effect of constitutional pigmentation on ultraviolet b-induced dna damage in fair-skinned people

4
Effect of Constitutional Pigmentation on Ultraviolet B- Induced DNA Damage in Fair-Skinned People Vladimir J. Bykov, Jan A. Marcusson,* and Kari Hemminki Department of Biosciences at Novum, Karolinska Institute, Huddinge, Sweden; *Department of Dermatology, Huddinge Hospital, Huddinge, Sweden Ultraviolet light has been implicated as a dominant factor in skin cancer development. Skin pigmenta- tion is traditionally regarded as an important protec- tion against skin cancer. Yet, little is known about how skin pigmentation is modulating induction of DNA damage, which is the primary event in carcinogenesis. We applied a recently developed 32 P- postlabeling technique to measure the effect of con- stitutional pigmentation on the formation of major ultraviolet-induced DNA damage in human skin in vivo. The induction of photoproducts showed a sta- tistically signi®cant negative correlation with erythe- mal response and skin pigmentation. Our results demonstrated that the constitutional pigmentation is ef®ciently guarding DNA against the formation of photoproducts. The difference in melanin content is likely to be one of the reasons for the observed inter- individual variation in levels of DNA damage after the uniform exposure to ultraviolet B. Key words: DNA photoproducts/humans/skin pigmentation/ultraviolet B. J Invest Dermatol 114:40±43, 2000 A n overwhelming epidemiologic evidence has im- plicated solar radiation as a major cause of skin cancer in humans (Vitasa et al, 1990; IARC, 1992; Kraemer et al, 1994; Kraemer, 1997). The constitu- tional skin pigmentation is believed to be an ef®cient protection against solar radiation (Marks, 1995). Epide- miologic studies have shown a signi®cantly lower risk of skin cancer in black skin people compared with Caucasians (IARC, 1992; Preston and Stern, 1992; Kricker et al, 1994). In this study we have measured the effect of natural pigmentation on the induction of the major ultraviolet (UV)-induced DNA damage, cyclobutane pyrimidine dimers and 6±4 photoproducts in human skin in vivo. These lesions are formed at most dipyrimidine combinations (Mitchell and Nairn, 1989; Cadet, 1994; Go Èrner, 1995) and they are thought to be responsible for the initiation events in skin carcinogenesis (Pierceall and Ananthaswamy, 1991; Lawrence et al, 1993; Horsfall and Lawrence, 1994; Gentil et al, 1996; Smith et al, 1996). Dipyrimidine lesions are likely to be important in the pathogenesis of skin cancer as mutations at dipyrimidine sites occur with a high frequency in skin tumors (Dumaz et al, 1993; Ziegler et al, 1993). Our results showed that natural pigmentation provides a reasonably good protection against UV-induced DNA damage. The variations in natural skin pigmentation contribute to the interindividual variation in the induction of photoproducts observed in this and previous studies after exposure with a uniform dose of UV light (Bykov et al, 1998b; Bykov et al, 1999). MATERIALS AND METHODS Volunteers Eight healthy Caucasians (six females and two males) with skin types II±III were recruited from university students and laboratory staff at Huddinge Hospital. The study plan was approved by the local ethical committee and the volunteers gave their informed consent to participate. The age of volunteers varied from 23 to 32 y (median age, 25.5). UV radiation A Waldmann F 85/100W-UV21 (Philips) tubes mounted in a Waldman UV 3003 K screen (Germany) with automatic computerized light dose measurements were used for UVB irradiations. This is a commonly used clinical lamp covering a UVB area of 280±315 nm and emitting approximately 5% of the relative spectral irradiation output in wavelengths < 290 nm, hardly any < 280 nm. The subjects were irradiated on a 2 3 4 cm area of skin on the lower back with a UVB lamp at doses of 0.3 and 0.6 J per cm 2 . The 4 mm punch biopsies were collected from one nonirradiated site and two irradiated sites. The biopsies were collected after an intradermal injection of xylocaine± epinephrine 5 mg per ml (Astra AB, So Èderta Èlje, Sweden). The time between irradiation and a biopsy excision was less than 15 min. The specimens were put in a plastic tube and rapidly frozen in carbon dioxide ice. The material was stored in a freezer at ±20°C until analyzed. The sample codes were blinded till completion of the analyses. Assessment of minimal erythema dose (MED) The measurement of MED was performed as described previously (Bykov et al, 1998b). Assessment of pigmentation The measurement of melanin pigmentation index was performed by an erythema/melanin meter (Dia- Stron, Hampshire, U.K.). This re¯ectometer device contains a tungsten± halogen lamp emitting white light into a ®beroptic probe. The probe illuminates the skin and then collects diffuse light scattered from the skin. The melanin pigmentation index was de®ned according to the manufacturer as: MNI = log 10 (905 nm/632 nm) 3 1000 DNA extraction and photoproduct analysis DNA was isolated as described (Bykov et al, 1998a). From each 4 mm punch biopsy we could isolate 4±8 mg of DNA. For each 32 P-postlabeling assay, 1±3 mg DNA was digested with enzymes (snake venom phosphodiesterase and prostatic acid Manuscript received June 11, 1999; revised September 15, 1999; accepted for publication October 6, 1999. Reprint requests to: Dr. Vladimir J. Bykov, Microbiology and Tumor Biology Center, Karolinska Institute, S-171 77 Stockholm, Sweden. Email: [email protected] Abbreviations: MED, minimal erythema dose; MNI, melanin pigmenta- tion index; TT=C and TT=T, cyclobutane pyrimidine dimers; TT±T and TT±C, 6±4-[pyrimidine-2¢-one] pyrimidine photoproducts; TT*T, Dewar isomer. 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 40

Upload: kari

Post on 06-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

������ �� ���������� ���������� �� � ����� �� ��������� ��� ������ � ���������� ���� �

�������� � �� �� ��� � ������� ��� ��� ���� ������������������ � � �������� �� � ���� ��� ������ ���������� ��������� !����" ����������� � ������ � ��� �������� � ������� ��������� !����

� ����� �� ��� �� ��� �� ����� � � ������������� � �� ������ ���� ������! ��� ����������� �������� " �������� � �� �������� ���������� ����� �� ������! #��$ �� � ���%� � �����% �� ���������� ���� ���� ������� ����� ������$ %��� ��� �����" ����� �����������! &� ��� �� � ������ " ���� ���� '(����� � � �� �����)�� �� ������ ��� ������ �� ����������� ���������� �� ��� �������� �� ��*��� ����� ��������� ��� ������ � ����� �� ������! +�� ������� �� ������������ ��%�� � ���

���� " ��,���� ������� ����� ���� %�� ��"������ ������ ��� �� ����������! -�� ��� ������������ ���� ��� ���������� ���������� ��,���� " ������� ��� ����� ��� �������� ��������������! +�� ��������� � �� ��� ������� �� " �� � ��� �� ��� ����� ��� ��� � ����� ����������� ������� � ��� �� ��� ������ �������� ������ �.����� �� � ����� �� �! ��� ���� �� ����������������������� ������������������������� � ������ ������ �� � !" #$ %!!!

�� ���!#������ ������� � ��� �������� #�� ��$�������� � ��� ������� � �� � ��% � ����� � ���������� �� #����� &������ �� ��� '(()" ��*+� '((,"������� �� ��� '((-" �������� '((./ 0#� � ������$�� ��� ���� ���������� � �� 1������� � 1� ��

��2����� �� ����� � ������� � ��� ������� � &������ '((3/ 4����$�� � ��� ������� #��� �# !� � �����2������ � !�� ���� � ���������� �� 1���� ���� �� ��� � ������ !��# +��������� &��*+�'((," 5���� � ��� ����� '((," ������� �� ��� '((-/

�� �#�� ����� !� #��� �������� �#� ������ � ������� ���������� � � �#� ������� � � �#� ��% � ������� ��� &6�/$������� ���������� ���� 1����� ���������� ������ ��� 78- �# � �� ����� ��#���� ���� �� ���� 0#��� ���� �� ��� � ���� �� � �� ������������� �1����� �� &����#��� ��� ������ '(9(" +����� '((-" : ;�����'((3/ ��� �#�� ��� �# ��#� � 1� ���� ���1�� � � �#� �������� ������� �� ���� ������ ������� &5�������� ��� �����#��!���� '(('"<�!����� �� ��� '((=" � ������ ��� <�!������ '((-" :����� �� ���'((7" ���# �� ��� '((7/ ������������ ���� �� ��� ������ � 1���� ����� �� �#� ���# ������� � ���� ������ �� ������ �� �������������� ����� ���� !��# � #��# ���>����� �� ���� ��� ��&����? �� ��� '((=" @������ �� ��� '((=/

A�� ������� �# !�� �#�� ������� ���������� � �� ����� ����� ��1�� � � �� ����� � ������� 6�$������� ��� ������0#� ������� �� �� ������� ���� ���������� � � ����1��� � �#���������������� ������� � �� �#� ������� � � �# � �� ����� 1������ �� �#�� ��� ����� �� ������� ����� �B� ���� !��# � ���� ��� �� � 6� ���#� &�� � �� ��� '((91" �� � �� ��� '(((/

��04*��< ��� �40�A�

/� ������ 4��#� #����#� +��������� &��B ������� ��� �! �����/ !��#���� ����� ��8��� !��� ��������� �� � ���������� �������� ��� ��1 ��� �� ������� �������� � ������ 0#� ����� ���� !�� ���� ��� 1� �#� � ��� ��#����� ������� ��� �#� � �������� ���� �#��� ��� ���� � ����� � �����������0#� ��� � � �������� ������ �� � ,= � =, � &������ ���� ,33/

�/ ������� � C������� D 93E'))C$6�,' &5#�����/ ��1�� � ������� � C������ 6� =))= � ������ &:������/ !��# ��� ����� � �������?�����#� � �� ������������ !��� ���� � � 6� ��������� �� 0#�� �� �� �� ��� ���� �������� ���� � ������ � 6� ���� � ,9)8='3 �� ����������� ���� B������� 3F � �#� �������� �������� ��������� � ����� ��!��������#� G ,() ��� #����� ��� G ,9) ��

0#� ��1%���� !��� ���������� � � ,� - �� ���� � ���� � �#� � !��1��� !��# � 6� ���� �� � ��� � )= ��� )7 � ��� ��, 0#� -�� ����#1� ����� !��� � ������� �� � �� � ����������� ���� ��� �! ���������� �����0#� 1� ����� !��� � ������� ����� �� ����������� ��%���� � � B�� �����8������#���� 3�� ����� &����� �� ;�����;�%�� !����/ 0#� ����1��!��� ��������� � ��� � 1� ��� �B���� � !�� ���� �#�� '3��� 0#���������� !��� ��� �� � ������� ��1� ��� ������� �� ?�� �� ���1 � �� B������ 0#� �������� !�� �� ��� �� � ����?�� �� 8,)�+ ����� �����?�� 0#������� � ��� !��� 1������ ���� � ������ � � �#� ��������

������ �� ���� ��"����� ��� 01��2 0#� ����������� ��4� !�� ���� ���� �� ������1�� ����� ���� &�� � �� ��� '((91/

������ �� ���������� 0#� ����������� � ����������������� � ����B !�� ���� ���� 1� �� ����#���E������� ����� &���$ �� �� �����#���� 6�/ 0#�� ��H��� ����� ������ � ������ � ��������8#�� ��� ���� �������� !#��� ���#� ��� � 21�� ���� �� 1� 0#� �� 1������������ �#� ���� ��� �#�� � ������ ������� ���#� ��������� �� � �#� ����0#� ������� ���������� � ����B !�� ��2��� ��� ����� � �#������������� ��I

���J � �') &()3 ��E7=, ��/� ')))

��� �.������� ��� ������������ ��� " ��� !�� �� ����� ��������1�� &�� � �� ��� '((9�/ D� � ���# -�� ����# 1� ��� !� � ����� ���� -89�� � ��� D � ���# =,5$� ����1����� ������ '8=�� ��� !���������� !��# ��?���� &����� ��� � �# ��# ���������� ��� �� ������ ����

���������� �������� ���� ''� '(((" ������� �����1�� '3� '((("�������� � � ��1������ � A�� 1�� 7� '(((

*������ ��>����� � I �� �������� � �� �� ���� 1� � �� ��� 0�� �� � �� +������ ��� ������ ���������� $'.' .. � ��# ��� !����4����I ���������� �K�������

�11������� ��I �4�� ������� ����#��� � ��" ���� ������� ��������$�� � ����B" 00J+ ��� 00J0� ���� 1����� ���������� ������" 0080 ���008+� 78-$L����������$,�$ ��M ���������� �# � �� �����" 00�0� ��!���� ���

)),,$,),NE))EO'3)) P + �����#� � ,))) 1� 0#� ����� � � ������������� ������ � ��� ���

34

�# ��#�����/ �#�� �� ����� � �# � �� ����$� �������� �������� ����� �������� ����� &�� � �� ��� '((3" �� � ��� ��������� '((7/

0#� �# � �� ���� ��������� !��� ����#���?�� �� � � �� ��2���������� ����� &�� � �� ��� '((3" �� � ��� ��������� '((7/ 0#���������� � ��������� �# � �� ����� !��� ��B�� !��# #��� ��?��� �� ��2�� ��� ��� ��1���� � ���#�� !��# �#� #���� ������� 0#�!# �� ��1����� ��B���� !�� ��%����� � � #��#$���� ������ ��>����#� ��� ����#� &�5<+/ �>������ !��# �� �$���� ���� �� � �� ��� 6������� �� 0#� �5<+ ��� !�� ���� ���� �� ������1�� &�� � �� ��� '(((/0#� >��������� � � � ��� ��� ��� �#� �� ��� � �#� �������� ����� ����#� ���� ���� 1������ �� � #���� ������� 0#� ��1����� ��2������ �� �#�� ����� �� ���� ������I �'))F � � 00J0� 9)F � � 00J+� .)F � � 0080��� =)F � � 008+ &�� � �� ��� '((3" �� � ��� ��������� '((7/D������ ���� � ��� � 00�0 ��!�� �� ��� !�� ����� �� �� ���������������� � ���# ������ 1�� �� =,5$� ����1����� 0#� �B��� �� ��� ���� ����� ��� �������� !�� � ��� ��� 1� � ����������� ��� B����� ���� �1� �1���� �� ,7) �� ������ �5<+ ��� 1� 6� ������ �� ���� '77 &������� ������� +�/ ��� ������� !��� �����?�� �!���0#� ���� ����1����� � ����� !�� ���������� �� � ���������� � �#� ����������1��!��� �! ������������ ������� 1� �#��� ���� 0#� ������� ����� !��,(F � � �#� �������� �# � �� �����

��� ����������� ��������� �� !��� ���� ���� 1� �#� A����� ���� ���� ��!��� 0#� � ������� � �������� !�� � �� 1� ���� ���� � �������������� � � ���I QJ �R 1B� !#��� � ��� 1 ��� ����������� B$����������������1�� ��� Q$��������� �����1��

*4 6<0

0#� �4� � � �������� ������ �� � )).8), � ��� ��, &+� � �/0#� ���������� �� �4� ���� ��� 1��!��� ���� ���� �� ��� ��� !��� � ������������� �����2���� ��� ����� � �� ����������� � ����&� J )7/ 0#� ������� ���������� � ����B� ��� � �#� ���#�� �������� ������� � ����� �� � 8(7 � 8-7 ����� &+� � �/ 0#����������� �� ��� 1��!��� ���� ����� �� ��� ��� !�� � � ������������������2���� ��� ����� � �� ����������� � ���� &� J )=/ 0#� �4����� ��� � �������� !��# �#� ��� �� �� &� J )77� � J ))./

+� � �! ������� ���� ��� 1�� ��� 1��

� �������� �4�� � ��� ��, ���

� )). 8.3 )). 8(,+ )' 897� )' 8(74 ), 8-.D )'- 89)� )' 8-)� ), 8=7

����� 5! �������� �� ������������ � �� �� ���� �� ������!0#� � �������� !��� �B� ��� � )= ��� )7 � ��� ��, � 6� 0#���������� ������ ��� ����� � �# � �� ���� ������ �B������� �� ���� � ���')7 � ���� ����� �����E� ��� ��, &����� 4�� �J ,/

����� (! ����� ���� ��%��� ��� ������� �� ������������ �����"����� ������ � ��! 0#� ������� � � 00J+ ��� 00J0���� 1����� ���������� ������ ��� 0080 ��� 008+ 78- �# � �� �����1� )= � ��� ��, &�/ ��� 1� )7 � ��� ��, � 6� &/ 0#� ��������� ��������� ����� � �# � �� ���� ������ &�J ,/ 0#� ���� !��� 2���� ��� ����� � � ������ �������� � � ���

����� '! ����� ���� ��%��� ��� ������� �� ������������ ����� ��� ���������� ���.! 0#� ������� � � 00J+ ��� 00J0���� 1����� ���������� ������ ��� 0080 ��� 008+ 78- �# � �� �����1� )= � ��� ��, &�/ ��� 1� )7 � ��� ��, � 6� &/ 0#� ��������� ��������� ����� � �# � �� ���� ������ &�J ,/ 0#� ���� !��� 2���� ��� ����� � � ������ �������� � � ���

�A< ''-� �A ' ���6�*Q ,))) ��� 5�:�4�0�0�A� ��� 5�A0A5*A�6+0 35

����� 5 �# !� �#� ������� � � 00J+ ��� 00J0 ���� 1����������� ��� 0080 ��� 008+ 78- �# � �� ����� �� #���� ������ � ���#� � �������� 0#� ������ � ��� ���� �� ��� �B������� ������� � �#������ � �� 0#� �1������� � �# � �� ����� �� �#�� �������� � �� !�� �#� ����I 00J+S00J0S008+S00800#� ���������� �� �#� ������� � ����� 1��!��� 00J+ ��� 00J0 ��!��� �� 1��!��� 0080 ��� 008+ ��� � � ����# ����������������2����� ��� ����� � � ������ � ���� �� � J ))3 ����� � ��1����#��� !�� ��� �� � 3$� �� ���������� 1��!��� �#� #��#��� ��� � !����# � �� ���� ������ 1��!��� �#� ���������������� ( �# !� � �������� � �������� 1��!��� ������� � �

�# � �� ����� ��� ����#���� ���� ��� �� ���� � ���#� � ������������ ��� ��������� � � )= � ��� ��, &�� (�/ ��� � � )7 � ��� ��,

� 6� ��������� � &�� (�/ 0#� � ����� � � 6�$������� ������� �� ������� � 1� ���������� � �������� !��# ����#���� ���� �������� ' �# !� � �������� � �������� 1��!��� �#� ������� � �

�# � �� ����� ��� �#� ������� ���������� � ����B �� �#� ���� ����#� � �������� ���� ��� ��������� � � )= � ��� ��, &�� '�/ ���� � )7 � ��� ��, � 6� &�� '�/ 0#� � ����� � � 6�$���������� ���� �� ������� � 1� ���������� � �������� !��# �������������� �+� � �� �# !� �#� � ������� � 1��!��� �#� ������� � �

�# � �� ������ ����#���� ���� ���� ��� ������� ���������� �����B 0#� ���� � ��� � )= ��� )7 � ��� ��, !��� � �1���� � ������������ �������� 0#� � �1���� � ������� � � ��2����� 1��!�������#���� ���� ��� ��� ������ � �# � �� ����� � � 00J+ !�� 8)37" � � 00J0 8)7(" � � 0080 8)7." � � 008+ 8)7(&+� � ��/ 0#� � ������� � !�� ������������� �����2���� � � 00J+�� �J ))3 ����� ��� � � 00J0� 0080� ��� 008+ �� �J ))'����� 0#� � �1���� � ������� � � ��2����� 1��!��� �#� ����������������� � ����B ��� ������ � �# � �� ����� � � 00J+ !�� 8)3." � � 00J0 8)3-" � � 0080 8)3." � � 008+ 8)77&+� � ��/ 0#� � ������� � !�� ������������� �����2���� � � 00J+�00J0� ��� 0080 �� � J ))3 ����� ��� � � 008+ �� �J ))' �����

�� +6 �A�

C� #��� ������� � =,5$�5<+ ���#��>�� � ����� # ! � �������������� ���������� � � ������� �#� ������� � � 6�$������� ��������� T���������� ��� >����������� ������� � �#� =,5$�5<+

���#��>�� !��� ��������� �� ������� ����� ���� &�� � ������������ '((3� '((7" �� � �� ��� '((9�� '(((/

������ ���� �� �������� ���� ��������� � ���1��� &���1 ! �� ���'(('/ ��# � � ������� � !�� ��� 1������ �� �� ����� 0#���������� �� � ��������� ����� � ������� !��# 6� ���#�� # !�������� ���#�� � ����B ��� � ��� ������� � �������� ��� #����# � �� ������� �� !��� �� �# � �������?��� � ������� �� ���� 0#��1������ ��� ������ � �#� � �� ���� � � �#� ��B���� � ��������&���� �� ��� '((." ����� '((./

� ������������� �����2���� �������� � ������� � 1��!��� �#�������� � � �# � �� ����� ��� �4� !�� 1������ C� 1������� �������� � ������� � 1��!��� ������ � �# � �� ����� ���� ���������� ���� ���������� � 0#� ���� ������� �#�� � ������� ����� � � �� ��������� �� ���� � ������� ��� ������ 0#��� 2������ ���� �������� !��# � ���1�� � ������� � ��� 1������� �� ��������������� ����������� �� ���� ������ ��������1����� &5���� � ��� �����'((," ������� �� ��� '((-/ ��� ����� � �#��� �������� �#� ����������� ������� �� �#� � �� � ���� �� ������� ���� � ������� ���������� ��# ��� ����� � ���#� 1� !��� !��#�� �#� ���� ���� �����# !����� ���������� ��� ������� � �#�� ���� �� �� ���������� ������� &4�����# �� ��� '((9/ 0#� ����� � ������� � ����� 1����� ���������� ������ �� �� ��� !��# � ���������� ���������� ���� ���������� � �# !�� �#� ������� � � � ����� � � �#��� ���� �� �� #������ ��������� �� ��� � ������ !��#+��������� & ��������� �� ��� '(99/ �� #�� 1��� �# !� �#�� �#�� ����� � � ������������ ������� ���� �� ������� ����� �� ����������� ������� ������� � � ���� 1����� ���������� ������ ��� 78-�# � �� ����� &� 1����#� �� ��� '((9/

� ����� �� ����� ��� � � 2�� ��� � ������� � �� � �� ����� ���� ���� 1� ���������� ������� ����#��� ��� ������� 6�$���������� ������ &�� � �� ��� '((91/ 0#�� 1������� � ��������� �#����� ������ ��� �#� ����#���� ���� ��� ��� �! ����������� ������ + ���������� ���� ���������� �� # !����� ����� � �� ���� � ���� 1��!��� �#��� ������� � 6� �B� ����

�� �#�� ����� !� 1������ � �3$� �� ��������������� ������� � ���#� ������� � � �# � �� ����� ����� � ���� �� � �� � 6� 0#��# � �� ���� ������ !��� � �������� !��� !��# ������� �������������� � 0#� ���� ������� �#�� ������� ���� ���������� � �� �� � �#� ���� �� �B�������� �#� 1������ ��������������� ������� �

+� � ��! +�� ������� �� ������������ �! ��������� ���������� ��� 1�� ������ �� �������� ��

5# � �� ����� � �� � 6�� � ��� ��, + ������� � � ��2������� ������ �������� � �

�4� 00J+ )= 8)77 )).)7 8)-( ),,� �1����� 8)37 )),

00J0 )= 8).3 ))=)7 8)7- ))(� �1���� 8)7( )))=

0080 )= 8)9. )))3)7 8)-. ),-� �1���� 8)7. )))-

008+ )= 8)97 )))7)7 8)7' )''� �1���� 8)7( )))=

��� 00J+ )= 8)3, )'()7 8)77 )).� �1���� 8)3. )),

00J0 )= 8)-= ),()7 8)7. )).� �1���� 8)3- ))=

0080 )= 8)7. )).)7 8)-7 ),3� �1���� 8)3. )),

008+ )= 8)3( )',)7 8)7, )')� �1���� 8)77 )))3

����� ��� � �1���� � � )= ��� )7 � ��� ��, ��� � �����?�� 1� �#������ � ��

3( Q�A� � � 0�4 �A6*��< AD ���4 0�:�0��4 �4*��0A<A:Q

�� �#� ������� � � ��� ������ &�� � �� ��� '((91" �� � �� ���'(((/

���� ����� ��� ��������� � ��� � ���������� ��� ������� �������� ���

�������� ������� ������������ ����� ��� ��� ������� ������� ��� ������

!�������"

*4D4*4�+4

��*+ � � ����#� � �#� 4������� � � +����� ����� *���� � ������I ��� ���6������ ��� *������ � ��*+ ������2� 5�1������ � � 33 <� �I ��*+�'((,� �� .=8'=9

�� � ��� �������� �I 6�$������� �# � �� ����� �� #���� ���� �B�������������� 1� 0<+ ��� �5<+$���� �������� ������� � �������������� '7I=)'38=)'(� '((3

�� � ��� �������� �I ����� � ��������� �# � �� ����� ����� 6��� ��� +��������� � � ��� ��� #���� ���� �B������ �������������� '.I'(-(8'(33�'((7

�� � ��� ������ +0� �������� �I ���# ������ � ������������ ������ ��� ��������� #���� ���� 1� � ���$���������� 6� ������� � ������ �������� ������#������� .I'((8,),� '((9�

�� � ��� ������� � ��� �������� �I 6�$������� ��� ������ ��� ���� ������ � 1� � ��������� ������ !�� 39I,(7'8,(7-� '((91

�� � ��� ����� *� D ;���� �� �������� �I �������� � 6�$������� �# � �� �����1� =,5$� ����1������ �������������� '7I''=8''9� '((3

�� � ��� #��#�� ��� �������� �� Q ��� �*I �� ���� ������ � ���� 1��������������� ������ ��� 78- �# � �� ����� �� #���� ���� �B� ��� � � ������������� ������� � $ %����� &������� '',I=,78=='� '(((

+���� �I ��� ������ ������ 1� B����� �� ��������� �� ������� ��� ������� � ����# � �B����� �� ������ ��I �������� �� �� �� &���/ %�!� ��������� �� ������������ �� ������������ !��#� �� '����� &�� �������( %�����)������ ������������� �����)������ � � ',3 <� �I ��*+ ������2� 5�1������ �� '((-� ��,-38,.7

����? �� �� ����� +� ������ �� ����$:� �%��� <I ����2� 6�$������� ������ ��������� �� �#� �3= ���� � ���� ��� �� �� � ���$������$��2�����B�� ����� ������� ��� �������� ���� ���� ���� ��� *�� ()I')3,(8')3==�'((=

4�����# �*� ������ �� �� ������� �� C����� �:� ������ 5�� *������ 5<I��� ����#�� �#�������������� ���������� ��� ������ �� ���� ���� �� � ��>��� �� ���� ������ �� � �#� ����I � ����$� ��� � ����� %�� $ ������.7I7,987=-� '((9

:����� �� <� 5��� D� ���� � �� <�!����� +C� ���� �� ������ �I ������������ � � ���>�� �#�����$�#����� ����� � �#�����$�#����� ����������

������� �� &78-/ �# � �� ���� �� ��������� ����� ������� ����� !��,-I'9=.8'9-)� '((7

: ;���� �I 5# � �#������� � ��� ��� ������� 1� � �������I >������ ������ ���� ���>������ � �# � � ��?��� � $ ��������� �������� � ���� ,7I''.8'=(�'((3

���� �@I 0#� �# � 1� � �� � ������� ���� ����� � ��������� �������� 73I-.'�'((.

���� �@� <� C� N�� 5� ����#��� �<I �������I � �! ����� �! ��U ������� ���� !��')I'398'7'� '((.

� ������ �� <�!����� +CI �������� � ��������� � ���� �#� 0$+ &78-/ ������" $ ������ ,=3I-738-.'� '((-

���1 ! �� D��?������� 0� C��� �� � �#������� ��� �#��� � �� � ����������������� � ��I : ������# <� &��/ ����������� ������������ ��� ��������������� �� ��� �#�� ��! Q ��I AB� �� 6��������� 5����� 9.=8(')� '(('

� 1����#� �� ������!� �� ��������� 0� �� ��I ����������� ������� ���� ������������� ��� ������� ��� �# � �� ����� �� #���� ��������� $ %����� &�������'')I9)789')� '((9

������� ��I �����#� ��� ���� ������I �� �#�� ���� �������� ���� ���� ���� ��� *��(-I''8'-� '((.

������� ��� <�� �$�� �����!� ��� <��1��� C+I 0#� � �� � ������#� ��� ��������� �� ����� �� ��� � ������ �� ���� ������ ���� &������� '=)I')'98'),'� '((-

������� �� ������ �� �� 4�����# � I �� �B� ���� ��� � �$����� ����� ���������� ������ ����� ������� 3I=7.8=(,� '((-

<�!����� +C� :�11� 54�� ���� �� � ������ ��� ���1�� �I ����������� �������1� ������ 6� �# � �� ����� �� " ���� ��� ����� ���� !�� ,((I'3.8'7=� '((=

����� *I �� ������! � ���� ������� ������ .3I7).87',� '((3����#��� �<� ����� * I 0#� 1� � �� � �#� &78-/ �# � �� ���� ��������� ��������

-(I9)389'(� '(9(5�������� C4� �����#��!��� ��I 0����� ����� � � ���=0= ����� 1� ���������� �

!��# 6�$���������� #���� �$��$���$' �� � $ �� ���� ��� +�������7I,)938,)('� '(('

5���� � � � ���� * I � ������ �� ������� � �#� ���� � ��� $ �� =,.I'7-(8'77,� '((,

���# +�� C��� �� ����� �� +#� <� @#� N� 0��� � �$ I ������ � ������� � �'=���� �� � �������� ����$�����2� ���$���� �����$���$� &78-/� ��� ��!��������� �� �# � �� ����� � �#��������$&=�$3�/ $�#������� �� ���������� ��������� A � ����� �� ������������ =3I-'-78-'3-� '((7

��������� 50� ��?� �� +������ �I +��� 1���$���#������� ������� � 1� � ���$���������� 6� ������� � �� #���� ���� � 5� ����� � 1� � �������������������� � ���������������� 3I'778'7(� '(99

������ +� 0��� � �*� ��������� 50� �� ��I ��� ����� � � � ������ �� ���� ��������� ������� ����� ��� !��# ���������� � ��� ������� ��� �B� ���� �� ��������!������� ������ 73I,9''8,9'.� '(()

@������ �� <������ ��� ������ � �� ��I ������ � # ��� �� ��� � ������#� �� �#� �3=���� � � ������ �� ���� ������� ���� ���� ���� ��� *�� ()I-,'78-,,)�'((=

�A< ''-� �A ' ���6�*Q ,))) ��� 5�:�4�0�0�A� ��� 5�A0A5*A�6+0 3'