遺伝毒性の評価法と結果の解釈makoto hayashi / 2016 1...

Makoto HAYASHI / 2016

1

第13回医薬品評価フォーラム2016年4月22日

遺伝毒性の評価法と結果の解釈

林真

makoto international consulting 名誉理事長 (公財)安全センター

mic


2


Mutagenicity Gene mutation Chromosomal aberrations Structural Numerical

Genotoxicity Mutagenicity DNA adduct formation DNA damage（UDS, Comet） Sister chromatid exchange（SCE） Etc.

Terminology Mutagenicity vs Genotoxicity 変異原性遺伝毒性


3

はじめに

DNAに付いた傷はほとんどが修復される

修復に誤りがあった場合に変異が起きる

変異した細胞が生き残り，増殖

次世代への影響：生殖細胞；流産


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代表的な遺伝毒性試験

遺伝子に傷を付ける（DNA鎖切断）

修復（除去修復）

遺伝子突然変異（塩基対置換，ﾌﾚｰﾑｼﾌﾄ）

染色体異常（構造異常，数的異常）

単細胞ゲル電気泳動法（コメットアッセイ），アルカリ流出法

不定期DNA合成試験(UDS)

Ames試験，MLA，TG，Pig-A

ほ乳類培養細胞，MLA，小核試験，DL


5

遺伝毒性試験

in vitro

in vivo

遺伝子突然変異染色体異常誘発性

Ames試験

MLA

HPRT

CHL，ヒト末梢血

MLA

小核試験

げっ歯類を用いる

小核試験

多臓器小核試験

トランスジェニック動物試験

Pig-A

DNA 傷害性

recアッセイ,

コメット試験,

UDS試験

コメット試験,

UDS試験


6

遺伝毒性試験

in vitro

in vivo

遺伝子突然変異染色体異常誘発性

Ames試験

MLA

HGPRT

CHL，ヒト末梢血

MLA

小核試験

げっ歯類を用いる

小核試験

多臓器小核試験

トランスジェニック動物試験

Pig-A

DNA 傷害性

recアッセイ,

コメット試験,

UDS試験

コメット試験,

UDS試験


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遺伝毒性物質の検出

遺伝子に傷を付ける（DNA鎖切断）

修復（除去修復）

遺伝子突然変異（塩基対置換，ﾌﾚｰﾑｼﾌﾄ）

染色体異常（構造異常，数的異常）


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Bacterial gene mutation assay (Ames assay)

Salmonella/microsome assay

His- His+ Trp

- Trp+

Salmonella typhimurium

Base-change type: TA100, TA1535, TA102, TA92

Frame-shift type: TA98, TA1537, TA97(a), TA1538, TA94

Cross-link: TA102, TA92, TA94

Escherichia coli: WP2uvrA(/pKM101), WP2(/pKM101)

チャイニ－ズ・ハムスタ－正常

チャイニ－ズ・ハムスタ－染色体異常

MMC

6-MP

Ara-C


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げっ歯類を用いる小核試験

験体投与骨髄細胞塗抹固定染色

観察

13

In vivo micronucleus assay

6-8 h 18-22 h

Erythroblasts

Immature

erythrocytes

Mature

erythrocytes

Bone marrow

Peripheral blood Clastogen

0.35-0.9

● ●

●

●

●

●

●


18

MN by flow cytometry

CP: SD rat

po single

5, 10, 15 mg/kg

Makoto HAYASHI / 2013 19

その他の試験法

単細胞ゲル電気泳動法（コメットアッセイ）

In vitro 小核試験

ＦＩＳＨ，染色体ペインティング

トランスジェニック動物を用いる試験

Pig-A assay

コメット法

陰性

陽性


21

Absence vs presence of Cyt-B

with Cyt-B

w/o Cyt-B


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Transgenic animal model

外来遺伝子を標的として遺伝子突然変異を検出する

全ての臓器，組織を評価対象とすることが出来る

OECD TG-488として，標準手法がある

Ames試験で陽性の2nd in vivo試験として注目

Multiple endpoint assayの構築が可能

+

λ packaging extract

Collect tissues (Store frozen)

λ LIZ α gene

l packaging

Infection to

E.coli C ( lac , galE ) - -

Mutagens

8 0 λ gt10 lac Z / cell

over night

Agar Agar + P-gal

lacZ Titer

Mutant Plaques

37°C

Mutant Plaques

G1225

( hfl - )

cII

Titer

G1217

( hfl + )

2 days

25°C

or G1225

( hfl - ) 1 day

37°C

DNA extraction

Peripheral blood MN assay

Multiple-endpoint genotoxicity assay

Other tissue MN assay

Comet assay

Gene mutation assay Rodents

24


25

Pig-A assay

Phosphatidylinositol Glycan

Complementation Group A （Pig-A）

遺伝子を内因性レポーター遺伝子として用いるin vivo試験

Environmental and Molecular Mutagenesis

Volume 49, Issue 4, 2008


26

遺伝毒性の特徴と限界

DNAは皆同じ

ヒトへの影響をバクテリアで評価？

原核生物と真核生物

裸のDNAと染色体

In vitro と in vivo

単細胞と多細胞ハザードとリスク

閾値を設定できない


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遺伝毒性の特徴と限界

DNAは皆同じ

ヒトへの影響をバクテリアで評価？

原核生物と真核生物

裸のDNAと染色体

In vitro と in vivo

単細胞と多細胞ハザードとリスク

閾値を設定できない


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閾値がない

ある一定の線量以下では，注目している生物反応が起

こらないとき，その値を”しきい値”という．個体の致死で

は明らかにそのような値が存在する．．．．．しかし，突

然変異のように，生きている個体に確率的に発生する

障害では，線量を下げてもその頻度が下がるだけで，

同種の傷害が依然として起こる．．．．

近藤宗平著「分子放射線生物学」

29

0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 0.001 0.010 0.100 1.000 10.00

MMC

0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0 0.100 1.000 10.00 100.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 0.010 0.100 1.000 10.00

Ara-C

COL

D o s e m g / k g

Mic

ron

ucle

ate

d r

eti

cu

locyte

s (

%)

Mouse MN

assay

30

1

10

100

1000

10000

0 0.010 0.100 1.000

MMC 1M

2K

20K

200K

Manual

0.0010 1

10

100

1000

10000

0 0.1 1.0 10.0

Ara-C 1M

2K

20K

200K

Manual

1

10

100

1000

10000

0 0.010 0.100 1.000

COL 1M

2K

20K

200K

Manual

D o s e m g / k g

D o s e m g / k g

Asano et al., Mutagenesis (2006)

Mouse MN assay M

icro

nu

cle

ate

d r

eti

cu

locyte

s p

er

mo

use


31

H17 (Rec+)

Bacillus subtilis

Rec assay


32

H17 (Rec+)

Bacillus subtilis

Rec assay

MNNG (-S9)

1

10

100

1000

10000

0.00001 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10

Concentration ( µ g/plate)

No

. o

f H

is+ r

evert

an

ts/p

late

TA1535

YG7108

Ames assay

O6-methylguanine DNA

methyltransferase (Dogtst

and Dadast) deficient strain

NO-MTMC: Nitro-m-tolyl-methylcarbamate

NO-MPMC: Nitro-3,4-xylyl-methylcarbamate

NO-Carbaryl: Nitro-1-naphtyl-N-methylcarbamate

SCE

Chrom Ab

1.0 10.0 100.0

Concentration (µg/mL)

1

2

3

4

5

50

0

100

Cell

s w

ith

ch

rom

ab

(%

)

No

. S

CE

per

big

gest

4 c

hro

mo

so

mes

SCE & CA assay

Risk of liver cancer Response of each carcinogenic marker at low dose level of MeIQx

Control

level

Re

sp

on

se

Dose of MeIQx

MeIQx-DNA

adduct

H-ras mutation 8-OHdG

GST-P Positive foci

Liver cancer

Activity of initiation LacI mutation

By Dr. Fukushima 19


36

ICH S2(R1)

Guidance on Genotoxicity

Testing and Data

Interpretation for

Pharmaceuticals Intended

for Human Use

Bacterial mutation assay

negative

Positive and relevant Negative

(or Positive

but not

relevant based

on WoE)

MNT

integrated into

toxicology

study

No 2nd in vivo

MNT

integrated in toxicology study

Acceptable only if top dose is appropriate

Option 1 Option 2

2nd tissue

integrated if possible

If top dose is not acceptable

for genotoxicity evaluation

Acute genotoxicity

Assay (2 tissues if possible)

+

either

or

No in vitro mammalian cell test In vitro mammalian cell test

遺伝毒性：相互関係

38

DNAと直接反応 Rec-assay (Bacteria) In vitro/in vivo: Alkaline elution Comet, UDS, DNA adducts

遺伝子突然変異Ames MLA (3-6h) Hprt (3-6h) Transgenic mice (LacZ,LacI)

Pig-A

染色体構造異常 Metaphase (in vitro, in vivo) MN (in vitro, in vivo) MLA (3-6h, 24h)

タンパクと反応 e.g., topoisomerase; tubulin

染色体数的異常 Metaphase (in vitro, in vivo) MN (in vitro, in vivo) MLA (24h)

遺伝毒性：相互関係

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DNAと直接反応 Rec-assay (Bacteria) In vitro/in vivo: Alkaline elution Comet, UDS, DNA adducts

遺伝子突然変異Ames MLA (3-6h) Hprt (3-6h) Transgenic mice (LacZ,LacI)

Pig-A

染色体構造異常 Metaphase (in vitro, in vivo) MN (in vitro, in vivo) MLA (3-6h, 24h)

タンパクと反応 e.g., topoisomerase; tubulin

染色体数的異常 Metaphase (in vitro, in vivo) MN (in vitro, in vivo) MLA (24h)

閾値：？閾値：有り


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ハザード

暴露量（Exposure）バックグランド量

複合曝露の影響

暴露の対象

物理化学性状

その他

これらが組み合わさった関数

リスク

100

80

60

40

20

0

100 80 60 40 20

染色体異常を有する細胞

(%

)


41

J.E. Sturrock and J.F. Nunn (1978): Chromosomal damage and mutations after exposure of

Chinese hamster cells to high concentrations of oxygen, Mutat. Res., 57, 27-33.

% Oxygen


42

リスク・ベネフィット

ベネフィット

ベネフィットの大きさを計算できるか

定量的ベネフィット

リスクの計算定量的リスク

許容値を設定できるか

ベネフィットを上回るか


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評価解釈に必要なもの

ガイドライン評価に必要な試験の基本的な道筋

評価に必要な一定の基準を満たす質

再現性のあるデータ

GLP 試験条件の記録（結果の再構築）再現性の高いデータ

統計客観性の高い評価


44

評価での問題点

ガイドライン何が必要なデータかを考えなくなる

その被験物質に取っての最適データは保証されない

目的になっていないか

GLP 再現性の高いデータにするためのプロセス管理


統計内容と仮説を理解しているか（正しい手法？）


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解釈での問題点

ガイドライン必要最低限の基本的なデータ

その被験物質に取っての最良のデータか


GLP 解釈者に安心感を与える道具


統計

統計の結果（*印）が一人歩きする

生物学的有意性に裏付けされているか


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評価解釈での問題点

安全サイドに立って考える

リスクベースで考えているか

ハザードで考えていないか

ベネフィットは考えているか

末端の使用者を考えているか

リスクトレードオフを考えているか

考えることの放棄／サイエンスの放棄

ものを怖がらなさ過ぎたり，

怖がりすぎるのはやさしいが，

正当に怖がることはなかなかむつかしい．

It is very easy to over- or under-estimate of risk but very hard to make a rational assessment of risk.

by Torahiko Terada translated by Sohei Kondo

寺田寅彦（近藤宗平）

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遺伝毒性の評価法と結果の解釈makoto hayashi / 2016 1...

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