ヘム鉄を選択的に検出可能な蛍光プローブの開発

岐阜薬科大学 薬学部 薬化学研究室准教授 平山 祐

JST 新技術説明会2018/ 10/ 23

生体内におけるヘム鉄

Fe

酸素運搬

赤血球 ヘモグロビン

代謝反応

タンパク構造によりヘムの高い反応性が制御されている

ヘムの細胞内挙動について

Fe

ヘムの高い反応性が制御されたまま輸送・合成される。

遊離ヘムの生体内挙動はこれまで調べる手段がなく、不明な点が多かったが、本研究により遊離ヘムと疾患との関与が明らかに。

ヘムの流出 反応性の暴走無差別な酸化反応酸化ストレス溶血等 遊離ヘム

出血や、ヘム分解酵素(HO-1)の異常によりヘムが関連すると考えられる疾患(脳出血、マラリア等)の迅速診断法への応用へ

細胞傷害疾患

ヘムの検出方法

ピリジン・ヘモクロモゲン法

メタノール・界面活性剤法

ペルオキシダーゼ反応法

検出原理 ピリジン・ヘモクロモゲン錯体を還元し、極大吸収波長の吸光度を検出

メタノール・界面活性剤混合溶液にヘムを含む測定資料を溶解し、吸光度を測定

ヘムの持つペルオキシダーゼ活性を利用し、呈色反応・発光反応を起こして吸光度・発光強度を測定。

検出範囲検出時間

50 µM1 min/sample

33~2100 nM1 min/sample

4~130 nM30 min/sample

特徴 • 感度が低い• 夾雑物の影響を受け

やすい• 毒性が高い試薬を使

用• 一度に多量の資料が

必要• 遊離ヘム濃度は測定

できない

• 混合液に試料を入れて測定するのみで簡便

• 夾雑物の影響を受ける

• 遊離ヘムとタンパク質結合ヘムの区別ができない

• 操作が煩雑• 強酸が必要• ペルオキシダーゼ活

性を持つ夾雑物が混在すると影響を受ける

本研究では、ヘムの蛍光検出法に加え、ヘムの生細胞イメージングが可能な新しい蛍光試薬を開発する

これまでの研究背景

RhoNox-1

Fe(II)

蛍光増大

高選択的

CoNox-1

FluNox-1

SiRhoNox-1

N-オキシドを使うことで遊離Fe(II)イオンの選択的蛍光検出が可能に(世界初の例）

Hirayama T. et al.Chem. Sci. 2013, 4, 1250

RhoNox, FluNox (化合物)

永澤秀子、平山祐特開 2013-193990

RhoNoxを使った鉄検出法永澤秀子、平山祐PCT/JP2015/051151

RhoNox-1にFe(II)を加えた際の蛍光スペクトル変化

関連文献・特許

Color variation of Fe(II) probe based on N-oxide

RedNox

OO N+O–

COO–

O

N+ O–OO

ON+ N+O–

COO–

SiN+ N+O–

COO–

CoNox-1 FluNox-1 RhoNox-1 SiRhoNox-1

Chem. Sci. 2017, 8, 4858

ArN+R

R

O–

ArNR

RFe(II) Highly selective

Turn-on response Universal

鉄(II)イオンの蛍光イメージング

鉄(II)イオンの蛍光イメージング

O

O

N NO– NN

O

OO N

H4

O HN

COO–

C15H31

O

OON

H 4

OHN

COO–

C15H31

O

Mem-RhoNox

Ac-MtFluNox

HMRhoNox-M(Lysosome)

ACS Chem. Biol. 2018, asap

Org. Biomol. Chem. 2014,12, 6590

Metallomics. 2018, asap

SiRhoNox-1 (ER)

Chem. Sci. 2017, 8, 4858

N-オキシド化合物のスクリーニング

none

5 mM Hemin20 mM Fe(II)

2 µM probe and 20 µM Fe(II) or 5 µM Hemin were reacted for 1 h in 50 mM HEPES buffer (pH 7.4)

ヘムの蛍光検出Fura-Nox-1 Fura-Nox-2 Fura-Nox-3

Fura-Nox-4 Fura-Nox-5 Fura-Nox-6

Fura-Nox-7 HMRhoNox-M

2 µM probe and 20 µM Fe(II) or 5 µM Hemin were reacted for 1 h in the presence of glutathione (1 mM) in 50 mMHEPES buffer (pH 7.4)

—Fe(II)—Hemin—GSH—none

ヘムへの選択性

2 µM probe and 20 µM Fe(II) or 5 µM Hemin were reacted for 1 h in 50 mMHEPES buffer (pH 7.4)

選択性試験まとめ

プローブ 二価鉄イオン ヘム 選択性ヘム/Fe(II)

Fura-Nox-1 1.55 5.94 3.8

Fura-Nox-2 1.10 10.1 10

Fura-Nox-3 1.25 30.4 24

Fura-Nox-4 0.86 11.1 13

Fura-Nox-5 1.03 1.10 1.1

Fura-Nox-6 1.20 13.4 11

Fura-Nox-7 1.16 58.0 50

RhoNox-1 29.4 104 3.5

HMRhoNox-M 39.9 41.2 1.0

SiRhoNox-1 20.6 49.8 2.4

イメージングへの応用

Fura-Nox-7AM

Fura-Nox-2AM

Fura-Nox-1AM

HepG2 cells treated with 5 µM probe in HBSS for 30 min, and then imaging was performed.

N-オキシド化合物の膜透過条件

Fura-Nox-8 Fura-Nox-9 Fura-Nox-10 Fura-Nox-11

30 mm30 mm30 mm30 mm

HepG2 cells treated with 5 µM probe in HBSS for 30 min, and then imaging was performed.

予想される用途

ヘムをマーカーとした疾患の診断の可能性潜血反応を伴う疾患の診断

腎臓・尿路の炎症、急性糸球体腎炎、腫瘍、出血性素因（白血病、血友病）、溶連菌敗血症、マラリア、下部消化器癌の早期発見等

酵素やタンパク質を用いないヘム鉄蛍光検出法

生細胞内でのリアルタイムヘム鉄蛍光検出法

研究試薬としての利用簡便かつ高感度検出キットへの応用

細胞でのヘム代謝機構の解明研究(研究試薬)生細胞での非侵襲的イメージング試薬遊離ヘムと疾患の関係性の解明

お問い合わせ先

岐阜薬科大学◎創薬化学大講座薬化学研究室 平山 祐

TEL 058-230-8110（内線3625）FAX 058-230-8105e-mail hirayamat＠gifu-pu.ac.jp

◎事務局庶務会計課 近藤直樹TEL 058-230-8100FAX 058-230-8200e-mail syomuk＠gifu-pu.ac.jp