efecto letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos
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Instituto Politécnico NacionalEscuela Nacional de Ciencias Biológicas
Departamento de MicrobiologíaLaboratorio de Microbiología General
“Efecto Letal y mutagénico de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos”
Introducción. • Una mutación es una
modificación heredable en una secuencia de bases del genoma.
• En una población bacteriana suelen aparecer mutaciones sin interferencia experimental, se denominan mutaciones espontaneas.
Genotipo-Fenotipo.• De acuerdo al tipo de
mutación que se presente, las características fenotípicas pueden variar de la cepa progenitora.
Tipos de Mutaciones. • Mutaciones puntuales.• Deleciones: Perdida de un
segmento cromosómico.• Duplicación• Translocación: Intercambio
de segmentos. • Inversión: Rotación 180°.
Tipos de Mutantes.• Auxótrofo• Sensible a las temperaturas.• Resistentes.• Sin pigmento.• Colonias rugosas.• Cápsula.• Inmóvil.• Fermentación de azucares.
Luz UV.• Radiación electromagnética
emitida por la región del espectro que ocupa la posición intermedia entre la luz visible y los rayos X.
• Regiones del espectro UV- vacío UV entre 100 y 200nm, UVC entre 200 y 280nm, UVB entre 280 y 315nm, y UVA entre 315 y 400nm
• Rango germicida se encuentra entre 240 y 280 nm
• Se obtiene la máxima eficiencia desinfectante cerca de los 260 nm
Mutaciones por luz UV.
• La radiación UV es absorbida por los nucleótidos, los bloques constitutivos del ADN y ARN de la célula y las proteínas .
• La UV absorbida promueve la formavión de fotoproductos (dimeros e hidratos de pirimidina).
• La formación de dímeros dentro de un microorganismo, impide que éste replique su ADN y ARN, lo cual inhibe su crecimiento incluso pudiendo llegar a ser letal.
Reparación foto-enzimática.
• Se debe a la acción de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante
• Las fotoliasas reparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda
• Fotoliasas: flavina reducida (FADH2) y una pterina.
Mecanismo.• La primera fase del mecanismo
es independiente de la luz.• La fotoliasa reconoce el dímero
de pirimidina, formando un complejo enzima-sustrato [E-S].
• La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz , se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.
Reparación por escisión-resíntesis.• Complejo proteico con
actividad de endonucleasa correctora, conocido como correndonucleasa o escinucleasa
• Las bases dañadas se eliminan y el hueco resultante se rellena por resíntesis reparadora de ADN.
Mecanismo.1. Un complejo proteico (Uvr[A2B])
desenrolla localmente la doble hélice.
2. Se une la proteína UvrC, formando el complejo Uvr[A2BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca del dímero.
3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dímero
4. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN
5. La ADN-ligasa sella la cadena
Reparación SOS. • Ocurre cuando el DNA es
lesionado por dosis elevadas de agentes mutagénico y los mecanismos anteriores no son suficientes para reparar el daño.
• Tienen lugar modificaciones profundas, entre otras, un retraso en la división celular (tabique transversal), respiración disminuida, etc.
Mecanismo.• Dirigida por las proteínas LexA
y RecA.
• LexA inhibe funciones celulares y en condiciones SOS pierde su capacidad represora, por lo que la proteína queda sometida a una proteólisis y pierde su capacidad para unirse al DNA, la proteólisis se ve estimulada de nuevo por la proteína RecA.
• Tiene una elevada tasa de error. (umuDC)
Modelo de Holliday.o Se inicia con roturas de cadena
sencilla en ambos cromosomaso Formación de la estructura de
Holliday.o Migración de la estructura de
Holliday y formación de regiones heteroduplexas.
o Resolución de la estructura por corte de las cuatro cadenas sencillas
o Resolución de la estructura por corte de dos cadenas:• Rotación de la estructura:
estructura isométrica de Holliday
• Corte longitudinal en la estructura y posterior ligación de extremos.
• Corte transversal en la estructura y posterior ligación de extremos.
Esquema del modelo de Holliday.
Serratia marcescens.1. Bacilo G(-)2. Anaerobios facultativos. 3. Móviles.4. Produce pigmento
característico conocido como prodigiosina.
5. Colonias altamente mucoides.6. Oxidasa (-) y reducen el
nitrato.7. Indol (-)8. VP (+)9. Citrato y Malonato (+)10. Se encuentra en suelo, agua y
plantas.
Objetivos.1. Realizar una técnica que nos ayude a realizar una mutación.2. Identificar colonias mutantes.3. Observar la eficacia de los diferentes métodos de
reparación.
Serie A
0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 210 y 300 segundos.
Serie B
0, 15, 30, 45 y 60 segundos. S.
marcescens
Serie A
Serie B
Exposición a luz UV durante los tiempos marcados
Incubación 37°C por 48hr.
Conteo de colonias apigmentadas y pigmentadas en cada placa de Serie A y Serie B
RESULTADOS Y DISCUSIÓN•Laboratorio 3
SERIE A (OSCURIDAD)Tiempo de exposición
0 15 45 60 90 120 210 300
R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T
1 IN IN IN
9 IN
29
0 29
17
0 17
2 0 2 0 0 0 0 0 0
2 IN IN 28
12
40
24
2 26
13
0 13
7 0 7 0 0 0 0 0 0
3 IN IN IN
7 IN
21
0 21
19
0 19
5 0 5 0 0 0 2 0 2
4 IN 53
37
90
7 0 7 43
2 45
0 7 7 2 0 2 1 0 1 7 3 7
5 IN IN 4 20
24
2 12
14
0 10
10
0 2 2 0 0 0 0 0 0
6 IN 109
65
174
2 2 4 9 0 9 1 0 1 2 0 2 4 0 4 0 0 0
7 IN IN 84
7 91
8 5 13
62
1 63
18
3 21
7 3 10
8 1 9
8 IN IN
5 IN
25
0 25
10
0 10
12
0 12
10
0 10
5 0 5 3 0 3
CÁLCULOS SERIE A
Tiempo de exposición
15 45 60 90 120 210 300
%M
%M
%S
%M
%S
%M
%S
%M
%S
%M
%S
%M
%S
1 0% 3% / 0% 11.6%
0% 58.6%
0% 11.7%
0% 0% 0% 0%
2 0% 30% 16% 7.6% 65% 0% 50% 0% 53.8%
0% 0% 0% 0%
3 0% 2.8% 0% 0% 8.4% 0% 90.4%
0% 26.3%
0% 0% 0% 0%
4 41.1% 0% 7.7% 4.4% 642% 100%
15.5%
0% 28.5%
0% 50% 43%
700%
5 0% 83.3%
9.6% 85.7%
58.3%
100%
71.4%
100% 20% 0% 0% 0% 0%
6 37.5% 50% 2.29% 0% 225% 0% 11.1%
0% 200% 0% 200%
0% 0%
7 0% 7.69%
36.4% 38.4%
14.2%
1.5% 485% 14.2% 33.3%
30%
48% 11%
90%
8 2% 0% 10% 0% 40% 0% 120% 0% 83.3%
0% 50% 0% 60%
0 50 100 150 200 250 3000
2
4
6
8
10
12
14
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Serie A)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
des
pig-
men
tada
s
0 50 100 150 200 250 3000
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie
A)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
SERIE B (LUZ)Tiempo de exposición
0 15 30 45 60
R B T R B T R B T R B T R B T
1 IN 27 83
110 27 83 110 112 26 128 15 15 30
2 IN IN 14 0 14 60 0 60 5 0 5
3 IN IN IN 4 INC 45 9 54 25 4 29
4 IN IN 166 20 186 50 1 51 25 20 45
5 IN IN 10 34 44 4 63 67 3 6 9
6 IN 105
24
129 8 1 9 7 8 15 0 0 0
7 IN IN IN 32 9 41 15 2 17
8 IN IN IN 10 IN 22 1 23 13 1 14
CÁLCULOS SERIE B
Tiempo de exposición
15 30 45 60
%M
%M
%S
%M
%S
%M
%S
1 75.4% 75.4% 100% 20.3% 116.3% 50% 23.4%
2 / 0% 5.6% 0% 428.5% 0% 8.3%
3 / 1.6% / 16.6% 21.6% 4% 53.7%
4 / 10.7% 74.4% 1.9% 27.4% 44.4% 88.2%
5 / 77.2% 17.6% 77.2% 152.2% 66.6% 13.4&
6 / 11.1% 6.9% 11.1% 166.6% 0 0
7 / 0% / 21.9% 16.4% 11.7% 41.4%
8 18.6% 4% / 4.34% 9.2% 7.1% 60.8%
0 10 20 30 40 50 6002468
101214161820
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Serie B)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)Prom
edio
de
colo
nias
api
gmen
tada
s
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie
B)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
0 10 20 30 40 50 6002468
101214161820
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Comparación).
Serie BSerie A
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
des
pig-
men
tada
s
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Com-
paración)
Serie BSerie A
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
Serie A – E.5 L.3
Serie B – E.1 L.3
RESULTADOS Y DISCUSIÓN•Laboratorio 4
SERIE A (OSCURIDAD)Tiempo de exposición
0 15 30 45 60 90 120 210 300
R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T R B T
1 INC 49
75
124
0 0 0 6 17
23
4 13
17
1 4 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 INC 304
68
372
25
78
103
8 1 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 INC 29
91
120
2 23
25
5 9 14
3 0 3 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
4 INC 0 0 0 14
1 15
5 1 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
5 INC 38
56
94
12
0 12
8 0 8 6 0 6 2 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 INC 0 0 0 6 0 6 11
3 14
9 1 10
0 0 0 3 1 4 11
2 13
2 0 2
7 INC 6 11
17
3 2 5 0 0 0 15
4 19
0 1 1 1 1 2 0 1 1 0 0 0
8 INC 52
120
172
19
2 21
15
2 17
9 0 9 5 0 5 4 0 4 0 0 0 0 0 0
CÁLCULOS (SERIE A)
Tiempo de exposición
15 30 45 60 90 120 210 300
%M %M %S %M %S %M %S %M %S %M %S %M %S %M
%S
1 60%
/ / 74%
/ 76%
74%
80%
29%
0% 0% 0% 0% 0% 0%
2 18%
75% 28%
11%
8.7%
/ / 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
3 76%
92% 21%
64%
56%
0% 21%
0% 67%
0% 0% 0% 0% 0% 0%
4 0% 6.6% / 17%
40%
0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
5 59.5$
0% 13%
0% 67%
0% 75%
0% 33%
0% 0% 0% 0% 0% 0%
6 0% 0% / 21%
233%
10%
71%
0% 0% 25%
/ 15%
325%
0% 15%
7 6% 67% 29%
0% 0% 21%
0% 100%
5% 50%
200%
100%
50%
0% 0%
8 69.7%
9.5% 12%
12%
81%
0% 53%
0% 56%
0% 80%
0% 0% 0% 0%
0 50 100 150 200 250 300-7
3
13
23
33
43
53
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Serie A)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
des
pig-
men
tada
s
0 50 100 150 200 250 3000
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie
A)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
SERIE B (LUZ)Tiempo de exposición
0 15 30 45 60
R B T R B T R B T R B T R B T
1 INC INC 55 8 63 26 2 28 0 0 0
2 INC INC INC 95 10 105 INC
7 INC
3 INC INC 35 95 130 13 2 15 10 2 12
4 INC 0 0 0 36 12 192 18 4 88 0 0 0
5 INC INC 160
92 252 19 2 21 17 1 18
6 INC INC 48 4 52 8 1 9 6 0 6
7 INC INC 16 INC 11 6 17 8 2 10 10 0 10
8 INC INC 174
11 185 37 1 38 26 0 26
CÁLCULOS (SERIE B)
Tiempo de exposición
15 30 45 60
%M %M %S %M %S %M %S
1 0% 12.6% 25.2% 7.14% 44.4% 0% 0%
2 0% 0% / 9.52% 42% 2.8% /
3 0% 73% 52% 13.3% 11.5% 16.6% 80%
4 0% 6.2% / 4.54% 45.8% 0% 0%
5 0% 36.5% / 9.5% 8.3% 5.5% 85.7%
6 0% 7.6% 20.8% 11.1% 17.3% 0% 66.6%
7 6.4% 35.2% 6.8% 20% 58.8% 0% 100%
8 0% 5.9% 74% 2.6% 20.5% 0% 68.4%
0 10 20 30 40 50 600
5
10
15
20
25
30
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Serie B)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)Prom
edio
de
colo
nias
api
gmen
tada
s
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Serie
B)
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
40
50
60
Relación entre el número de colonias mu-tadas y el tiempo de irradiación con luz UV
(Comparación).
Serie BSerie A
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos
Prom
edio
de
colo
nias
des
pigm
en-
tada
s
0 10 20 30 40 50 60 700
50
100
150
200
250
300
Relación entre el número de colonias totales y el tiempo de irradiación con luz UV (Comparación)
Serie BSeire A
Tiempo de irradiación con luz UV (segundos)
Prom
edio
de
colo
nias
tot
ales
Serie B E-6 L-4
Serie A E-8 L-4
Conclusiones• Al irradiar con luz UV pudimos poner en practica una técnica para producir una
mutación que se puso de manifiesto con la observación de colonias pigmentadas y no pigmentadas y se pusieron de manifiesto algunos mecanismos mediante la comparación de la serie A con la serie B.
• No se logró demostrar cual mecanismo presenta mayor eficiencia en la reparación de dímeros de pirimidina.
• Se logró poner de manifiesto la relación que existe entre el tiempo de exposición a la radiación UV y el efecto mutagénico y/o letal que éste presenta.
Bibliografía• HOWARD-FLANDERS, P. (1982): Reparación inducible del ADN. Inv. y
Ciencia 64 (enero): 28-37.• SANCAR, A., G.B. SANCAR (1988): DNA repair enzymes. Ann. Rev.
Biochem. 57: 29-67.• http://
www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/18_micro.htm#uv• Madigan M.. (2009). Brock. Biologia de los microorganismos..
México: Pearson Education.