efecto del ph y la temperatura - dipa.unison.mx · el caso mas interesante, puede ser o de la...
TRANSCRIPT
Efecto del pH y la temperatura
Dr. José Luis Cárdenas LópezEnzimas de Productos Marinos
Semestre 2014-1
Cooperatividad y alosterismo
Alostería
Bajo [S] Alto [S]Cambio de conformación
Se presenta en enzimas multisubunidades los sitios activos se comunicanLas enzimas cambian de forma, cambian su reactividad
Alo (otro) Steria (forma)
Kd1Kd2
Kd1 > Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen mejorpor lo que sera cooperatividad positiva
Kd1 < Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen peorpor lo que será cooperatividad negativa
¿Como medirla?
max1.0_][
max9.0_][
VVaqueproduzcS
VVaqueproduzcSRs
===
Rs = Factor de cooperatividad
max1.0_][ VVaqueproduzcS =
Cooperatividad positiva Rs < 81Cooperatividad negativa Rs > 81Comportamiento MMenten Rs 81
Demostrar esto
Ejercicio:
Michaelis Menten
][
][9.0
max
max9.0
SKm
S
V
v
Vv
=++
==
=
][1.0][1.0
][
][1.0
max
max1.0
SKmS
SKm
S
V
v
Vv
=++
==
=
][9
][1.09.0
][9.0][9.0
SKm
SKm
SKmS
==
=+
][9
1
][9.01.0
][1.0][1.0
SKm
SKm
SKmS
=
==+
81
9
1
9 ==Km
KmRs
Efecto del pH
pepsina peroxidasa tripsina fosfatasa alcalina
pH
Vo
2 6 8 10
¿Porqué?
• ¿Porqué pH optimos diferentes?• ¿Porqué la forma de campana?• ¿Porqué a veces son asimétricos?• ¿Qué controla la anchura?• ¿Qué controla la anchura?Explicación:1. estabilidad de la enzima2. ionización del sustrato, cofactor, buffer, etc.3. Ionización de los grupos de la enzima que
alteran el Km o Vmax
Estabilidad
• Almacenar a condiciones experimentales (diferentes pH’s, diferentes tiempos), luego hacer el ensayo en condiciones óptimas (sirve para monitorear la óptimas (sirve para monitorear la desnaturalización)
• Duración del comportamiento lineal a [S]>>>Km
[S]>>>Km
Perdiendo producto
Desviación de lo lineal
Perdiendo
actividadproducto
tiempo
Posibles resultados
constante
decreciente
creciente
V residualVo
decrecientecampana
pH de almacenamiento
Vo
¿El pH óptimo dependiente del tiempo?
pH
vEnsayo corto
Ensayo largo
Ionizaciones
• Buffer• Sustrato• Cofactor• Enzima
HPO4-2 PO4
-3 + H+
SH2 SH- + H+
CoFH CoF- + H+• Enzima
El caso mas interesante, puede ser
o de la enzima libre o del complejo ES
Las proteinas tienen muchos grupos ionizables,
pero solo algunos pocos afectan la actividad,
los que se encuentran en el sitio activo
Ionizaciones de la enzima
1) Estos son los que se ionizan a pH neutro• Grupo pKa ∆H ionización (Kj)• Cys 8.33 6.5-7.0• Asp 3.86• Asp 3.86• Glu 4.25• Lys 10.53• Arg 12.48 12-13• His 6.0 6.9-7.5� α-carboxilo 2.1-2.3 0� α-amino 9.1-10.8 10-13
Los pKa se alteran por la polaridad del ambiente
• Ambiente hidrofóbico� forma no cargada
• Cadenas laterales cargadas vecinas �forma cargada�forma cargada
pKa2pKa1
pH
Vo
2 H+ removibles
S+EH2 EH2S EH2+P
- H+
Posible diagrama de equilibrio
S+EH- EH- S EH- +P
S+E-2 E-2 S E-2 +P
- H+
- H+
Primero ver catálisis
Vmax
ESH-
¿Cómo?Hacer un experimento a [S]>>>Km, la velocidad es igual a Vmax
ES-2ESH2
pH
Vmax
Luego ver la unión
Vmax/Km
EH-
Igual hacer un experimento con [S]<<<Km, la velocidad es igual a Vmax/Km
E-2EH2
pH
Vmax/Km
Regla: Una ionización tiene que ver o con catálisis o con unión, no con ambas
Resultado
S+EH2 EH2S EH2+P
- H+
S+EH- EH- S EH- +P
S+E-2 E-2 S E-2 +P
- H+
- H+
Efectos de la Temperatura
• Estabilidad de la enzima• Cambios en la solubilidad (sólidos más
solubles a >temp, gases menos solubles a >temp)>temp)
• Ionizaciones de los buffers (Tris varía cerca de 0.03 unidades de pK/oC)
• Efectos en el equilibrio• Efectos en el paso catalítico ES ����E+P
Dependencia de la temperatura• Aun a pH const y ausencia de
ionizaciones, la vel de la Rx depende de la Temperatura
¿Porqué?
Gráfica típica de Vo vs T
T optima
desnaturalizacion
Vo
T (oC)
La rx se aceleraAl incrementar T
Estimación de velocidades a otras temperaturas de las del
ensayo
Q10 = velocidad a (T +10)/ velocidad a T
Predice la velocidad de la reacción a 10, 20, 30 grados,
siempre y cuando no se pase del óptimosiempre y cuando no se pase del óptimo
Para intervalos diferentes de 10 se usa:
∆log velocidad = T/10 log Q10
Enzimas 1.4 <Q10<3.0
Interpretacion del Q10
T 2 3 4
0 1 1 1
10 2 3 410 2 3 4
20 4 9 16
30 8 27 64
40 16 81 256
Una rx química
Ea
Energia
Rx
Cambio neto de energia
Grafica de Arrhenius
-Ea/R
k=Ae -(Ea/RT)
1/T (1/ oK)
ln k
Catalizada por enzimas
Ed/R
-Ea/R
1/T
ln k
Magnitud de la velocidad de Rx
Ea(Kcal/mol)
catalizador Velocidad relativa(25oC)
18 ninguno 1
13.5 I- 2.07 x 103
6.4 catalasa 3.47 x 108
La Ea se relaciona un poco con el Q10
Ea(Kcal/mol)
Q10
6 ≈1.46 ≈1.4
12 2
18 3
Para determinar Ea• Usamos• Sacamos log de cada lado
k=Ae -(Ea/RT)
ln k= ln A - (Ea/RT)
• Por lo que una gráfica de ln k contra 1/T, nos dará una línea recta con pendiente –Ea/R
• La constante de los gases (R) está en energía/mol °, por lo que Ea/RT es sin unidades (Ea es energía/mol)
Uso
• la ecuación de Arrhenius predice las tasas de reacción a diferentes temperaturas y usa un parámetro para entender de manera intuitiva la dependencia de la manera intuitiva la dependencia de la reacción en la temperatura, pero no nos dice cómo…
Teoría de colisiones
• Donde P representa la probabilidad de que una colisión tenga la correcta orientación para producir una reacción y zes la energía cinética
k=Pz e -(Ea/RT)
es la energía cinética• No todas las colisiones son productivas• De donde viene la dependencia de la
temp?– La energía cinética es proporcional a la temp
absoluta– A 0°K la energía cinética es 0
Intermedio “la ecuación de Boltzman”
Es idéntica a la ecuación de Arrhenius, solo que la kB está en energía/molécula gradoEn lugar de energía /mol grado
Entonces, la constante k es proporcional a la población de moléculasque tienen cierta energía (Ea), por encima del estado basal
Esta energía proviene de las COLISIONES activadas por la temperatura
De donde viene la dependencia de la temperatura?
– La energía cinética es proporcional a la temp absoluta
– A 0°K la energía cinética es 0– Conforme se incrementa la temperatura se dá – Conforme se incrementa la temperatura se dá
un incremento fraccional – De 20°a 30° 10/293 cerca de 3% – (muy poco)
Que tal del exponente? Asumir Ea = 12 Kcal/mol
Un incremento del doble!!
Obviamente, la dependencia de la temperatura de debe al términoexponencial
Teoría de Eyring
K= (KBT/h)e(-∆G*/RT)
KB constante de Boltzmann= 1.38 x 10-16 erg/o
h constante de Planck = 6.624 x 10 –27 erg sR constante de los gases = 1.98 cal/mol o
∆G* es la energia libre de activacion
kBT/h tiene unidades de (erg/o)o / erg s = 1/s “por segundo”Unidades de frecuencia vibratoria o Hertz“La velocidad a la cual el estado de transicion desaparece yse convierte en producto”
¿Cómo calcular los parámetros termodinámicos?
-(∆H*/R)y ∆S* se calcula de
∆S*=(∆H*-∆G*)/T
∆G*= ∆H*-T ∆S*
1/T
ln k/T
∆S*=(∆H*-∆G*)/T
Breve paréntesis termodinámico
∆G°=-RT ln Keq∆G°= ∆H°-T ∆S°Por lo que:
∆ ∆-RT ln Keq= ∆H°-T ∆S°y ln Keq= (∆H°/ RT)- ( ∆S°/R), así que se
puede graficar ln Keq vs 1/T y la pendiente será -∆H°/ R
-(∆H*/R)
1/T
ln Keq