukleiinhappe molekuli või siin eespool

kirjeldatud vektori kasutamist geeniteraapias.

EE – EP 1 417 305 B1

19

Geeniteraapia lähenemisviiside üle on arutletud siin eespool seoses leiutisekohase vektoriga

ja need kehtivad samaväärselt siin. Ka nukleiinhappe molekulide fragmente, mis on siin

eespool määratletud ja eriti nagu siin on kirjeldatud ja kujutatud järjestustena SEQ ID nr: 3-4,

võib kasutada geeniteraapia lähenemisviisides. Nimetatud fragmendid sisaldavad nukleotiidi

positsioonis -13910, nagu siin eespool on määratletud punktis (c) (ja samuti näidatud järjes-

tuses SEQ ID nr: 3), või positsioonis -22018, nagu siin eespool on määratletud punktis (d) (ja

samuti näidatud järjestuses SEQ ID nr: 4). Eelistatult sisaldavad nimetatud fragmendid

vähemalt 200, vähemalt 250, vähemalt 300, vähemalt 400 ja kõige eelistatumalt vähemalt

500 nukleotiidi.

[0065] Siin kirjeldatakse ka, et nimetatud geeniteraapiaga ravitakse või ennetatakse täis-

kasvanu tüüpi hüpolaktaasiat.

[0066] Joonistel on näidatud järgmist.

Joonisel 1 on uuritud Soome täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiaga perekondi. Mustaks värvitud

sümbolid viitavad laktoositalumatusega isikutele, tärn (*) viitab, et ei proovi ei olnud

võimalik saada, küsimärk (?) viitab tundmatule haigestumusele, ↑ viitab sekveneerimisel

SNP tuvastamiseks kasutatud isikutele (tabel 2).

Joonisel 2 on täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia lookuse füüsiline kaart. BAC-kloonid on

näidatud horisontaaljoone kohal. Kolm geeni, LPH, MCM6 ja DARS, on näidatud paksu

musta noolega, nooleots osutab noolte kohal mustades lahtrites asuva geeni 3-lõpu suunas.

Näidatud on lookuse viimistletud kaardistamiseks (fine mapping) kasutatud kümne polü-

morfse mikrosatelliidi markeri positsioonid. Längkriips läbi horisontaalse joone tähistab

järjestuse lõhet järjestuse jadas (contig sequence). Markeri D2S2169 positsioon kinnitab tühi-

mikku, mida on eelnevalt kirjeldatud PAC-kogust eraldatud PAC 106020-ga lõhe sildamise

abil 40. Näidatud on geeni MCM6 ehitus, sealhulgas laktaasi püsiva fenotüübiga seotud

variantide positsioon intronites 9 ja 13, mis asuvad LPH esimesest ATG-st 13,9 kb ja 22 kb

5'-suunas.

Joonisel 3 on Soome täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiaga perekondadelt pärit proovide püsi-

vate kromosoomide laiendatud haplotüübianalüüs, kasutades seitset tihedalt seotud mikrosa-

telliidi markerit. Haplotüübid, mis esindavad esivanematelt päritud algset (ancrestal founder)

püsivat kromosoomi, on varjutatud. Näidatud on mittepüsivate (non-persistent) kromosoo-

mide ainult need haplotüübid, mis esinesid ka püsivates kromosoomides. Esivanematelt pärit

EE – EP 1 417 305 B1

20

rekombinatsioonidele põhinedes võib täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia lookuse piirata vahe-

mikuni kuni 47 kb markerite LPH1 ja AC3 vahel.

Joonisel 4 on geeni MCM6 introni 13 järjestuses sisalduv järjestus (3220 bp), mis sisaldab

SNP-d positsioonis -13910, milles T, mis on spetsiifiline laktaasi püsivusele, on asendatud

C-ga. Nimetatud positsioon on näidatud väikest kirja kasutades. Käesolev järjestus viitab

järjestusele SEQ ID nr 1.

Joonisel 5 on geeni MCM6 introni 9 järjestuses sisalduv järjestus (1295 bp), mis sisaldab

SNP-d positsioonis -22018, milles A, mis on spetsiifiline laktaasi püsivat tüüpi järjestusele,

on asendatud G-ga. Nimetatud positsioon on näidatud väikest kirja kasutades. Käesolev

järjestus viitab järjestusele SEQ ID nr 2.

Joonisel 6 on geeni MCM6 laktaasi püsivat tüüpi introni 13 järjestus (3220 bp), mis sisaldab

positsioonis -13910 T-d. Nimetatud positsioon on näidatud väikest kirja kasutades. Käesolev

järjestus viitab järjestusele SEQ ID nr 3.

Joonisel 7 on geeni MCM6 laktaasi püsivat tüüpi introni 9 järjestus (1295 bp), mis sisaldab

positsioonis -22018 A-d. Nimetatud positsioon on näidatud väikest kirja kasutades. Käesolev

järjestus viitab järjestusele SEQ ID nr 4.

Joonisel 8 on geeni MCM6 introni 13 järjestuses sisalduv järjestus (3220 bp), mis sisaldab

SNP-d positsioonis -13910, milles A, mis on spetsiifiline laktaasi püsivat tüüpi järjestusele,

on asendatud C-ga. Nimetatud positsioon on näidatud väikest kirja kasutades. Käesolev

järjestus viitab järjestusele SEQ ID nr 5.

Joonisel 9 on geeni MCM6 introni 9 järjestuses sisalduv järjestus (1295 bp), mis sisaldab

SNP-d positsioonis -22018, milles A, mis on spetsiifiline laktaasi püsivat tüüpi järjestusele,

on asendatud G-ga. Nimetatud positsioon on näidatud väikest kirja kasutades. Käesolev

järjestus viitab järjestusele SEQ ID nr 6.

[0067] Leiutist illustreerivad näited.

Näide 1: Ahelduse ja ahelduse tasakaalustamatuse analüüsid

[0068] Analüüsiti Soome üheksa laiendatud hüpolaktaasiaga perekonna 2q21-s LPH geeniga

külgnevat D2S114 ja D2S2385 vahel asuvat seitset polümorfset mikrosatelliitide markerit

(joonis 1). Oluline tõend aheldusest leiti markeritega D2S314, D2S442, D2S2196 ja

EE – EP 1 417 305 B1

21

D2S1334, maksimaalne LOD skoor 7,67 θ = 0 juures saadi markeriga D2S2196 (tabel 1).

Rekombinatsiooni obligatoorsed sündmused tuvastati markeriga D2S114 (pere B IV3), mis

määratleb laktaasi püsivuse/mittepüsivuse lookuse tsentromeerse piiri, ning markeriga

D2S2385 (pere B, IV17), mis määratleb lookuse telomeerse piiri (joonis 1, tabel 1). Kriitilise

piirkonna viimistletud kaardistamiseks analüüsiti üheksat täiendavat polümorfset markerit

(tabel 1). Piirkonna ahelduse tasakaalustamatust (LD) jälgiti tuvastatud ahelduse suhtes

tingimuslikult, töödeldes alleelisagedusi ja rekombinatsioonifraktsiooni häirivate parameetri-

tena16-17. Kuus markerist üheksast (LPH13, LPH2, LPH1, AC3, AC4, ja AC10), mis ulatuvad

üle -200 kb vahemiku, näitasid väga olulist tõendit LD-st (p < 10-4), samas ei näidanud

markerid LPH geenist 3'-suunas LD-st mingeid tõendeid (tabel 1). Kaks markerit, LPH2 ja

AC3, näitasid laktaasi püsivuse alleelides kõige olulisemat ahelduse tasakaalustamatust

(p < 10-7).

[0069] Perekondlik materjal (family material) koosnes algselt Sahi5 poolt uuritud üheksast

Soome laiendatud sugupuust. Kogu perekondlikku materjali testiti täiskasvanu tüüpi hüpolak-

taasia suhtes 1970-tel aastatel. Käesolevaks uuringuks suurendati perekondlikku materjali,

kogudes DNA-d nooremate põlvkondade pereliikmetelt. Käesolevas uuringus koosnes pere-

kondlik materjal kokku 194 isiku andmetest (joonis 1). Kõikide pereliikmete, välja arvatud

49 isiku, fenotüüpiline seisund kinnitati laktoosi taluvuse testis etanooliga (LTTE)4-5. Kõikide

mõjutatud patsientide gluteenienteropaatia välistati seerumi IgA koevastase transglutaminaasi

mõõtmise45 kaudu. Pärast teadva nõusoleku saamist eraldati kõikidelt osalevatelt pereliikme-

telt võetud vereproovidest DNA vastavalt standardprotokollidele48. Tühisoole biopsiaproovi-

dest, milles olid mõõdetud sahharaasi aktiivsused47, eraldati haigusjuhtude kontrolluuringuna

196 juhuslikku DNA proovi, mis sekveneeriti Helsingi Ülikooli Kliinikumis. DNA eraldati

soolebiopsiatest vastavalt standardprotokollile48. Need seeriad hõlmasid 137 laktaasi püsi-

vuse ja 59 laktaasi mittepüsivuse proovi. Täiendavalt analüüsiti üheksa itaallase DNA-d, mis

saadi M. Ross’lt Napoli ülikoolist, üheksa sakslase DNA-proovi, mis saadi M. Lentze’lt

Bonni ülikoolist ja 22 lõuna-korealase soolebiopsia proovi, mis saadi J. K. Seo’lt Seouli

Rahvusülikoolist (tabelis on 23 korealast, 9 itaallast ja 7 sakslast (üks Saksamaalt saadud

haigusjuhtudest on pärit Lõuna-Koreast). Diagnoosimine põhines sahharaasi aktiivsuste

mõõtmisel. Lõpuks, et määrata C/T-13910 variandi sagedust Soome populatsioonis, analüüsiti

Soome ida- ja läänepoolsete väikeste valdade 938 anonüümse veredoonori DNA-d ning 109

CEPH-perekondadesse19 kuuluvate vanemate DNA-d. Lisaks analüüsiti paaviani (Papio

EE – EP 1 417 305 B1

22

hemedryas ussinus) maksabiopsia eraldatud genoomset DNA-d, kasutades standardproto-

kolle48. Uuring kiideti heaks Helsingi Ülikooli Haigla ja Soome Punase Risti Vereülekande-

teenistuse Eetikakomiteede poolt.

Näide 2: Laiendatud haplotüübianalüüs

[0070] Esimeses etapis analüüsiti kümmet väga polümorfset 2q21-s LPH geeniga külgnevat

mikrosatelliitide markerit mujal kirjeldatud viisil40,55. Lühidalt, analüüsiti kümmet The

Généthon Resource Center55 –st pärit väga polümorfset mikrosatelliitide markerit laktaasi

geeni 2q ümbruses järgmiste geneetiliste vahemaadega: CEN - D2S114 – 1 cm - D2S1334 –

0 cm - D2S2196 – 0 cm - D2S442 – 2 cm - D2S314 – 2 cm - D2S2385 – 1 cm - D2S2288 –

1 cm - D2S397 – 1 cm - D2S150 – 1 cm - D2S132. Markerite järjekord saadi enamasti

kromosoomi 2 YAC-jada füüsiliselt kaardilt (Chumakov et al., 199556), mida täiendati

Généthoni kaardiga. PCR viidi läbi kogumahus 15 µl, mis sisaldas 12 ng matriits-DNA-d,

5 pmol praimereid, 0,2 mM iga nukleotiidi, 20 mM TrisHCl (pH 8,8), 15 mM (NH4)2SO4,

1,5 mM MgCl2, 0,1% Tween 20, 0,01% želatiini ja 0,25 U Taq-polümeraasi (firma

Dynazyme, Finnzymes). Üks praimeritest oli 5'-lõpus radiomärgistatud 32P-γATP-ga. Reakt-

sioonid viidi läbi mitme süvendiga mikrotiiterplaadil, 35 tsüklit denatureerimisega tempera-

tuuril 94 °C 30 s, anniliimisega erinevatel temperatuuridel sõltuvalt praimerist 30 s ja

pikendamisega temperatuuril 72 °C 30 s, denaturatsioon toimus 3 min ja lõplik pikendamine

5 min. Amplifitseeritud fragmendid lahutati 6% polüakrüülamiidgeelis ja teostati autoradio-

graafia.

Teises etapis tuvastati üle LPH geeni konstrueeritud jada sees BAC-de (NH034L23,

NH0318L13, NH0218L22 ja RP11-32911) avaldatud genoomsest järjestusest üheksa mikro-

satelliitide markerit, kasutades Repeat Masker programmi (hftp://ftp.genome.washington.-

edu/cgi-bin/RepeatMasker). Praimerid sünteesiti kordusjärjestustega külgnevalt. PCR tingi-

mused olid sellised, nagu on kirjeldatud mujal40. Amplifitseeritud fragmendid lahutati 6%

polüakrüülamiidgeelis ja teostati autoradiograafia.

[0071] Paari kaupa LOD skoorid arvutati LINKAGE programmi paketi49 MLINK valikut

kasutades. Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia puhul eeldati täieliku penetrantsusega autosoom-

set retsessiivset pärilikkust, arvestamata rekombinatsiooni fraktsioonides soolisi erinevusi ja

haiguse alleelisagedust 0,4. Uuringusse kaasati ainult üle 20-aastased isikud, kuna seisund

EE – EP 1 417 305 B1

23

avaldub Soome populatsioonis selles vanuses5-6. Isikute LTTE-ga kinnitamata haigestumust

käsitleti kui tundmatut. Markerite alleelisagedust ja heterosügootsust hinnati perekondlikust

materjalist, kasutades parameetrite seose analüüsi eesmärgil Downfreq programmi49. Lisaks

teostati pseudomarkeri ahelduse ja ahelduse tasakaalustamatuse analüüsid, eeldades pärilik-

kuse autosoomset retsessiivset viisi16. LD test viidi läbi tuvastatud ahelduse tingimustes,

arvestades alleelisagedusi ja rekombinatsioonifraktsiooni häirivate parameetritena16,49. Nende

analüüside P-väärtused on toodud tabelis 1. Haplotüübid konstrueeriti mikrosatelliitide mar-

kerite jaoks käsitsi selles järjekorras: LPH1-LPH2-LPH13-AC7-AC3-AC4-AC5 (joonis 3).

Kokku oli meie perekondlikust materjalist haplotüübianalüüsiks saadaval 54 mittepüsivat

kromosoomi ja 33 püsivat kromosoomi.

[0072] Tihedalt seotud markerite järjekord kinnitati nelja BAC-klooni, NH0034L23,

NH0218L22, NH0318L13 ja 329110, assambleerimise abil kriitilises piirkonnas üheks katke-

matuks järjestuse segmendiks. See jada ulatus aspartüül-tRNA süntetaasi (DARS) geeni

markerist AC8 kuni eksonini 10 ning hõlmas kokku 222,5 kb (joonis 2). Põhinedes seotud

piirkonna sellel füüsilisel kaardil, konstrueeriti seitsme markeriga laiendatud haplotüübid,

mis hõlmavad 150 kb suurust vahemikku (CEN-LPH13-LPH2-LPH1-AC7-AC3-AC4-AC5-

tel) (joonis 3). Üks peamisi haplotüüpe esines 20-s püsivuse alleelis (60%) võrreldes kolme

mittepüsivuse alleeliga (5%), samas täheldati mittepüsivuse alleelides haplotüüpide suurt mit-

mekesisust. Ülejäänud 40% haplotüüpidest püsivuse alleelides erinesid esivanemate haplo-

tüübist viisil, mis on kooskõlas haplotüübi jaotusega ajalooliste rekombinatsioonisündmuste

kaupa. Konserveerunud haplotüübi analüüsile tuginedes võiks laktaasi püsivuse lookuse

piirata 47 kb suuruse vahemikuga markerite LPH1 ja AC3 vahel (joonis 3).

Näide 3: Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia lookuse järjestuse analüüs

[0073] Üheksa hüpolaktaasiaga perekonna mitme liikme genoomsest DNA-st amplifitseeriti

kattuvates PCR fragmentides markerite LPH1 ja AC3 vaheline 47 kb suurune piirkond ning

sekveneeriti. Piirkond sisaldab minikromosoomi säilitamise geeni (MCM6)18, mis katab

kriitilises 47 kb suuruses piirkonnas 36 kb (joonis 2). MCM6 geeni kodeerivas piirkonnas

muutusi ei tuvastatud, kuid kriitilises 47 kb suuruses piirkonnas määrati kindlaks kokku 52

varianti: 43 SNP-d ja 9 deletsiooni/insertsiooni polümorfismi (tabel 2). Soome perekondades

olid laktaasi püsivuse/mittepüsivuse tunnusega seotud ainult kaks varianti (C/T-13910,

EE – EP 1 417 305 B1

24

G/A-22018) (tabelid 2 ja 3). Esimene seotud variant, C/T-13910, asub geeni MCM6 intronis 13

positsioonis -13910 bp alates LPH geeni esimesest ATG-koodonist. Teine seotud variant,

G/A 22018, asub geeni MCM6 intronis 9 positsioonis -22018 alates LPH geeni esimesest ATG-

koodonist (joonis 2). Need kaks teineteisest 8 kb kaugusel asuvat varianti on üheksas Soome

laiendatud perekonnas täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiaga täiesti ko-segregeerunud. Kõik

(mittepüsiva) laktoositalumatusega pereliikmed olid nii C-13910 kui ka G-22018 suhtes homosü-

gootsed (tabel 3). Huvitaval kombel asuvad mõlemad need variandid korduselementides,

C/T-13910 L2-st pärit elemendis ja G/A-22018 Alu elemendis.

[0074] Esimeses etapis kasutati eksperimentaalseks sekveneerimiseks meie perekondlikust

materjalist kolme mittepüsivusega, 2 homosügootset püsivusega ja 2 heterosügootset püsivu-

sega isikut, kellel on kriitlises piirkonnas sarnane haplotüüp (joonis 1). Kasutades avaldatud

BAC-de genoomi järjestuse kavandit: NH0034L23, NH0218L22 NH0318L23 ja RP-329110,

mis hõlmas täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia kriitilist piirkonda, assambleeriti need üheks

jadaks, kasutades Sequencher 4 tarkvara (Gene Codes Corporation). Kavandati oligonukleo-

tiidpraimerid, mis katavad markerite LPH1 ja AC3 vahel kriitilist piirkonda (oligonukleotiid-

praimerite loetelu on kirjeldatud siin allpool). PCR amplifikatsioon viidi läbi kogumahus

50 µl genoomse DNA (100 ng), praimerite (20 ng igaüht), dNTP-de (200 µM), 0,5 U Taq-

polümeraasiga (firma Dynazyme, Finnzymes) standardpuhvris. Enamik PCR-dest amplifit-

seeriti järgmisi PCR tsükli tingimusi kasutades: esialgne denatureerimine temperatuuril 94 °C

3 min, seejärel 35 tsüklit temperatuuril 94 °C 30 s, temperatuuril 55 °C 30 s ja temperatuuril

72 °C 1,25 min ning lõplik pikendamine temperatuuril 72 °C 10 min, välja arvatud juhtudel,

kui PCR produktid olid suuremad kui 1 kb, sel juhul kasutasime Dynazyme pikendamise

komplekti (tingimused on kirjeldatud siin allpool). Puhastatud PCR produktid (15-40 ng)

sekveneeriti tsükliliselt, kasutades BigDye Terminator kemikaale (firma PE Biosystems).

Andmed analüüsiti, kasutades programme ABI Sequencing Analysis 3.3 (firma PE

Biosystems) ja Sequencher 4.1 (firma Gene Codes).

Laktaasi variantide tuvastamine sekveneerimise abil

[0075] PCR amplifikatsioonid viidi läbi kogumahus 50 µl genoomse DNA (100 ng), prai-

merite (20 ng igaüht), dNTP-de (200 µM), 0,5 U Taq-polümeraasiga (firma Dynazyme,

Finnzymes) standardpuhvris. Mõlemad PCR-d amplifitseeriti järgmisi PCR tsükli tingimusi

EE – EP 1 417 305 B1

25

kasutades: esialgne denatureerimine temperatuuril 94 °C 3 min, seejärel 35 tsüklit tempe-

ratuuril 94 °C 30 s, temperatuuril 55 °C 30 s ja temperatuuril 72 °C 1,25 min ning lõplik

pikendamine temperatuuril 72 °C 10 min. Puhastatud PCR produktid (15-40 ng) sekveneeriti

tsükliliselt, kasutades BigDye Terminator kemikaale (firma PE Biosystems). Andmed ana-

lüüsiti, kasutades programme ABI Sequencing Analysis 3.3 (firma PE Biosystems) ja

Sequencher 4.1 (firma Gene Codes).

Laktaasi variantide sõelumine tahke faasi minisekveneerimise abil

[0076] C/T-13910 varianti hõlmav DNA fragment amplifitseeriti, kasutades ühte biotinüülitud

(5'-Bio-CCTCGTTAATACCCACTGACCTA-3') praimerit ja biotinüülimata (5'-GTCACT-

TTGATATGATGAGAGCA-3') praimerit. G/A-22018 puhul kasutati eespool kirjeldatud

tingimustes biotinüülitud (5'-Bio-TGCTCAGGACATGCTGATCAA-3') ja ühte biotinüüli-

mata (5'-CTACCCTATCAGTAAAGGCCTA-3') praimerit. 10 µl PCR produkti püüti strep-

tavidiiniga kaetud mikrotiiterplaadile (firma Lab systems, Finland). Süvendid pesti ning

seondunud DNA denatureeriti järgnevates viidetes Syvänen et al. (Am J Hum Genet., (1993)

52, 46-59) ja Syvänen, Landegren (Hum Mutat., (1994) 3, 172-9) kirjeldatud viisil. 50 µl

minisekveneerimise reaktsioonisegu sisaldas minisekveneerimise praimereid C/T-13915

(5'-GGCAATACAGATAAGATAATGTAG-3') ja G/A-22018 (5'-AAAAACAGCATTCTC-

AGCTGGGC-3') jaoks 10 pmol ning vastavalt 0,1 µl kummatki, H-dCTP-d, H-dGTP-d,

mida kasutatakse laktaasi mittepüsivuse alleeli puhul (115 Ci/mmol; firma Amersham, UK),

või H-dTTP-d, H-sATP-d, mida kasutatakse laktaasi püsivuse alleeli puhul, ning 0,05 ühikut

DNA polümeraasi (firma Dynazyme II, Finnzymes) oma puhvris, mis lisati igasse süven-

disse. Mikrotiiterplaate inkubeeriti 20 min temperatuuril 50 °C ning süvendid pesti. Tuvasta-

miseks elueeriti ja elueeritud lahuse radioaktiivsus mõõdeti vedelikstsintillatsiooniloenduriga

(Rackbeta 1209, Wallac, Soome). Iga PCR produkti kohta viidi läbi kaks paralleelset

minisekveneerimise reaktsiooni.

PCR praimerid ja C/T-13910 variandi tuvastamise praimer:

EE – EP 1 417 305 B1

26

Päripidine PCR praimer GTCACTTTGATATGATGAGAGCA Tm 58 SEQ ID nr: 8

Tuvastamise praimer GGCAATACAGATAAGATAATGTAG Tm 58 SEQ ID nr: 10

Bio-äraspidine praimer Bio-cCTCGTTAATACCCACTGACCTA Tm 62 SEQ ID nr: 9

või Bio-TAGGTCAGTGGGTATTAACGAGGT SEQ ID nr: 7

PCR praimerid ja G/A-22018 variandi tuvastamise praimer

Päripidine PCR praimer: CTACCCTATCAGTAAAGGCCTA Tm 58 SEQ ID nr: 12

Tuvastamise praimer: AAAAACAGCATTCTCAGCTGGGC Tm 62 SEQ ID nr: 14

Bio-äraspidine praimer: Bio-TGCTCAGGACATGCTGATCAA Tm 62 SEQ ID nr: 13

või Bio-TTGATCAGCATGTCCTGAGCA SEQ ID nr: 11

Näide 4: DNA variantide jälgimine haigusjuhtumi/kontrolluuringu proovis

[0077] C/T-13910 ja G/A -22018 variantide sagedust analüüsiti DNA proovides, mis eraldati

kokku 196 isiku soolebiopsia proovidest, mille sahharaasi aktiivsust oli analüüsitud hüpolak-

taasia diagnostilise testina. Esmane laktaasipuudulikkus ilmnes kokku 59 proovis. Kuus 59-st

haigusjuhust (tabel 3) olid heterosügootsed G/A -22018 variandi GA suhtes, ülejäänud 53 olid

G-alleeli suhtes homosügootsed. Kõik 59 proovi olid homosügootsed variandi C/T-13910

C-alleeli suhtes. Laktaasi püsivus ilmnes 137 haigusjuhu puhul, 74 leiti olevat homosügoot-

sed alleelide T ja A suhtes, 63 olid heterosügootsed CT ja GA suhtes ning mitte keegi ei

olnud homosügootne C/T-13910–s ja G/A-22018-s vastavalt C ja G suhtes (tabel 3).

[0078] Analüüsimaks neid variante teistes populatsioonides, sekveneeriti määratud sahharaa-

sipuudulikkusega haigusjuhtudega 40 mittesoomlase soolebiopsia proovidest eraldatud DNA

proovid: 23 haigusjuhtu olid pärit Lõuna-Koreast, 9 Itaaliast ja 8 Saksamaalt. Ühe itaallase

haigusjuhtumi puhul oli GA heterosügootne G/A-22013 suhtes, samas olid ülejäänud 39 haigus-

juhtu C/T-13910 ja G/A-22018 suhtes vastavalt CC ja GG homosügootsed (tabel 3). Laiendatud

uuringuga saadud andmed on esitatud tabelis 7, mis esindavad andmeid C/T-13910 variandi

täielikust seosest biokeemiliselt tõendatud hüpolaktaasiaga (laktaasi mittepüsivusega) 6 eri-

EE – EP 1 417 305 B1

27

nevasse populatsiooni kuuluval 400 isikul. G/A-22018 variant oli laktaasi mittepüsivusega

seotud 401-st haigusjuhust 400-l.

Näide 5: Laktaasi püsivuse variandi C/T-13910 molekulaarne epidemioloogia

[0079] Et jälgida hüpolaktaasiaga seotud variandi levimust Soome populatsioonis kasutati

938 anonüümse soome veredoonori, kes on pärit kas Soome läänepoolsest varasema asustu-

sega piirkonnast või idapoolsest hilisema asustusega piirkonnast, DNA proovide sõelumiseks

tahke faasi minisekveneerimise meetodit19,20 (tabel 4). Eksperimentaalselt amplifitseeriti

C/T-13910 varianti hõlmav DNA fragment, kasutades ühte biotinüülitud (5'-CCTCGTTAA-

TACCCCTGACCTA-3') praimerit ja biotinüülimata (5'-GTCACTTTGATATGATGAGAG-

CA-3') praimerit. G/A-22018 puhul kasutati eespool kirjeldatud tingimustes ühte biotinüülitud

(5'-AGTCTGTGGCATGTGTCTTCATG-3') ja ühte biotinüülimata ('5-TGCTCAGGACAT-

GCTGATCAACT-3') praimerit. 10 µl PCR produkti püüti streptavidiiniga kaetud mikrotii-

terplaadile (firma Lab systems, Finland). Süvendid pesti ning seondunud DNA denatureeriti

eelnevalt kirjeldatud19,20 viisil, 50 µl minisekveneerimise reaktsioonisegu sisaldas minisekve-

neerimise praimereid G/A-22005 (5'-GACAAAGGTGTGAGCCACCG-3'), G/A-13915 (5'-GGC-

AATACAGATAAGATAATGTAG-3') jaoks 10 pmol ning vastavalt 0,1 µl kas H-dCTP-d

laktaasi mittepüsivuse alleeli puhul (115 Ci/mmol; firma Amersham, UK) või H-dTTP-d

laktaasi püsivuse alleeli puhul, ning 0,05 ühikut DNA polümeraasi (firma Dynazyme II,

Finnzymes) oma puhvris, mis lisati igasse süvendisse. Mikrotiiterplaate inkubeeriti 20 min

temperatuuril 50 °C, seejärel süvendid pesti. Tuvastamise praimer elueeriti ja elueeritud

vedeliku radioaktiivsus mõõdeti vedelikstsintillatsiooniloenduriga (Rackbeta 1209, Wallac,

Soome). Iga PCR produkti kohta viidi läbi kaks paralleelset minisekveneerimise reaktsiooni.

Oletatava hüpolaktaasia genotüübi CC-13910 (170 haigusjuhtu) üldine levimus oli 18,1% kõr-

gema levimusega (16,8% versus 18,9%) läänepoolsetes proovides võrreldes idapoolsete

proovidega (tabel 4). Need väärtused langevad hästi kokku epidemioloogilise uuringuga,

milles teatati levimusest 17% soome keelt kõnelevate soomlaste hulgas, kasvava gradiendiga

Läänest Ida poole2. Sama proovide valim genotüpiseeriti ka G/A-22018 polümorfismi uurimi-

seks ja nende kahe SNP vahelist LD-d jälgiti D'-statistikat21 kasutades. Leiti, et need olid

peaaegu täielikus LD-s (D = 0,98, p = 7,62 × 10-11, tabel 5).

EE – EP 1 417 305 B1

28

[0080] On teada, et hüpolaktaasia levimus erinevates populatsioonides on väga erinev,

varieerudes vähem kui 5% kuni peaaegu 100%3,6. Et teha kindlaks, kas need muutused

hüpolaktaasia levimusest korreleeruvad genotüübi CC-13910 levikuga, analüüsiti CEPH-pere-

kondade22 vanemate DNA-d. CEPH-perekonnad on kogutud peamiselt Prantsusmaalt, kus on

teatanud hüpolaktaasia levimuseks ligikaudu 37%23, ja Utah’st, Utah’ Põhja-Euroopast pärit

populatsioonist, hüpolaktaasia levimusega vähem kui 5%24. CEPH-perekondade vanemate

genotüpiseerimisel selgus, et 41,2% (7 proovi 17-st proovist) Prantsusmaa perekondadest on

CC genotüüp, samal ajal on CC genotüüp ainult 7,6% (7 proovi 92-st proovist) Utah’ pere-

kondadest (tabel 4 ).Taas, vaatamata analüüsitud proovide väikesele arvule, langevad need

arvud kokku epidemioloogilistel uuringutel saadud hüpolaktaasia väärtustega nendes populat-

sioonides23,24.

Tabelis 8 on näidatud, et variantide täheldatud levimus langeb hästi kokku laktoositalumatuse

kirjeldatud sagedusega nendes populatsioonides.

Näide 6: Laktaasi püsivuse variandi C/T-13910 genealoogia

[0081] Soome perekondade haplotüübianalüüs vihjas, et Soomes põlvneb enamik kui mitte

kõik laktaasi püsivuse alleelidest ühest ühisest esivanemast. Püsivuse alleeli Soome popu-

latsiooni introdutseerimise aja hindamiseks kasutati ahelduse tasakaalustamatust25. Võttes

põlvkonna pikkuseks 20 aastat näitab see hinnang, et algne mutatsioon introdutseeriti Soome

populatsiooni umbes 9000-11400 aastat tagasi (tabel 6). See langeb hästi kokku esimeste

märkidega asustuskohtadest Soome maismaal umbes 8000-9000 aastat tagasi26 ja ühtiks

piisavalt hästi piimakarjakasvatuse algusega 8000-10000 aastat eKr27. Veelgi tähtsam on, et

sama DNA variandi esinemine püsivuse alleelides erinevates populatsioonides vihjab sellele,

et see variant on veel iidsem ja mutatsioon on toimunud enne analüüsitud populatsioonide

lahknemist.

[0082] Et saada aimu laktaasi alleeli fülogeneetilisest päritolust, sekveneeriti paaviani (Papio

hamadryas) geeni MCM6 intron 9 ja osa intronist 13. Paavianide DNA-s esines GG ja CC

genotüüp nii G/A-22018-s kui ka C/T-13910-s. See võiks viidata, et alleelid G ja C kajastavad

vastavalt algse alleeli ilmumist, esindades mittepüsivuse tüüpi, ning mutatsioon on selle

alleeli transformeerinud, tekitades püsivuse alleeli. Seda oletust toetab LD kindlakstegemine

EE – EP 1 417 305 B1

29

ja ühine haplotüüp püsivuse alleelides versus mittepüsivuse alleelides leitud väga suur allee-

lide mitmekesisus.

Näide 7: C/T ja G/A variantide paarikaupa LD

[0083] C/T-13910 ja G/A-22018 vahelist paarikaupa LD-d hinnati, kasutades D'-statistikat21.

Haplotüübi sagedust hinnati maksimaalse tõenäosuse kaudu, kasutades EH programmi50. D'

arvutati kui max (D/Dmax, D/Dmin), milles tasakaalustamatuse arvväärtus D = hpq - pq, milles

hpq on harvaesinevat alleeli sisaldava haplotüübi sagedus igas lookuses, p ja q on harva-

esinevate alleelide sagedus lookustes 1 ja 2 ning Dmax = min p(1 - p),q(1 - q), kui D > 0 ja

Dmin = -min pq, (1 - p)(1 - q), kui D < 0. D' kõrvalekalde olulisus alates nullist määrati,

kasutades statistikat

,

mis jagatakse, kui χ2 1 df-ga21.

Geenide andmebaasi registreerimisnumbrid

BAC-de puhul on NH0218L22, N0034L34, NH0318L13 ja RP11-329110 vastavalt

AC012551, AC011893, AC011999 ja AC016516. Inimese polümorfismide puhul on regist-

reerimisnumbrid andmebaasis GenBank AF395607-AF395615.

Viited

[0084]

1. Flatz, G. & Rotthauwe, H., The human lactase polymorphism: physiology and genetics of

lactose absorption and malabsorption. Prog. Med. Genet., 2, 205-249 (1977).

2. Sahi, T., Isokoski, M., Jussila, J. & Launiala, K., Lactose malabsorption in Finnish

children of school age. Acta Paediatr. Scand., 61, 11-16 (1972).

3. Wang, Y. et al., The genetically programmed down-regulation of lactase in children.

Gastroenterology, 114, 1230-1236 (1998).

EE – EP 1 417 305 B1

30

4. Sahi, T., Isokoski, M., Jussila, J., Launiala, K. & Pyörälä, K., Recessive inheritance of

adult-type lactose malabsorption. Lancet, 823-826 (1973).

5. Sahi, T., The inheritance of selective adult-type lactose malabsorption. Scand. J.

Gastroenterol. suppl., 30, 1-73 (1974).

6. Sahi, T. Genetics and epidemiology of adult-type hypolactasia. Scand. J. Gastroenterol.

suppl., 202, 7-20 (1994).

7. Boll, W., Wagner, P. & Mantei, N., Structure of the chromosomal gene and cDNAs coding

for lactase-phlorizin hydrolase in human with adult-type hypolactasia or persistence of

Lactase. Am. J. Hum. Genet., 48, 889-902 (1991).

8. Mantei, N. et al., Complete primary structure of human and rabbit lactase-phlorizin

hydrolase: implications for biosynthesis, membrane anchoring and evolution of the enzyme.

EMBO J., 7, 2705-2713 (1988).

9. Wang, Y. et al., The lactase persistence/non-persistence polymorphism is controlled by a

cis-acting element. Hum. Mol. Genet., 4, 657-662 (1995).

10. Harvey, C. B., Pratt, W. S., Islam, I., Whitehouse, D. B. & Swallow, D. M., DNA

polymorphisms in the lactase gene: linkage disequilibrium across the 70 kb region. Eur. J.

Hum. Genet., 3, 27-41 (1995).

11. Escher, J. C et al., Molecular basis of lactase levels in adult humans. J. Clin. Invest., 89,

480-483 (1992).

12. Lloyd, M. et al., Regulation of intestinal lactase in adult hypolactasia. J. Clin. Invest., 89,

524-529 (1992).

13. Fajardo, O., Naim, H. Y. & Lacey, S. W., The polymorphic expression of lactase in

adults is regulated at the messenger RNA level. Gastroenterology, 106, 1233-

14. Luigi, M. et al., Mosaic regulation of lactase in human adult-type. Gastroenterology, 112,

1506-1514 (1997).

15. Rossi, M. et al., Lactase persistence versus decline in human adults: Multifactorial events

are involved in down-regulation after weaning. Gastroenterology, 112, 1506-1514 (1997).

16. Göring, H. H. H. & Terwilliger, J. D., Linkage analysis in the presence of errors IV: Joint

pseudomarker analysis of linkage and / or linkage disequilibrium on a mixture of pedigrees

and singletons when mode of inheritance cannot be accurately specified. Am. J. Hum. Genet.,

66, 1310-1327 (2000).

EE – EP 1 417 305 B1

31

17. Terwilliger, J. D. & Göring, H. H. H., Gene mapping in the 20th and 21st centuries:

Statistical methods, data analysis, and experimental design. Hum. Biol., 72, 63-132 (2000).

18. Harvey, C. B. et al., Regional localization of the lactase-phlorizin hydrolase, LCT, to

chromosome 2q21. Ann. Hum. Genet., 57, 179-185 (1993).

19. Syvänen, A-C., Sajantila, A., Lukka, M., Identification of individuals by analysis of

biallelic DNA markers, using PCR and solid-phase minisequencing. Am. J. Hum. Genet., 52,

46-59 (1993).

20. Syvänen, A-C. & Landegren, U., Detection of point mutations by solid-phase methods.

Hum. Mutat., 3, 172-179 (1994)

21. Thompson, E. A., Deeb, S., Walker, D. & Motulsky, A. G., The detection of Linkage

disequilibrium between closely linked markers:RFLPs at the Al-CIII Apolipoprotein genes.

Am. J. Hum. Genet., 42, 113-124 (1998).

22. Dausset, J. et al., Centre d'étude du polymorphisme humain (CEPH): Collaborative

genetic mapping of human genome. Genomics, 6, 575-577 (1990).

23. Cuddenec, Y., Delbrück, H. & Flatz, G., Distribution of the adult lactase phenotypes-

lactose absorber and malabsorber in a group of 131 army recruit. Gastroenterol. Clin. Biol., 6,

776-779 (1982):

24. McLellan, T., Jorde, L. B. & Skolnick, M. H., Genetic distance between the Utah

Mormons and related populations. Am. J. Hum. Genet., 36, 836-857 (1984).

25. Terwilliger, J. D., A powerful likelihood method for the analysis of linkage

disequilibrium between trait loci and one or more polymorphic marker loci. Am. J. Hum.

Genet., 56, 777-787 (1995).

26. Nunez, M. G., A model of the early settlement of Finland. Fennosscandia archaelogica

IV, 3-18 (1997).

27. Simoons, F. J., Primary adult lactose intolerance and the milking habit: a problem in

biological and cultural interrelations.II. A cultural historical hypothesis. Am. J. Dig. Dis., 16,

695-710 (1970).

28. Varilo, T. et al.,The age of human mutation:genealogical and linkage disequilibrium

analysis of the CLN5 mutation in the Finnish population. Am. J. Hum. Genet., 58, 506-512

(1996).

29. Hästbacka, J. et al., Linkage disequilibrium mapping in isolated founder populations:

diastrophic dysplasia in Finland. Nature Genet., 2, 204-211 (1992).

EE – EP 1 417 305 B1

32

30. Harvey C. B. et al., Lactase haplotype frequencies in Caucasians: association with the

lactase persistence/non persistence polymorphism. Ann. Hum. Genet., 62, 215-223 (1998).

31. Ohtani, K. et al., Cell growth-regulated expression of mammalian MCM5 and MCM6

genes mediated by the transcription factor E2F. Oncogene, 18, 2299-2309 (1999).

32. Smith, A. F. A., The origin of interspersed repeats in the human genome. Curr. Opin.

Genet. Dev., 6, 743-748 (1996).

33. Kazazian, H. H. & Moran, J. V., The impact of L1 retrotransposons on the human

genome. Nature Genet., 19, 19-24 (1998).

34. Moran, J. V., DeBerardinis, R. J. & Kazazian, H. H., Exon shuffling by L1

retrotransposition. Science, 283, 1530-1534 (1999).

35. Wei, W. et al., Human L1 retrotransposition: cis preference versus trans

complementation. Mol. Cell. Biol., 21, 1429-1439 (2001).

36. Donnelly, S. R., Hawkins, T. E. & Moss, S. E., A conserved nuclear element with a role

in mammalian gene regulation. Hum. Mol. Genet., 8 (9), 1723-1728 (1999).

37. Boeke, J. D., LINEs and Alus - the polyA connection. Nature Genet., 16, 6-7 (1997).

38. Jurka, J., Sequence patterns indicate an enzymatic involvement in integration of

mammalians retroposons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, 1872-1877 (1997).

39. Savilahti E, Launiala K, Kuitunen P., Congenital lactase deficiency. Arch. Dis. Child., 58,

246-252 (1983).

40. Järvelä, I. et al., Assignment of the locus for congenital lactase deficiency to 2q21, in the

vicinity of but separate from the lactase-phlorizin hydrolase gene. Am. J. Hum. Genet., 63,

1078-1085 (1998).

41. Simoons, F. J., The geographic hypothesis and lactose malabsorption. A weighing of the

evidence. Am. J. Dig. Dis., 23, 963-980 (1978).

42. Flatz, G. & Rotthauwe, H. W., The human lactase polymorphism: physiology and

genetics of lactose absorption and malabsorption. Prog. Med. Genet., 2, 205-249 (1977).

43. McCracken, R. D., Lactase deficiency: an example of dietary evolution. Curr. Anthropol.,

12, 479-517 (1971).

44. Arola, H. et al., Diagnosis of hypolactasia and lactose malabsorption. Scand. J.

Gastroenterol. suppl., 202, 26-35 (1994).

45. Sulkanen, S. et al., Tissue transglutaminase autoantibody enzyme-linked immunosorbent

assay in detecting celiac disease. Gastroenterology, 115 (6), 1322-1328 (1998).

EE – EP 1 417 305 B1

33

46. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T., Molecular cloning: a laboratory manual, (2nd

ed). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

47. Messer, M. & Dahlqvist. A., A one - step ultramicro method for the assay of intestinal

disaccharidases. Anal. Biochem., 14 (3), 376-92 (1966).

48. Cottingham, Jr. R. W., Idury, R. M. & Schaffer, A. A., Faster sequential genetic linkage

computations. Am. J. Hum. Genet., 53, 252-263 (1993).

49. Göring, H. H. H. & Terwilliger, J. D., Linkage analysis in the presence of errors III:

Marker loci and their map as nuisance parameters. Am. J. Hum. Genet., 66,1298-1309

(2000).

50. Terwilliger, J. D. & Ott, J., Handbook of human genetic analysis. Johns Hopkins

University Press, Baltimore (1994).

51. Osborne et al., Curr. Opin. Chem. Biol. I, 5-9 (1997).

52. Stall, Szoka, Pharm. Res., 12 465-483 (1995).

53. Harlow, Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor,

USA, 1988.

54. Higgins, Hames (eds.), "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press,

Oxford 1985.

55. Dib C., Faure S., Fizames C., Samson D., Drouot N., Vignal A., Millasseau P., Marc S.,

Hazan J., Seboun E., Lathrop M., Gyapay G., Morissette J., Weissenbach J., A

comprehensive genetic map of the human genome based on 5264 microsatellites. Nature,

1996 Mar 14, 380 (6570), 152-4.

56. Chumakov I. M., Rigault P., Le Gall I., Bellanne-Chantelot C., Billault A., Guillou S.,

Soularue P., Guasconi G., Poullier E., Gros I. et al., A YAC contig map of the human

genome. Nature, 1995 Sep 28, 377(6547 suppl.), 175-297.

Tabel 1. Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiaga perekondade ahelduse ja ahelduse tasakaalusta-

matuse analüüsid (viimistletud kaardistamise markerid on toodud paksus kirjas)

Marker LOD skoor(Z) Θ juures p-väärtusa

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4

D2S114 -∞ 2,44 1,92 1,13 0,41 0,87195

P6112 2,76 2,20 1,45 0,75 0,22 0,66207

EE – EP 1 417 305 B1

34

Marker LOD skoor(Z) Θ juures p-väärtusa

D2S1334 3,15 2,45 1,61 0,84 0,25 0,91039

AC8 2,26 1,99 1,36 0,71 0,21 0,53670

LPH13 3,67 2,94 1,96 1,03 0,31 4 x 10-6

LPH2 4,09 3,07 2,00 1,00 0,26 5,7 x 10-7

LPH1 5,91 4,52 2,96 1,53 0,46 5 x 10-6

AC7 3,63 2,60 1,66 0,83 0,23 0,03471

AC3 6,63 4,88 3,16 1,61 0,44 32 x 10-8

AC4 3,07 2,22 1,42 0,71 0,19 4 x 10-5

AC5 5,33 4,10 2,72 1,39 0,39 0,02166

AC10 6,60 4,99 3,25 1,65 0,46 1 x 10-5

D2S2196 7,67 5,62 3,62 1,85 0,54 0,00010

D2S442 3,81 3,08 2,08 1,03 0,27 0,2805

D2S314 4,22 3,61 2,50 1,37 0,45 0,27535

D2S2385 -∞ 2,79 1,92 1,01 0,28 0,46457

a: p-väärtused on saadud, kasutades antud ahelduse tasakaalustamatuse testi 10, 49

Tabel 2. Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia lookuses kindlakstehtud muutused Soome

perekondades

Positsioona Variant Laktaasi püsivus

(homosügootne)

Laktaasi püsivus

(heterosügootne)

Laktaasi mittepüsivus

BIV4 AIV3 BIV8 CIV3 BIV9 DIV4 EIII2b

-694 A→G AA AA AG AA GG Nc AA

-1640/50 T13-T12 T13/13 T13/13 T13/13 T13/13 T13/13 T12/12 T12/12

-2131 C→T CC CC CT CC TT CT* TT

-3058/72 T15→T16 T15/15 T15/15 T15/15 T15/15 T15/15 T16/16 T16/16

-3075 G→T GG GG GG GG GG GG TT

-4480 T→A TT TT TA TT AA TT TT

-5440 C→T CC CC CT CC TT CC CC

-5926 A→T AA AA AA AA AA TA TT

-8540 G→A GG GG GA GA AA AG AA

-8630 C→G CC CC CG CG GG GC GG

EE – EP 1 417 305 B1

35

Positsioona Variant Laktaasi püsivus (homosügootne)

Laktaasi püsivus (heterosügootne)

Laktaasi mittepüsivus

BIV4 AIV3 BIV8 CIV3 BIV9 DIV4 EIII2b

-13495 T→C TT TT TC TT CC CT CC

-13910 T→C TT TT TC TC CC CC CC

-15239 G→A GG GG GA GG AA AG AA

-15862 T→C CC CC CT CC TT TC TT

-16568/79 T11→T12 T11/11 T11/11 T11/12 T11/11 T12/12 T11/11 T12/12

-16888 A→G AA AA GA AA GG GA GG

-17300 C→T CC CC CC CC CC CT TT

-19044 T→C TT TT TC TT CC CT CC

-19519 T→C TT TT TC TT CC TT TT

-20077 C→G CC CC CG CC GG GC GG

-20486 G→A GG GG GA GG AA GG GG

-21721/28 A7→A6 A7/7 A7/7 A7/7 A7/7 A7/7 A7/A6 A7/7

-21731 A→C AA AA AA AA AA CC AA

-21736/43 A9→A8 A9/9 A9/9 A9/A8 A9/9 A8/8 A8/8 A8/8

-22018 G→A AA AA AG AG GG GG GG

-22741 C→T CC CC CC CC CC N TT

-22788 A→G AA AA AG AA GG N GG

-23069 A→G AA AA AG AA GG N GG

-23442 A→G AA AA AA AA AA N GG

-23771 T→C TT TT TT TT TT N CC

-25093/23 ∆30bp ∆∆ ∆∆ ∆∆ ∆∆ ∆∆ N II

-27310 A→G AA AA AG AA GG GA GG

-27480 G→A GG GG GA GG AA AG AA

-27807 A→C AA AA AA AA AA AC GC

-30183 A→G AA AA AG AA GG AA AA

-31268 A→G AA AA AG AA GG AA AA

-31342 T→C TT TT TT TT TT CT CC

-33645 C→T CC CC CT CC TT CC CC

-35176 T→C TT TT TC TT CC CT CC

-36254 C→T CC CC CT CC TT TC TT

EE – EP 1 417 305 B1

36

Positsioona Variant Laktaasi püsivus (homosügootne)

Laktaasi püsivus (heterosügootne)

Laktaasi mittepüsivus

BIV4 AIV3 BIV8 CIV3 BIV9 DIV4 EIII2b

-36296 G→T TT TT TG TT GG TG N

-36501 A→T AA AA AT AA TT AT N

-36506/14 ∆ 9 bp ∆∆ ∆∆ ∆I ∆∆ II ∆I N

-36671/77 T7→T6 T7/7 T7/7 T7/6 T7/7 T6/6 T7/7 T7/7

-37565 T→G TT TT TG TT GG GG TG

-38276 G→C GG GG GC GG CC GG GG

-39036 G→C GG N GC N CC N N

-40608 G→C GG GG GG GG GG GC CC

-41590 T→C TT TT TC TT CC CT CC

-42081/82 ∆AG AG AG AG/∆ AG ∆∆ AG AG

-42618 T→C TT TT TC TT CC TT TT

-42893 G→A GG GG GA GG AA GG GG

a: arv alates LPH geeni translatsiooni initsiatsioonikoodonist (ATG), kasutades koostatud BAC-de NH034L23, NH0218L22, NH0318L13 ja RP11-329I10 genoomset järjestust, b: isikud, sekveneeritud uuritud Soome perekondadest ning osutatud noolega joonisel 1, c: ei ole määratud

Tabel 3. C/T-13910 & G/A-22018 genotüüpide levik laktaasi püsivates/mittepüsivates alleelides

C/T-13910 G/A-22018 Kokku

Genotüüp CC CT TT GG GA AA

Perekonnaliikmed laktaasi mittepüsivus 45 0 0 45 0 0 45

laktaasi püsivus 0 32 13 0 32 13 45

Haigusjuhu - kontrolli proovid

soomlased laktaasi mittepüsivus 59 0 0 53 6 0 59

laktaasi püsivus 0 63 74 0 63 74 137

mittesoomlaseda laktaasi mittepüsivus 40 0 0 39 1 0 40

laktaasi püsivus 0 5 0 0 5 0 5

Kokku laktaasi mittepüsivus 0 144

laktaasi püsivus 187

EE – EP 1 417 305 B1

37

C/T-13910 G/A-22018 Kokku

Genotüüp CC CT TT GG GA AA

a: mittesoomlaste valim koosneb 23 Lõuna-Korea, 9 Itaalia ja 7 Saksa isikust

Tabel 4. C/T-13910 variandi levimus populatsioonide proovides

Analüüsitud DNA proovid

Genotüüp Kokku Alleeli sagedus (%) (CC) genotüüp, %

CC CT TT C T

I. Soome populatsioon

1. idapoolsed piirkonnad

108 287 176 571 0,440 0,560 18,9%

2. läänepoolsed piirkonnad

62 159 146 367 0,385 0,615 16,8%

Kokku 170 446 322 938 0,418 0,582 18,1%

II. CEPH-perekonnad:

1. Utah’ perekonnad 7 33 52 92 0255 0,745 7,6%

2. Prantsuse perekonnad 7 9 1 17 0,676 0,324 41,2%

Kokku analüüsiti Soome ida- ja läänepoolsete väikeste valdade 938 anonüümse vere-doonori DNA proove ning 109 CEPH-perekondadesse kuuluvate vanemate DNA proove. Hüpolaktaasia levimust populatsioonides peegeldab CC alleelide genotüübi esinemise sagedus.

Tabel 5. C/T-13910 ja G/A-220018 variantide vaheline LD soomlaste juhuslikes proovides

Genotüüp C/T-13910 puhul

Kokku D' χ2(1 dt) p-väärtus

CC CT TT

Genotüüp G/A-220018 puhul

GG 162 2 1 165

GA 6 440 3 449

AA 2 4 318 324

Kokku 170 446 322 938 0,984 42,41 7,62x10-11

LD arvutati D' statistikat18 kasutades, p-väärtus on D' olulisus alates nullist, nagu on kirjeldatud meetodites18.

EE – EP 1 417 305 B1

38

Tabel 6. C/T-13910 variandi Soome populatsiooni introdutseerimise hinnang, kasutades

DISLAMB programmi

Marker AC3 LPH2

Alleel Laktaasi püsivus Laktaasi mittepüsivus Laktaasi püsivus Laktaasi mittepüsivus

1 0 1 0 1

2 31 10 0 20

3 0 1 0 14

4 2 9 32 15

5 0 31 0 2

λa 0,838 0,999

Θb 0,00031 (0,000038-0,00099) 0,0000(0,00000-0,00052)

nc 570 450

a: λ on teatud alleeli kasvu proportsioon haigusega seotud kromosoomides (laktaasi püsivuse alleel) võrreldes selle sagedusega populatsioonis (0,60). b: Θ on rekombinatsioonifraktsioon, mis kajastab mutatsiooni kaugust lähimast markerist, eeldusel, et 1 cm = 1 Mb. c: n on põlvkondade arv alates algse mutatsiooni introdutseerimisest populatsiooni, rakendades valemit λ, = α (1 - Θ)n d: Hüpoteetiline alleel, mida kasutati arvutustes, kui Θ on null ja α on üks.

Tabel 7. Laktoositalumatuse variantide levimus biokeemiliselt kontrollitud proovides

C1T13910 G/A22018

Arv

Populatsioon CC CT TT GG GA AA

1. soomlased

laktaasi püsivus 182 0 95 87 0 95 87

laktaasi mittepüsivus 116 116 0 0 110 6 0

2. itaallased

laktaasi püsivus 7 0 7 0 0 7 0

laktaasi mittepüsivus 23 23 0 0 22 1 0

3. sakslased

laktaasi püsivus 0 0 0 0 0 0 0

laktaasi mittepüsivus 8 8 0 0 8 0 0

4. somaallased

EE – EP 1 417 305 B1

39

C1T13910 G/A22018

Arv

Populatsioon CC CT TT GG GA AA

laktaasi püsivus 0 0 0 0 0 0 0

laktaasi mittepüsivus 42 42 0 0 42 0 0

6. lõunakorealased

laktaasi püsivus 0 0 0 0 0 0 0

laktaasi mittepüsivus 23 23 0 0 23 0 0

kokku 401 212 102 87 205 109 87

Tabel 8. Laktoositalumatuse variantide levimus erinevate populatsioonide proovides

Populatsioon Genotüüp

C/T13910 G/A22018

Laktaasi püsivuse alleeli levimus, %

Arv

CC CT TT GG GA AA

lõunakorealased 23 23 0 0 23 0 0 0 *

prantslased 17 7 9 1 6 10 1 59 *

baskid 85 7 44 34 13 35 37 92 *

lõunaitaallased 100 89 11 0 88 12 0 11 *

somaallased 79 74 5 0 78 1 0 6

Utah 92 7 33 52 7 30 55 92 *

afroameeriklaseds 96 76 15 5 78 12 5 21 *

marokolased 90 62 25 3 65 22 3 31 *

sarawhid (aafriklased) 57 29 26 2 28 26 3 49 *

saamid 30 20 10 0 21 9 0 33 *

tiibetlased 23 23 0 0 23 0 0 0

idasoomlased 571 108 287 176 107 288 176 81 *

läänesoomlased 367 62 159 146 58 161 148 83 *

soome-ugri hõimud

Xan 20 19 1 0 19 1 0 5

Xm 20 19 1 0 19 1 0 5

mansid 22 20 2 0 20 2 0 9

komid 10 7 3 0 7 3 0 30

ersalased 30 17 10 3 19 9 2 43

EE – EP 1 417 305 B1

40

Populatsioon Genotüüp

C/T13910 G/A22018

Laktaasi püsivuse alleeli levimus, %

Arv

CC CT TT GG GA AA

mokšalased 30 13 17 0 14 16 0 57 *

udmurdid 30 12 16 2 11 15 4 60 *

Pakistaniani hõimud

kalašid 30 30 0 0 28 2 0 0

burušod 30 29 1 0 27 3 0 3

hasaarid 14 13 1 0 11 3 0 7

kašmiirid 20 15 5 0 14 6 0 25

Makrani balutšid 29 19 10 0 19 8 1 34

brahuid 30 17 10 3 16 11 3 43

makranid (negriidid) 29 16 10 3 16 10 3 45

pathanid 29 12 16 1 13 14 2 59 *

indialased (Indian) 29 11 13 5 10 12 5 62 *

Kokku 2032

*Laktaasi püsivuse alleeli levimus korreleerub väga hästi laktaasi püsivuse alleeli levimuse andmetega (Simoons Fj. The geographic hypothesis and lactose malabsorption. Am. J. Dig. Dis., 1978, 23 (11), 963-80)

JÄRJESTUSTE LOETELU

[0085]

<110> National Public Health Institute

PELTONEN, Leena

ENATTAH, Nabil

JÄRVELÄ, Irma

SAHI, Timo

SAVILAHTI, Erkki

TERWILLIGER, Joseph

<120> Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiaga seotud DNA variandi kindlakstegemine

<130> F 2034 PCT <150> EP 01 11 9377.8

EE – EP 1 417 305 B1

41

<151> 2001-08-10 <150> EP 01 11 9528.6 <151> 2001-08-14 <150> US 60/315, 955 <151> 2001-08-31 <160> 14 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1

<210> 2 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2

<210> 3 <211> 3213 <212> DNA <213> Homo sapiens

EE – EP 1 417 305 B1

42

<400> 3

EE – EP 1 417 305 B1

43

<210> 4 <211> 1296 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4

EE – EP 1 417 305 B1

44

<210> 5 <211> 3213 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5

EE – EP 1 417 305 B1

45

EE – EP 1 417 305 B1

46

<210> 6 <211> 1296 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6

EE – EP 1 417 305 B1

47

<210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> kunstlik järjestus <220> <223> praimer <400> 7 taggtcagtg ggtattaacg aggt 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> kunstlik järjestus <220> <223> praimer <400> 8 gtcactttga tatgatgaga gca 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> kunstlik järjestus

EE – EP 1 417 305 B1

48

<220> <223> praimer <400> 9 cctcgttaat acccactgac cta 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> kunstlik järjestus <220> <223> praimer <400> 10 ggcaatacag ataagataat gtag 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> kunstlik järjestus <220> <223> praimer <400> 11 ttgatcagca tgtcctgagc a 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> kunstlik järjestus <220> <223> praimer <400> 12 ctaccctatc agtaaaggcc ta 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> kunstlik järjestus <220> <223> praimer

EE – EP 1 417 305 B1

49

<400> 13 tgctcaggac atgctgatca a 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> kunstlik järjestus <220> <223> praimer <400> 14 aaaaacagca ttctcagctg ggc 23

EE – EP 1 417 305 B1

50

PATENDINÕUDLUS

1. Nukleiinhappe molekul, mis sisaldab soole laktaas-florisiini hüdrolaasi (LPH) geeni 5'osa,

mis aitab kaasa või viitab täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale, kusjuures nimetatud nukleiin-

happe molekul on valitud rühmast, kuhu kuuluvad:

(a) nukleiinhappe molekul, mis sisaldab või koosneb nukleiinhappe järjestus(es)t SEQ ID

nr 1, SEQ ID nr 1 järjestus on kujutatud ka joonisel 4 ja sisaldub joonisel 8 kujutatud

järjestuses, ja

(b) nukleiinhappe molekul, mis sisaldab või koosneb nukleiinhappe järjestus(es)t SEQ ID

nr 2, SEQ ID nr 2 järjestus on kujutatud ka joonisel 5 ja sisaldub joonisel 9 kujutatud

järjestuses,

seejuures nimetatud nukleiinhappe molekul ulatub maksimaalselt 30000 nukleotiidi üle vas-

tava SEQ ID nr 1 või 2 nukleiinhappe molekuli 5'- ja/või 3'-otsa.

2. Nukleiinhappe molekul, mis koosneb soole laktaas-florisiini hüdrolaasi (LPH) geeni

5'-osast, mis aitab kaasa või viitab täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale, kusjuures nimetatud

nukleiinhappe molekul on valitud rühmast, kuhu kuuluvad:

(a) nukleiinhappe molekul pikkusega vähemalt 20 nukleotiidi, mille komplementaarne

ahel hübridiseerub rangetes tingimustes nukleiinhappe molekuliga, mis koosneb või mis

sisaldab nukleiinhappe järjestus(es)t SEQ ID nr 1, kusjuures nimetatud polünukleotiidil

on positsioonis, mis vastab positsioonile -13910 LPH geeni esimesest ATG-st 5'-suunas,

tsütosiinijääk, ja

(b) nukleiinhappe molekul pikkusega vähemalt 20 nukleotiidi, mille komplementaarne

ahel hübridiseerub rangetes tingimustes nukleiinhappe molekuliga, mis koosneb või mis

sisaldab nukleiinhappe järjestus(es)t SEQ ID nr 2, kusjuures nimetatud polünukleotiidil

on positsioonis, mis vastab positsioonile -22018 LPH geeni esimesest ATG-st 5'-suunas,

guaniinijääk,

EE – EP 1 417 305 B1

51

seejuures nimetatud nukleiinhappe molekul ulatub maksimaalselt 30000 nukleotiidi üle vas-

tava SEQ ID nr 1 või 2 nukleiinhappe molekuli 5'- ja/või 3'-otsa.

3. Nukleiinhappe molekul, mis sisaldab soole laktaas-florisiini hüdrolaasi (LPH) geeni

5'-osa, kusjuures nimetatud nukleiinhappe molekul on valitud rühmast, kuhu kuuluvad:

(a) nukleiinhappe molekul, mis sisaldab või koosneb nukleiinhappe järjestus(es)t SEQ ID

nr 3, SEQ ID nr 3 järjestus on kujutatud ka joonisel 6;

(b) nukleiinhappe molekul, mis sisaldab või koosneb nukleiinhappe järjestus(es)t SEQ ID

nr 4, SEQ ID nr 4 järjestus on kujutatud ka joonisel 7.

4. Nukleiinhappe molekul, mis koosneb soole laktaas-florisiini hüdrolaasi (LPH) geeni

5'-osast, kusjuures nimetatud nukleiinhappe molekul on valitud rühmast, kuhu kuuluvad:

(a) nukleiinhappe molekul, mille komplementaarne ahel hübridiseerub rangetes tingimus-

tes nukleiinhappe molekuliga, mis koosneb või mis sisaldab nukleiinhappe järjestus(es)t

SEQ ID nr 3, kusjuures nimetatud polünukleotiidil on positsioonis, mis vastab positsioo-

nile -13910 LPH geeni esimesest ATG-st, tümidiinijääk, ja

(b) nukleiinhappe molekul, mille komplementaarne ahel hübridiseerub rangetes tingimus-

tes nukleiinhappe molekuliga, mis koosneb või mis sisaldab nukleiinhappe järjestus(es)t

SEQ ID nr 4, kusjuures nimetatud polünukleotiidil on positsioonis, mis vastab positsioo-

nile -22018 LPH geeni esimesest ATG-st, adenosiinijääk.

5. Mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 kuni 4 vastav nukleiinhappe molekul, mis on ge-

noomne DNA.

6. Nukleiinhappe molekul vastavalt nõudluspunktile 5, milles nimetatud genoomne DNA on

osa geenist.

7. Mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 kuni 6 vastava nukleiinhappe molekuli fragment,

milles on vähemalt 14 nukleotiidi, kusjuures nimetatud fragment sisaldab positsioonis -13910

LPH geeni nukleotiidi või positsioonis -22018 LPH geeni nukleotiidi.

EE – EP 1 417 305 B1

52

8. Nukleiinhappe molekul, mis on komplementaarne mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 või

2 ja 5 kuni 7 vastava nukleiinhappe molekuliga.

9. Nukleiinhappe molekul, mis on komplementaarne mis tahes ühele nõudluspunktidest 3

kuni 7 vastava nukleiinhappe molekuliga.

10. Vektor, mis sisaldab mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 või 2 ja 5 kuni 7 vastavat nuk-

leiinhappe molekuli.

11. Vektor, mis sisaldab mis tahes ühele nõudluspunktidest 3 kuni 7 vastavat nukleiinhappe

molekuli.

12. Praimer või praimerite paar, kusjuures praimer või praimerite paar hübridiseerub range-

tes tingimustes mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 või 2 ja 5 kuni 7 vastava nukleiinhappe

molekuliga, mis sisaldab nukleotiidi LPH geeni positsioonis -13910, või selle komplemen-

taarse ahelaga, seejuures praimer on täpselt komplementaarne järjestusega, mis sisaldab C-d

positsioonis -13910, või selle komplementaarse ahelaga.

13. Praimer või praimerite paar, kusjuures praimer või praimerite paar hübridiseerub range-

tes tingimustes mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 või 2 ja 5 kuni 7 vastava nukleiinhappe

molekuliga, mis sisaldab nukleotiidi LPH geeni positsioonis -22018, või selle komplemen-

taarse ahelaga, seejuures praimer on täpselt komplementaarne järjestusega, mis sisaldab G-d

positsioonis -22018, või selle komplementaarse ahelaga.

14. Praimer või praimerite paar, kusjuures praimer või praimerite paar hübridiseerub range-

tes tingimustes mis tahes ühele nõudluspunktidest 3 kuni 7 vastava nukleiinhappe moleku-

liga, mis sisaldab nukleotiidi LPH geeni positsioonis -13910, või selle komplementaarse

ahelaga, seejuures praimer on täpselt komplementaarne järjestusega, mis sisaldab T-d posit-

sioonis -13910, või selle komplementaarse ahelaga.

EE – EP 1 417 305 B1

53

15. Praimer või praimerite paar, kusjuures praimer või praimerite paar hübridiseerub range-

tes tingimustes mis tahes ühele nõudluspunktidest 3 kuni 7 vastava nukleiinhappe moleku-

liga, mis sisaldab nukleotiidi LPH geeni positsioonis -22018, või selle komplementaarse

ahelaga, seejuures praimer on täpselt komplementaarne järjestusega, mis sisaldab A-d posit-

sioonis -22018, või selle komplementaarse ahelaga.

16. Mitteinimpäritolu peremees, mis on transformeeritud nõudluspunktile 10 vastava vekto-

riga.

17. Mitteinimpäritolu peremees, mis on transformeeritud nõudluspunktile 11 vastava vekto-

riga.

18. Mitteinimpäritolu peremees vastavalt nõudluspunktile 16 või 17, milleks on bakter,

pärmirakk, putukarakk, seenerakk, imetajarakk, taimerakk, transgeenne loom või transgeenne

taim.

19. Antikeha või aptameer või faag, mis seondub spetsiifiliselt mis tahes ühele nõudlus-

punktidest 1 või 2 ja 5 kuni 8 vastava mutantse nukleiinhappe molekuliga, kuid mitte vastava

metsiktüüpi nukleiinhappe molekuliga, kusjuures metsiktüüpi nukleiinhappe molekulil on

LPH geeni positsioonile -13910 vastavas positsioonis tümidiin ja/või positsioonile -22018

vastavas positsioonis adenosiin ning mutantsel nukleiinhappe molekulil on positsioonile

-13910 vastavas positsioonis tsütosiin ja/või positsioonile -22018 vastavas positsioonis gua-

niin.

20. Antikeha või aptameer või faag, mis seondub spetsiifiliselt mis tahes ühele nõudlus-

punktidest 3 kuni 7 ja 9 vastava metsiktüüpi nukleiinhappe molekuliga, kuid mitte vastava

täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasiale kaasa aitava või viitava mutantjärjestusega, kusjuures met-

siktüüpi nukleiinhappe molekulil on LPH geeni positsioonile -13910 vastavas positsioonis

tümidiin ja/või positsioonile -22018 vastavas positsioonis adenosiin ning mutantsel nukleiin-

happe molekulil on positsioonile -13910 vastavas positsioonis tsütosiin ja/või positsioonile

-22018 vastavas positsioonis guaniin.

EE – EP 1 417 305 B1

54

21. Farmatseutiline kompositsioon, mis sisaldab nõudluspunktidele 3 kuni 6 vastavat nuk-

leiinhappe molekuli või nõudluspunktile 11 vastavat vektorit, kusjuures metsiktüüpi nukleiin-

happe molekulil on LPH geeni positsioonile -13910 vastavas positsioonis tümidiin ja/või

positsioonile -22018 vastavas positsioonis adenosiin.

22. Diagnostiline kompositsioon, mis sisaldab mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 kuni 9

vastavat nukleiinhappe molekuli, nõudluspunktile 10 või 11 vastavat vektorit, nõudluspunk-

tidele 12 kuni 15 vastavat praimerit või praimerite paari ja/või nõudluspunktile 19 või 20 vas-

tavat antikeha, aptameeri ja/või faagi.

23. Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia esinemise või sellele eelsoodumuse testimise meetod,

mis hõlmab tulevaselt patsiendilt või isikult, kellel kahtlustatakse sellist eelsoodumust, saa-

dud proovi testimist mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 või 2 ja 5 kuni 8 vastava homo-

sügootses või heterosügootses vormis nukleiinhappe molekuli esinemise suhtes.

24. Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia esinemise või sellele eelsoodumuse testimise meetod,

mis hõlmab tulevaselt patsiendilt või isikult, kellel kahtlustatakse sellist eelsoodumust, saa-

dud proovi testimist mis tahes ühele nõudluspunktidest 3 kuni 7 ja 9 vastava homosügootses

või heterosügootses vormis nukleiinhappe molekuli esinemise suhtes.

25. Meetod vastavalt nõudluspunktile 23 või 24, mille kohaselt nimetatud testimine hõlmab

nõudluspunktile 8 vastava komplementaarse nukleiinhappe molekuli, mis on komplemen-

taarne nukleiinhappe molekuliga, mis aitab kaasa või viitab täiskasvanu tüüpi hüpolak-

taasiale, või nõudluspunktile 9 vastava nukleiinhappe molekuliga, mis on komplementaarne

metsiktüüpi järjestusega, hübridiseerimist sondina rangetes tingimustes nimetatud proovis

sisalduvate nukleiinhappe molekulidega, ja nimetatud hübridisatsiooni tuvastamist, kusjuures

metsiktüüpi nukleiinhappe molekulil on LPH geeni positsioonile -13910 vastavas positsioo-

nis tümidiin ja/või positsioonile -22018 vastavas positsioonis adenosiin ning mutantsel nuk-

leiinhappe molekulil on positsioonile -13910 vastavas positsioonis tsütosiin ja/või positsioo-

nile -22018 vastavas positsioonis guaniin.

EE – EP 1 417 305 B1

55

26. Meetod vastavalt mis tahes ühele nõudluspunktidest 23 kuni 24, mis hõlmab lisaks

nimetatud hübridisatsiooniprodukti lõikamist restriktaasiga või nimetatud hübridisatsiooni-

produkti allutamist restriktaasiga lõikamisele ning nimetatud lõikamisprodukti analüüsimist.

27. Meetod vastavalt nõudluspunktile 25, mille kohaselt nimetatud sond on tuvastatavalt

märgistatud.

28. Meetod vastavalt nõudluspunktile 23 või 24, mille kohaselt nimetatud testimine hõlmab

mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 kuni 9 vastavast nukleiinhappe molekulist vähemalt osa

nukleiinhappe järjestuse määramist, nimetatud osa sisaldab nukleotiidi LPH geeni positsioo-

nis -13910 ja/või nukleotiidi positsioonis -22018.

29. Meetod vastavalt nõudluspunktile 28, mille kohaselt nukleiinhappe järjestuse määramine

toimub tahke faasi minisekveneerimise teel.

30. Meetod vastavalt nõudluspunktile 28, mis hõlmab lisaks enne nimetatud nukleiinhappe

järjestuse määramist nimetatud nukleiinhappe molekuli vähemalt nimetatud osa amplifit-

seerimist.

31. Meetod vastavalt nõudluspunktile 23 või 24, mille kohaselt nimetatud testimine hõlmab

amplifikatsioonireaktsiooni läbiviimist, kusjuures vähemalt üks nimetatud amplifikatsiooni-

reaktsioonis kasutatud praimeritest on nõudluspunktile 12 või 13 vastav praimer või kuulub

nõudluspunktile 12 või 13 vastavasse praimerite paari, ning hõlmab amplifikatsiooniprodukti

analüüsimist.

32. Meetod vastavalt nõudluspunktile 23 või 24, mille kohaselt nimetatud testimine hõlmab

amplifikatsioonireaktsiooni läbiviimist, kusjuures vähemalt üks nimetatud amplifikatsiooni-

reaktsioonis kasutatud praimeritest on nõudluspunktile 14 või 15 vastav praimer või kuulub

nõudluspunktile 14 või 15 vastavasse praimerite paari, ning hõlmab amplifikatsiooniprodukti

analüüsimist.

EE – EP 1 417 305 B1

56

33. Meetod vastavalt mis tahes ühele nõudluspunktidest 30 kuni 32, mille kohaselt nimetatud

amplifikatsioon teostatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil või nimetatud amplifikat-

sioon on polümeraasi ahelreaktsioon (PCR).

34. Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia või sellele eelsoodumuse esinemise testimise meetod,

mis hõlmab inimeselt saadud proovi hindamist spetsiifilise seondumise suhtes nõudluspunk-

tile 19 vastava antikeha või aptameeri või faagiga.

35. Täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia või sellele eelsoodumuse esinemise testimise meetod,

mis hõlmab inimeselt saadud proovi hindamist spetsiifilise seondumise suhtes nõudluspunk-

tile 20 vastava antikeha või aptameeri või faagiga.

36. Meetod vastavalt nõudluspunktile 34 või 35, mille kohaselt nimetatud antikeha või

aptameer või faag on tuvastatavalt märgistatud.

37. Meetod vastavalt mis tahes ühele nõudluspunktidest 34 kuni 36, mille kohaselt test on

immuunanalüüs.

38. Meetod vastavalt mis tahes ühele nõudluspunktidest 23 kuni 37, mille kohaselt nimetatud

proov on veri, seerum, plasma, lootekude, sülg, uriin, limaskest, lima, vaginaalkude, tupest

saadud lootekude, nahk, juuksed, karvanääps või inimese muu kude.

39. Meetod vastavalt mis tahes ühele nõudluspunktidest 23 kuni 38, mille kohaselt nimetatud

proovist pärit nimetatud nukleiinhappe molekul on kinnitatud tahkele toele.

40. Meetod vastavalt nõudluspunktile 39, mille kohaselt nimetatud tahkeks toeks on kiip,

räniketas, helmes või mikrotiiterplaat.

41. Mis tahes ühele nõudluspunktidest 1 kuni 9 vastav nukleiinhappe molekul kasutamiseks

täiskasvanu tüüpi hüpolaktaasia või sellele eelsoodumuse esinemise analüüsimiseks.

EE – EP 1 417 305 B1

57

42. Komplekt, mis sisaldab ühes või enamas mahutis mis tahes ühele nõudluspunktidest 1

kuni 9 vastavat nukleiinhappe molekuli, nõudluspunktidele 12 kuni 15 vastavat praimerit või

praimerite paari, nõudluspunktile 10 või 11 vastavat vektorit ja/või nõudluspunktile 19 või 20

vastavat antikeha, aptameeri ja või faagi.

EE – EP 1 417 305 B1

1/10

EE – EP 1 417 305 B1

2/10

EE – EP 1 417 305 B1

3/10

EE – EP 1 417 305 B1

4/10

EE – EP 1 417 305 B1

5/10

EE – EP 1 417 305 B1

6/10

EE – EP 1 417 305 B1

7/10

EE – EP 1 417 305 B1

8/10

EE – EP 1 417 305 B1

9/10

EE – EP 1 417 305 B1

10/10