摇 南京农业大学学报摇 2013,36(6):37-44 http: / / nauxb. njau. edu. cn摇 Journal of Nanjing Agricultural University doi:試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試試

10. 7685 / j. issn. 1000-2030. 2013. 06. 007

收稿日期:2013-08-16基金项目:国家 863 计划项目(2012AA101504);国家公益性行业(农业)科研专项(201303015);国家自然科学基金项目(31100056);高等学

校博士学科点基金项目(20100097120011)作者简介:乔俊卿,博士,E鄄mail:junqingqiao@ hotmail. com。*通信作者:高学文,教授,博导,研究方向为分子植物病理学和植物病害生物防

治,E鄄mail:gaoxw@ njau. edu. cn。

乔俊卿,伍辉军,霍蓉,等. 表达 Harpin 蛋白的芽孢杆菌工程菌的构建及其生防效果[J] . 南京农业大学学报,2013,36(6):37-44

表达 Harpin 蛋白的芽孢杆菌工程菌的构建及其生防效果

乔俊卿1,2,伍辉军1,霍蓉1,Rainer Borriss3,高学文1*

(1. 南京农业大学植物保护学院 /农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室,江苏 南京 210095;2. 江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏 南京 210014;3. 德国柏林洪堡大学生物学和细菌遗传学实验室,德国 柏林)

摘要:利用同源重组方法将来源于水稻细菌性条斑病菌的 Harpin(HpaGXooc)编码基因 hpa1 分别插入根围拮抗解淀粉芽孢

杆菌 FZB42 的蛋白水解酶编码基因 aprE 和 nprE 位点,成功构建双拷贝 Harpin 表达工程菌株 FZBHarpin。 反转录 PCR 检测

结果显示,hpa1 能在 RNA 水平上正常转录表达。 工程菌 FZBHarpin 发酵 72 h 后,其发酵液可引起烟草过敏性反应,这表明

Harpin 蛋白外泌胞外并保持生物活性。 利用 FZBHarpin 浸种烟草后,烟草主根长达 64. 05 mm,比对照增加了 30% ,促生效

果是 FZB42 的 2 倍。 盆栽水稻白叶枯病防治试验结果显示,FZBHarpin 防效为 51. 9% ,比出发菌株 FZB42 防效显著提高。这为利用病原物中可激发植物产生抗病性的激发子来遗传改良生防微生物提供了理论基础。关键词:解淀粉芽孢杆菌 FZB42;Harpin 蛋白;基因工程菌;生物防治

中图分类号:S476+ . 8摇 摇 摇 摇 文献标志码:A摇 摇 摇 摇 文章编号:1000-2030(2013)06-0037-08

Construction of Harpin expression engineering strain FZBHarpinand evaluation of its biocontrol activity

QIAO Junqing1,2,WU Huijun1,HUO Rong1,Rainer Borriss3,GAO Xuewen1*

(1. College of Plant Protection / Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests,Ministry of Education,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2. Institute of Plant Protection,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,

Nanjing 210014,China;3. Institute of Biology and Bacterial Genetics,Humboldt University,Berlin,Germany)

Abstract:HpaGXooc,from rice pathogenic bacterium Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,is a member of the Harpin group of proteins,eliciting hypersensitive cell death in non鄄host plants,inducing disease and insect resistance in plants and enhancing the plant growth.Bacillus amyloliquefaciens FZB42 has been used as powerful weapons for the suppression of plant pathogenic organisms and plantgrowth promotion in the world. In this study,two recombinant Harpin protein expression vectors pGAprEHS and pUNprEKHS were con鄄structed and integrated into the aprE,nprE site of FZB42. These two vectors were composed of powerful promoter P43 and nprB signalpeptide,which leads to the expression of Harpin protein continuously and secretes into the medium. The result of hypersensitiveresponse(HR)on tobacco also indicates that Harpin protein is secreted in the extracellular. RT鄄PCR analysis reveals the hpa1 gene canbe transcribed normally. After tobacco seeds soaking by FZB derived strains,FZBHarpin exhibits an excellent effect of plant growth pro鄄motion;the tobacco root length is about 64. 05 mm and is 30% higher than control. The greenhouse experiment revealed that engineeredstrain FZBHarpin is the best one for the control of rice bacterial leaf blight; the control efficacy is 51. 9% . This study provides afundamental basis for genetically modification of biocontrol agent by using of HR鄄elicitors from plant pathogens.Key words:Bacillus amyloliquefaciens FZB42;Harpin protein;engineering strain;biocontrol

Harpins 是革兰氏阴性植物病原细菌通过芋型分泌系统泌出的一类能诱导非寄主植物过敏性反应和

系统获得抗性的蛋白激发子,其能够诱导植物抗旱性,兼具促进植物生长和改善作物品质的作用[1-3]。Wei 等[4]首先从 Erwinia amylovora 中发现了能引起非寄主植物过敏性反应的 HrpNEa,进一步研究证明

HrpNEa能增强植物的光合作用和提高植物吸收营养的能力,从而促进植物的生长和提高产果率。 EdenBioscience 公司对 HrpNEa进行了深入研究,利用基因工程菌株大量生产 HrpNEa,并成功开发出 Messenger襆

生物农药,获得了美国环保局(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可。 本研究室从 Xanthomonas oryzae

南摇 京摇 农摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 36 卷

pv. oryzicola(Xooc)中克隆到了 HpaGXooc编码基因 hpa1,并利用大肠杆菌表达系统进行了表达,研究结果表

明,虽然 HpaGXooc蛋白序列与 HrpNEa存在很大差异,但是它们具有相似的生物学功能[5]。化学农药的过度使用对环境造成了极大的污染,因此生防细菌和其他一些天然来源的植物材料在植

物病害防治和提高作物产量上具有重要意义[6]。 当前,国内外将许多具有促生和生防作用的芽孢杆菌开

发成了微生物制剂,如国内由南京农业大学开发的生防菌 B3 和江苏省农业科学院植物保护研究所开发

的生防菌株 B916 分别用来防治小麦纹枯病和水稻纹枯病[7-8];国外有德国 ABiTEP GmbH 公司开发的解

淀粉芽孢杆菌 FZB42 生防促生微生物制剂,美国 Gustafson 公司和 Microbio 公司分别将菌株 GB03 和

MB1600 开发成微生物制剂[9]。 此外,由于芽孢杆菌的蛋白泌出系统非常发达,因此一直被作为表达外源

蛋白的重要宿主[10]。 缺失了 8 个蛋白酶基因的 Bacillus subtilis WB800 菌株的改造成功为芽孢杆菌表达

系统的研究开辟了新的视野,使许多易被水解的外源蛋白在芽孢杆菌中的高水平表达成为了现实[11]。本研究以具有良好促生和防病效果的根围细菌解淀粉芽孢杆菌 FZB42 作为出发菌株[12-13],将本实验

室的 Harpin 蛋白编码基因 hpa1 通过同源重组的方法插入到 FZB42 基因组的碱性蛋白水解酶和中性蛋白

水解酶基因位点,进行稳定表达和外泌,并评估了所构建基因工程菌 FZBHarpin 的促生和防病效果。

1摇 材料与方法

1. 1摇 供试菌株、质粒、植物材料及培养条件

供试菌株及质粒见表 1。 解淀粉芽孢杆菌 FZB42 及其突变体、大肠杆菌 TOP10 均在 LB 培养基 37 益培养活化;解淀粉芽孢杆菌的遗传转化方法及培养基主要借鉴德国洪堡大学合作实验室方法[14];芽孢杆

菌发酵在 Landy 培养基中 30 益、200 r·min-1培养 48 h,加无菌水将发酵液稀释至试验所需的细胞浓度备

用;水稻白叶枯病菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae POX99 在 NA 培养基 28 益 培养。 烟草品种为‘三生

烟爷,水稻品种为‘丰优 22 号爷,烟草促生试验所用培养基为植物 MS 培养基。 试验所用抗生素及其浓度如

下:氨苄青霉素(Amp)100 滋g·mL-1,氯霉素(Cm)5 滋g·mL-1,卡那霉素(Km)5 滋g·mL-1,壮观霉素(Spec)100 滋g·mL-1。

表 1摇 本研究所用菌株和质粒

Table 1摇 Strains and plasmid used in this study菌株 / 质粒

Strains / plasmids描述

Description来源

Reference or sourcePlasmids

pUC18 Clone vector;lacZ;Apr Laboratory collectionpGEMT鄄easy T / A鄄clone site vector;lacZ;Apr Promega CompanypBT2鄄arcA Allelic replacement vector for Staphylococcus aureus,containing Km cassette [15]pIC333 A vector carrying mini鄄Tn10 transposase gene for Bacillus subtilis,containing Spec cassette Laboratory stock

pM43HF Expression vector carrying hpa1 gene which under the control of promoter p43 and nprBsignal peptide [16]

pGAprEHSpGEM鄄T carrying a 2. 8 kb fragment containing aprE,a 1. 4 kb fragment of lox鄄spec and a 0. 8kb fragment of hpa1;Apr,Specr This study

pGAprES pGEM鄄T carrying a 2. 8 kb fragment containing aprE,a 1. 4 kb fragment lox鄄spec;Apr,Specr This study

pUNprEKHSpUC18 plasmid carrying a lox鄄km cassette, nprE鄄L, nprE鄄R fragment, hpa1鄄his fragment;Apr,Kmr This study

pUNprEK pUC18 plasmid carrying a lox鄄km cassette,nprE鄄L fragment and nprE鄄R fragment;Apr,Kmr This studyStrainsE. coli

TOP10F鄄mcrA 驻(mrr鄄hsdRMS鄄mcrBC 渍80lacZ驻M15 驻lacX74 nupG recA1 araD139 驻(ara鄄leu)7697galE15 galK16 rpsL(StrR)endA1 姿-

Laboratory stock( Invitrogen)

Bacillus amyloliquefaciens

FZB42 Wild type,producer of lipopeptides and polyketides,plant growth promotion rhizobacteria FZB BiotechGmbH Berlin

FZB42 / AHS FZB42驻aprE驻nprE宜hpa1宜loxspec This studyFZBHarpin FZB42驻aprE驻nprE宜hpa1宜hpa1his宜loxspec宜loxkm This studyFZBAN FZB42驻aprE驻nprE宜loxspec宜loxkm This study

PathogensXanthomonas oryzaepv. oryzae POX99 Philippine race 6 strain Laboratory stock

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摇 第 6 期 乔俊卿,等:表达 Harpin 蛋白的芽孢杆菌工程菌的构建及其生防效果

1. 2摇 酶、试剂和引物

载体构建过程中酶切反应、连接反应和 PCR 反应所用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA Marker、Taq 酶及 Pfu 酶购于 TaKaRa 公司,分子操作过程均按说明书进行。 具体引物合成和测序均由德国 Martin公司完成,引物序列见表 2。

表 2摇 本研究所合成的引物

Table 2摇 Oligo DNA primers used in this study名称 Name 引物序列 Sequence of primers(5忆寅3忆)

aprE鄄1 ATAGTAAGGGCAGCATCAACCaprE鄄2 CGGTCGTGATTGATCCTTTATA

P43鄄1(Hpa玉) AACTGATAGGTGGTATGTTTTCHpa鄄2(Cla玉) TTTTATCGATCTATTACTGCATTGATGCGC

Hpa鄄his2 TCAATGATGATGATGATGATGGspe鄄1鄄lox66 TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGspe鄄2鄄lox71 TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAAGGTGGATACACATCTTGTCA

nprE鄄L1鄄(Ehe玉) TCACTGTTGTCTGAATCCCTTGnprE鄄L2(Sph玉) AAAAAGCATGCACCTAAACCCACAATAAATCCC

nprE2274R1(Sal玉) AATCGTCGACCTCGCCTATGATGTAACnprE3662R2(Kpn玉) AAAGGTACCATGTACAATGGAACATGGC

Km(c)1 GGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTKm(c)2 GAACCATTTGAGGTGATAGGTAAGAHpa(R)1 AACTCTTTGAACACACAATTCGGCGHpa(R)2 CTGCATTGATGCGCTGTCGTT

摇 摇 注:引物中的酶切位点用下划线标注。 Restriction sites in primers are underlined.

1. 3摇 hpa1 在芽孢杆菌中的转录检测

LB 平板活化解淀粉芽孢杆菌 FZB42 及其衍生菌株。 单菌落接入液体 LB 活化 12 h 后,按 1%接种量

接入 Landy 培养基发酵,在发酵 24 h 时收集菌体,利用 Trizol 法提取总 RNA,经 DNase玉处理后纯化,反转

录成 cDNA,用引物 Hpa(R)1、Hpa(R)2 进行 PCR 检测 hpa1 转录情况。1. 4摇 烟草过敏性反应(HR)

FZB42、FZBAN 和 FZBHarpin 菌株在 LB 培养液中活化过夜,按 1%接种量接入 Landy 发酵培养基,取发酵液,注射‘三生烟爷叶片,以 Landy 培养基和大肠杆菌所表达的 Harpin 纯化蛋白(50 滋g·mL-1)分别为

阴性对照和阳性对照,24 ~ 36 h 时观察过敏反应产生情况。 试验重复 3 次,每重复 3 片烟叶。1. 5摇 实验室烟草促生试验

通过测定植物的生长量(烟草根系生长情况)来反映芽孢杆菌和基因工程菌促进植物生长的效应。具体方法如下:将烟草种子预先在一定细胞浓度的芽孢杆菌发酵液(1 伊108 CFU·mL-1 )或灭菌水浸种

12 h,取出后用 15% (体积分数)的次氯酸钠消毒 15 min,之后用无菌水洗涤直至没有氯气味道为止,然后

播种在10 cm2、含 MS 培养基的方形塑料培养皿上,置于 25 益光照培养箱中,垂直培养 4 ~ 5 周后观察结

果,测定烟草根系(主根系)长度[17]。1. 6摇 温室水稻生防促生试验

选择饱满水稻种子(品种为‘丰优 22 号爷)于 15%的次氯酸钠溶液中消毒 15 min,用无菌水洗涤直至

没有氯气味道为止,将种子置于无菌水中浸泡发芽(25 益,2 ~ 3 d),待水稻露白后置于芽孢杆菌及其工程

菌的 Landy 发酵液(灭菌水稀释至 1伊108 CFU·mL-1)中浸泡 2 h,取出种子播种于已灭菌的土壤 /蛭石盆钵

中,放于温室大棚中。 45 d 后,再次用芽孢杆菌发酵液(灭菌水稀释至 1伊108 CFU·mL-1)喷雾处理植株。发酵液处理后 1 d,采用剪叶法接种水稻白叶枯 POX99,3 周后调查水稻白叶枯发病情况和植株高度。 每

个处理 10 盆,每盆 5 株水稻苗,试验独立重复 3 次。

2摇 结果与分析

2. 1摇 Harpin 蛋白整合表达载体的构建

2. 1. 1摇 aprE 位点整合载体 pGAprEHS 的构建摇 以 FZB42 基因组为模板,用引物 aprE鄄1 和 aprE鄄2 扩增

aprE 基因及其两侧序列,并进行 T / A 克隆,构建中间载体 pGEMT鄄aprE;以质粒 pM43HF 为模板,用引物

P43鄄1(Hpa玉)和 Hpa鄄2(Cla玉)扩增 hpa1 基因,将片段进行 Hpa玉和 Cla玉双酶切后与 pGEMT鄄aprE 载体

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南摇 京摇 农摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 36 卷

连接,构建载体 pGAprEH;以质粒 pIC333 为模板,用引物 spe鄄1鄄lox66 和 spe鄄2鄄lox71 扩增壮观霉素序列

( lox鄄spec),将其以平末端连接方式与经 Hpa玉限制酶酶切的中间载体 pGAprEH 连接,最终成功构建

Harpin 蛋白表达整合载体 pGAprEHS(图 1)。 另外,将 lox鄄spec 片段以平末端连接方式直接与 Hpa玉酶切

的中间载体 pGEMT鄄aprE 连接,构建 aprE 的突变载体 pGAprES。

图 1摇 hpa1 整合表达载体 pGAprEHS 构建示意图

Fig. 1摇 The schematic diagram of the construction of Harpin expression vector pGAprEHS

2. 1. 2摇 nprE 位点整合载体 pUNprEKHS 的构建摇 利用 Pst玉限制酶酶切质粒 pBT2鄄arcA,并回收 lox鄄km片段,将之与载体 pUC18 相连接,构建中间载体 pUK;以 FZB42 基因组为模板,用引物 nprE鄄L1鄄(Ehe玉)和nprE鄄L2(Sph玉)扩增 nprE鄄L 序列,用引物 nprE2274R1(Sal玉)和 nprE3662R2(Kpn玉)扩增 nprE鄄R 序列,将 nprE鄄L 和 nprE鄄R 分别克隆到载体 pUK 相应酶切位点,构建 nprE 突变载体 pUNprEK;以 pM43HF 质粒

为模板,用引物 P43鄄1 (Hpa玉) 和 Hpa鄄his2,利用 Pfu 酶扩增 hpa1 序列,将其与 Hinc域单切的载体

pUNprEK 连接,成功构建 nprE 位点整合载体 pUNprEKHS(图 2)。2. 2摇 工程菌 FZBHarpin 和双突变体 FZBAN 的构建及其转化子验证

采用芽孢杆菌 FZB42 的化学转化方法,将构建成功的突变载体 pGAprES、pUNprEK 和整合表达载体

pGAprEHS、pUNprEKHS 分别转化 FZB42 中,经过 Km 和 Spec 抗生素筛选,最终分别得到了 FZB42 含有 2个拷贝 hpa1 基因的工程菌 FZBHarpin 和 aprE 及 nprE 同时被破坏的双突变体 FZBAN。 提取转化子的基

因组 DNA,选择抗生素(Km,Spec)和 hpa1 片段为检测序列,利用 PCR 的方法检测了所得到的转化子

(图 3),将完全正确的转化子于 15%甘油-70 益保存。2. 3摇 工程菌 FZBHarpin 的 hpa1 基因转录检测

为了进一步确定 hpa1 是否能够正常转录,我们采用 RT鄄PCR 方法对工程菌 FZBHarpin 进行了检测。利用检测引物 Hpa(R)1 和 Hpa(R)2,以 FZBHarpin 反转录 cDNA 为模板,60 益条件下进行扩增,25 个循

环;同时,以 FZBHarpin 的 RNA 为模板扩增,以检验 RNA 中是否有 DNA 的污染。 从图 4 可以看出,hpa1能够在工程菌 FZBHarpin 中正常进行转录。2. 4摇 工程菌 FZBHarpin 激发烟草的过敏反应

为了测定表达 Harpin 的芽孢杆菌工程菌 FZBHarpin 在烟草上激发 HR 的能力,我们将测试菌株在

04

摇 第 6 期 乔俊卿,等:表达 Harpin 蛋白的芽孢杆菌工程菌的构建及其生防效果

Landy 发酵培养基中发酵,分别在 24、48 和 72 h 取发酵菌液,注射烟草。 结果显示:在发酵 72 h 后所收集

的 FZBHarpin 发酵菌液,能够像大肠杆菌所表达的 Harpin 一样,在烟草上激发 HR,但出发菌株 FZB42 及

双突变株 FZBAN 不能激发 HR 产生(图 5)。 这表明:Harpin 蛋白能够在 FZB42 中表达,并通过信号肽分

泌至胞外在培养基中累积。

图 2摇 hpa1 整合表达载体 pUNprEKHS 构建示意图

Fig. 2摇 The schematic diagram of the construction of Harpin expression vector pUNprEKHS

图 3摇 aprE、nprE 位点双突变菌 FZBAN 转化子(A)和双拷贝 hpa1 工程菌 FZBHaprin 转化子(B)的 PCR 验证

Fig. 3摇 The validation of mutant FZBAN(A)and FZBHarpin(B)by PCR analysis摇 摇 P. 阳性对照(以含有抗生素的质粒为模板);N. 无菌水为模板的阴性对照;M. A:Marker 姿+EcoR玉;B:Marker DL2000;F42. FZB42(以 FZB42 基因组为模板);FAN. aprE、nprE 突变体 FZBAN(以 FZBAN 基因组为模板);FZBH. Harpin 工程菌 FZBHarpin(以 FZBHarpin基因组为模板)。

P. Positive control( the plasmid with Km or Spec);N. Negative control ( double鄄distilled water);M. A:Marker 姿 + EcoR玉;B:MarkerDL2000;F42. FZB42( the DNA of strain FZB42 was used as the template);FAN. aprE,nprE mutants( the DNA of strain FZBAN was used as thetemplate);FZBH. Transformant carrying two copies hpa1( the DNA of strain FZBHarpin was used as the template) .

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南摇 京摇 农摇 业摇 大摇 学摇 学摇 报 第 36 卷

图 5摇 基因工程菌 FZBHarpin 培养 72 h 的

发酵菌液在烟草上激发 HRFig. 5摇 HR in tobacco elicited by fermentatio

liquid of FZBHarpin collected at 72 h

图 4摇 RT鄄PCR 分析基因 hpa1 的转录

Fig. 4摇 RT鄄PCR analysis of hpa1 expression inthe engineering strain FZBHarpin

摇 摇 N. 无菌水为模板的阴性对照;M. Marker DL2000; P. 载体

pM43HF 为模板的阳性对照; FZBHC. 以 FZBHarpin RNA 反转录

cDNA 为模板;FZBHR. 以 FZBHarpin RNA 为模板的阴性对照。N. Negative control ( double鄄distilled water was used as template);

M. Marker DL2000;P. Positive control ( vector pM43HF was used as thetemplate); FZBHC. The cDNA of strain FZBHarpin was used as thetemplate;FZBHR. The RNA of strain FZBHarpin was used as the template.

2. 5摇 工程菌 FZBHarpin 对烟草根系的促生效果

烟草根系促生试验结果表明(图 6):与无菌水和 Landy 培养基浸种处理相比,FZB42 及其衍生菌株都

具有促进烟草根系生长的作用。 FZB42 处理后烟草根长为 55. 17 mm,促生效果达 15% ;而 FZBHarpin 处

理后烟草根长为 64. 05 mm,促生效果达 30% 。 此外,aprE、nprE 双突变菌株 FZBAN 的促生能力也比出发

菌株 FZB42 有所提高,但比 FZBHarpin 略低。 目前,尚未见胞外蛋白水解酶与促生相关的研究报道,其原

因有待进一步研究。

图 6摇 烟草根系促生试验

Fig. 6摇 The analysis of tobacco root promotion in plastic plate不同字母表示在 0. 05 水平差异显著。 The different letters mean significant difference at 0. 05 level. The same as follows.

2. 6摇 工程菌 FZBHarpin 对水稻的促生和白叶枯病的防治效果

为了进一步评估工程菌 FZBHarpin 的生防和促生效果,我们进行了温室水稻促生和白叶枯病防治试

验。 结果显示:FZBHarpin 和 FZBAN 的促生作用均比 FZB42 显著增强,但 FZBHarpin 和 FZBAN 之间并无

显著差异。 FZBHarpin 防治水稻白叶枯病的效果最高,达 51. 9% ,与野生菌株 FZB42 相比,防效提高了一

倍,比双突变菌株 FZBAN 也提高了 50% (表 3)。表 3摇 FZB42 及其衍生菌对水稻的促生和白叶枯病的防治效果

Table 3摇 The biocontrol efficacy of rice bacterial blight and plant growth promotion by FZB derived strains

处理 Treatment 病情指数 / % Disease index 防治效果 / % Control efficacy 株高 / cm摇 Plant heightWater(CK) 44. 25依2. 82a 71. 75依3. 54c

FZB42 36. 57依1. 73b 17. 4 75. 92依1. 88b

FZBAN 28. 97依2. 01c 34. 5 80. 33依1. 53a

FZBHarpin 21. 26依2. 73d 51. 9 82. 58依0. 80a

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摇 第 6 期 乔俊卿,等:表达 Harpin 蛋白的芽孢杆菌工程菌的构建及其生防效果

3摇 讨论

自 1992 年发现革兰氏阴性植物病原细菌 Harpin 蛋白以来,人们在利用其防治植物病害方面进行了

多种方式的探索,如蛋白质产物形式[18] 和转基因形式[19]。 之前,本实验室的 Wu 等[16] 将 Harpin 蛋白通

过穿梭载体的方式在枯草芽孢杆菌 OKB105 中进行了表达,但因芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒在芽孢杆菌

复制过程中容易丢失和转移[20],这一利用途径受到一定程度的限制。 本研究利用同源重组原理将 Harpin激发子编码基因整合到根围促生拮抗解淀粉芽孢杆菌 FZB42 基因组中,从而有效解决了穿梭载体丢失和

转移给环境造成的基因漂移危害,使有促生防病效果的 Harpin 蛋白和生防芽孢杆菌真正结合起来,创制

出功能多样性的生防制剂。本研究选择将 Harpin 编码基因 hpa1 分别整合到 FZB42 的碱性蛋白水解酶编码基因 aprE 和中性蛋

白水解酶编码基因 nprE 位点,成功构建双拷贝 Harpin 外泌工程菌株 FZBHarpin。 之所以选择整合在这 2个位点是因为这 2 个水解酶是胞外蛋白降解的主要作用因子,在它们正常表达情况下,可能会将分泌到胞

外的 Harpin 蛋白降解,使得其生物功能不能完全发挥出来。 工程菌 FZBHarpin 发酵 72 h 后,其发酵液可

引起烟草过敏性反应,这进一步表明 Harpin 蛋白可以外泌在发酵培养基中并且保持生物活性。 烟草根系

促生和温室水稻白叶枯病防效结果显示,工程菌 FZBHarpin 具有比出发菌株更好的促生和防病能力。 此

外,我们也观察到 aprE、nprE 双突变体 FZBAN 的促生和生防效果比出发菌株 FZB42 也有所提高,但原因

尚不清楚,有待深入研究。本研究中我们在整合 hpa1 到染色体的同时将蛋白水解酶基因突变,即保证了 Harpin 蛋白的稳定表

达,也降低了蛋白水解酶对外泌 Harpin 的降解作用。 另外,我们在构建同源重组载体过程中,将重组酶

Cre / lox 系统的 lox 序列位点引入到相应的抗生素筛选基因两侧[21],这为我们将来切除抗生素标记提供了

可能性。 利用重组酶 Cre / lox 系统切出抗生素标记将使工程菌在农业生产中的应用更加具有潜力。

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责任编辑:夏爱红

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