efecto fotoprotector del extracto metanólico de dyssodia
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Universidad Nacional Autónoma de México
FES Iztacala
“Efecto fotoprotector del extracto metanólico de Dyssodia tagetiflora
Lag. en dos modelos biológicos”
Tesis profesional para obtener el título de
BIÓLOGO Presenta:
Cruz Barajas Isaac Enrique
Bajo la asesoría y dirección de:
Dra. Ana María García Bores
Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla Edo. México 2021
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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I
Agradecimientos
A la Universidad Nacional Autónoma de México por brindarme la oportunidad de desarrollarme académica y profesionalmente.
Al proyecto CONACYT A1-S-14605 “Estudio de la actividad fotoquimioprotectora de algunas plantas mexicanas” por el financiamiento para la realización de este proyecto.
Al laboratorio de Fitoquímica (UBIPRO), el Acuario FESI, el laboratorio de Microscopía y el Laboratorio 9 (UBIMED) por brindarme el apoyo, material, espacio y equipo necesario para desarrollar mi proyecto.
A mi tutora Ana María García Bores por brindarme su tiempo, apoyo y por ser una increíble persona que hizo que el tiempo de desarrollo de este proyecto fuera una de las mejores experiencias y ayudarme a ver mis errores haciéndome una mejor persona cada día.
A la Sra. Bety por ser la persona que me recibió el primer día y me enseñó lo básico sobre el laboratorio, siempre estará en mi memoria.
Al personal del laboratorio de Fitoquímica de la FESI por su apoyo, orientación y compañía.
A mi familia por todo el apoyo y ánimo que me brindaron además, de siempre haber creído en mí.
A Aarón por acompañarme en este proceso y ayudarme a plantearme metas y objetivos que yo sólo nunca hubiera podido lograr.
Y finalmente, a mis amigos y compañeros de la carrera que me ayudaron en más de una ocasión en varios aspectos, especialmente a Enrique Suárez, Joselyn Sánchez, Octavio Trejo y Rebeca García, mis compañeros de equipo con los que siempre fue un gusto trabajar y convivir.
II
Dedicatorias
Le dedico este trabajo a mi madre Patricia Margarita Barajas
Salazar. Sin tu ayuda ninguna de mis habilidades hubieran
significado nada porque no hubiera tenido las oportunidades que
tú me diste para probarlo y a la vez que yo me esforzaba
estudiando tú te esforzabas trabajando para que yo pudiera
hacer posibles mis metas. ¡Muchas gracias mi viejita!
III
Índice de contenido
Índice de contenido………………………………………………………………………………………………………….III
Índice de tablas e imágenes………………………………………………………………………………………………V
Resumen……………………………………………………………………………………………………………………………1
Introducción………………..……………………………………………………………………………………………………2
La radiación ultravioleta y sus efectos………………………………………..…………………………………….2
Daño a nivel molecular………………………………………………………………………………………………………2
Daño directo……………………………………………………………………………………………………………………..2
Daño indirecto………………………………………………………………………………..…………………………………3
Daño a nivel celular……………………………………………………………………………………………………………4
Daño en la piel…………………………………………………………………………………………………………..………4
Tipos de daño en la piel…………………………………………………………………………………………….………5
Inducido por radiación ultravioleta……………………………………………………………………………………5
Daño agudo…………………………………………………………………………………………………………………….…5
Daño crónico…………………………………………………………………………………………………………..…………6
Cáncer……………………………………………………………………………………………………………………….………6
Productos naturales…………………..……………………………………………………………………………………..7
Metabolitos secundarios…………………………………………………………………………………………………..7
Función de los metabolitos secundarios…..………………………………………………………………………..7
Tipos de metabolitos secundarios…………………………………………………………………………………….8
Terpenos……………………………………………………………………………………………………………………………8
Alcaloides………………………………………………………………………………………………………………………….8
Fenoles………………………………………………………………………………………………………………………………8
Metabolitos secundarios fotoprotectores…………………..……………………………………………………9
Dyssodia tagetiflora y sus metabolitos secundarios…………………………..………..……………..…10
Experimentos in vivo………………………………………………………………………………………….……………10
Modelos biológicos………………………………………………………………………………………………………...11
IV
Ratón SKH-1………………………………………………………………………………………………………………….…11
Escherichia coli………………………………………………………………………………….………………………….…12
Danio rerio……………………………………………………………………………………………………………………...12
Justificación…………………………………………………………………………………………………………………….13
Pregunta de investigación……………………………………………………………………………………………….13
Hipótesis…………………………………………………………………………………………………………………………13
Objetivo general……………………………………………………………………………………………………………..14
Objetivos particulares………………..…………………………………………………………………………………..14
Materiales y métodos……………………………………………………………………………………………………..15
Obtención del extracto……………………………………………………………………………………………………15
Modelo bacteriano………………………………………………………………………………………………………….15
Modelo de pez cebra………………………………………………………………………………………………………17
Mantenimiento……………………………………………………………………………………………………………….17
Reproducción………………………………………………………………………………………………………………….18
Mantenimiento de los huevos…………………………………………………………………………………………18
Mantenimiento de los embriones……………………………………………………………………………………18
Tratamientos…………………………………………………………………………………………………………………..18
Resultados………………………………..…………………………………………………………………………………….20
Modelo bacteriano………………………………………………………………………………………………………….20
Modelo pez cebra……………………………………………………………………………………………………………22
Discusión…………………………………………………………………………………………………………………………33
Modelo bacteriano………………………………………………………………………………………………………….33
Modelo pez cebra……………………………………………………………………………………………………………34
Conclusiones……………………………………………………………………………………………………………………37
Apéndice 1. Descripcion de D. tagetiflora…………………..….………………………………………….……38
Referencias………………………………………………..……………………………………………………………………40
V
Índice de tablas e imágenes
Tabla 1. Inóculos iniciales del experimento bacteriano………………..………………………………….20
Imagen 1. Estructura de un fenol…………………………………………………………………………………….…8
Imagen 2. Esquema del experimento de fotoprotección…………………….……………………………16
Imagen 3. Estructura del parsol ……………………………………………………..……………………………….16
Imagen 4. Curvas de muerte celular del experimento
bacteriano…………………………………………………………….21
Imagen 5. Micrografías donde se detecta la muerte celular y la producción
de ROS en los grupos testigo y controles en modelo de pez cebra………………………….………24
Imagen 6. Micrografías donde se detecta la muerte celular y la producción
de ROS en los grupos: control de irradiación, Dyssodia tagetiflora y DUV en modelo
de pez cebra………………………………………………………….…………………………………………………..……26
Imagen 7. Micrografías donde se detecta la muerte celular y la producción
de ROS en los grupos: control de irradiación, parsol y PUV en modelo de pez
cebra ....….……………………………………………………………………………………………………………..……….28
Imagen 8. Micrografías donde se detecta la muerte celular y la producción
de ROS en los grupos: control de irradiación, DUV y PUV en modelo de pez cebra..…...….29
Imagen 9. Gráficos de los promedios de la fluorescencia en los diferentes grupos
experimentales con naranja de acridina (A) y con DCFH-DA o fluorosceína (B) modelo de
pez cebra..…………………...32
1
Resumen
La radiación ultravioleta (RUV) es una de las causas principales de enfermedades
como el cáncer de piel y otras afecciones cutáneas debido a sus distintos efectos
en los organismos. Dyssodia tagetiflora es una planta endémica de México, el
extracto metanólico (EM) de ésta contiene metabolitos secundarios de interés como
avicularina, hiperósido y quercetina. El objetivo de éste estudio es determinar sí el
EM de D. tagetiflora tiene efecto fotoprotector en dos modelos biológicos:
Escherichia coli y Danio rerio. El efecto fotoprotector del EM se evaluó en E. coli
mediante el cálculo de la constante de mortalidad obtenida a través de experimentos
en donde se determina el efecto de diversas sustancias en la muerte celular al
utilizarlas como fotoprotectores de poblaciones bacterianas irradiadas. El efecto
fotoprotector del EM en D. rerio se evaluó mediante la detección y cuantificación de
muerte celular y producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en alevines
irradiados con RUV, empleando como controles alevines expuestos a la RUV sin
protección. En el experimento utilizando bacterias como modelo, el EM de D.
tagetiflora permitió la sobrevivencia de las poblaciones de E. coli durante más de
150 minutos contra la muerte inducida por la RUV, mientras que las poblaciones
bacterianas protegidas con parsol dejan de presentar sobrevivientes a los 120
minutos. Por otra parte, los alevines tratados con EM exhiben un incremento de
muerte celular pero al irradiarse, se reduce la presencia tanto de muerte celular
como la producción de ROS, esta disminución del daño causado por el EM al
irradiarse puede deberse a los compuestos fotosensibles del extracto. Mientras que
los alevines protegidos con parsol, a pesar de presentar una reducción en la muerte
celular y producción de ROS, ésta es menor a la producida por el EM de D.
tagetiflora. Por lo que el EM de D. tagetiflora tiene efectos fotoprotectores superiores
a los del parsol.
2
Introducción
La radiación ultravioleta y sus efectos
La radiación ultravioleta (RUV) es un componente del espectro de luz solar que
incide en la biósfera. Ésta puede tener efectos negativos en organismos debido a
su naturaleza energética. A la corteza terrestre llegan la UV-A (de 315-400 nm) y la
UV-B (de 280-315 nm). Actualmente, hay evidencia sobre los efectos negativos de
la RUV-B en un amplio rango de organismos desde bacterias hasta plantas y
animales (Coffey & Jansen, 2019). La RUV también provoca efectos como
quemaduras, envejecimiento, cáncer e incluso la muerte celular en la piel del ser
humano (Sliney, 2003).
Daño a nivel molecular
La energía de la luz es absorbida por cromóforos. Estas moléculas pasan a un nivel
excitado tras recibir la energía de la RUV y posteriormente regresan a su estado
basal al emitir el exceso de energía como fluorescencia o calor en un proceso
llamado conversión interna. La energía absorbida también puede ser transferida a
moléculas receptoras en un proceso llamado fotosensibilización. A través de este
mecanismo, la energía luminosa es transformada en reactividad química, lo cual
activa diversas reacciones que usualmente culminan en la la transferencia de
energía al oxígeno provocando la oxidación de biomoléculas como: lípidos, ácidos
nucleicos y proteínas (Kochevar et al., 2014; Tsubone et al., 2018; Volldhardt &
Schore, 2000).
Daño directo
Los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) son capaces de
absorber la RUV gracias a su estructura que les permite ser cromóforos hacia esta
radiación. Otra molécula que es blanco de la RUV es el DNA, ya que presenta
absorbancia de luz UV y es químicamente modificado debido a que dicha radiación
excita los electrones de los enlaces π o sp2 de las bases nitrogenadas, lo cual
provoca una alteración en la estructura de la doble hélice. Induciendo así,
mutaciones acumulativas debido a la formación de dímeros de pirimidina. También
3
se producen rompimientos de cadena dobles, lesiones que pueden provocar
aberraciones cromosómicas (Mesa-Arango et al., 2017; Schuch et al., 2017).
Daño indirecto
Los carbohidratos son biomoléculas compuestas de carbono, hidrógeno y oxígeno,
cuya principal función es energética, estructural y de señalización. La RUV provoca
su oxidación generando aldehídos que pueden interactuar con otras moléculas
como el DNA y las proteínas en su forma oxidada (Alberts et al., 2014; Halliwell &
Gutteridge, 2015).
Una de las causas de los daños provocados por la exposición a la RUV es que ésta
induce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS por sus siglas en
inglés), lo cual genera múltiples efectos negativos en moléculas como
carbohidratos, aminoácidos y lípidos. Todo esto altera la función celular (Kohl et al.,
2011; Sliney, 2003)
Los lípidos se oxidan en una reacción en cadena, generando múltiples radicales
afectando la estructura de los ácidos grasos poli insaturados. Además, se producen
otras moléculas derivadas de la ciclación de ácidos grasos como eicosanoides.
Mientras que los fragmentos resultantes continúan oxidándose para formar
aldehídos insaturados como el 4-hidroxinonenal y el malonaldehído. Éste último es
el producto de la oxidación de ácidos grasos poli insaturados más estudiado, ya que
puede adherirse a grupos funcionales de varias biomoléculas como proteínas,
lipoproteínas, DNA y RNA (Agnieszka & Elzbieta, 2019; Shovna & Uma, 2014).
Las proteínas sufren daños estructurales causados por subproductos de los ácidos
grasos poli insaturados como el malonildialdehído. Las proteínas presentan daños
reversibles como uniones disulfuro o generación de ácido sulfénico. También se
pueden oxidar las cadenas laterales de los aminoácidos o generarse nitraciones
que son daños irreversibles que hacen necesaria la destrucción y reemplazo de las
proteínas dañadas (Halliwell & Guteridge, 2015).
4
El DNA sufre de rupturas de cadena simple y enlaces cruzados produciendo
alteraciones en la estructura y función de la molécula culminando en acumulación
de mutaciones (Halliwell & Guteridge, 2015; Schuch et al., 2017)
Daño a nivel celular
El DNA mitocondrial está expuesto tanto como el nuclear, sin embargo al no tener
intrónes ni estar asociado a histonas es más susceptible a ser dañado en un gen
codificante a causa de los radicales libres que se producen en la cadena
transportadora de electrones. Además, estas afecciones en el metabolismo
mitocondrial reducen la capacidad antioxidante. Generando un estado de estrés
oxidativo, es decir, un desbalance entre los compuestos oxidantes y las defensas
antioxidantes o el fracaso de los sistemas de reparación. Éste estado produce daño
a las biomoleculas que constituyen la célula y al estar demasiado tiempo bajo las
influencias del estrés oxidativo la célula muere (Halliwell & Gutteridge, 2015; Kohl
et al., 2011; Ray et al., 2012).
Las membranas celulares son de vital importancia para mantener la homeostasis y
la organización de la célula y sus orgánulos. Se componen principalmente de lípidos
y proteínas con una pequeña porción de carbohidratos. La oxidación de los lípidos
en la bicapa fosfolipídica de la membrana puede comprometer la homeostasis y
provocar un aumento en la permeabilidad de la célula y por lo tanto, reduce la
viabilidad de la misma. Por otro lado, se ha comprobado que la incorporación de
ácidos grasos oxidados en las membranas provoca diversos cambios estructurales
además de aumentar su compactación, reducir su fluidez, separación de fases e
incluso la formación de poros (Boonoy et al., 2015; Cwiklik & Jungwirth, 2010;
Tsubone et al., 2018).
Daño en la piel
La piel humana es una barrera anatómica que protege contra agentes patógenos y
daño físico. También actúa como un importante límite entre los ambientes interno y
externo del cuerpo. La RUV induce daño en la piel resultando en: quemaduras
5
solares, pigmentación dispareja y cambios histológicos que incluyen el
engrosamiento y alteraciones en el tejido conectivo (Matsui et al., 2016).
La exposición a la RUV puede provocar quemaduras en la piel, como una respuesta
inflamatoria acompañada de ardor y eritema. El tipo de piel determina quién podría
estar en riesgo de quemaduras ya que algunas personas las sufren de manera
constante mientras que otras se broncean. Esta es una reacción causada por la
RUV-B y ha sido asociada al daño producido al DNA. Por otro lado, si la exposición
a la RUV es continua se genera otro tipo de daño como el fotoenvejecimiento, la
acumulación de daño en el DNA mitocondrial y el acortamiento de los telomeros.
Esto es muy común en la mayoría de las personas que trabajan expuestas a la
radiación. Además de las quemaduras, la exposición a la RUV puede generar
distintas afecciones en la piel como resequedad, aumento de pH en la superficie y
una continua producción de ROS, factores importantes en el desarrollo de cáncer
de piel (Monseau et al., 2015; Kohl et al., 2011; Medhaug & Reuder, 2009).
El fotoenvejecimiento se refiere a los efectos de la RUV a largo plazo sobrepuesto
al envejecimiento intrínseco de la piel. Este provoca despigmentación, piel laxa, tono
amarillento, arrugas, telangiectasia (vasos sanguíneos visibles), aspecto coriáceo,
neoplasias cutáneas, aumento del grosor de la epidermis, proliferación y elongación
de los fibroblastos, incremento de elastina y el engrose de las paredes de los vasos
sanguíneos y se origina tanto por factores fisiológicos como por la predisposición
genética. Por otro lado, también se puede producir por factores externos como
fumar o estar expuesto a la RUV, reduciendo la proliferación celular y provocar la
degradación de la matriz extracelular (Kohl et al., 2011; Nikolakis et al., 2013; Rabe
et al., 2006).
Tipos de daño en la piel inducidas por la radiación ultravioleta
Daño agudo
En el daño agudo, la reacción cutánea ante una exposición intensa a la RUV,
comienza en el intervalo de tres a seis horas. Inicia con una respuesta inflamatoria
6
aguda con dolor, calor y enrojecimiento llamada eritema, a causa de la inflamación
de los vasos sanguíneos cutáneos (Zamora, 2018).
A los 30 minutos de la exposición a la RUV en la epidermis se observan células de
quemadura, que son queratinocitos apoptóticos. El número de estas células
aumenta a las 24 horas post exposición a la RUV, para después formar una capa
protectora en el estrato córneo (Kochevar et al., 2014).
Daño crónico
La acumulación de daños agudos a través de los años resulta en alteraciones
crónicas y progresivas en la piel. La RUV también produce inmunosupresión al
afectar células del sistema inmune debido a que las células de Langerhans, que
tienen la función de presentadoras de antígeno, son más sensibles ante la RUV que
los queratinocitos. Así, antes de que se presenten las células de quemadura las
células de Langerhans están alteradas o han muerto, culminando en la falla del
reconocimiento inmune de los antígenos liberados por los queratinocitos
apoptóticos (Maverakis et al., 2010; Rabe et al., 2016; Sayama et al., 2010;
Sreekanth et al., 2007; Zamora, 2018).
Una vez que la piel sufre de fotoenvejecimiento e inmunosupresión se genera un
ambiente inmunológicamente permisivo para el desarrollo de lesiones premalignas
y posteriormente, el cáncer de piel (Zamora, 2018).
Cáncer
Las mutaciones acumuladas que se originaron por los efectos de la RUV traen como
consecuencia el cambio de la estructura y la función de las biomoléculas que llevan
a alteraciones celulares, las cuales afectan después la función de órganos, tejidos
o sistemas especializados. Esto participa en el desarrollo de enfermedades de tipo
crónico-degenerativas (Corrales & Muñoz 2012).
En humanos, la exposición prolongada a la RUV es un factor de riesgo para el
desarrollo de cáncer de piel (Medhaug & Reuder, 2009). Los tres principales tipos
son el melanoma, el carcinoma de células basales y el espinocelular. Éstos pueden
presentar grandes riesgos para la salud, siendo el segundo, el más común en
7
México, con 12,000 casos registrados cada año (INEGI, 2018). La mayoría de los
casos de melanoma maligno se encuentran en zonas del cuerpo expuestas a la
radiación indicando una directa relación entre la incidencia de RUV y el desarrollo
de cáncer de piel. Y tiene un índice de mortalidad del 6.8% (Cáncer.org, 2020;
Medhaug & Reuder, 2009).
El cáncer de piel no melanómico implica el crecimiento de células cancerígenas que
es tratable fácilmente al no presentar metástasis. Es la lesión maligna más común,
afectando a más del 30% de las personas con piel clara en áreas con una incidencia
solar elevada. Es causado por exposición a la RUV en la etapa temprana de vida y
no por una constante exposición a lo largo de ella. No se le suele dar mucha
importancia al cáncer no melanómico debido a que no afecta la supervivencia de
los pacientes afectados pero genera gastos en el sector de la salud y puede dejar
como consecuencia cicatrices o marcas que afectan al estilo de vida del paciente
(Monseau et al., 2015).
Productos naturales
Una alternativa para prevenir y tratar algunos padecimientos como el cáncer de piel
son los productos naturales, que son compuestos sintetizados por los seres vivos y
son muy valiosos para la sociedad desde el punto de vista económico (Dyke, 2008).
Metabolitos secundarios
Con el fin de enfatizar en el origen biosintético de los productos naturales se les ha
llamado metabolitos secundarios (MS), considerando que estas sustancias
provienen de las vías metabólicas primarias de los seres vivos. Aunque
recientemente se les ha denominado con el término de semioquímicos para
enfatizar el papel de estas sustancias en la comunicación química principalmente
en las plantas (Delgado, 2015).
Función de los metabolitos secundarios
La función de los MS en las plantas es muy variada, actúan como señalizadores,
atractores de polinizadores, agentes antimicrobianos o fotoptrotectores,
8
otorgándoles las características necesarias para ser utilizados en la industria
farmacéutica (Taiz & Zeiger, 2006).
Tipos de metabolitos secundarios
Terpenos
Los terpenos son el grupo más amplio de MS vegetales con distintas funciones:
atractores de polinizadores, defensa ante patógenos y la resistencia al estrés
ambiental. Todos los terpenos estan compuestos de una o varias subunidades de 5
carbonos llamada isopreno y sus características varían dependiendo de la cantidad
de unidades que las conforman (Nawade et al., 2019).
Alcaloides
Los alcaloides son productos naturales nitrogenados y son los principios activos de
la mayoría de las plantas tóxicas o medicinales conocidas, contienen nitrógeno, son
de naturaleza básica y sus estructuras y actividades son muy variadas (Romo de
Vivar et al., 2015).
Fenoles
Los fenoles son MS con una gran variedad de funciones en las plantas tales como
dar color a las flores, atraer o repeler insectos, proveer efectos antimicrobianos,
antivirales y como protectores contra la RUV debido a su estructura (imagen 1).
Adicionalmente, los fenoles han demostrado tener un amplio rango de beneficios
para la salud humana debido a su capacidad de reducir radicales libres, retrasando
el desarrollo de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo como:
aterosclerosis, diabetes y cáncer (Ribeiro et al., 2019).
9
Imagen 1: Estructura de los fenoles (Soviquim.cl).
Los flavonoides son MS presentes en las vacuolas vegetales y constituyen al grupo
más amplio de los fenoles y cumplen funciones metabólicas importantes. Suelen ser
incoloros o amarillos y se encuentran en las partes superficiales de hojas y flores
para captar hasta un 90% de la RUV evitando sus efectos nocivos, un ejemplo de
esto es el camferol, que protege a la planta de la RUV-B (Aguilar, 2015). Esto último
debido a que la RUV es captada por los cromóforos, moléculas que absorben ciertas
longitudes de onda y reflejan otras gracias a su cualidad de recibir energía, cada
uno con su propio espectro de absorción (Kochevar et al., 2014).
Los flavonoides tambien protegen contra el daño producido por agentes oxidantes
como la RUV, la contaminación ambiental o agentes químicos, reduciéndo el riesgo
de cáncer al limitar la acción de los radicales libres como las ROS (Aguilar, 2015;
Graf et al., 2005)
Metabolitos secundarios fotoprotectores
Se han identificado MS con capacidad fotoprotectora ante la RUV-B, como
salicilatos, alcamfor y cinamatos. Estos últimos son los que más se utilizan en la
fabricación de filtros solares comerciales, de acuerdo a la FDA, debido a su
naturaleza insoluble en agua y su capacidad para absorber la RUV. La mayoría
cuentan con estructuras de enlaces dobles conjugados con un anillo aromático que
les confiere la capacidad de excitar sus electrones de posición al recibir un electrón
o un fotón de la luz. Por lo que son capaces de absorber la energía antes de que
provoque daños en la piel (Setlow, 2005).
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Dyssodia tagetiflora Lag. y las funciones de sus metabolitos secundarios
D. tagetiflora es una planta herbácea perenne erecta con hojas opuestas y flor
amarilla perteneciente a la familia Asteraceae (apéndice 1). El extracto metanólico
(EM) de la parte aérea demostró actividad antioxidante ya que contiene fenoles,
flavonoides, terpenos, lactonas sesquiterpénicas y glicósidos (Reyna, 2018).
El aceite esencial de D. tagetiflora contiene limoneno, β-pineno, β-terpineno, α-
terpineno y α-ocimeno. Mientras que el EM presentó glicósidos como hiperósido,
avicularina, avicularina acetilada, además de quercetina y quercetina metoxilada.
Por otro lado en la fase apolar presentó tiofenos como α-tertienil, BBT y 5-metil-
2,2:5,2 tertiofeno (García-Bores et al., 2018: Reyna, 2018).
El EM de D. tagetiflora también promueve la división celular de forma dependiente
a la concentración, siendo significativo en concentraciones mayores a 1000 µg/ml
en células de raíz de Vicia faba y en la linea celular HaCat de queratinocitos
humanos y no genera daño cromosómico al no inducir la formación de micronúcleos
en raíces de V. faba (Reyna, 2018).
La eficacia del EM como fotoprotector de D. tagetiflora ya ha sido demostrada en
experimentos agudos y crónicos en ratones SKH-1. En los experimentos de
exposición aguda, la aplicación del EM reduce la presencia de células de
quemadura y afecciones locales como la espongiosis, sin embargo los grupos
tratados sólo con D. tagetiflora desarrollaron daños relacionados con la exposición
a un agente tóxico externo como infiltrados inflamatorios y congestión de vasos
sanguíneos. En cuanto a la fotoprotección en la exposición crónica, el EM de D.
tagetiflora provoca la reducción del porcentaje de incidencia y el número de tumores
en la piel de los organismos (Estrella-Parra et al., 2019).
Experimentos in vivo
En los últimos años los experimentos in vivo han ganado terreno al ser útiles para
determinar biodisponibilidad, especifidad, biotransformación y toxicologia de una
sustancia química en particular, sin embargo a pesar de su utilidad el costo y
dificultad de manejo elevados en los modelos de mamíferos comunes como el ratón
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y los chimpancés hace necesario el uso de otros modelos más sencillos y
económicos (Helenius & Yeh, 2012).
Modelos biológicos
Los organismos modelo son especies altamente estudiadas, debido a que mientras
más se aprende de ellos se vuelven más atractivos para estudios posteriores y
proporcionan herramientas con las que se puede enfrentar preguntas generales en
el contexto del organismo. Y hay distintos modelos enfocados para cada tipo de
experimento dependiendo de los requerimientos del mismo (Alberts et al., 2015;
Hernández, 2006).
Ratones SKH-1
La variedad de ratones SKH-1 “hairless” tiene una mutación en el gen Hr del
cromosoma 14. El ratón presenta alelos recesivos de este gen, lo cual provoca la
ausencia de pelo en los organismos homocigotos. Los ratones SKH-1 presentan
una piel con cierta rugosidad, la cual aumenta con la edad. Se debe tener en cuenta
que estos ratones parecen tener mayor sensibilidad a la inmunosupresión
provocada por la RUV. La ausencia de pelo facilita la observación de la evolución
del fotoenvejecimiento y carcinogénesis, así como la aplicación de tratamiento
tópico de los tratamientos (Benavides et al., 2009). Sin embargo, los ratones SKH-
1 tienen desventajas con respecto a modelos de piel humana: un ciclo del pelo
anormal, son propensos a la formación de quistes y la inflamación dérmica
persistente. Además, sufren de una alta incidencia de tumores. (Sayama et al.,
2010). Por otra parte, es un modelo muy utilizado para estudios inmunológicos,
oncológicos, enfermedades infecciosas y en estudios de fotoenvejecimiento y
fotocarcinogéneis, sin embargo a pesar de todas estas ventajas es un modelo muy
costoso, tanto en su adquisición como en su mantenimiento (Arribas, 2016).
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Escherichia coli (Theodore von Escherich)
Existen otros modelos biológicos como lo es Escherichia coli, que es muy utilizado
debido a su bajo costo y a su fácil reproducción. Esta bacteria gram negativa con
forma de bacilo pertenece a la familia de las Enterobacterias. Se encuentra en el
tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre caliente (Allocati et al.,
2013).
Es un organismo empleado para experimentos de fotoprotección en los cuales se
estudia su supervivencia ante la RUV (Avila et al., 2005). Sin embargo, a pesar de
ser muy utilizado, E. coli es un modelo de célula procarionte que carece de las
respuestas ante el daño que pueden presentar otros modelos pluricelulares.
Danio rerio (Hamilton-Buchanan)
El pez cebra (Danio rerio), es un modelo biológico que pertenece a la familia
Ciprinidae y habita normalmente en los rios, lagos y lagunas de la India y hoy en día
es muy común su uso en acuarios (Lambert, 1997). D. rerio es un organismo
económico y posee el beneficio de poseer un tamaño pequeño, lo cual le hace fácil
de manejar, en conjunto con las ventajas de tener una fisiología similar a la de un
vertebrado superior. A esto se le suma una rápida absorción cutánea de
compuestos, lo que lo hace ideal para la aplicación de tratamientos polares
(Helenius & Yeh., 2012). Tambien tiene la ventaja de tener un genoma compacto y
un tiempo de generación de aproximadamente tres meses. Finalmente, D. rerio
tiene la virtud adicional de ser transparente las primeras dos semanas de vida, lo
cual permite observar el comportamiento de las células en el organismo vivo en
experimentos de toxicología y es útil para evaluar el daño causado por la RUV, así
como su inhibición y tratamiento (Alberts et al., 2015; Yang et al., 2012).
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Justificación
El propósito de esta investigación es proponer a D.rerio como un modelo alternativo
para evaluar el efecto fotoprotector de D. tagetiflora, siendo que sus efectos ya han
sido estudiados en el modelo de ratón SKH-1.
Pregunta de investigación
¿Tendrá efecto fotoprotector el extracto metanólico de Dyssodia tagetiflora en
Escherichia coli y Danio rerio?
Hipótesis
Debido a que el EM de D. tagetiflora presenta un efecto fotoprotector ya que
contiene compuestos capaces de absorber la radiación ultravioleta como
quercetina, avicularina e hiperósidos además de haber sido un efectivo fotoprotector
en el modelo de ratón SKH-1. Se plantea que el EM de D. tagetiflora protegerá las
poblaciones de E. coli de la muerte inducida por la radiación ultravioleta. Además,
disminuirá tanto la muerte celular como la producción de especies reactivas de
oxígeno en alevines de Danio rerio debido a sus metabolitos secundarios capaces
de absorber la radiación y sus propiedades antioxidantes.
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Objetivo general
Estudiar el efecto fotoprotector del extracto metanólico de Dyssodia tagetiflora en
los modelos Escherichia coli y Danio rerio.
Objetivos particulares
- Determinar el efecto fotoprotector del extracto metanólico de Dyssodia tagetiflora
en Escherichia coli.
- Determinar el efecto fotoprotector del extracto metanólico de Dyssodia tagetiflora
en Danio rerio.
- Determinar el efecto del extracto metanólico de Dyssodia tagetiflora en la
producción de las especies reactivas de oxígeno en Danio rerio.
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Metodología
Recolecta y obtención del extracto
La parte aérea de D. tagetiflora fue colectada en el cerro del Toro, Municipio de
Acámbaro. Estado de Guanajuato, México a 1884 msnm en octubre del 2015. La
planta fue identificada y registrada en el herbario IZTA de la FES Iztacala UNAM
con el número de herbario 20407IZTA. El extracto utilizado en éste trabajo fue
proporcionado por la M. en C. Alma Ofelia Reyna Campos.
1 kg de la parte aérea de D. tagetiflora fue utilizado para obtener el extracto
mediante una maceración en frio con metanol (MeOH). Posteriormente, fue
destilado a presión reducida. Finalmente, los sólidos totales se separaron mediante
diferencia de peso y se calculó el rendimiento.
Modelo bacteriano
Una población de bacterias (Control de irradiación) fue expuesta a una fuente de
radiación UV para comprobar los efectos letales en E. coli. Al graficar el tiempo de
exposición a la RUV y el logaritmo del número de supervivientes se puede calcular
la constante de mortalidad K con el fin de determinar el efecto de la RUV en la
muerte bacteriana (Avila et al., 2005).
Las bacterias se dejaron crecer en caldo nutritivo Muller-Hinton durante 24 horas a
37°C, o hasta que el crecimiento poblacional alcance una densidad óptica de 0.3 a
560 nm. El inóculo se separó del medio por el método de centrifugación y la pastilla
de bacterias se suspendió en 100 ml de solución salina, esperando un inóculo de
aproximadamente 106 UFC/ml. Posteriormente, la población bacteriana fue
colocada en las cubetas de cuarzo para armar una unidad experimental. Cada
unidad está conformada por dos cubetas, una con la población bacteriana
suspendida en 2250 μl de solución salina y otra cubeta sólo con las sustancias
fotoprotectoras a evaluar (extractos, compuestos y controles) utilizando 3000 μl a
una concentración de 2 mg/ml. Las cubetas se colocaron a 15 cm de distancia frente
a la lámpara de luz UV-B (312 nm) como se muestra en la imagen 2. La intensidad
de la radiación fue medida con un radiómetro dando una lectura de 20.1 mW/m².
16
Además se realizaron experimentos de protección donde se evaluó el efecto del EM
de D. tagetiflora así como del etil-hexil-p-metoxicinamato o parsol (2 mg/ml) que se
utiliza como principio activo de varios filtros solares comerciales. Este compuesto
es un cinamato que absorbe RUV-B Imagen 3 (DMS Personal Care Bussines Unit,
2018).
Como Control de irradiación se utilizó el metanol, para el experimento sin protección,
ya que fue el solvente utilizado para diluir el EM de D. tagetiflora.
Imagen 2: Esquema de experimento de fotoprotección con el modelo bacteriano (García-Bores,
2010).
Imagen 3: Estructura del parsol (alibaba.com)
Las poblaciones de bacterias fueron expuestas a la RUV, iniciando desde una breve
exposición de 30 segundos hasta los 5 minutos. Haciendo muestreos en intervalos
17
de 30 segundos. Las muestras de 50 μl de las poblaciones irradiadas se tomaron
en los distintos tiempos de exposición a la RUV para posteriormente, determinar el
número de sobrevivientes por el método de dilución (Eisenstadt et al., 1994). Los
resultados fueron graficados y se obtuvo la pendiente de la recta, siendo ésta la
constante de mortalidad K.
En el caso de los experimentos para evaluar la capacidad fotoprotectora del EM de
D. tagetiflora (sustancia a evaluar) y el parsol, los tiempos se tomaron a diferentes
intervalos, iniciando de 5, 10, 20, 40, 60, 90 y 120 minutos. Posteriormente, para el
grupo con EM de D. tagetiflora se tomó una muestra más a los 150 minutos, debido
a que en experimentos preliminares las poblaciones bacterianas aún presentaban
sobrevivientes a los 120 minutos para este grupo. Al ser sustancias que poseen un
efecto fotoprotector comprobado, se requirió que los tiempos en los que se tomaron
las muestras fueran más largos en comparación con los tomados para el grupo
Control de irradiación.
Los resultados de los experimentos fueron analizados contando las UFC a distintos
tiempos de irradiación. Se tomaron en cuenta los resultados de conteo que fueran
más homogéneos calculando el número de UFC/ml para finalmente calcular el
logaritmo base diez del resultado. Cada punto fue graficado con respecto al tiempo
de irradiación, así se obtuvo la gráfica de cada experimento cuya ecuación o modelo
es la de la recta y la pendiente es la constante de mortalidad (K).
Las constantes de mortalidad obtenidas en los experimentos protegidos con el EM
de D. tagetiflora se compararon con las de los experimentos protegidos con parsol
y se realizó un análisis estadístico de t de student.
Modelo de pez cebra
Mantenimiento
Especímenes de pez cebra adultos fueron proporcionados por el Acuario “Juan Luis
Cifuentes Lemus” de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FESI) y se
mantuvieron en peceras con un volumen de agua de 3 L por cada diez individuos a
18
una temperatura promedio de 26°C con un ciclo de luz y obscuridad de 12/12 hrs.
Fueron alimentados dos veces al día siete días a la semana con hojuelas de
tetamina complementadas con Artemia salina.
Reproducción
Los peces se transfirieron a una pecera para reproducción a la cual se le aumentó
la temperatura hasta los 28.5°C. También se le colocó una red de tul de 5 mm
suspendida a 10 cm de altura del fondo para evitar el canibalismo de los huevos.
Los peces se trasladaron en un número de dos machos por cada hembra.
Posteriormente, se colocó una hembra adicional para asegurar contar con el número
de huevos necesario para los experimentos. Los huevos fueron recuperados cada
mañana mediante sifoneo y se mantuvieron a temperatura ambiente en medio de
huevos hasta su eclosión a las 48 horas post-fecundación (hpf) (Yang et al., 2012).
Mantenimiento de los huevos
Los huevos fueron recuperados del fondo de la pecera mediante sifoneo, se
separaron los viables de los no fecundados. Los viables se trasladaron en medio
para huevos (CaCl2 10 mg, MgSO4 70 mg, NaHCO3 0.8 mg, KCl 30 mg, NaCl 620
mg, CaSO4 58 mg por litro) con suficiente aireación cambiando el medio una vez al
día durante 48 horas o hasta el momento de la eclosión (Yang et al., 2012).
Mantenimiento de embriones
Cuando los embriones tenían una edad de 48 hpf fueron colocados en medio de
huevos. Posteriormente, los embriones se trasladaron a una placa de 96 pozos (un
alevín por pozo) cubiertos con 200 μl de medio, separándolos en los siguientes
tratamientos:
Grupo testigo: embriones sin irradiar colocados solamente en agua de huevo
D. tagetiflora: grupo sin irradiar colocado en agua de huevo y con extracto de
D. tagetiflora 2 mg/ml
Parsol: grupo sin irradiar colocado en agua de huevo con parsol
Control de irradiación: grupo irradiado colocado solamente en agua de huevo
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DUV: grupo irradiado colocado en agua de huevo y con extracto de D.
tagetiflora
PUV: grupo irradiado colocado en agua de huevo y con parsol
Control vehículo (DMSO): Grupo sin irradiar sólo con el vehículo
Los grupos que se irradiaron fueron colocados bajo una lámpara de luz UV
(intensidad de 312 nm) a una altura de 10 cm durante una hora. Se realizaron tres
experimentos y cada grupo tuvo 3 repeticiones, excepto el grupo Control vehículo
que solo se utilizó para el experimento cualitativo.
Para detectar producción de ROS de forma cualitativa y cuantitativa se emplearon
los siguientes colorantes fluorescentes: naranja de acridina (excitación 502 nm y
emisión 525 nm) para detectar muerte celular y DCFH-DA (Diacetato dicloro-dihidro-
fluoresceína con excitación 495 nm y emisión 519 nm).
Los alevines 48 (hpf) fueron colocados uno por pozo en una placa de 96 pozos
negra con fondo transparente para ser irradiados con una lámpara de luz UV (312
nm) durante una hora. Después, se le agregó a cada pozo 200 μl de medio fresco y
20 μl de fluorosceína (20 μg/ml), y 20 μl de naranja de acridina (7 μg/ml).
Posteriormente, fueron incubados en la obscuridad a temperatura ambiente durante
una hora. Finalmente, los alevines fueron colocados en una solución de medio con
fenoxietanol (50 μg/ml) durante cinco minutos para sacrificarlos.
Para el análisis cualitativo los alevines fueron observados en un microscopio óptico
de fluorescencia.
Para el análisis cuantitativo de la muerte celular y la producción de ROS en los
alevines irradiados se realizó el mismo procedimiento pero se agregaron los
colorantes en pozos separados.
Los experimentos cuantitativos fueron realizados en una placa de 96 pozos negra
con fondo transparente. Las placas se revisaron en un fluorómetro con filtros de
excitación de 485 y emisión de 524 con un rango de error de 20 nm con una
ganancia de 50. Finalmente los datos fueron trasladados a tablas de Excel y se
realizó un gráfico para mostrar los resultados.
20
Resultados
Modelo bacteriano
Los dos experimentos fueron realizados utilizando el modelo de irradiación en E.
coli propuesto por Avila et al., 2005. Los valores de absorbancia de los inóculos
iniciales de las poblaciones bacterianas utilizados se muestran en la tabla 1.
Tabla 1: Inóculos iniciales de cada experimento realizado.
Experimento Absorbancia del inóculo (560 nm)
# de bacterias (UFC/ml)
1 0.295 3.81x106
2 0.3 4.24x106
El logaritmo base diez del número de sobrevivientes y el tiempo de exposición
fueron graficados como se muestra en la imagen 4A. Además, se obtuvo la
pendiente de la recta, que es la constante de mortalidad bacteriana. Por otra parte,
en la imagen 4B se muestran los coeficientes de determinación (R2), que
representan la relación entre ambos ejes, así como las constantes de mortalidad
bacteriana (K).
La población de E. coli en el grupo Control de irradiación no presentó sobrevivientes
en el inóculo para la muestra tomada a los 2.5 minutos de irradiación momento en
el que se presume que ocurre la muerte celular de toda la población bacteriana.
Este grupo presenta una K de 2.3564, lo que indica una inactivación o muerte
bacteriana alta con respecto al tiempo imagen 4A. También se muestran los
resultados del parsol con una K de 0.0447 demostrando que al ser un fotoprotector
comercial protege a las poblaciones bacterianas de la muerte celular inducida por
la exposición a la RUV. Mientras que el EM de D. tagetiflora presentó una K de
0.0284 imagen 4B teniendo un efecto fotoprotector 50 veces superior al del grupo
control. Al realizar un análisis estadístico de t de student se observó que la K del
grupo protegido con el EM de D. tagetiflora es significativamente menor, por lo que
protege a las poblaciones bacterianas por más tiempo con respecto al parsol.
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A
B
Grupo Sustancia K R2 Muerte celular inducida por RUV (mins)
Control Metanol 2.3574 0.9552 2.5
Parsol Parsol 0.0447 0.9675 120
Extracto D. tagetiflora
EM de D. tagetiflora
0.0287*
0.9569
+150
Imagen 4 A: Curvas de muerte celular inducida por RUV en E. coli para los grupos Control de
irradiación (sin protección) y en experimentos con protección (EM de D. tagetiflora y parsol) B:
Constante de mortalidad (K) y coeficientes de determinación (R2) para los experimentos con y sin
protección en el que el valor de la K del EM es significativamente menor según el análisis de t de
student al presentar un valor de *p=0.042 con respecto al parsol
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Modelo pez cebra: Experimentos cualitativos
Los huevos se recuperaron de la pecera de reproducción mediante sifoneo por las
mañanas obteniendo un promedio de 70 huevos viables cada colecta con un éxito
de eclosión del 100%.
Como primer paso para evaluar la efectividad del modelo se determinó el nivel basal
cualitativo de ROS y muerte celular en alevines de pez cebra con y sin irradiación
en experimentos preliminares. En éstos, se determinó el nivel de colorante
necesario así como el tiempo de irradiación más adecuado para el modelo.
Los alevines que se muestran en la imagen 5 presentan una ligera respuesta ante
el naranja de acridina para el grupo testigo en la región ocular (5A) así como en el
área ventral del alevín (5B). Por otro lado, la reacción ante la fluorosceína fue
imperceptible tanto en el área ventral (5C) como en la región cefálica (5D). Esto
indica un estado basal de muerte celular y producción de ROS en alevines de pez
cebra.
En el grupo Control de irradiación, es decir los alevines que fueron irradiados sin
protección, se observó una reacción intensa al interactuar con el naranja de acridina
lo cual se observa en el área ventral mostrando un brillo intenso en el saco vitelino
(5E) así como en la aleta caudal (5F). De la misma manera, este grupo reaccionó
ante la fluorosceína presentando un brillo intenso en el área ventral (5G y 5H). Lo
anterior indica que la exposición a la RUV incrementa considerablemente el nivel
basal de muerte celular y producción de ROS en los organismos.
El grupo Control vehículo (DMSO) presentó una ligera reacción ante el naranja de
acridina en el área frontal de la región cefálica (5I) y en el saco vitelino (5J), sin
embargo, no se observó reacción ante la fluorosceína tanto en la región cefálica
(5K) como en la ventral (5L) por lo que la exposición de los embriones al vehículo
causa daño, pero a un menor nivel que la RUV.
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Imagen 5. Micrografías de los alevines. El grupo testigo tratado con naranja de acridina presentó
un brillo leve en la región ocular (A) y en la región ventral (B). Por otra parte, la reacción del grupo
testigo tratado con fluorosceína fue casi imperceptible en el área ventral (a esta imagen se le
agrego luz normal para comprobar la presencia del tejido en el campo) (C) así como en la región
cefálica (D). El grupo Control de irradiación tiene un brillo muy intenso en la región ventral (E) y en
la aleta caudal (F) y de manera similar el grupo Control de irradiación tratado con fluorosceína
posee un brillo intenso en la región ventral de los alevines (G y H). Para el grupo Control vehículo
tratado con naranja de acridina se observa un brillo superior al del grupo testigo pero menor al del
grupo Control de irradiación tanto en la región cefálica (I) como en la región ventral (J). Y para el
grupo Control vehículo tratado con fluorosceína no hubo un efecto visible tanto en la región cefálica
(K) como en la región ventral (L). Aumento real: 400x.
25
Para los alevines que se muestran en la Imagen 6 se observa que en el grupo de
alevines tratados con el EM de D. tagetiflora hay una reacción intensa ante el
naranja de acridina en la región cefálica (6E) y en la aleta caudal (6F). De manera
similar, en este grupo hubo una reacción notoria ante la fluorosceína tanto en la
región cefálica (6G) como en la región ventral (6H). Estos resultados indican que en
los alevines hay un incremento en el daño celular y la producción de ROS causado
por el EM de D. tagetiflora, sin embargo la intensidad del brillo fue menor comparada
con la del Control de irradiación (6A-6D).
En los alevines tratados del grupo DUV (6I-J) hubo reacción con ambos colorantes,
sin embargo la intensidad del brillo fue menor comparado tanto con el grupo Control
de irradiación como con el grupo EM de D. tagetiflora. Estos resultados indican que
el EM brinda un efecto protector a los peces irradiados, por lo que se observa una
disminución del daño causado por la RUV. Por lo tanto, el EM de D. tagetiflora posee
capacidad fotoprotectora en este modelo.
26
Imagen 6. Micrografías de alevines. El grupo Control de irradiación con naranja de acridina exhibe
un brillo muy intenso en la región ventral (A) y en la aleta caudal (B). De manera similar, el grupo
Control de irradiación tratado con fluorosceína presenta una fluorescencia intensa en la región
ventral de los alevines (C y D). El grupo D. tagetiflora tratado tanto con naranja de acridina, a pesar
de no estar irradiado, tuvo un reacción ante el colorante comparable a la del grupo control de
irradiación en la región cefálica (E) y en la aleta caudal (F). Así mismo, el grupo D. tagetiflora
tratado con fluorosceína exhibió un brillo intenso en la región cefálica (G) y en la aleta caudal (H)
de los alevines de pez cebra. Por otra parte, el grupo DUV tratado con naranja de acridina
demostró una disminución en la intensidad de la fluorescencia comparado con el control de
irradiación y el grupo D. tagetiflora tanto en la región cefálica (I) como en la región ventral (J) con
resultados similares para el grupo DUV tratado con fluorosceína, presentando una reacción muy
leve al colorante tanto en la región cefálica (K) como en la región ventral (L). Aumento real: 400x.
27
En los alevines expuestos al parsol se produce una reacción ante el naranja de
acridina en la región cefálica imagen 7E y en la región ventral en el saco vitelino
(7F). Esto indica un incremento en la muerte celular. De manera similar, los peces
con este tratamiento presentaron una reacción ligera ante la fluorosceína tanto en
la región cefálica (7G) como en la ventral (7H). Estos resultados sugieren que el
parsol también provocó un incremento en la producción de ROS aunque fue
inferior a la reacción observada en el grupo Control de irradiación (7A-D).
En los organismos del grupo PUV se observó una reacción intensa ante el naranja
de acridina en la región cefálica (7I y 7J) y la fluorosceína en la misma región
como reacción ante la RUV (7K y 7L). Esto sugiere un incremento de la muerte
celular y producción de ROS causado por la RUV a pesar de estar protegido por
el parsol comparado con los grupos testigo y DUV.
28
Imagen 7. Micrografías de alevines. El grupo Control de irradiación tratado con naranja de acridina
presenta un brillo muy intenso en la región ventral (A) y en la aleta caudal (B) y de manera similar
el grupo Control de irradiación tratado con fluorosceína hay una reacción intensa ante el colorante
en la región ventral de los alevines (C y D). El grupo parsol tratado con naranja de acridina exhibió
un nivel de fluorescencia considerable en la región cefálica (E) y en la región ventral (F). El grupo
parsol tratado con fluorosceína demostró un brillo leve en la región cefálica (G) y uno más intenso
en la región ventral (H). Por otra parte, el Grupo PUV tratado con naranja de acridina mostró una
reacción más intensa ante el colorante en la región cefálica (I y J). Y el grupo PUV tratado con
fluorosceína presentó un incremento considerable en el nivel de fluorescencia de la región cefálica
(K y L). Aumento real: 400x.
29
Por otra parte si comparamos a los alevines de los grupos DUV (imagen 8E-8H) y
PUV (imagen 8I-8L) tratados con naranja de acridina y fluorosceína se puede
apreciar que el grupo protegido con el parsol presenta una mayor fluorescencia con
respecto al grupo DUV. Esto indica que el EM de D. tagetiflora (E-F), posee una
capacidad tanto fotoprotectora como antioxidante.
Imagen 8. Micrografías de alevines. Comparativa visual de los grupos irradiados. El grupo Control
de irradiación tratado con naranja de acridina presenta un brillo muy intenso en la región ventral
(A) y en la aleta caudal (B) y de manera similar el grupo Control de irradiación tratado con
fluorosceína demostró un nivel de fluorescencia intenso en la región ventral de los alevines (C y
D). El grupo DUV tratado con naranja de acridina tanto en la región cefálica como en la ventral
exhibió una reacción intensa ante el colorante (E y F) con resultados similares para el grupo DUV
tratado con fluorosceína, teniendo un nivel de fluorescencia muy leve tanto en la región cefálica
(G) como en la región ventral (H) siendo menor al de los grupos Control de irradiación y parsol. El
30
grupo PUV tratado con naranja de acridina presentó un brillo más intenso en la región cefálica (I
y J). Por otra parte el grupo PUV tratado con fluorosceína exhibió un incremento considerable en
el nivel de fluorescencia de la región cefálica (K y L), sin embargo sigue siendo un brillo menor al
del Control de irradiación. Aumento real: 400x.
Modelo pez cebra: Experimentos cuantitativos
Para los experimentos cuantitativos se realizaron tres experimentos y se
promediaron los datos de la intensidad de la fluorescencia. Posteriormente, los
resultados fueron graficados para compararlos.
En la imagen 9A se muestra la gráfica de los experimentos tratados con NA para
medir la muerte celular. Los tratamientos que no fueron expuestos a la RUV son
el grupo testigo 647.75 unidades de fluorescencia (Uf), D. tagetiflora 666.5 Uf y
parsol 305.833 Uf.
Los experimentos para detectar ROS con el colorante fluorosceína se presentan
en la imagen 9B donde se observaron los siguientes valores, donde los grupos
que no fueron expuestos a la RUV grupo testigo 108.333 Uf, D tagetiflora 231 Uf
y parsol 145.833 Uf.
Los grupos que se expusieron a la RUV y se trataron con NA que se muestran en
la imagen 9A presentaron los siguientes valores Control de irradiación 1049.916
Uf, DUV 434.75 Uf y PUV 1141.166 Uf. Los grupos tratados con fluorosceína sin
irradiar fueron el grupo testigo 108.333 uf, D. tagetiflora 231 uf y parsol con
145.833 uf (imagen 9B) Los grupos sometidos a la RUV y tratados con
fluorosceína (imagen 9B) presentaron los siguientes valores, Control de
irradiación 240.166 Uf, DUV 236.33 Uf y PUV 182.166 Uf.
En la imagen 9A se observa que de los grupos no irradiados el que presenta un
menor nivel de muerte celular es el grupo parsol, seguido del testigo los cuales
representan el nivel del daño basal.
Mientras que el grupo no irradiado con mayor muerte celular fue el tratado con el
EM de D. tagetiflora indicando que este puede inducir muerte celular.
De los grupos no irradiados tratados con fluoresceína, el valor de producción de
ROS más elevado es el tratado con el EM de D. tagetiflora, mientras que el grupo
31
testigo es el que presenta una menor producción de ROS, representando el nivel
basal de producción de ROS.
También se observa que en los grupos irradiados en los experimentos con naranja
de acridina el grupo PUV presentó el valor más elevado de muerte celular,
mientras que el grupo DUV tratado con el EM de D. tagetiflora es el que presenta
menos muerte celular, incluso es menor al del grupo testigo.
El grupo con mayor producción de ROS para los tratamientos expuestos a
irradiación fue el Control de irradiación y el de menor producción de ROS es el
grupo tratado con parsol.
Los grupos EM de D. tagetiflora irradiados y sin irradiar presentaron valores
similares de ROS al del grupo Control de irradiación.
Debido a la variación de estos resultados, se sugiere incrementar el número de
experimentos y alevines en experimentos posteriores.
32
A
B
Imagen 9. Gráficos de promedios de la fluorescencia en los diferentes grupos experimentales con naranja de acridina (A) y con DCFH-DA o fluoroceina (B)
33
Discusión
Modelo bacteriano
La RUV-B tiene la capacidad de generar cambios químicos en las moléculas sobre
las que incide (Jansen et al., 2008), principalmente en aquellas con sistemas π en
forma de dobles enlaces conjugados, como el DNA (Schuch et al., 2017). A su vez
produce indirectamente ROS culminando en oxidación de proteínas,
entrecruzamientos y rompimientos del DNA y la peroxidación de lípidos de la
membrana, finalizando en la muerte celular (Halliwell & Gutteridge 2015). Es por
esto que se incluye a la RUV en el tratamiento para la desinfección de agua potable
para eliminar las bacterias sin crear ningún tipo de residuos (Hong et al., 2018).
Teniendo esto en cuenta, se sabe que E. coli es sensible a la RUV concordando
con este trabajo ya que la población bacteriana sin protección no presentó
sobrevivientes a los 2.5 minutos de irradiación Imagen 4A.
En la Imagen 4B se puede observar la K de los 3 grupos tratados; siendo la del
grupo Control de irradiación (2.35) la de mayor valor en comparación con la de los
grupos tratados con parsol (0.04) y el extracto de D. tagetiflora (0.02). Este valor es
la pendiente de la recta, por lo que mientras más alto sea mayor es la velocidad a
la que se da la muerte de la población bacteriana. En la misma imagen se observan
los coeficientes de determinación o R2 que nos indican la relación entre los factores
de tiempo y número de bacterias, al ser valores cercanos a uno, se confirma la
relación que hay entre dichos valores.
El parsol le brindó un alto efecto fotoprotector a las poblaciones bacterianas de E.
coli ya que la población protegida con esta sustancia dejó de presentar
sobrevivientes hasta el minuto 120. Este compuesto es reconocido como protector
de luz UV-B debido a su estructura Imagen 3; se utiliza para los filtros solares
resistentes al agua ya que se une fácilmente a la fase acuosa de los bloqueadores
solares además de contar con una estructura que le confiere una absorbancia
considerable de la RUV (DMS Personal Care Bussines Unit, 2018). Además, ha sido
evaluado como fotoprotector en estudios clínicos pediátricos proporcionando una
protección contra la RUV de hasta 4 horas (Saéz & Orozco, 2015).
34
El EM de D. tagetiflora fue el tratamiento que presentó el mejor efecto fotoprotector
a las poblaciones bacterianas de E. coli, ya que la población protegida por el
extracto aún presentó sobrevivientes en el minuto 150. Esto se debe a que el EM
contiene una capacidad fotoprotectora considerable gracias a sus MS de tipo
flavonol, especialmente el hiperósido, un MS fotoprotector el cual es el más
abundante en el extracto (Ku et al., 2014; Ku et al., 2015; Jun et al., 2018; Reyna,
2018).
Modelo pez cebra
En el modelo de pez cebra, los alevines tanto del grupo testigo como del Control
vehículo presentaron un nivel bajo de muerte celular (Imagen 5). Teniendo en
cuenta que la muerte celular o apoptosis es un proceso natural por el cual las células
de los organismos mueren y se renuevan, es normal la presencia de este fenómeno
en los alevines de D. rerio sin tratamientos. Mientras que los alevines del grupo
testigo presentaron un efecto casi imperceptible para la producción de ROS en el
experimento cualitativo Imagen 5 y un efecto leve en el experimento cuantitativo
Imagen 9A, indicando un adecuado funcionamiento de los sistemas antioxidantes
como, vitaminas, enzimas, etc. (Deng et al., 2019; Feig & Peter, 2007).
Por otra parte, el grupo parsol presentó un nivel más elevado de muerte celular y
producción de ROS en el experimento cualitativo y presentó una disminución en el
experimento cuantitativo. Lo cual no concuerda con la bibliografía al ser un
fotoprotector comercial sin antecedentes de toxicidad. Esto puede deberse a que al
manipular a los organismos se puede generar muerte celular. Por otra parte, el
parsol al ser un compuesto de naturaleza apolar se requirió el uso del DMSO como
vehículo. Se ha reportado que éste vehículo puede afectar la replicación y alterar
los patrones de acetilación de proteínas tales como las histonas, culminando en
patrones alterados de expresión. También ha demostrado tener efectos negativos
a nivel celular incluyendo la inhibición de enzimas, alteraciones en el metabolismo
y apoptosis (Kang et al., 2019). Por lo tanto, en este grupo puede haber un efecto
combinado del parsol y del vehículo.
35
En la imagen 7 se observa como los alevines del grupo PUV para el experimento
cualitativo presentaron un nivel elevado de muerte celular, mientras que el mismo
grupo para el experimento cuantitativo si presentó una reducción en la muerte
celular comparado con el grupo control de irradiación lo cual puede deberse tanto a
la presencia del DMSO como al hecho de que el parsol es un compuesto apolar lo
cual pudo haber limitado su correcta absorción, permaneciendo en el medio con
forma de micelas y esto sumándose al posible daño de los organismos durante su
manejo (DMS Personal Care Bussines Unit, 2018; Shovna & Uma, 2014). Sin
embargo, el nivel de producción de ROS fue más bajo en comparación con el grupo
Control de irradiación y el grupo DUV demostrando tener un efecto fotoprotector sin
efectos secundarios.
El EM de D. tagetiflora, al estar en contacto directo con los organismos de D. rerio
produjo una elevada producción de ROS y muerte celular en el experimento
cualitativo imagen 6H y 6I, mientras que para el experimento cuantitativo se
presentó una reducción para el nivel de muerte celular pero no para la producción
de ROS imagen 9A y 9B. Este efecto puede deberse a la presencia de compuestos
fototóxicos en el extracto ya que el género Dyssodia contiene tiofenos que al
excitarse mediante fotones se transforman en moléculas dañinas para los
organismos ya que inducen un estado de estrés oxidativo y de manera similar a que
el extracto al poseer una enorme cantidad de antioxidantes como hiperósido y
quercetina estos se transforman en pro oxidantes (Gutierrez-Lugo et al., 1996;
Halliwell & Gutteridge, 2015).
Por otro lado, para los alevines del grupo DUV en el experimento cualitativo (Imagen
7), tanto la muerte celular como la producción de ROS se reducen, mientras que
para el experimento cuantitativo se reduce la muerte celular con respecto al grupo
control de irradiación pero se mantiene un nivel similar de producción de ROS con
este mismo imagen 9A y 9B. Esto demuestra que el EM tiene una capacidad
fotoprotectora considerable debido a sus MS de tipo flavonol gracias a sus
estructuras con anillos aromáticos y enlaces dobles conjugados (Reyna, 2018).
Además, se ha reportado que el hiperósido, presente en el EM de D. tagetiflora,
36
posee propiedades antiinflamatorias y reduce la actividad del factor de necrosis
tumoral α (FNT-α) en células endoteliales humanas (Ku et al., 2014, Ku et al., 2015).
Mientras que la disminución de la muerte celular en el grupo DUV comparada con
el grupo D. tagetiflora en el experimento cualitativo puede deberse a que los MS
causantes del daño sean sensibles a la RUV, Como ocurre con el ácido ascórbico
en el trabajo de Knight et al., 2017. Por otra parte, la avicularina ha presentado
actividad hepatoprotectora, antinflamatoria, antioxidante y antitumoral (Vo et al.,
2012). Finalmente, la quercetina ha demostrado ser antiinflamatoria, antioxidante y
anticancerígena (Wan et al., 2016; Williams et al., 2004) Lo cual explica la reducción
del daño inducido por la RUV en los organismos protegidos de la RUV con el EM de
D. tagetiflora en los experimentos cualitativos y cuantitativos tratados con naranja
de acridina.
Los MS fotoprotectores son producidos por las plantas en respuesta a la RUV-B y
cuentan con estructuras con enlaces π conjugados que absorben la energía
proporcionada por la RUV antes de que provoque daño celular (Jansen et al., 2008).
Por lo que el EM de D. tagetiflora al contener esta clase de metabolitos (Reyna,
2018), presenta un efecto fotoprotector en los peces, lo cual se puede observar en
el experimento cualitativo de la imagen 8E-8H (irradiados una hora y protegidos con
EM de D. tagetiflora) demostrando el efecto fotoprotector del EM de D. tagetiflora
ya que redujo la muerte celular como se observa en el experimento cuantitativo en
la imagen 9A
37
Conclusiones.
- El extracto metanólico de D. tagetiflora tiene capacidad
fotoprotectora significativa en los modelos E. coli y D. rerio.
El extracto metanólico de D. tagetiflora tiene una capacidad
fotoprotectora estadísticamente superior a la del parsol en el
modelo E. coli.
- El extracto metanólico de D. tagetiflora produce una disminución
considerable en la producción ROS en alevines de D. rerio.en el
experimento cualitativo y una disminución ligera en el cuantitativo.
38
Apéndice 1
Dyssodia tagetiflora (Sonia Rojas)
Dentro de las especies parecidas (Tribu Tageteae) se reconoce el género Dyssodia
por tener un vilano de escamas, no cerdas libres. Una característica fácilmente
observable son las brácteas involucrales que son libres hasta la base, o sea, no
forman un tubo como en Tagetes. Los individuos de Dyssodia frecuentemente
tienen un aroma parecido a Tagetes (flor de muerto) al estrujarse (Villarreal et al.,
2008).
Descripción técnica de D. tagetiflora (Basada en la descripción de Villarreal et al.,
2008)
La especie se reconoce por ser perenne - frecuentemente con la base leñosa - y los
pedúnculos ensanchados en la parte superior. Las hojas están pinnatisectas con los
lóbulos más o menos lineares, y las escamas del vilano están divididos en aristas.
Además, el involucro generalmente es rojo-purpúreo y con los bracteolas del
calículo con el ápice agudo
Hábito y forma de vida: Planta herbácea perenne, erecta.
Tamaño: De 40 a 90 cm de alto
Tallo: Ramificado en la porción superior, estrigoso (pelos rectos y recostados).
Hojas: Opuestas (una frente de la otra) a alternas (hojas desfasadas a lo largo del
tallo) de 3 a 5 cm de largo, pinnatisectas (las hendiduras llegan casi hasta el nervio
medio) en 11 a 17 lóbulos lineares a oblanceolados (con forma de lanza invertida)
de 8 a 18 mm de largo y 2 a 4 mm de ancho, margen entero a dentado, con pelos
esparcidos y numerosas glándulas.
Inflorescencia: Las cabezuelas son inflorescencia densas, sésiles y sobre una
estructura generalmente aplanada sobre pedúnculos de 5 a 10 cm de largo,
bracteolados (que presentan una hoja pequeña), notablemente ensanchados en la
porción terminal; calículo que son un grupo de hojas parecidos al cáliz que están
por debajo de éste de 6 ó 7 bracteólas lineares de 5 a 9 mm de largo, ápice agudo,
39
con glándulas, el involucro es un grupo de hojas pequeñas que rodean a la
inflorescencia de las cabezuelas de primer grado turbinado o de forma cónica a
campanulado de 7 a 10 mm de alto, sus brácteas u hojas pequeñasson 8,
oblanceoladas, purpúreas, con glándulas lineares, receptáculo plano a convexo.
Flores: Liguladas (flor periférica de la inflorescencia) 5 a 8, ovadas (con forma de
huevo) de 6 a 8 mm de largo, amarillas; flores del disco (flores centrales) 40 a 60,
las corolas cilíndricas de 4 a 6 mm de largo, amarillas, puberulentas (con pelos).
Frutos y semillas: Fruto un aquenio (fruto simple, seco, que no se abre al madurar)
obpiramidal, estriado, de 3 a 4 mm de largo, negro; vilano de 12 a 20 escamas
dispuestas en dos hileras, partidas en 5 a 10 cerdas (parecidas a pelos largos y
rígidos) usualmente purpúreas (CONABIO, 2019; Villarreal et al., 2008).
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