eiΣaΓΩΓh Σthn ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ
TRANSCRIPT
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
ΦAPMAKEYTIKHΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ
ΔIAΛEΞEIΣ1-3
EIΣAΓΩΓHΣTHNΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ
ΚΑΙΣΤΗΝTEXNOΛOΓIATOYΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥDNA
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
ΗΠΡΟΟΔΟΣΤΗΣΜΟΡΙΑΚΗΣΒΙΟΛΟΓΙΑΣΕΔΩΣΕΩΘΗΣΗΚΑΙΣΤΗΝΑΝΑΠΤΥΞΗΤΗΣΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ
HΜοριακήΒιολογίαπουέχειωςαντικείμενοτηνανάλυσητηςδομήςκαιτηςέκφρασηςτουγενετικούυλικούανέπτυξεμιάσειράεργαλείααπαραίτηταγιατηνανάπτυξηκαιτηςΦαρμακευτικηςΒιοτεχνολογίας,όπωςτιςδυνατότητες:
✔ Nα«κόβουμε»τοDNAσεμικρότερατμήματα✔ Να«αρχειοθετούμε»τοDNAστοεργαστήριο✔ NααναλύουμετηνπρωτοταγήδομήτουDNA✔ Nαμετράμετηνέκφρασητωνγονιδίων✔ Nαεκφράζουμεταγονίδιασεετερόλογασυστήματαείτεγιανα
μελετήσουμετηλειτουργικότητάτουςήγιαναπαράγουμεμεγάλεςποσότητεςτωνπροϊόντωντους
✔ Ναενισχύουμεγενετικόυλικόαπόαπειροελάχιστεςποσότητες
ΕισαγωγήDNAσεευκαρυωτικάκύτταρααλλάζειτονφαινότυποτους
ΕφαρμογήστηΦαρμακευτικήΒιοτεχνολογία;G
enes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση
Φορείς Έκφρασης
DNAΜΠΟΡΕΙΝΑΑΠΟΜΟΝΩΘΕΙΕΙΤΕΑΠΟΚΥΤΤΑΡΑΗΑΠΟΙΣΤΟΥΣΠΡΟΚΕΙΜΕΝΟΥ
ΝΑΜΕΛΕΤΗΘΕΙ■ ΠΡΟΣΟΧΗ:
ΤοDNAείναιέναΤΕΡΑΣΤΙΟμόριο(ακόμηκαιτοDNAτωνσχετικάμικρώνβακτηριακώνγονιδιωμάτωνείναιαρκετάμεγάλο)πουείναιεξαιρετικάευαίσθητοστημηχανικήκαταπόνηση,δηλαδήμπορείπολύεύκολανα«σπάσει»σεμικρότεραθραύσματακατάτηδιάρκειατωνεργαστηριακώνχειρισμών.
ΕΠΟΜΕΝΩΣ
ü Το«κόψιμο»τουDNAσεμικρότεραθεραύσματαμπορείναβελτιώσειτημηχανικήτουσταθερότητακαινααπλοποιήσειτοχειρισμότου
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
ΠΩΣMΠOPOYMENA«KOΨOYME»TODNAΣEMIKPOTEPAΘPAYΣMATA;
METHXPHΣHEIΔIKΩNENZYMΩN
✍ YΠAPXOYNΠPOΫΠOΘEΣEIΣ;
✔ NAI,TAENZYMAAYTAΘAΠPEΠEINAΔIAΣΠOYNTODNAΠANTAΣTIΣIΔIEΣAΛΛHΛOYXIEΣOIOΠOIEΣEINAIEKTΩN
ΠPOTEPΩNΓNΩΣTEΣ
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
ENΔONOYKΛEAΣEΣΠEPIOPIΣMOY
Oιενδονουκλεάσεςπεριορισμούείναιένζυματαοποίααναγνωρίζουνσυγκεκριμένες
παλινδρομικέςαλληλουχίεςτουDNAκαιτιςδιασπούνπάνταστοίδιοσημείο.Μπορύνναθεωρηθούνσαν«μοριακάψαλίδια»που
κόβουντοDNA
Παραδείγματαστιςεπόμενεςδιαφάνειες
ΤΙΕΙΝΑΙΟΙENΔONOYKΛEAΣEΣΠEPIOPIΣMOY;
Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού είναι ενδονουκλεάσες οι οποίες αναγνωρίζουν συγκεκριµένες παλινδροµικές αλληλουχίες στο DNA, το οποίο διασπούν πάντα στις
ίδιες προκαθορισµένες θεσεις.
Θαδείξουμεμερικάπαραδείγματαστιςεπόμενεςδύοδιαφάνειες
ΤΕΣΣΕΡΙΣ�ΔΗΜΟΦΙΛΕΙΣ��ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΩΝΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ
EcoRI
HindIII
AluI
NotI
PstI
θέσηδιάσπασης Σακχαροφωσφορικόςσκελετός
ΑΠΟΠΟΥΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙΟΙΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ;
✔ Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού αποµονώθηκαν αρχικά από βακτήρια. Είναι συστατικά ενός
µηχανισµού άµυνας των βακτηρίων ενάντια σε εισβολή ξένου γενετικού υλικού, π.χ. από
µόλυνση µε κάποιον βακτηριοφάγο.
✄ Γιατί οι ενδονουκλεάσες περιορισµού δεν διασπούν και το DNA του βακτηρίου που τα
παράγει;
ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗΧΗΜΙΚΗΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΤΟΥΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΥDNAΤΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΕΙΑΠΟ
ΠΕΨΗΑΠΟΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ
ΜεθυλιωμένοDNA
ΜημεθυλιωμένοDNA
ΗEcoRIδεμπορείναδιασπάσειτομεθυλιωμένοDNA
ΜημεθυλιωμένοDNA
ΔιάσπασητουDNA
«κολλώδη»άκρα
ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI
EcoRIμεθυλάση
ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΚΟΠΗ ΤΙ;
Πως αναλύεται το DNA µετά την πέψη του µε ενδονουκλεάσες περιορισµού;
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
HΛEKTPOΦOPHTIKHANAΛYΣHTΩNΘPAYΣMATΩNTOYDNA
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
APXEΣHΛEKTPOΦOPHTIKHΣANAΛYΣHΣ
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
KΛΩNOΠOIHΣH H «αρχειοθέτηση» του DNA
στο εργαστήριο
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Φορείς κλωνοποίησης - Tα πλασµίδια
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
H Διαδικασία της Kλωνοποίησης
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Πολλαπλασιασµός των Aντιγράφων ενός Γονιδίου
µε Kλωνοποίηση
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Aπαραίτητες Iδιότητες ενός Πλασµιδιακού Φορέα
Kλωνοποίησης1. Aλληλουχίες έναρξης αντιγραφής (ORI) 2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή
(π.χ.Aντίσταση σε αντιβιοτικό) 3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές ενδονουκλεάσες περιορισµού (polylinker)
4. ( Έναν υποκινητή που να επιτρέπει ρυθµιζόµενη έκφραση)
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Δηµιουργία µιας Γενωµικής Bιβλιοθήκης
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Γενωµικές & cDNA Bιβλιοθήκες
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Διαδικασία Παρασκευής cDNA
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Bιβλιοθήκες DNA µπορούν να Kατασκευασθούν και σε
Φάγους
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Τα βασικά βήµατα της κλωνοποίησης DNA σε πλασµίδιο
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Συρραφή ΘραυσµάτωνDNA µε Διαδοχική Kλωνοποίηση
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Προσανατολισµένη κλωνοποίηση του δίκλωνου cDNA σε πλασµιδιακό φορέα
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Διάκριση µπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισµό ανασυνδυασµένων φορέων
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
ΠΩΣ MΠOPOYME NA TAYTOΠOIHΣOYME
AΠOIKIEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN ANAΣYNΔYAΣMENOYΣ ΦOPEIΣ KΛΩNOΠOIHΣHΣ
AΠO AYTEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN «AΔEIOYΣ»
ΦOPEIΣ;
Τακοσμίδιαείναιπλασμιδιακοίφορείςκλωνοποίησηςπουπεριέχουνμίαήδύοθέσεις�cos�.(Ηθέσηcosείναιμίααλληλουχίαπερίπου200bpπουπροέρχεταιαπότονφάγολκαιηοποίαείναιαπαραίτητηγιατο«πακετάρισμα»τουDNAσεσωματίδιαφάγου).ΠωςκλωνοποιούμετοDNAσεένακοσμίδιο;1.Χρησιμοποιούμετηθέσηπολλαπλήςκλωνοποίησης(polylinker)γιαναενθέσουμε
θραύσματαDNAπουέχουνδημιουργηθείμεπέψημεενδονουκλεάσεςπεριορισμού.
2.ΤοDNAπακετάρεταισεφάγους,ακριβώςόπωςκαιτοDNAτουίδιουτουφάγου.3.Τακοσμίδιαπολλαπλασιάζονταιμέσασταβακτηριακάκύτταραόπωςκαιτα
πλασμίδια(δηλ.φέρουνγονίδιαπουπροσδίδουνστακύτταρααντίστασησεαντιβιοτικό).
4.Τακοσμίδιααπομονώνονταιακριβώςόπωςκαιταπλασμίδια.Τοπλεονέκτηματουςείναιότιμπορούννα«πακετάρουν»μέσαστην«κεφαλή»του
φάγουμεγαλύτερασεμέγεθοςθραύσματαDNA(40-55kbofDNA,δηλ.Σεκοσμίδιαμεγέθους~5kbμπορούμεναεισάγουμεενθέματα33-50kb)).
Kοσµίδια
• Τοκοσμίδιο«κόβεται»μετηνενδονουκλεάσηBglIIσεθέσηκοντάστηθέσηcos.• ΤογενωμικόDNA«κόβεται»μετηνενδονουκλεάσηSau3A(μερικήυδρόλυση),πουδημιουργεί
συμβατά«κολλώδη»άκραμετηνBglII.Ταθραύσματατακατεργαζόμαστεμεαλκαλικήφωσφατάση(ΓΙΑΤΙ;)
• ΤοDNAδότηςσυνδέεταιμετοDNAδέκτη(κοσμίδιο)μετηνDNAλιγάσηδημιουργώνταςενσειράσυνδέσεις.ΤοDNAκαθαρίζεταιμεβάσητομέγεθος.
• ΤοDNA«πακετάρεται»σεφάγους.
Kλωνοποίηση σε κοσµίδια - Παράδειγµα
Το DNA των κοσµιδίων «πακετάρεται» σε γραµµική µορφή
Κοσµίδια - ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
YBPIΔIΣMOΣ NOYKΛEΪNIKΩN OΞEΩN
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς
Kλώνους µε Yβριδισµό -1
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς
Kλώνους µε Yβριδισµό - 2
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
ΠΩΣ MΠOPOYME NA EΠITYXOYME THN
ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣH ΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN DNA
(πριν την κλωνοποίηση ή και µετά);
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Στύπωµα κατά Southern: ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και υβριδοποίηση - 1
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Στύπωµα κατά Southern:
ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και
υβριδοποίηση - 2
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
ANIXNEYΣH THΣ METAΛΛAΞHΣ ΠOY ΠPOKAΛEI ΔPEΠANOKYTTAPIKH
ANAIMIA ΜΕ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟ ΝΟΥΚΛΕΪΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη
χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη
χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
TI KANOYME OTAN TO ΔIAΘEΣIMO ΓENETIKO
YΛIKO ΔEN EINAI ΔIAΘEΣIMO ΣE ΠOΣOTHTEΣ
IKANEΣ ΠPOΣ ANAΛYΣH; ΦTIAXNOYME ΠEPIΣΣOTEPO ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ
(PCR)
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
PCR – Η ενίσχυση του DNA in vitro
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Ο κύκλος της τεχνικής PCR
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την
PCR - 1
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 2
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 3
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Μοριακή διαγνωστική µε PCR στην ιατροδικαστική
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Aνίχνευση HIV µε RT-PCR
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Xρήση RT-PCR µε πολλαπλούς εκκινητές στη µοριακή διαγνωστική µιάς
ιογενούς κτηνιατρικής νόσου
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
H PCR στην κλωνοποιηση DNA και RNA
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Χρήση της PCR πραγµατικού χρόνου για τη µέτρηση της ποσότητας των
µορίων-στόχων που περιέχει ένα δείγµα
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Μοριακοί φάροι για την PCR πραγµατικού χρόνου
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση
Φορείς Έκφρασης
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Kατευθυνόµενη Mεταλλαξιγένεση
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Eισαγωγή Kατευθυνόµενων Tροποποιήσεων στο
Γενετικό Yλικό
Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής
Kατασκευή Διαγονιδιακών Ποντικών