EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CÉLULAS

PARTE II

CONSIDERAÇÕES GERAIS

DNA

REPAROAgentes ou produtos ambientais(radiação ionizante)

DANO DANO NÃOREPARADO

Letalidade celularEnvelhecimento precoceMalformação Câncer

TÉCNICAS (EM NÍVEL CELULAR)

Aberrações cromossômicasCitogenéticas Micronúcleos

Troca entre cromátides irmãs

Bioquímicas Cometa

Moleculares Hibridização in situ

Dosimetria biológica

Genética toxicológica

Biomonitoramento

Instabilidade genômica

IDENTIFICAÇÃO DE MANIFESTAÇÕES CELULARES OU MUTAÇÕES

INDICADORES BIOLÓGICOS- aberrações cromossômicas

Métodos - micronúcleos- Cometa (“single cell gel assay”)

MÉTODO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS

Formação: quebras nos cromossomos quebras na fita dupla do DNA

reparo não reparo reparo errôneo(deleção) (rearranjo)

cromossomo aberrações cromossômicas normal estruturais

Aberração cromossômica qualquer fase do ciclo celular

metáfase

G1- tipo cromossômicoS - cromossômico + cromatídicoG2 - tipo cromatídico

necessitam de quebrasnos cromossomos

ABERRAÇÃO TIPO CROMOSSÔMICO

ABERRAÇÃO TIPO CROMATÍDICO

ABERRAÇÕES CROMOSÔMICAS RADIOINDUZIDAS

REPLICAÇÃO

METÁFASEREJUNÇÃOQUEBRA EM G1

FRAGMENTOACÊNTRICO

ANEL COMFRAGMENTOACÊNTRICO

DICÊNTRICO COMFRAGMENTOACÊNTRICO

TRICÊNTRICO COMFRAGMENTOACÊNTRICO

DOSIMETRIA BIOLÓGICA

ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA

frequência de aberraçõesencontadas em linfócitosde indivíduos expostos

frequência observada em lifócitos irradiados in vitro

com doses conhecidas

Curvas dose - resposta

LINFÓCITOS “dosímetros biológicos”

- altamente radiossensíveis- população naturalmente sincrônica de células- ampla distribuição corpórea (G0 G1)- facilmente coletadas- in vitro = in vivo

Moorhead et al. (1960) - desenvolvimento de técnicas de cultivo de linfócitos humanos in vitro, utilizando um mitogênico.

Linfócitos células blásticas MITOSE

(G0 G1)

PHA

(Phaseolus vulgaris)

Bender e Gooch (1962) - propuseram a análise de aberrações cromossômicas para a avaliação quantitativa de dose absorvida de radiação.

CULTURA DE LINFÓCITOS (48 h)(Construção de Curva de Calibração)

- Coleta do sangue (5 mL)- Fracionamento de amostras sanguíneas e irradiação com várias doses (10-500 cGy)- Cultivo a 37oC

sangue total + meio de + soro fetal + mitogênico + antibiótico (0,5 mL) cultura bovino PHA

- Adição de colchicina (2h antes da fixação)- Adição de solução hipotônica (KCl 0,075 M)- Fixação com metanol + ácido acético (3:1)- Preparação de l6aminas: fixação a 65oC- Coloração com Giemsa a 2%

1a divisão em cultura: 40 54 h -BrdU 2a divisão: 72 h -critérios

48h padronização da técnica

Cada laboratório obtenção de curva - padrão

- Sensibilidade da técnica: estimativa de dose, da ordem de 5 cGy de radiação de baixa LET- para cada dose de radiação: pelo menos 100 metáfases analisadas

CROMOSSOMOS ARLEQUIM

Trocas entre cromátides – irmãs em cromossomos mitóticos.Corados com Hoechst – 33238 e acridine orange, observados ao microscópio de fluorescência

CURVA DOSE-RESPOSTA

Todos os tipos de radiação ionizante – mesmo tipo de aberrações cromossômicas em células expostas

Frequência de aberrações induzidas – depende da dose, depende do tipo de radiação

LET = quantidade de E depositada na matéria por unidade de comprimento do trajeto (keV/m)

x x x x x x x x

x x x x x x x x

alto LETbaixo LET

Ilustração diagramática da densidade de ionização relativa por alvo de uma trajetória simples para radiação de alta e baixa LET

Energia média do neutron (MeV)

Dic

êntr

icos

por

cél

ula

Dose (Gy)

baixa LET y = 0 + D2

(R-X, R-y = 0 + D+ D2

alta LET y = 0 + D(n, p, )

0 FA = 1 em 300 células0 D = 1 em 2000 células

1 2 3 4 5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,7 7,6 14,7Raios X 250 kVpa 1,0 Gy/min

Radiação de 60Coa 0,5 Gy/min

Curva dose – resposta para dicêntricos induzidos em linfócitos sanguíneoshumano, expostos in vitro ao 37Cs com taxa de dose de 5 cGy.min.-1

Curva dose – resposta para dicêntricos induzidos em linfócitos sanguíneos humano, expostos in vitro ao 60 Co com taxa de dose de 5 cGy.min.-1

CURVA DOSE – RESPOSTARADIAÇÃO DE BAIXA LET

Aberração cromossômica resultante de 2 quebras (anéis, dicêntricos)

y = 0 + D+ D2

termo lineardicêntrico única trajetória ionizante

(1 ou 2 quebras)independe da taxa de dosedoses mais baixas da curva

termo quadráticodicêntrico interação de 2 trajetórias

ionizantes independentedepende da taxa de dose: zona de rejunção < 0,1 mdoses mais altas da curva

D

D2

MÉTODO DO MICRONÚCLEO

Origem - fragmentos acêntricos

- cromossomos inteiros

Tamanho- 1 a 1 de do núcleo principal

Indicadores - agentes clastogênicos

- agentes aneugêncios

Schmidt (1975) – células da medula óssea de camundongos

Countryman e Heddle (1976) – relação quantitativa entre a dose e a frequência de MN em linfócitos humanos

20 5

Ilustração esquemática do mecanismo de formação de micronúcleos em células mononucleadas

METÁFASE

EFEITOGENOTÓXICO

ANÁFASE

CÉLULANORMAL

CÉLULAANORMAL

CÉLULAS -FILHAS NORMAISCÉLULAFILHA

NORMAL

CÉLULAMICRONUCLEADA

Fenech & Morley (1985) – “cytokinesis block method”

Citocalasina B – Helminthosporum dematoideuminibe a citocinese, mas não a carciocinesecélula binucleada (1 divisão nuclear)

Cultivo: adição de cito B, 44 horas após tratamento isotônico – preservação do citoplasma

para cada dose – 500 células binucleadas

Desvantagem - não oferece toda a informação- 10 a 12 MN / 1000 binucleadas

Vantagens - relativamente simples e sensível- análise mais rápida- bom indicador de dano genético- magnitude do dano ocorrido

Ilustração esquemática do mecanismo de formação de micronúcleos em células binucleadas

METÁFASE

EFEITOGENOTÓXICO

ANÁFASECÉLULANORMAL

CÉLULAANORMAL

CÉLULAMICRONUCLEADA

CÉLULANORMAL

ADIÇÃO DECITOCALASINA B

Parâmetros:

-frequência de células com MN (incidência de células afetadas)

-distribuição de MN (extensão do dano ocorrido)0, 1, 2, 3, 4, 5 MN por célula>5 MN - desprezado

TESTE DO COMETA(“SINGLE CELL GEL ASSAY”)

Ostling & Johanson (1984) – técnica eletroforética de microgel

condição neutra quebra na dupla fita

direta visualização do dano em nível de célula individual

Singh et al. (1988) – condição alcalina

quebra na fita sítios

simples álcali-lábeis

Número e tipo de lesões radio – induzidas no DNA (Resnick (67), Warters e Childers (74) e Wlodek e Hittelman (75))

Tipo de lesão Número por gray

Quebra fita dupla (dsb) 40

Quebra simples fita (ssb) 500 – 1000

Dano na base 1000 – 2000

Dano no acúcar 800 – 1600

ligações cruzadas (crosslinks) DNA – DNA 30

ligações cruzadas DNA – proteínas 150

Sítos álcali – lábeis 200 - 300

1 Gy de radiação 1 quebra na 25 quebras na fita de baixa LET fita dupla na fita simples / cromossomo

PRINCÍPIO DO MÉTODO

-DNA nuclear altamente organizado-Molécula de DNA de células de eucarioto-(50 – 100 cm de comprimento)

105 x núcleo(5-10 m )

Interpretação esquemática do padrão de migração do DNA, formando estrutura semelhante ao do cometa

TÉCNICA DE ELETROFORESE DE MICROGEL

PARÂMETROS

- Comprimento da imagem ou do Cometa

( cabeça + cauda)

DNA do nucleóide DNA que migrou

- Comprimento da Cauda

(distância de migração de DNA)

magnitude de dano ocorrido

- Área do Cometa

- “Tail moment” = quantidade DNA X comprimento

na cauda da cauda

intensidade de fluorescência

VANTAGENS

- Análise direta do dano no DNA em nível de célula individual

- Quantidade pequena de células ( da ordem de L)

- Relativa facilidade na obtenção de dados

- Análise de 50 células / dose

- Sensibilidade: 5 cGy de radiação de baixa LET

- Estudo de danos no DNA e reparo: danos oxidativos, dosimetria biológica,

biomonitoramento e estudos de apoptose

Radiação de 60Co

Radiação de 60Co

Radiação de 90Sr