efecto anti tumoral de extracto etanÓlico de pÚnica
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EFECTO ANTI TUMORAL DE EXTRACTO ETANÓLICO DE PÚNICA GRANATUM (GRANADA) EN
COMBINACIÓN CON BYRSONIMA CRASSIFOLIA (NANCE) EN UN MODELO MURINO DE CÁNCER
CÉRVICO UTERINO PVH+16
Nombre del Residente
Norma Alicia Márquez Sánchez
Nombre del Asesor Interno
M. en C. Luis Alfonso Núñez Plascencia
Nombre del Asesor Externo
D. en C. David Alejandro Soriano Hernández
INFORME TÉCNICO DE RESIDENCIA PROFESIONAL QUE PRESENTA:
Villa de Álvarez, Col., a Enero de 2018
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ÍNDICE JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................................... 3
OBJETIVOS ............................................................................................................................................... 3
OBJETIVO GENERAL ......................................................................................................................... 3
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................................. 3
PROBLEMAS A RESOLVER ........................................................................................................................ 4
FUNDAMENTO TEÓRICO ......................................................................................................................... 4
CARACTERÍSTICAS DEL VPH ............................................................................................................. 6
DIAGNÓSTICO Y TIPIFICACIÓN DEL VPH .......................................................................................... 6
USO DE PLANTAS MEDICINALES COMO TRATAMIENTO CONTRA EL CÁNCER ................................ 7
NANCE (Byrsonima crossifolia) ........................................................................................................ 8
GRANADA (Punica granatum) ....................................................................................................... 10
ACTIVIDADES REALIZADAS .................................................................................................................... 11
PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ................................................................... 11
INOCULACIÓN DE MODELOS MURINOS ............................................................................................ 12
PROCEDIMIENTO METÓDOLOGICO .............................................................................................. 12
IDENTIFICACIÓN DE MODELOS MURINOS CON CÁNCER .................................................................. 12
PROCEDIMIENTO METÓDOLOGICO .............................................................................................. 13
MEDICIÓN TUMORAL Y REGISTRO DE PESO ..................................................................................... 14
PROCEDIMIENTO METÓDOLOGICO .............................................................................................. 14
PREPARACIÓN Y ADMINISTRACION DEL TRATAMIENTO .................................................................. 15
PROCEDIMIENTO METÓDOLOGICO .............................................................................................. 15
RESULTADOS ......................................................................................................................................... 15
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................................................ 19
COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS .............................................................................. 20
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Y VIRTUALES ......................................................................................... 20
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JUSTIFICACIÓN
Entre los principales problemas del cáncer se encuentra: la ausencia de tratamiento
específico, sobre todo en etapas avanzadas (cuando existe metástasis) y la toxicidad y agresividad de
los métodos para tratar de erradicar esta enfermedad. Sumado a lo anterior, se sabe que la
incidencia de esta enfermedad en nuestro país y en el resto del mundo va en aumento, llevándonos a
la búsqueda de tratamientos alternativos para ayudar a combatir los diferentes tipos de neoplasias.
México cuenta con una cultura herbolaria ancestral y gran biodiversidad de plantas
medicinales, a las cuales no se les ha corroborado sus efectos anticancerígenos representando un
gran potencial para el descubrimiento de nuevos fármacos antineoplásicos. En este trabajo se busca
determinar el efecto anti tumoral de los extractos etanólicos de granada (púnica granatum) con
nance (byrsonima crassifolia) en un modelo murino cepa C57BL/6. Buscando que dichos extractos
sean una terapia alternativa o se empleen como ayudantes de tratamientos quimioterapéuticos para
disminuir los efectos dañinos de los tratamientos convencionales (Hernández, 2005).
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto antineoplásico de la combinación de extracto etanólico de granada (púnica
granatum) con nance (byrsonima crassifolia) en un modelo murino cepa C57BL/6
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Evaluar la actividad de los extractos sobre la masa tumoral
Evaluar la sobrevivencia de los ratones cepa C57BL/6 con cáncer cérvico
uterino PVH+16 inducido, tratados con la combinación del extractos etanólico de granada
(púnica granatum) con nance (byrsonima crassifolia)
Determinar la efectividad de la combinación de los extractos a través de un
análisis estadístico
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Evaluar los resultados de la actividad de la combinación de extractos, entre
grupo ensayo y grupo control
Potenciar el uso medicinal de plantas
PROBLEMAS A RESOLVER
El carcinoma invasor de cuello uterino es una enfermedad de transmisión sexual causada por
el virus del papiloma humano (VPH). En la actualidad muestra una marcada incidencia y mortalidad
en el sexo femenino siendo un delicado problema de salud humana, hecho que es favorecido por la
resistencia farmacológica y los marcados efectos adversos de los agentes usados clínicamente. Es el
segundo cáncer más frecuente en mujeres después del de mama en el mundo, y el quinto de todos
los cánceres. La edad media de diagnóstico es de 48 años, aunque aproximadamente el 47% de las
mujeres con carcinoma invasivo de cérvix se diagnostica antes de los 35 años. Solo el 10% de los
diagnósticos se hacen en mujeres mayores de 65 años. El tipo histológico más común es el carcinoma
de células escamosas, que representa el 80% de todos los carcinomas invasivos de cérvix. El 83% de
los cánceres de cérvix diagnosticados cada año ocurren en los países en vías de desarrollo, siendo el
mismo la causa más frecuente de muerte por cáncer en estos países, y teniendo una supervivencia
media tras el diagnóstico de 5 años, mientras que en los países desarrollados es de 10 años. Las cifras
estimadas para mujeres mayores de 15 años indicarían que actualmente hay 27 millones de mujeres
con displasia de bajo grado, 1,5 millones con displasia de alto grado y 400 000 con carcinoma invasor
de cuello. En México se registra una elevada incidencia y mortalidad por cáncer de mama y cérvix
(Hernández, 2005).
FUNDAMENTO TEÓRICO
El impacto del cáncer cérvicouterino (CaCU) en el mundo es devastador. En el informe anual
de la Federación Internacional de Gineco-Obstetricia (FIGO) representa 5% de las neoplasias
genitales femeninas, ubicándose en el cuarto lugar a nivel mundial. En México, el cáncer
cérvicouterino se ha mantenido como la segunda neoplasia más importante entre la población
mexicana y como la primera causa en la población femenina. La edad promedio al momento del
diagnóstico es de 45 años, pero la enfermedad puede ocurrir inclusive en la segunda década de la
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vida y, ocasionalmente, durante el embarazo. En un estudio realizado en la Ciudad de México,
Lazcano Ponce y colaboradores reportan que el riesgo de enfermedad para cáncer cérvicouterino se
incrementó hasta siete veces en mujeres con virus del papiloma humano (VPH) 16-18 positivo. En un
estudio de prevalencia del VPH en cáncer del cuello uterino coordinado por la Agencia Internacional
para la Investigación sobre Cáncer (AIIC), se reportó la presencia de ADN del VPH en más de 93% de
los tumores a través de pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), capaces de identificar
más de 25 tipos de VPH, lo que sugiere que menos de 5% de los cánceres del cuello uterino
probablemente son verdaderos tumores VPH negativos. Por lo tanto, se considera a la infección por
este virus como el factor de riesgo más importante. Los tipos de VPH comúnmente detectados
fueron: el 16 (50%), el 18 (12%), el 45 (8%) y el 31 (5%). Los virus del papiloma humano (VPH)
descubiertos en la actualidad suman ya cerca de 120 tipos, de los cuales 25 afectan al tracto genital.
Se clasifican de alto o bajo riesgo según su repercusión en el grado de invasión. Los VPH 6 y 11 son
capaces de producir condiloma acuminado de comportamiento benigno y autolimitado, llamados de
bajo riesgo, y raramente se asocian a cáncer; en cambio otros, como los VPH 16, 18, 31, 45, 56, son
de fácil reconocimiento clínico y de alto poder oncogénico, sobre todo en el cérvix. El VPH-16 tiene
mayor proporción en el cáncer escamoso, mientras que el VPH-18 se encuentra más relacionado con
el adenocarcinoma (Sanchez, 2005).
El virus del papiloma humano (VPH) pertenece a la familia de los papovavirus. Este virus de
doble cadena de ADN se ha vinculado a diferentes alteraciones moleculares con la carcinogénesis
cervical como: alteraciones en el receptor del factor del crecimiento epidérmico (RFCE), la
sobreexpresión del gen HER-2-neu, la mutación de los genes H-ras y K-ras y la
amplificación/sobreexpresión del gen c-myc. El VPH es capaz de transformar las células que infecta
mediante la acción directa de los productos de dos de sus genes tempranos: E6 y E7. Las proteínas E6
y E7 de los VPH de alto riesgo son capaces de interaccionar con moléculas importantes para la
regulación del crecimiento y replicación celular, así como para la reparación de daños sufridos por el
ADN de las células sanas. La proteína E6 de los VPH de alto riesgo se une con alta afinidad a la
molécula conocida como p53, induciendo su degradación. La proteína p53 es un importante factor
regulador de la replicación celular y es conocido como el principal represor de tumores en el ser
humano; p53 es capaz de detectar daños sufridos por el ADN en cualquier célula del organismo. Si el
daño ha sido en una etapa del ciclo celular en la que aún no ha ocurrido la replicación del ADN, p53
envía una señal para que el ciclo celular se detenga y el daño sea reparado; una vez ocurrida la
reparación, la célula continúa su ciclo normal. Cuando el daño es sufrido durante o inmediatamente
después de la replicación del ADN, p53 envía una señal para detener el ciclo celular y, como a este
nivel es imposible reparar los daños, la célula sufre un proceso de eliminación por apoptosis
orquestado por la misma p53. Con esto no se permite que los daños causados al ADN sean
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heredados a células hijas que pueden, eventualmente, ser el origen de un tumor maligno
(Hernández, 2005).
CARACTERÍSTICAS DEL VPH
Una alta proporción de cánceres humanos demuestra tener daños en el gen que codifica la
proteína p53; el cáncer cervical es una excepción, ya que en este caso el gen se encuentra intacto,
pero la proteína no se encuentra presente en las células infectadas por VPH, ya que E6 se ha
encargado de eliminarla. De esta manera la célula queda desprotegida y los tumores se desarrollan
cuando el número de mutaciones desfavorables aumenta y, a la par, se incrementa la malignidad de
las células. Por otra parte, la proteína E7 se une específicamente al producto del gen Rb, represor de
tumores. Rb fue descubierto y caracterizado en el retinoblastoma, y es un factor regulador del ciclo
celular, ya que se une directamente al factor transcripciónal E2F, que a su vez induce la transcripción
de elementos involucrados con la replicación celular. La proteína E7 de los VPH de alto riesgo tiene
una alta afinidad por el sitio de unión de Rb a E2F, cuando la célula ha sido infectada por el virus, la
proteína E7 se une a este sitio en Rb, impidiendo que éste mantenga controlado a E2F, el cual queda
libre e induce la replicación celular continua. De esta manera E6 y E7 cooperan eficientemente en la
transformación de las células, produciendo tumores cervicales a largo plazo (Hernández, 2005).
Los VPH de alto riesgo tienen mayor inactivación de p53 y de pRb y presentan una diferencia
en un aminoácido (ácido aspártico en el de alto grado y glicina en los de bajo grado) que se relaciona
con la afinidad por el pRb. La ausencia de HPV en 5% de los cánceres de cuello es un factor de mal
pronóstico. El p53 es afectado por oncogenes del VPH, principalmente por E6. Es de esperar que los
tumores que contengan ADN de VPH sólo tengan pequeños niveles de p53. Se puede sugerir que, de
los resultados publicados sobre las mutaciones del p53 en el cáncer cervical, las mutaciones en el gen
p53 son muy raras. El porcentaje de tumores con mutaciones del p53 va desde 0-10%. En adición a
las mutaciones del p53, la inactivación del p53 puede también ser el resultado de otros mecanismos,
por ejemplo la unión del p53 tipo salvaje a varias oncoproteínas (Hernández, 2005).
DIAGNÓSTICO Y TIPIFICACIÓN DEL VPH
Cada día se brinda mayor importancia a la asociación biológica entre el VPH y el hombre
debido a la capacidad que éste posee en el desarrollo de atipias en las células cérvicovaginales, ya
que induce cambios en su genética molecular a través de la alteración de genes preexistentes a
oncogenes cuyos productos son los causantes de la afección sobre los mecanismos que regulan la
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multiplicación celular, dando como resultado un clon de células que terminan formando una masa
celular denominada tumor, por lo que queda claro que la mutación en el ADN celular es la clave en el
desarrollo del cáncer cérvicouterino El VPH ahora se conoce como la mayor causa de cáncer del
cuello del útero (cérvix). Algunos tipos de VPH se conocen como virus de “bajo riesgo” porque
raramente se convierten en cáncer; éstos incluyen los VPH-6 y VPH-11. Los tipos de virus de
papiloma humano que pueden llevar al desarrollo de cáncer se conocen como “tipos asociados con el
cáncer”. Los tipos de virus más importantes de papiloma humano, transmitidos sexualmente,
asociados con el cáncer en hombres y mujeres incluyen los VPH-16, VPH-18, VPH- 31 y VPH-45. Estos
tipos de VPH asociados con el cáncer causan crecimientos que normalmente parecen planos y son
casi invisibles, comparados con las verrugas causadas por los VPH-6 y VPH- 11. Las bases moleculares
de la oncogénesis en el cáncer cervical se explican a través de la regulación y función de dos
oncogenes virales conocidos como E6 y E7 debido a la habilidad de transformación en el ADN celular
que poseen cuando son transferidos a líneas celulares in vitro. Dichos genes se encuentran bajo la
regulación de otro gen viral conocido como E2; los VPH producen proteínas conocidas como E5, E6 y
E7. Estas proteínas interfieren con las funciones de la célula que normalmente previenen el
crecimiento excesivo. Por ejemplo, el VPH E6 interfiere con la proteína humana p53. La proteína p53
está presente en todas las personas y actúa para impedir que los tumores crezcan (Hernández, 2005).
La técnica de PCR ha permitido amplificar selectivamente diferentes fragmentos del genoma
viral que pueden ser utilizados para su diagnóstico y posterior tipificación (Hernández, 2005).
USO DE PLANTAS MEDICINALES COMO TRATAMIENTO CONTRA EL CÁNCER
El hombre, desde la antigüedad ha buscado en las plantas la curación para sus diversas
enfermedades. Las ha utilizado para tratar diferentes afecciones de la piel, sistema circulatorio,
endocrino, nervioso, reproductor, respiratorio y urinario; también para el cáncer y las infecciones
(Cabrera, 2005).
Los compuestos secundarios son sustancias orgánicas. Dichos compuestos se encuentran en
plantas y en los demás organismos como respuesta a las presiones de selección de depredadores,
competidores, parásitos y microorganismos patógenos de selección, actúan a primera estancia, como
defensas químicas que permitan mantener la integridad de las plantas (Cabrera, 2005).
Las plantas son una fuente de moléculas bioactivas, para uso humano, la mayoría son para
tratar problemas de salud que ocupan los primeros lugares como causa de muerte y que la mayor
parte de las plantas no ha sido estudiada y por otro lado urge acelerar la investigación de las plantas
en la búsqueda de sustancias de interés médico (Cabrera, 2005).
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Es por esto que se trata de desarrollar estrategias de investigación eficaces en esta
búsqueda. Una estrategia seria la selección de especies vegetales usadas en los sistemas
etnomedicos del mundo esto incrementa la posibilidad de encontrar actividad biológica en
comparación con la selección al azar de plantas (Cabrera, 2005).
Los compuestos secundarios que se encuentran presentes en las plantas son agrupados en
tres grupos principales, como podemos observan en la tabla 1.
Tabla 1 Compuestos presentes en las plantas
Otro problema en esta búsqueda es que como ya se dijo, la gran mayoría de las plantas no se
ha estudiado, de modo que hay que contar con una amplia variedad y que a veces hay que definir en
qué órgano vegetal se concentran los componentes bioactivos, todo esto incrementa notablemente
las posibilidades de búsqueda de estudio (Cabrera, 2005).
NANCE (Byrsonima crossifolia)
Nombre científico:
Byrsonima crossifolia
Nombre común: Nance
Familia: Malpighiaceae
Sinónimos: Byrsonima cinérea Dec. B. cotinifolia HBK, B. cubensis Juss
Descripción Botánica:
Árbol de 3-10 m de alto, copa redondeada o extendida, tronco recto, corteza café, rugosa,
rosada por dentro. Hojas siempre verdes, opuestas, ovadas, 5-20 cm de largo, puntiagudas. Flores de
Compuestos Fenólicos
• Taninos
• Fitoestrogenos
• Cumarinas
Compuestos Nitrogenados
• Alcaloides
• Glicósidos cianogenéticos
• Glucosinolatos
• Aminoácidos Tóxicos
• Lectinas o inhibidores de las proteasas
Terpenos
• Lactonas sesquiterpénicas
• Glicósidos cardíacos
• Saponinas
• Oxalatos
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5 pétalos, anaranjadas o amarillas, numerosas, en grupos. Frutos en drupa carnosa, 8-22 mm de
diámetro, portados aisladamente en racimos, piel delicada, amarilla; carnaza blanca, jugosa, ácida,
olor peculiar; una semilla negra muy dura.
Usos populares:
Para curar úlceras, por vía oral se emplea para tratar afecciones respiratorias y digestivas,
dolor de muelas, hemorragias, picaduras de culebra, parásitos y favorece el parto y la expulsión de la
placenta. Por vía tópica se usa para tratar afecciones dermatomucosas (estomatitis, leucorrea,
piodermia, tínea, úlcera, vaginitis), tumores y apretar los dientes. Se le atribuye actividad acaricida,
antifúngica, antineurálgica, antitusiva, astringente, desinflamante, emenagoga, febrífuga y tónica.
Evidencia pre-clínica:
El extracto acuoso de hojas, corteza y raíz es activo contra E. coli y S. aureus; la tintura de
corteza es activa contra enterobacterias, S. pneumoniae, S. pyogenes, C. albicans, la decocción
contra E. floccosum, M. canis. M gypseum, T. mentagrophytes y T. tubum. La corteza es el órgano
más activo contra bacterias y el etanol el mejor disolvente por bioactividad y rendimiento. El extracto
con acetato de etilo de la raíz tiene potente actividad. El metanólico de hojas es activo contra
trofozoitos de G. lamblia (Cl50 15µg/ml). Hojas y corteza son espasmogénicos.
Evidencia clínica:
Esta indicado en el tratamiento de diarrea, atonía gástrica y cólera. Indicado en el
tratamiento de candidiasis, tínea y úlcera.
Evidencia toxicológica:
A la corteza se le atribuye cierta toxicidad, pero no hay estudios específicos. Los extractos
acuosos y etanólico de hojas, corteza y raíz son tóxicos a peces del género Mollinesia. La infusión de
corteza por vía oral en ratón no tiene toxicidad aguda en dosis de 1-5 g/Kg.
Composición Química:
La corteza presenta taninos (20-30%), glucósidos, flavonoides, saponinas,
sesquiterpenlactonas y triterpenos (β- amirina). Las hojas contienen saponinas, esteroles insaturados
(β–sitosterol), cardenólidos, bufadienólicos, flavonoides (catechina, epicatechina, guayaverina,
hiperina, quercetina, galoilgalactósido), leucoantocianinas, taninos, polifenoles, triterpenoides
(birsonimol); terpenos (betulinaldehído, betulina, lupeol), éster aromático (metilgalato) y glicolípidos.
Proantocianidina B2. Taninos condensados del grupo de los polifenoles (Moreno, 2010)
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GRANADA (Punica granatum)
Familia:
Punicaceae
Porte: pequeño árbol caducifolio, a veces con porte arbustivo, de 3 a 6 m de altura, con el tronco
retorcido. Madera dura y corteza escamosa de color grisáceo. Las ramitas jóvenes son más o menos
cuadrangulares o angostas y de cuatro alas, posteriormente se vuelven redondas con corteza de
color café grisáceo, la mayoría de las ramas, pero especialmente las pequeñas ramitas axilares, son
en forma de espina o terminan en una espina aguda; la copa es extendida.
Sistema radicular:
Raíz nudosa consistente, con corteza rojiza, que lleva un alcaloide, llamado peletierina
Hojas:
Son de color verde brillante, lustrosas por el haz y con el borde entero. Nacen opuestas o casi
opuestas sobre las ramas o bien agrupadas formando hacecillos, tienen forma lanceolada a abovada,
un pecíolo corto y son ligeramente correosas. Generalmente miden 2-8 x 0.8-2 cm, y tienen un
nectario apical que segrega azúcares (fructosa, glucosa, sacarosa).
Flores: Hermafroditas, solitarias o reunidas en grupos de 2-5 al final de las ramas nuevas y de 3-4 cm
de diámetro son grandes y de color rojo, lustrosas, acampanadas, subsentadas, con 5-8 pétalos y
sépalos, persistiendo el cáliz en el fruto.
Fruto: baya globosa denominada balausta, de color rojo brillante, verde amarillento, o
blanquizco, rara vez violeta, cuando madura, estando coronado por el cáliz, de 5-8 cm de diámetro,
lleno de semillas y cuenta con una cáscara coriácea. Las semillas son angulares y duras por dentro, la
capa externa de la testa está cubierta por una capa delgada o pulpa jugosa, roja o blanco-
amarillenta, astringente, subácida o acidad.
Se han validado varios de los usos tradicionales de Punica granatum, por los resultados de
las investigaciones farmacológicas que han demostrado que la planta posee una fuerte actividad
antibiótica de amplio espectro, antimicrobiana y antiascaricida.
Las acciones tóxicas de la cáscara del fruto indican que se debe tener mucha precaución en el
manejo de esta planta (Shanghai Key, 2017)
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ACTIVIDADES REALIZADAS
PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
Esquema 1 Diagrama de flujo para la obtención de extracto etánolico
Recepción de la materia prima
Las hojas fueron separadas del tallo. Se revisaron las características en que se recibieron las hojas:
limpieza, color, presencia de alguna posible enfermedad.
Lavado y secado
Las hojas se lavaron sin detergente, eliminándose la suciedad que pudiera contener. Para el secado
se extendieron en una superficie limpia, para que se eliminaran los restos de agua que pudieran
permanecer del lavado. Este secado se realizó a temperatura ambiente.
Secado en un horno de charolas a 40° C
Para introducir las hojas al secador, no deben de tener restos de agua, se dejaron en el secador hasta
que la textura de la hoja se notó demasiada seca. Una vez que se alcanzó esta característica que
suele variar en tiempo dependiendo de la planta, se retiraron del secador para ser pesadas.
Macerado
Se trituraron las hojas con una licuadora marca Oster, y se homogenizaron con etanol, se
depositaron en frascos en un lapso de 3 días.
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Filtración
La filtración se realizó con una bomba de vacío, y la mezcla fue depositada en un matraz balón para
montar al rotavapor IKA RV10.
Destilación en el rotavapor IKA RV10
Para la destilación, debe estar montado el equipo previamente, con el respectivo flujo de agua
externo a 5°C, y la temperatura de flujo interno a 50° C así como también la bomba encendida.
Una vez que se haya recuperado la mayor cantidad de solvente, se inicia la condensación del agua.
Concentración
Este procedimiento se realizó en un concentrador, para eliminar la cantidad de agua que pudo
permanecer después de que el extracto pasó por el rotavapor IKA RV10
Obtención del extracto
Para la obtención del extracto total, debe de estar libre de agua y contenido en un recipiente libre
de humedad.
INOCULACIÓN DE MODELOS MURINOS
Para la inoculación doce ratones de la cepa C57BL/6 fueron elegidos al azar
aproximadamente de 6 a 8 semanas. De los cuales fueron siete hembras y cinco machos.
PROCEDIMIENTO METODOLÓGICO
Se rasuró la zona previa a la inyección del tumor, en este caso a una altura
del lomo entre patas y cola.
Inoculación a ratones cepa C57BL/6 por vía subcutánea (ectópica), con 5 ×
10^5 células de la línea de cáncer de cérvico uterino (TC1).
La numeración de cada ratón se le asigno de acuerdo al orden en que fueron
presentando el tumor
IDENTIFICACIÓN DE MODELOS MURINOS CON CANCER
El tumor primario se clasifica como un tumor sólido, el cual está compuesto por una cápsula
fibrosa y en su interior por diferentes tipos de células como: tumorales, estromales, inflamatorias
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polimorfonucleares, fibroblastos y células endoteliales. Este conjunto de células junto con las
citoquinas, hormonas y factores de crecimiento producidos en él, se conoce como microambiente
tumoral (MT) (Vargas, 2013).
Luego de la inoculación vía tópica de doce modelos murinos, se desarrolló una inflamación
local originada por los factores producidos de células de la línea de cáncer de cérvico uterino (TC1).
Con características como VEGF (Factor de crecimiento endotelial vascular), GM-CSF (Factor
estimulador de colonias granulocíticas y monocíticas), induciendo la infiltración de células
inflamatorias con perfil supresor (Gr1+CD11b+, células supresoras derivadas mieloides, MDSC),
Las células Gr-1 + CD11b + o MDSCs se sobreproducen significativamente en la médula ósea y el bazo
de ratones portadores de tumores. Hay un gran número de estas células en la sangre periférica de los
hospedadores tumorales. Los MDSCs expresan CD11b, un marcador para células mieloides del linaje
de macrófagos, y un marcador para granulocitos, Gr-1; así se llaman Gr-1 + CD11b +Células (Res,
2010). Se ha demostrado que los MDSC son inmunosupresores desde los años ochenta. Inhiben las
células asesinas naturales (NK), B y T a través de la producción de arginasa y especies reactivas de
oxígeno; también inhiben la maduración funcional de las células dendríticas y promueven el
desarrollo de macrófagos tipo II y representan un mecanismo de escape tumoral del control del
sistema inmune y comprometen la eficacia de la inmunoterapia del cáncer. La inmunosupresión de
estas células puede ser sistémica efecto sobre los órganos linfoides secundarios y un efecto local
dentro del microambiente tumoral. Estas MDSC son una población heterogénea de macrófagos,
granulocitos y células dendríticas en un estado temprano de maduración y con el mismo progenitor
en la médula ósea; su función es controlar la inflamación excesiva o prolongada en condiciones
patológicas, pero cuando esta población forma parte del microambiente tumoral, inhibe de manera
significativa la respuesta celular de linfocitos (LT) CD4+ y CD8+, a través de la producción de óxido
nítrico sintasa inducible (iNOS), el cual hace que los macrófagos activados (M1) se polaricen a
macrófagos activados alternativamente (M2) siendo estos los responsables de la polarización de la
respuesta celular tipo Th1 a tipo Th2 facilitando la progresión del tumor, (Serafini, Borrello, & Bronte,
2006; Sinha, Clements, Bunt, & Ostrand-Rosenberg, 2007) e induciendo la acumulación de LT
reguladores (LTr) Otro mediador de importancia en el microambiente es el INF- γ, secretado en el
microambiente por células inflamatorias como: macrófagos, células dendríticas, natural killer (NK) y
granulocitos (Vargas, 2013).
PROCEDIMIENTO METODOLOGICO
Se emplearon siete ratones hembras C57BL/6, nulíparas e inmunológicamente maduras (6 a
8 semanas de edad) con un peso de 20 a 25 gr y 5 machos inmunológicamente maduros (6 a 8
semanas de edad) con un peso de 25 a 30 gr. Los ensayos se realizaron según la Legislación Nacional
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e Internacional para el uso de animales vivos como sujetos de experimentación (El Congreso General
de los Estados Unidos Mexicanos, Ley General de Sanidad Animal (2007); Norma Oficial Mexicana
NOM-062- ZOO-1999 con las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los
animales de laboratorio.
Se emplearon grupos de siete hembras y ocho machos para que el estudio sea
estadísticamente significativo. Los ratones fueron identificados con marcas en la cola con tinta
indeleble.
La inoculación se realizó el día 07 de agosto del 2017 y se identificaron tumores subcutáneos
de unos de 3 a 4 mm de diámetro. Mediante palpación digital se identificó el inicio del crecimiento
del tumor y luego cada quinto día se midió el diámetro del tumor con un calibrador de vernier. Cabe
mencionar que cada modelo murino reaccionó diferente ante la presencia de células TC1 en su
organismo, es por eso que el rango de crecimiento e identificación tumoral se encuentra entre cinco
y nueve días.
MEDICIÓN TUMORAL Y REGISTRO DE PESO
PROCEDIMIENTO METODOLÓGICO
Cuando los tumores superaron los tres milímetros de
diámetro, se midió la longitud mayor y menor del tumor ( en
mm) de cada animal una vez a la semana, utilizando un
vernier. Para determinar el volumen tumoral se aplicó la
fórmula: π/6 × diámetro mayor × (diámetro menor). La
medición tumoral se realizó cada 5 días a partir del día cero.
En la Fig.1 se muestra la forma en que se realizaron las
medidas del tumor (vertical, horizontal).
Transcurridos 35 días de la inoculación de las células
tumorales o cuando los tumores alcanzaron un volumen de 3 cm se practicó la eutanasia de todos
los animales tal como lo indica la Legislación Nacional e Internacional para el uso de animales vivos
como sujetos de experimentación. Para lo cual se aplicó el método físico de dislocación cervical
(según El Congreso General de los Estados Unidos Mexicanos, Ley General de Sanidad Animal (2007);
Norma Oficial Mexicana NOM-062- ZOO-1999 con las especificaciones técnicas para la producción,
cuidado y uso de los animales de laboratorio).
Fig. 1 Longitud vertical y horizontal
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Los pesos de los animales fueron evaluados semanalmente, durante los 30 días que fueron
administrados con el tratamiento.
PREPARACIÓN Y ADMINISTRACION DEL
TRATAMIENTO
La administración del extracto etanólico de las
hojas de granada (púnica granatum) con nance (byrsonima
crassifolia) fue por vía oral, haciendo uso de una sonda de
plástico, iniciándose el día cero.
Para la preparación del extracto diluido en agua
potable, se requiere el cálculo de la dosis y el promedio de
pesos, de los ratones hembras y machos.
PROCEDIMIENTO METODÓLOGICO
Se pesó el extracto por separado, primeramente
granada (púnica granatum), y en segundo lugar nance (byrsonima crassifolia).
Se homogeneizó la combinación de los extractos y posteriormente se diluyó en 100 µl de
agua con una dosis de 600 mg/Kg.
La administración de extractos se realizó durante 25 días.
RESULTADOS
En la fig. 2 Se muestra una imagen
del rotavapor IKA RV10, equipo utilizado
para la extracción de compuestos que
contienen las plantas.
Un rotavapor IKA RV10, es un
sistema de destilación que funciona a baja
temperatura y presión, este a su vez,
permite conservar los compuestos
aromáticos volátiles que se pierden durante
la reducción del vacío tradicional
(QuimiNet, 2011)
En la figura 3 Podemos observar ratones en su jaula, con una base de aserrín, y sobre todo
podemos observar la higiene que se debe de tener, con ratones en tratamiento.
Fig. 2 Rotavapor IKA RV10 para la extracción de compuestos en plantas
Fig. 3 Ratones en sus jaulas
16
En la figura 4 Observamos la jaula por
la parte superior, así como también la
alimentación y los contenedores de agua, al
igual deben de estar completamente limpios,
libre de hongos.
En las figuras 5 y 6 observamos el
crecimiento tumoral. En la figura 5, podemos
observar que el tumor tiene un diámetro poco
notable, y se encuentra en los 3 mm. Es
importante el corte de pelo del ratón en la
zona donde probablemente crezca el tumor, para que este pueda ser observado y monitoreado. Esto
es de importancia en los primeros 5 días.
En la figura 6 el tamaño del tumor es considerablemente grande con respecto al tamaño del
ratón, el diámetro tumoral ya ha alcanzado los 30 mm. Una vez que se alcanza este diámetro el ratón
fue sacrificado.
En la figura 7 observamos la forma en que
se administra el tratamiento vía oral.
En la figura 8 se muestran los
resultados del incremento en el volumen
tumoral y una comparación entre los
ratones en tratamiento y los ratones del
grupo control, y se observa que la
diferencia en el volumen tumoral entre
ambos grupos no es muy significativa; sin
Fig. 4 Alimentación e higiene de ratones en tratamiento
Fig. 5 Tumor en sus 5 mm
Fig. 6 Tumor en sus 30 mm
Fig. 7 Administración del tratamiento
17
embargo, se observó también que los ratones que recibieron el tratamiento se mostraban en un
estado de relajación mejor que los del grupo control. El tratamiento se aplicó por 25 días y las
mediciones tumorales, se realizaron hasta el día 30 para observar el comportamiento del tumor 5
días después sin tratamiento.
A continuación se muestra, la tabla 2, en la cual podemos observar los días en que el tumor
alcanzó el tamaño adecuado para ingresar al ensayo de nance combinado con granada.
Tabla 2 Día cero de los modelos murinos H: HEMBRA M: MACHO
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
En la tabla 3 podemos observar los valores del volumen tumoral del grupo granada-nance y
grupo control así como la desviación estándar y en la tabla 4 se muestra un análisis ANOVA para
determinar si hay diferencia significativa entre los resultados obtenidos.
Ratón
Día cero
Diámetro mayor (mm)
Diámetro mayor (mm)
H #1 16 Agosto 4 3
H #2 16 Agosto 4 3
H #3 17 Agosto 4 3
H #4 17 Agosto 7 4
H #5 18 Agosto 6 5
H #6 18 Agosto 4 4
H #7 14 Agosto 4 3
M #1 14 Agosto 4.5 4
M #2 14 Agosto 4 3.5
M #3 16 Agosto 5 3
M #4 17 Agosto 5 4
M #5 21 Agosto 8 5
18
Fig. 8 Volumen tumoral
Tabla 3 Comparación del volumen del crecimiento tumoral
Días Volumen tumoral tratamiento Volumen tumoral control Desviación estándar
Día 0 9.9175 10.181 1.388404165
Día 5 30.67423333 34.034 2.375713793
Día 10 77.58006667 81.36744 2.678077367
Día 15 133.0816667 137.445 3.085342589
Día 20 193.6883667 198.4444 3.363023422
Día 25 240.5505667 245.35896 3.400047533
Día 30 342.4344 347.8449333 3.82582481
Análisis ANOVA
Valor de referencia 0.05
19
Tabla 4 Análisis ANOVA
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
En el presente trabajo se encontró que la combinación de extractos etánolicos de nance-
granada no resultó eficaz como se tenía previsto desde un principio y esto lo podemos observar en
los resultados obtenidos. La diferencia en cuanto a volumen no fue significativa, sin embargo se
observaron ciertas conductas diferentes en ambos grupos. El grupo granada-nance presentó mayor
movilidad y agilidad al momento de ser manipulados a diferencia del grupo control que se mostró
suprimido. Estas conductas se observaron en los últimos días del tratamiento.
En los resultados obtenidos no se mostró mucha diferencia entre el volumen tumoral del
grupo control y el grupo que se encontraba en tratamiento, unos de los factores que afectaron fue
el crecimiento de dos tumores que al fusionarse dan como resultado un diámetro tumoral
equivalente al doble. Esto ocurre por un error en la inoculación de ratones. Las pocas diferencias que
hubo se notaron desde el día 5.
EL tratamiento de granada-nance podría ser utilizado como ayudante de tratamientos
quimioterapéuticos para disminuir los efectos dañinos de los tratamientos convencionales.
Recomendaciones
Planeación en general de actividades relacionadas al ensayo.
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Estandarizar los tratamientos en tiempo y objetivos a desarrollar así como factores de
alimentación para ratones en tratamiento, edad adecuada para los ratones que serán
destinados a tratamiento, someter al mismo estrés al grupo control de ratones.
Realizar la investigación previa necesaria, para un mejor protocolo.
Definir previamente todos los puntos clave y que son de mayor importancia en un ensayo in
vivo, como dosis y horario de administración de tratamiento.
Organizar previamente el equipo de trabajo (responsables y material necesario para
trabajar).
Preparar previamente el extracto suficiente (realizar extracciones de compuestos de la
planta con la cual se está trabajando), para que no falte durante el transcurso de los 25 días.
Mayor trabajo en equipo.
COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS
Aplicaciones de las herramientas teóricas de genética, biología molecular y plantas, para su
aprovechamiento racional e integral y el desarrollo de investigación científica.
Aplicar los elementos de la investigación documental para elaborar escritos académicos.
Elaboración de un protocolo de investigación en el que se presentan soluciones científicas-
tecnológicas a un problema desarrollado.
Toma de decisiones y aprovechamiento de recursos bióticos de la región.
Manejo de ratones cepa C57BL/6.
Relacionar la ética con el desarrollo de la ciencia y la tecnología para determinar sus
implicaciones sociales.
Administración de extracto en modelos murinos.
Manejo de equipos de laboratorio que involucran las operaciones unitarias de transferencia
de masa, secado, extracción y destilación en la extracción de compuestos de plantas con
solventes.
Desarrollo de habilidades de comunicación y sociabilidad de una organización académico-
científica, así como los factores que influyen en el comportamiento humano.
Aplicación de los conocimientos para proponer estrategias en la solución de conflictos y
propiciar el desarrollo de una organización sana.
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