清酒酵母の遺伝子組換え 技術の進展と展望 -...
TRANSCRIPT
赤田倫治
山口大学工学部
清酒酵母の遺伝子組換え
技術の進展と展望
「よい清酒はよい酵母から」
「よい清酒はよい酵母から」
酵母ゲノム
「よい清酒はよい酵母から」
酵母遺伝子
FAS2ATF1---
遺伝子組換え酵母のお
酒を飲みたいですか?
GREEN CO-OP
どうすれば組換えのお酒
を飲んでもらえるか
遺伝子組換え微生物食品の不安
抗生物質耐性遺伝子
食品用組換え微生物
大腸菌DNA病原性微生物
?
プラスミド
有用遺伝子
導入用マーカー
自然形質転換をおこなう病原性細菌類
Species from clinical Transformation frequencyisolates (transformants/viable cell)Campylobacter jejuni 2.0 x 10-4
Campylobacter coli 1.2 x 10-3
Haemophilus influenzae 7.0 x 10-3
Haemophius parainfluenzae 8.6 x 10-3
Helicobacter pylori 5.0 x 10-4
Neisseria gonorrhoeae 1.0 x 10-4
Neisseria meningitidis 1.1 x 10-2
Staphylococcus aureus 5.5 x 10-6
Streptococcus pneumoniae 2.9 x 10-2
Streptococcus sanguis 2.0 x 10-2
Streptococcus mutans 7.0 x 10-4
Lorenz and Wackernagel, 1994を改変
解決
不要DNA配列の除去
遺伝子組換え微生物の不安を除くことから着手
有用遺伝子
不要大腸菌プラスミドDNA
不要抗生物質耐性遺伝子
マーカー遺伝子
有用遺伝子
遺伝子除去技術の開発
グルコース培地:正常OFF
不安な遺伝子を抜く方法
ガラクトース誘導増殖阻害遺伝子
GAL10promoter
ON
増殖増殖できない ガラクトース培地
GIN11
Y'X
cen
Subtelomeric region
C1-3A repeat
GIN11配列テロメア
染色体末端近くの配列の過剰発現は酵母の増殖を止める
GIN11はtelomeric X-element の配列
1 GATCAATAAC AGTGTTTGTG GAGCATTTTC TGAATACAAT AAACCCAAAA CAGAAACTTC CCTTTTGTAT CACTGTTCTG
81 GAAAAGGGGT GGGCGGTAAT AAAGCTAATA GGGTGTGTCC ATAAGTAATA CTGAACTTGG AAATGTGCGG CTTTGCAGCA
161 TTTTGTCTTT CTATAAAAAT GTGTCGTTCC TTTTTTTCAT TTTTTGGCGC GTCGCCTCGG GGTCGTATAG AATATGCGTC
241 ACTTTTAAAA ATAAGATTGC AGATCAGGGC AAAACAAGTA GCAAATCATA GCAAGAGACC CTGATTTTTG TGACATAAAT
321 ATTTTTACTT CTGTGTTAGG TTAACTTTTT ATGTAACTGT AAATGGAATA GAGTTGAGGG GATAGTGCCC ACAAGTCAAT
401 ATGTTTATTT TGTAAAGTTG AAAGATAATT ATTTTTATGT TTAGGTGATT TTGGTGTTGA ATTTTCTGTA ATATTAACAT
481 AAGAGTAATA CATTGAGTGG TTAGTATATG GTGTAAAAGT GGTATAACGC ATGTATTAAG AGCAGTTATA CAATATTTGG
561 GGCCGCTGAA TGAGATATAG ATATTAAAAT GTGGATAATC ATGGGCTTTA TGGGTAAATG GAACAGGGTA TAGACCACTG
641 AGGCAAGTGC CGTGCATAAT GATATGAGTG CATCTAGT
(C1-3A)n
TelomereY'Xcen
Subtelomeric region
GIN11
cen
20100
0
20
40
60
80
pGL108
p315GAL
Time (hr)
5 15 25
Pla
sm
idlo
ss r
ate
(%) コントロール
プラスミド
GIN11を発現させたプラスミド
ガラクトース液体培地でGIN11プラスミドは抜け落ちる
協会7号増殖阻害遺伝子導入
組換え協会7号
生えている酵母では不要遺伝子が抜けている!
ガラクトース培地
FAS2変異遺伝子は香気成分を増加させる
1250Gly⇨Ser
GGT⇨AGT
香気成分カプロン酸エチルの増加
脂肪酸合成酵素(Fatty acid synthase)
1 1887
F A S 2
FAS2-1250S
吟醸香
Mutation siteFAS2-1250S ∆NC
NdeI
Af l I I
Amp
ori
AUR1-C
GIN11
GAL10promoter
pAURFAS2-6
12566 bp
*
除去選択マーカー(増殖阻害遺伝子)
導入用マーカー
染色体への挿入
染色体DNA
YPgal培地で選択
GIN11 AUR1
除去選択用マーカー 導入用マーカー
AUR1 GIN11
相同組換え
AUR1 GIN11
不要配列が脱落
FAS2-1250S変異株
正常FAS2遺伝子
S
S
S
S
GIN11 AUR1
S
遺伝子導入体の選択(オーレオバシジン培地)
GIN11 AUR1
遺伝子除去体の選択(ガラクトース培地)
S
pAURFAS2-6
第1段階遺伝子導入
第2段階不要配列の除去
遺伝子組換えで評判の清酒酵母株と全く同じ株を作成できる
A/G
変異株の塩基配列
⇨変異遺伝子
GTTCTGGTATG ⇨正常遺伝子
GTTCTAGTATG
G
A
T
C
S
FAS2-1250SS
FAS2-1250S
FAS2-1250S 酵母兄弟
薬剤耐性遺伝子 薬剤耐性遺伝子
セルレニン耐性変異株スクリーニングで作成
2段階遺伝子組換えで作成
S
弟兄
醸造した芳醇な清酒は市販中 厚生労働省確認済
セルフクローニングと呼ぶ(自分に自分の遺伝子を入れること)
表3.セルフクローニング審査事情
審査年月日 申請者 審査対象 審査結果 備考
13.2.2 山口県産業技術センター セルフクローニング清酒酵母 追加資料 再検討
13.4.27 山口県産業技術センター セルフクローニング清酒酵母 該当する
ジェネンコア α-アミラーゼ,グルコースイ
ソメラーゼ生産菌
追加資料 再検討
協和醗酵工業 イノシン酸二ナトリウム,グア
ニル酸二ナトリウム生産菌
該当する
13.6.26
ノボザイムジャパン グルコアミラーゼ生産菌 該当しない
味の素 酸性フォスファターゼ生産菌 該当する13.9.18
ジェネンコア グルコースイソメラーゼ生産菌 該当する
13.11.13 ジェネンコア α-アミラーゼ生産菌 該当する
14.1.30 三栄源エフ・エフ・アイ キサンタンガム生産菌 該当する
世界最初に市販された遺伝子組換え酵母のお酒
表示の義務はないのだが,見せられないのが悲しい。
2003年春
今までと同じ酵母なら意味がない?
実用化のための酵母遺伝子組換え技術開発
プラスミド
(1)導入用マーカー
プラスミド
有用遺伝子マーカー遺伝子
プラスミド
薬剤耐性遺伝子
(2)マーカー除去法 [GALp-GIN11]
Start Goal
方法をシェイプアップ
Table 1. Drug resistance markersMarker Selection drug Referencekanr G418 Hadfield et al., 1990; Wach et al., 1994Mdhfr methotrexate Zhu et al., 1986CAT chloramphenicol Hadfield et al., 1986aroA glyphosate Kunze et al., 1989hph hygromycin B Gritz and Davies, 1983cyh2 cycloheximide Del Pozo et al., 1991Tn5ble phleomycin Wenzel et al., 1992PDR4 cerulenin Nakazawa et al., 1993P45014DM triazole Doignon et al., 1993ARO4 fluorophenylalanine Shimura et al., 1993? lipid hydroperoxide Inoue et al., 1993AUR1 aureobasidin A Hashida-Okado et al., 1996SMR1 sulfometuron methylCasey et al., 1988; Xie and Jiménez, 1996SFA1 formaldehyde Van den Berg et al., 1997LEU4-1 trifluoroleucine Bendoni et al., 1999FZF1-4 sulfite Park et al., 1999PDR3-9 cycloheximide Lacková and Subík, 1999hphMX hygromycin B Goldstein and McCusker, 1999natMX nourseothricin Goldstein and McCusker, 1999patMX bialaphos Goldstein and McCusker, 1999
導入用マーカー
薬剤耐性マーカーによる形質転換の問題点
1. 低い形質転換効率
2. バックグラウンド耐性変異株の出現
3. 蛋白合成阻害剤とマーカー遺伝子発現の拮抗作用
4. プレーティング前の非選択培地での培養
5. 酵母遺伝子との相同組換え(酵母変異遺伝子マーカー)
高発現YAP1カセット
恒常的高発現
PGKプロモーター
YAP1
YAP1プロモーター
YAP1
金属耐性cadmium
薬剤耐性
cycloheximidesulfometuron methyl1,10-phenanthroline
酸化ストレス耐性H2O2
diamide
URA3
PGK3 '
YAP1PGK5 '
Or iYCp- PGKp- YAP1
Amp
ARS/ CEN
YCpプラスミド
PGKプロモーター
URA3
PGK3 '
YAP1PGK5 '
Or iYCp- PGKp- YAP1
Amp
ARS/ CEN
YCpプラスミド
PGKプロモーター
URA3
PGK3 '
YAP1
PGK5 '
O r i
Amp
YIp- PGKp- YAP1
YIpプラスミド
PGKプロモーター
URA3
PGK3 '
YAP1
PGK5 '
O r i
Amp
YIp- PGKp- YAP1
YIpプラスミド
PGKプロモーター
W303-1A (control)0.5 10.1 5
Cycloheximide10 0.5 1 2 4
Cerulenin8
5 10 20Nystatin
1 5 10AmphotericinAureobasidin
0.05 0.1 0.2 0.4 200100 400Geneticin
(µg/ml)
YAP1はcycloheximideとceruleninに耐性を示すが他の薬剤には耐性能を示さない。
YCp-PGKp-YAP1
YIp-PGKp-YAP1
W303-1A (control)
YCp-PGKp-YAP1
YIp-PGKp-YAP1
0
20
40
60
80
100
120 YCp
YIp
-Ura0.5 0.5 1 2 4 21 0.5 1 (μg/ml)SDSD YPD培地
薬剤シクロヘキシミド セルレニン選択培地
高発現型YAP1の形質転換効率
形
質
転
換
効
率
(%)
YPD
セルレニン
1.0 μg/ml
脂肪酸合成阻害剤セルレニンで高率の形質転換が可能しかし、濃度が低いとバックがでる
プラスミドあり プラスミドなし
シクロヘキシミド形質転換用セルレニンプレート
他の薬剤培地へのレプリカによる真の形質転換体の確認
レプリカ レプリカ
あり
オーレオバシジン
プラスミド導入体はシクロヘキシミドに耐性だが,ほとんどの耐性変異体は感受性
プラスミドなしにもコロニーが出現する=薬剤耐性変異体
プラスミド導入体はオーレオバシジンに感受性だが,シクロヘキシミド耐性変異体はこれにも耐性
なし
プラスミド
プラスミド
遺伝子導入と除去選択が可能なpGG119ベクター
PGKp-YAP1
除去選択マーカー
導入選択マーカー
GALp-GIN11M86
実用化のための酵母遺伝子組換え技術開発
プラスミド
(1)導入用マーカー [PGKp-YAP1]
プラスミド
有用遺伝子マーカー遺伝子
プラスミド
薬剤耐性遺伝子
(2)マーカー除去法 [GALp-GIN11M86]
Start Goal
方法をシェイプアップ
今までと同じ酵母なら意味がない?
遺伝子組換えを使わなければできないおいしい清酒酵母
AlaSer Thr Cys1250GGly
1250S 1250A 1250T 1250C
HC
H
OH
H
CH
H
HC
HO
HC
H
H
H
CH
H
S
H
C
OH
N
C
H
O
C
H
C
H
H
HH H
C
O
N
O H
C
H
C NH
CH
C
H
C
H
S
H H
H
C
O
C
H
C
H
H
NC
C
N
H O
C
O
NC
H H
O
C
H
H
N
H
C H
C H
CH
H
H H
N末側⋯ Gly-Ser-Gly-Met-Gly-Gly-Val⋯ C末側
1250
1250番目の側鎖
野生型高生産
FAS2の1250番目をAla, Thr, またはCysにする
FAS2アミノ酸配列
カプロン酸エチル ?
1250G (Gly)野生型高生産型
PCRを利用した部位特異的変異導入
GGT TCT GGT ATG GGT GGT
Gly Ser Gly Met Gly Gly
--- --- AGT --- --- ------ --- GCT --- --- ------ --- ACT --- --- ------ --- TGT --- --- ---
1250S (Ser)1250A (Ala)1250T (Thr)1250C (Cys)
NheI
AflII
SphI
SalI/XhoI
XhoIApaI
GALp-GIN11M86
PGKp-YAP1
OriAmp
14.3 kb
r
pGG119FAS2
Mutation
FAS2-1250
NotI
108
76
kb
FAS2 probe pBluescript probeKy
okai
no.
7pG
G11
9-FA
S2A
inte
gran
t
FAS2
Aco
unte
r-sel
ecte
d
FAS2
Cco
unte
r-se
lect
ed
Kyok
ai n
o. 7
pGG
119-
FAS2
Ain
tegr
ant
FAS2
Aco
unte
r-sel
ecte
d
FAS
2Cco
unte
r-sel
ecte
d
除去選択株は野生型または変異型FAS2のどちらかを持つ
Southern analysisによるプラスミドの導入と除去の確認
FAS2 probe pBluescript probe
NruI NruI
*NruI NruI
*NruI NruI
*
22 kb
8 kb
8 kb
Integration
Homologousrecombination
or
NruI NruI8 kb
or
Wild-type FAS2 Mutant FAS2
Counter-selection
pGG119FAS2
*
菌株 K7 1250S 1250A 1250C
FAS2-1250 Gly Ser Ala Cys
もろみ日数 27 25 27 27
Alcohol (%) 15.5 15.3 15.2 15.5
日本酒度 +9.3 +8.9 +9.2 +11.4
カプロン酸エチル (ppm) 1.0 4.9 3.4 6.1
<小仕込分析結果>
おいしい酵母と実用的遺伝子操作技術
FAS2
S
FAS2-1250S
FAS2-1250 酵母兄弟
薬剤耐性遺伝子
薬剤耐性遺伝子
S
FAS2
AFAS2-1250A
薬剤耐性遺伝子
薬剤耐性遺伝子
A
C
FAS2-1250C
薬剤耐性遺伝子
薬剤耐性遺伝子
C
FAS2-1250S
FAS2-1250A FAS2-1250C
1.0 ppm 4.9 ppm
3.4 ppm 6.1 ppm
HC
H
OH
H
CH
H
H
CH
H
S
組換え技術を使わないと作れない
従来の変異選択法でもなんとかなる
アルコールアセチルトランスフェラーゼ(ATF1)の過剰発現をセルフクローニングで
SphI
SacISacIINotI
GALp-GIN11M86
ATF1? C
PGKp-YAP1
pGG119TDH3pATF1
11.2 kb
TDH3promoter
5' upstreamof ATF1
Ori
Ampr
XbaI
過剰発現プロモータのセルフクローニング
1809
1857
1858
1861
Counter-selected
Ladd
er
32
kb
Inte
gran
t
23kb
12
A B
1859
pBluescript KS+ probeATF1 probe
1807
Kyok
aino
.7
Kyok
aino
.7
1808
1809
1857
1858
1861
1807
1808
1809
1857
1858
1861
Counter-selectedIntegrated
Counter-selectedIntegrated
Strain Days Sake Alcohol Isoamylmeter (%) acetate
Kyokai no. 7 27 +9.3 15.5 4.9pGG119TDH3p-ATF1 27 +9.0 15.5 15.4TDH3p-ATF1 28 +8.8 15.5 24.2
醸造結果
(ppm)
協会7号
・FAS2-1250C・TDH3p-ATF1
まだ市販されていません。
扱いにくい
結局,実用酵母の遺伝子操作は研究室酵母に比べて
1990年代の酵母研究
実用酵母は二倍体多くは胞子形成能がなく一倍体が取れない遺伝的解析が不自由二倍体では劣性変異体取得が困難二倍体では交配も困難
1倍体酵母 2 倍 体 酵 母
変異が取得できる 形質として現れない
2倍体で劣性変異が取れないと考えていたわけ
変異 変異 変異 変異
10-4 10-4変異が同時に起こる確率は
10-4 x 10-4 =10-8
UV照射
照射時間 (s)
0 5 10 15 20 25 300
20
40
60
80
100
・カ・カ・ヲ・i・・・j
1倍体2倍体
変異誘発による生存率
生存
率%
UV照射
酵母菌
培養
レプリカ
YPD培地 (栄養培地)
MM培地 (最小培地)
YPD培地に生育できてMM培地に生育できないものを探す
栄養要求性変異株
栄養要求性変異株の取得方法
UV照射による変異誘発率
親株 生存率(%) 調査数変異株数 変異取得率(%)
協会7号
協会7号H
協会9号
協会10号
協会701号
協会901号
22.0
19.3
13.4
9.9
8.1
3422
1885
1696
3046
2147
2998
2
1
1
2
3
6
0.06
0.05
0.06
0.07
0.14
0.20
17.8
変異
10-4
染色体欠失
遺伝子変換体細胞交叉
高頻度の「Loss of heterozygosity」で説明できる
10-1~10-2?
栄養要求性関連遺伝子を約100とすると
100 x 10-4 x 10-1=10-3 1000個に1個の割合
取得した栄養要求性変異株
取得株名 親株 栄養要求性の種類
RAK1536
RAK1537
RAK1546
RAK1763
RAK1764
RAK1785
RAK1786
RAK1787
RAK1788
RAK1922~RAK1927
協会7号
協会7号
協会7号
協会701号
協会701号
協会701号
協会10号
協会10号
協会9号
協会901号
Histidine
Methionine
Histidine+lysine
Leucine
Arginine
Uracil
Methionine
Tryptophan
Tryptophan
Tryptophan
栄養要求性相補遺伝子
取得株名 親株 栄養要求性と相補遺伝子
RAK1536
RAK1537
RAK1546
RAK1763
RAK1764
RAK1785
RAK1786
RAK1787
RAK1788
RAK1922~RAK1927
協会7号
協会7号
協会7号
協会701号
協会701号
協会701号
協会10号
協会10号
協会9号
協会901号
Histidine
Methionine
Histidine+lysine
Leucine
Arginine
Uracil
Methionine
Tryptophan
Tryptophan
Tryptophan
HIS3
LYS4
LEU4
TRP3
TRP3(RAK1926以外)
研究室酵母並みの遺伝子操作技術
PGKp-YAP1
プラスミド
導入用マーカー[PGKp-YAP1]
プラスミド
有用遺伝子の開発
プラスミド
効率よい確実な導入体選択法[セルレニンとシクロヘキシミド耐性]
GoalStart
薬剤耐性遺伝子
外来DNA除去[GALp-GIN11M86]
HIS3有用遺伝子
HIS3有用遺伝子
his3-変異株
1段階での実用化
除去の必要なし
90年代の方法
PGKp-YAP1
10865432
1.5
kb
Sac ISac IINot IXba I
Sal ISma I
BamH I
Sph I
Xho IApa I
pSKHIS3-ATF110649 bp
LEU2
ATF1 5' non-coding
ATF1
TDH3p
HIS3
TDH3p-ATF1の作成法も変わる
香気成分の測定(ppm)
K7 RAK1536 RAK1884K7 his3- K7
香気成分 TDHp-ATF1酢酸イソアミル 5.7 5.9 15.4カプロン酸エチル 0.65 0.64 0.89
研究室酵母並の遺伝子操作を清酒酵母で
不要なDNA配列を除去するセルフクローニング
DNAを除去する必要がないセルフクローニング
A.
プラスミド(大腸菌)
薬剤耐性遺伝子
不要配列
実用化可能
除去
有用遺伝子
栄養要求性変異(醸造酵母)
実用化可能
B.
栄養要求性相補遺伝子
有用遺伝子
栄養要求性遺伝子を利用した醸造酵母遺伝子操作
過剰発現型TDH3プロモータHIS3
酵母染色体
HIS3過剰発現型TDH3p-XXX1
Systematic Selfcloning!
酵母染色体
40mer 40mer
過剰発現プロモータHIS3
+40merプライマー +40merプライマー
PCR
2
3
RAK2196 kbHIS3 TDH3p
ATF1-401 ATF1-402
ATF1
HIS3 TDH3p
PCR
40 bp 40 bp
ATF1HIS3 TDH3p2.0 kb
TDH3-160 NotI-ATF1
PCR産物の挿入もできることはできるが
そんなにうまくはいかない
基本的な研究室酵母株
BY4741(1倍体)MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0
BY4742 (1倍体)MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 lys2Δ0
BY4743 (2倍体)MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 LYS2+
MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 MET15+ lys2Δ0
2倍体以外に研究室酵母とどこが違う?
協会7号でこんな株を作れば自由自在な遺伝子操作ができる
基本的な研究室酵母株
BY4741MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0BY4742MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 lys2Δ0BY4743 MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 LYS2+
MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 MET15+ lys2Δ0
1倍体で劣性変異が取得できる。1倍体同士の接合で2倍体ができる。2倍体の胞子形成で1倍体ができる。栄養要求性マーカーが揃っている。遺伝子操作ができる。
ura3Δ0
URA3ATG STOP
デルタ0ゼロ=全くない
メリット1:URA3で形質転換ができる。メリット2:URA3マーカーはURA3に入ることがない。 つまりターゲッティングができる。メリット3:5-FOA培地でURA3の除去ができる。
ura3Δ0
URA3
ura3変異ATG STOP
*
マーカー
URA3 マーカー
ura3変異株ではURA3マーカーが変異部位へ挿入されてしまう。
相同組換え
デルタ0ゼロ株には決して入らない⇒挿入したい場所へターゲッティングできる!
酵母株
テンプレートpScHIS3TDH3p
URA3-401: atcaaagaaggttaatgtggctgtggtttcagggtccataggcgcgcccgURA3-402: ttttttcgtcattatagaaatcattacgaccgagattcccggcagtattg
URA3URA3-401 URA3-402
協会7号のura3Δ株の作製
プライマー設計
pScLYS4TDH3patcaaagaaggttaatgtggctgtggtttcagggtccataggcgcgcccg
tttttt
cgtcat
tataga
aatcat
tacgac
cgagat
tcccgg
cagtat
tg
atcaaagaaggttaatgtggctgtggtttcagggtccataggcgcgcccg
tttttt
cgtcat
tataga
aatcat
tacgac
cgagat
tcccgg
cagtat
tg
基本的な研究室酵母株
BY4741MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0BY4742MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 lys2Δ0BY4743 MATa leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 met15Δ0 LYS2+
MATα leu2Δ0 ura3Δ0 his3Δ1 MET15+ lys2Δ0
1倍体で劣性変異が取得できる。1倍体同士の接合で2倍体ができる。2倍体の胞子形成で1倍体ができる。栄養要求性マーカーが揃っている。遺伝子操作ができる。
LOH(Loss of heterozygosity)
MATa/MATaMATa/MATα ⇒ or
MATα/MATα
ヘテロはホモになりやすい
レプリカ
レプリカで混合する
栄養培地
UV照射(20秒間)栄養欠損培地
変異株からのa型・α型株の取得方法
栄養培地
a/
a型
栄養培地 栄養培地
ロイシン要求性の醸造酵母
メチオニン要求性1倍体テスター株
交配可能変異株とテスター株との交配
協会701号由来ロイシン要求性株
スクリーニング数
20 15.4
α型 (%)UV(秒)生存率(%) a型 (%)
RAK1763
0
864
639
32 (3.8)
1 (0.2)
38 (4.5)
0 (0)-
『桜酵母』と協会酵母の変異株
株名 由来 栄養要求性変異 交配型
RAK2150 桜酵母 ウラシル a/a
RAK1595 協会7号 ヒスチジン・リジン α/α
RAK1600 協会701号 ロイシン α/α
RAK1606 協会9号 トリプトファン α/α
RAK1613 協会901号 トリプトファン α/α
RAK1618 協会10号 トリプトファン α/α
協会7号 His-/Lys-
協会701号 Leu-
協会9号 Trp-
協会901号 Trp-
協会10号 Trp-
桜酵母 Ura-
aa型
αα型
最少培地
K7 1562
1583 1562+1583
交配株
K7 his/lys a型
4倍体ができている
α/α体の取得 a/a体の取得
URA3をHIS3で置換
FOA
URA3を LYS4で置換
FOA
ウラシル、リジン要求性 ウラシル、ヒスチジン要求性
研究室酵母並の遺伝子操作を酵母ゲノムで利用すれば
出芽酵母
Saccharomyces cerevisiae
パン酵母清酒酵母ワイン酵母焼酎酵母ビール酵母
真核生物で最初のゲノムシークエンス
1996年 12,068kb
600人以上の研究者による国際プロジェクト
清酒ゲノムも完成
栄養要求性遺伝子を利用した醸造酵母の遺伝子操作
過剰発現型TDH3プロモータHIS3
酵母染色体
HIS3過剰発現型TDH3p-XXX1
酵母遺伝子6000個を操作できる技術
酵母染色体
過剰発現プロモータHIS3
プライマー プライマー
PCR
合成DNA 合成DNA 注文3日で1本約3000円
PCR機器で3時間
形質転換実験3時間
増殖3日
Chromosome 2 Chromosome 3Chromosome 1
TDH3pURA3 TDH3pURA3TDH3pURA3
Confirmation of URA3-TDH3p fragment insertion
Colony-PCR
ATF2ATF1 SLI1 ATF1 ATF2 SLI1
3
RAK2336 (α/α) RAK2359(a/a)
W T W T W T W T W T W T
0.5
markerkb
Mating
α/αura3Δ::HIS3/ura3Δ::HIS3
lys4/lys4
a/aura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3
YYY1XXX1
α/α/a/a
Tetraploid
RAK2336
TDH3p-ATF1
TDH3p-ATF2
TDH3p-SLI1
RAK2359
TDH3p-ATF1
TDH3p-ATF2
TDH3p-SLI1
a/a his3/his3
α/ α
lys4
/lys
4
Minimal medium
・・・
Ethanol
Taste
Ethanol
Flavor Taste
XXX1
XXX2
YYY1
YYY2
ZZZ1
ZZZ2
ZZZ2
Flavor
・・・・
・・・・
・・・・
・・・・
・・・・
・・・・
・・・・・・
・・・・・・
・・・・・・
・・・・・・
・・・・・・
・・・・・・
・・・・
XXX1 XXX2 ZZZ1YYY2YYY1
・・・・・・・・・・・・
遺伝子1
遺伝子2
遺伝子11
遺伝子3
遺伝子6000
遺伝子4
遺伝子5
遺伝子6
遺伝子7
遺伝子8
遺伝子9
遺伝子10
遺伝子12
お酒1
お酒2
お酒3
お酒4
お酒5
お酒6
お酒7
お酒8
お酒9
お酒10
お酒11
お酒12
お酒6000
PCR変異醸造酵母へ形質転換 醸造
ゲノム酒へ
おいしければ飲んでもらえるのか?
S-Adenosylmethionine
様々な肝臓疾患に治療効果エタノールによる肝障害が緩和肝硬変患者の死亡率減少鬱病治療骨関節症治療癌治療
大量生産が必要清酒酵母はもともと高生産さらなる高生産へ
sah1T279I
Mizunuma M, Miyamura K, Hirata D, Yokoyama H, Miyakawa T.
Involvement of S-adenosylmethionine in G1 cell-cycle regulation in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA. 101: 6086-6091, 2004
分子生物学から清酒酵母育種へ
Mizunuma et al., PNAS 101, 6086, 2004
MSAPAQNYKIADISLAAFGRKEIELAEHEMPGLMAIRKAYGDVQPLKGARIAGCLHMTIQ
TAVLIETLVALGAEVTWSSCNIYSTQDHAAAAIAASGVPVFAWKGETEEEYLWCIEQQLF
AFKDNKKLNLILDDGGDLTTLVHEKHPEMLEDCFGLSEETTTGVHHLYRMVKEGKLKVPA
INVNDSVTKSKFDNLYGCRESLVDGIKRATDVMLAGKVAVVAGYGDVGKGCAAALRGMGA
RVLVTEIDPINALQAAMEGYQVVTMEDASHIGQVFVTTIGCRDIINGEHFINMPEDAIVC
NIGHFDIEIDVAWLKANAKECINIKPQVDRYLLSSGRHVILLANGRLVNLGCATGHSSFV
MSCSFSNQVLAQIALFKSNDKSFREKHIEFQKTGPFEVGVHVLPKILDEAVAKFHLGNLG
VRLTKLSKVQSEYLGIPEEGPFKADHYRY*
T279I
sah1T279I
Table 1. Cellular contents of AdoMet and AdoHcy in wild-type and sah1-1 cells
YPD O medium
Wild type sah1-1 Wild type sah1-1
AdoMet, nmol/mg cells ND 1.95 0.36 13.40
AdoHcy, nmol/mg cells ND 0.31 0.16 1.35
The content of AdoMet and AdoHcy were measured using early log-phase growing cells (OD660 of 0.2 0.3) of wild-type (DHT22—1b) and sah1—1 (YMM222) strains in YPD or O medium. The values are means from two independent experiments. ND, not detected.
Mizunuma et al., PNAS 101, 6086, 2004
Standard Name SAH1
Systematic Name YER043C
Feature Type ORF, Verified
Description
Name Description S-Adenosyl-l-Homocysteine hydrolase
Molecular Function adenosylhomocysteinase activity (ISS)
Biological Process methionine metabolic process (NAS)
selenocysteine metabolic process (NAS)
Pathways S-adenosylhomocysteine catabolism
Systematic deletion inviable
S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase, catabolizes S-adenosyl-L-homocysteine which is formed after donation of the activated methyl group of S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) to an acceptor
ATGTCTGCTCCAGCTCAAAACTACAAAATCGCTGATATCTCTTTGGCTGCCTTCGGTAGA
AAGGAAATCGAATTGGCTGAACATGAAATGCCAGGTTTGATGGCCATCAGAAAGGCTTAC
GGTGACGTCCAACCTTTGAAAGGCGCCCGTATTGCTGGTTGTTTGCACATGACCATTCAA
ACTGCTGTTTTAATTGAAACTTTAGTTGCTTTGGGTGCCGAAGTTACCTGGTCCTCTTGT
AACATCTATTCGACTCAAGATCATGCCGCCGCTGCTATTGCCGCTTCCGGTGTTCCAGTT
TTTGCCTGGAAGGGTGAAACTGAAGAAGAGTATTTGTGGTGTATTGAACAACAATTGTTT
GCCTTCAAGGACAACAAGAAATTGAACTTGATCTTAGATGATGGTGGTGATTTAACCACT
TTAGTTCATGAAAAGCACCCTGAAATGCTGGAAGACTGCTTTGGTCTTTCCGAAGAAACT
ACCACCGGTGTTCACCACTTATACAGAATGGTCAAAGAAGGCAAGTTAAAGGTTCCTGCC
ATTAACGTTAACGACTCCGTCACTAAGTCCAAGTTTGACAACTTGTACGGCTGTAGAGAA
TCCTTAGTCGACGGTATTAAGAGAGCCACTGATGTCATGTTGGCTGGTAAGGTTGCCGTT
GTTGCTGGTTACGGTGATGTCGGTAAGGGTTGTGCTGCTGCCTTAAGAGGAATGGGTGCT
CGTGTCTTGGTTACCGAAATTGACCCAATCAACGCTTTACAAGCTGCCATGGAAGGCTAC
CAAGTTGTTACCATGGAAGATGCATCCCACATTGGTCAAGTTTTCGTTACCACCACTGGT
TGTAGAGATATTATCAACGGTGAACATTTCATCAACATGCCAGAAGATGCCATTGTTTGT
AACATTGGCCATTTCGATATCGAAATTGATGTCGCCTGGTTAAAGGCTAACGCTAAAGAA
TGTATTAACATCAAACCACAAGTCGACCGTTACTTGTTGTCTTCTGGTAGACACGTCATC
TTGTTGGCTAACGGTAGATTAGTTAACTTGGGTTGTGCTACTGGTCACTCATCTTTCGTT
ATGTCTTGTTCCTTCTCTAACCAAGTCTTAGCTCAAATTGCTTTGTTCAAGTCTAACGAT
AAGTCTTTCAGAGAAAAGCACATTGAATTCCAAAAGACAGGCCCATTCGAAGTTGGTGTC
CACGTTTTGCCAAAGATCTTGGATGAAGCTGTCGCTAAGTTCCACTTGGGCAACTTGGGT
GTTAGATTGACTAAATTGAGTAAAGTCCAATCTGAATACTTGGGTATTCCAGAAGAAGGT
CCATTCAAGGCCGACCACTACAGATATTGA
ATT=Ile
AAGTATCCCTACCTCTCTCCTCTAACGCAGATATTTCTGTGCACGTGATCTCGTTGGCTTTTTTTTCGGCCGAAATTTTCACAGGCTAAGGCCGAAAAAGAAAGAAAATTTTCAGAGGAAAAAGAAAATTAAACGACCTCGAAGCCGTATTTTAGATTTTCCAATCTCTTATTTAGTAACGTGGTTTATTAACTCCATGATTCCATTCCTATTTGTTTTTCTTTCTTTCTGAAAATCCTCTTCTCCTCGAAATAACCCAACTGACAAAAAGAACAATTCCCAATGTCTGCTCCAGCTCAAAACTACAAAATCGCTGATATCTCTTTGGCTGCCTTCGGTAGAAAGGAAATCGAATTGGCTGAACATGAAATGCCAGGTTTGATGGCCATCAGAAAGGCTTACGGTGACGTCCAACCTTTGAAAGGCGCCCGTATTGCTGGTTGTTTGCACATGACCATTCAAACTGCTGTTTTAATTGAAACTTTAGTTGCTTTGGGTGCCGAAGTTACCTGGTCCTCTTGTAACATCTATTCGACTCAAGATCATGCCGCCGCTGCTATTGCCGCTTCCGGTGTTCCAGTTTTTGCCTGGAAGGGTGAAACTGAAGAAGAGTATTTGTGGTGTATTGAACAACAATTGTTTGCCTTCAAGGACAACAAGAAATTGAACTTGATCTTAGATGATGGTGGTGATTTAACCACTTTAGTTCATGAAAAGCACCCTGAAATGCTGGAAGACTGCTTTGGTCTTTCCGAAGAAACTACCACCGGTGTTCACCACTTATACAGAATGGTCAAAGAAGGCAAGTTAAAGGTTCCTGCCATTAACGTTAACGACTCCGTCACTAAGTCCAAGTTTGACAACTTGTACGGCTGTAGAGAATCCTTAGTCGACGGTATTAAGAGAGCCACTGATGTCATGTTGGCTGGTAAGGTTGCCGTTGTTGCTGGTTACGGTGATGTCGGTAAGGGTTGTGCTGCTGCCTTAAGAGGAATGGGTGCTCGTGTCTTGGTTACCGAAATTGACCCAATCAACGCTTTACAAGCTGCCATGGAAGGCTACCAAGTTGTTACCATGGAAGATGCATCCCACATTGGTCAAGTTTTCGTTACCACCATTGGTTGTAGAGATATTATCAACGGTGAACATTTCATCAACATGCCAGAAGATGCCATTGTTTGTAACATTGGCCATTTCGATATCGAAATTGATGTCGCCTGGTTAAAGGCTAACGCTAAAGAATGTATTAACATCAAACCACAAGTCGACCGTTACTTGTTGTCTTCTGGTAGACACGTCATCTTGTTGGCTAACGGTAGATTAGTTAACTTGGGTTGTGCTACTGGTCACTCATCTTTCGTTATGTCTTGTTCCTTCTCTAACCAAGTCTTAGCTCAAATTGCTTTGTTCAAGTCTAACGATAAGTCTTTCAGAGAAAAGCACATTGAATTCCAAAAGACAGGCCCATTCGAAGTTGGTGTCCACGTTTTGCCAAAGATCTTGGATGAAGCTGTCGCTAAGTTCCACTTGGGCAACTTGGGTGTTAGATTGACTAAATTGAGTAAAGTCCAATCTGAATACTTGGGTATTCCAGAAGAAGGTCCATTCAAGGCCGACCACTACAGATATTGATCAATTCAATTCCCATTTCAGTTCTTCTTTCTCACTATTTTTTAATGTTCAAAAACTCAACGGTTTGATCATCAAATAAAAGATCAAATAAATTGCAAATATAAAAACAACAGCTAACAATCCTATCACAGTATTAATAC
SAH1-282
SAH1-1450cSAH1d100-40cTDHu1 SAH1+1450+ASC
SAH1-401
変異遺伝子断片の作製
sah1T279I
SAH1-282 SAH1-1450c
HIS3
SAH1d100-40cTDHu1SAH1+1450+ASC
MIX
Fusion PCR
sah1T279ISAH1-282 SAH1d100-40cTDHu1
HIS3
sah1T279I HIS3
Template; pUC119-SAH1T279I Template; pScHIS3TDH3p
sah1T279I HIS3
SAH1
SAH1
協会7号RAK2359a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3
sah1T279I HIS3
SAH1
a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/SAH1+
協会7号
sah1T279I HIS3
a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/SAH1+
協会7号
URA3
SAH1
SAH1-401 SAH1d100-40cTDHu1
PCRURA3
形質転換(-U-H培地)
sah1T279I HIS3
a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/SAH1+
協会7号SAH1
URA3
sah1T279I HIS3協会7号
URA3
a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/sah1Δ::URA3
協会7号
a/a ura3Δ::LYS4/ura3Δ::LYS4 his3/his3 sah1T279I::HIS3/sah1Δ::URA3
・セルフクローニング・AdoMet高生産・肝臓によい・体によいかも
酒は百薬の長
謝 辞
広島大学水沼正樹先生宮川都吉先生
山口県産業技術センター有富和生氏
山口大学大学院医学系研究科生命機能工学研究室
末廣大輔
磐田化学工業阿野明彦氏