einfluss eines gentechnisch veränderten, auxin...
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„Einfluss eines gentechnisch veränderten, Auxin produzierenden Rhizobienstammes auf die bakterielle
Bodengemeinschaft“
Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der
Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des
akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte
Dissertation
vorgelegt von
Diplom-Biologin
Corinna Lantin
aus Aachen
Berichter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Ursula B. Priefer
Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Andreas Schäffer
Tag der mündlichen Prüfung: 07.04.2008
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar
"Wenn du einen Hügel hinauf rennst, kannst du ruhig aufgeben, sooft du willst - solange
deine Füße in Bewegung bleiben."
Shoma Morita
.
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
A Einleitung ........................................................................................................... - 1 -
A.1 Die Rhizobien- Leguminosen Symbiose .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 1 - A.2 Rhizosphäre und Rhizoplane.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 3 - A.3 Wirkung von Indol-3-Essigsäure auf das Wachstum der Pf lanzen .. . - 5 - A.4 Die bakter ie l le Gemeinschaft im Boden .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 7 -
A.4 .1 Moleku larb io log ische Ana lysen der bakter ie l len D ivers i tä t im Boden . . . . . . . - 8 - A.4 .2 Mikroskop ische Detek t ion von hor izonta lem Gentransfer (HGT) . . . . . . . . . . . . - 10 -
A.5 Freisetzung von gentechnisch modi f iz ier ten Organismen (GMO) zur
Verbesserung der Landwir tschaft – Vortei le und Problemat iken .. . . . . . . . . . . . - 13 - A.6 Erntesteigerung bei Leguminosen durch bakter ie l le
Phytohormonprodukt ion - das Songl ines EU-Projekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 16 -
B Zielsetzungen................................................................................................... - 18 -
B.1 Die Entwick lung eines kul t iv ierungsunabhängigen Detekt ionssystems
für den HGT bei Bodenbakter ien .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 18 - B.2 Die Analyse mögl icher Veränderungen innerhalb der
Zusammensetzung und Diversi tät der Bakter iengemeinschaft in Anwesenheit
des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 19 -
C Material und Methoden ................................................................................... - 20 -
C.1 Mater ia l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 20 - C.1 .1 Chemika l ien und Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 20 - C.1 .2 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 22 - C.1 .3 Bakter iens tämme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 23 - C.1 .4 Pf lanzenmater ia l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 24 -
C.2 Mikrobiologische Methoden .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 25 - C.2 .1 Bakter ienku l t i v ie rung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 25 - C.2 .2 Hers te l lung von Glycer inku l tu ren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 26 - C.2 .3 Messung des Bakter ien t i te rs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 27 - C.2 .4 Hers te l lung kompeten ter Ze l len . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 27 - C.2 .5 Mobi l i s ie rung von P lasmiden aus E. co l i nach R. leguminosarum . . . . . . . . . . - 29 - C.2 .6 Analyse der P lasmids tab i l i tä t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 30 - C.2 .7 Hor izonta ler Gent ransfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 31 - C.2 .8 Versuche auf N i t roce l lu lose f i l te rn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 31 - C.2 .9 Konjugat ionsversuche in s ter i le r und unster i le r Erde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 32 - C.2 .10 Mikroskop ische Detek t ion von hor izonta lem Gentransfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 33 - C.2 .11 Konjugat ionsversuche auf Schrägagarp la t ten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 34 - C.2 .12 Untersuchung des hor izon ta len Gent rans fers in s te r i len Mik rokosmen . . - 35 -
C.3 Pflanzenkul t iv ierung .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 36 - C.3 .1 Samenster i l i s ie rung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 36 - C.3 .2 Pf lanzennodu la t ionsmedium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 37 -
Inhaltsverzeichnis
II
C.3 .3 Boden fü r d ie P f lanzenku l t i v ie rung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 38 - C.3 .4 Eigenschaf ten des Bodens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 38 - C.3 .5 Inoku la t ion der P f lanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 39 - C.3 .6 Ober f lächenster i l i sa t ion von Wurze lknö l l chen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 39 -
C.4 Plasmidkonstrukt ionen .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 40 - C.4 .1 pK19gabTgenta1 lac I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 40 - C.4 .2 pPJ2plac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 40 - C.4 .3 pJPeGFPplac und pJPdsRedplac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 41 - C.4 .4 pHR-P lasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 42 -
C.5 Molekularbiologische Methoden.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 43 - C.5 .1 I so l ie rung von P lasmid-DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 43 - C.5 .2 I so l ie rung von Gesamt-DNA aus Bakter ien (CTAB-Methode) . . . . . . . . . . . . . . . . - 43 - C.5 .3 DNA-Konzent ra t ionsbest immung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 45 - C.5 .4 DNA-Spal tung durch Restr ik t ionsendonuk leasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 45 - C.5 .5 Agarose-Gele lek t rophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 45 - C.5 .6 Größenabschätzung von DNA-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 46 - C.5 .7 I so l ie rung von DNA-Fragmenten aus Agarosege len . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 46 - C.5 .8 Auf fü l len von Rest r i k t ionsenden ( f i l l - in ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 46 - C.5 .9 Dephosphory l ie rung l inearer DNA-Molekü le . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 47 - C.5 .10 L igat ion von DNA-Fragmenten. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 47 - C.5 .11 Auf t rennung von P lasmidpro f i len (Eckhard t Lyse) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 48 - C.5 .12 Vakuumblo t t ing von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 49 - C.5 .13 Hers te l lung Digox igen in-dUTP mark ier ter Sonden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 51 - C.5 .14 Immunolog ische Nachweisreakt ion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 54 - C.5 .15 Ext rak t ion von DNA und RNA aus der Rh izosphäre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 55 - C.5 .16 Abbau der DNA und reverse Transkr ip t ion (RT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 57 - C.5 .17 Polymerase-Ket tenreak t ion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 58 - C.5 .18 Denatur ie rende Grad ienten Gele lek t rophorese (DGGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 61 - C.5 .19 Si lber färbung (nach Radojkov ica & Kus ic , 2000) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 63 - C.5 .20 TOPO-TA-Klon ie rung® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 65 - C.5 .21 Sequenz ierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 66 - C.5 .22 Termina ler Rest r ik t ions-Fragment Längen Po lymorph ismus ( tRFLP) . . . . . - 66 -
C.6 Analyt ische Methoden .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 68 - C.6 .1 Quant i ta t i ve IAA-Messung (nach Gl i ckmann & Dessaux, 1995) . . . . . . . . . . . . . - 68 - C.6 .2 Gaschromatograph ie und Massenspekt roskop ie (GC-MS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 69 -
C.7 Stat is t ik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 71 - C.7 .1 Mul t id imens iona le Ska l ierung (MDS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 71 - C.7 .2 Bivar ia te Kor re la t ionen – Mante l Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 72 - C.7 .3 Var ianzana lyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 73 -
C.8 Software .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 74 -
D Ergebnisse und Diskussion ........................................................................... - 75 -
D.1 Tei l 1 – Die Entwick lung eines kul t iv ierungsunabhängigen
Detekt ionssystems für den HGT bei Bodenbakter ien .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 75 - D.1 .1 Hor izonta ler Gent ransfer auf N i t roce l lu losef i l te rn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 75 -
Inhaltsverzeichnis
III
D.1 .2 Southern Hybr id is ie rung zum Nachweis des Transfers von pRleVF39b aus
VF39 [genta lac I ] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 83 - D.1 .3 Hor izonta ler Gent ransfer in s ter i lem und unster i lem Boden. . . . . . . . . . . . . . . . . . - 84 - D.1 .4 Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 86 - D.1 .5 Fluoreszenzmikroskop ische Detek t ion des hor izonta len Gent rans fers . . . - 88 - D.1 .6 Verg le ichende Auswer tung durch F luoreszenzmikroskop ie und KBE . . . . . . - 90 - D.1 .7 Untersuchung des hor izon ta len Gent rans fers in s te r i len Mik rokosmen . . - 92 - D.1 .8 Konjugat ionsversuche auf Schrägagarp la t ten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 95 - D.1 .9 Plasmidstab i l i tä t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 97 - D.1 .10 Zusammenfassung – Ergebn isse und Diskuss ion Te i l 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 99 -
D.2 Tei l 2 – Einf luss der gentechnisch veränderten Rhizobienstämme auf
die bakter ie l le Gemeinschaft im Boden .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 100 - D.2 .1 In v i t ro IAA Synthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 101 - D.2 .2 Versuchsansatz 1 : Analyse der bak ter ie l len Gemeinschaf t in der
Rh izosphäre und Rhizop lane der Erbse nach neunwöchiger Inkuba t ionsze i t . . . . - 103 - D.2 .3 Versuchsansatz V2: Analyse der bak ter ie l len Gemeinschaf t in der
Rh izosphäre und Rhizop lane der Erbse nach zehntäg iger Inkubat ionsze i t . . . . . . - 117 - D.2 .4 Versuchsansatz V3: Analyse der bak ter ie l len Gemeinschaf t in der
Rh izosphäre und Rhizop lane der Luzerne nach zehntäg iger Inkubat ionsze i t . . . - 122 - D.2 .5 Versuchsansatz V4: Analyse der bak ter ie l len Gemeinschaf t in der
Rh izosphäre und Rhizop lane der Erbse nach zwöl fwöch iger Inkubat ionsze i t . . . - 128 - D.2 .7 Analyse der IAA Konzentra t ion in der Rh izosphäre (V 1- 4) . . . . . . . . . . . . . . . - 132 - D.2 .8 Zusammenfassung IAA Synthese der versch iedenen VF39-Stämme . . . . - 137 - D.2 .9 Sequenz ier te DGGE Banden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 139 - D.2 .10 Phänotyp ische Veränderungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 142 - D.2 .11 Veränderungen im Ersche inungsb i ld der Wurze lknö l l chen . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 144 - D.2 .12 Veränderungen im Ersche inungsb i ld der Wurze ln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 146 - D.2 .13 Stat is t i sche Auswer tung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 147 - D.2 .14 Ergebn isse der wei te ren b ivar ia ten Mante l tes ts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 154 - D.2 .15 Ergebn isse der Var ianzana lyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 155 - D.2 .16 Zusammenfassung Ergebn isse und D iskuss ion Te i l 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 156 -
E Zusammenfassung und Ausblick ................................................................ - 158 -
F Literatur .......................................................................................................... - 160 -
G Anhang ........................................................................................................... - 183 -
G.1 Shannon Divers i tätsanalyse .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 183 - G.2 Auswertungen der tRFLP-Analysen des Versuchsansatzes V1 .. . - 187 - G.3 Abbi ldungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 191 - G.4 Tabel lenverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 192 - G.5 Abkürzungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . - 194 -
H Danksagung................................................................................................... - 198 -
I Lebenslauf...................................................................................................... - 199 -
Einleitung
- 1 -
A Einleitung
A.1 Die Rhizobien- Leguminosen Symbiose
Rhizobien werden in die Gattungen Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium,
Mesorhizobium und Azorhizobium unterteilt und sind aerobe Gram-negative Stäbchen.
Sie gehören überwiegend zur Klasse der α-Proteobakterien (Young, 1992). Nach
neueren Studien gibt es auch einige Vertreter unter den β-Proteobakterien (Chen et al.,
2003). Rhizobien sind die bakteriellen Symbiose-Partner der Leguminosen und
deswegen für die gentechnische Veränderung, die im Rahmen des Songlines EU-
Projekts durchgeführt wird, optimal geeignet.
Die Bakterien induzieren in den Leguminosen die Bildung von Wurzelknöllchen, in denen
sie zu Bakteroiden differenzieren. Unter den im Inneren der Knöllchen herrschenden
sauerstoffreduzierten Verhältnissen sind sie in der Lage, molekularen Stickstoff zu
fixieren und als Ammonium (NH4+) an die Leguminosen abzugeben (Gisi et al., 1997).
Sie werden im Gegenzug dazu von der Pflanze mit Kohlenstoffverbindungen versorgt
(Gage, 2004). Die Symbiose zwischen Leguminosen und den symbiontischen Rhizobien
ist wechselseitig hoch spezifisch, d.h. eine bestimmte Leguminosengattung kann die
Symbiose nur mit bestimmten Rhizobien (z.B. Bohne - R. phaseoli; Erbse – R.
leguminosarum bv. viciae) eingehen. Die gegenseitige Erkennung erfolgt über die
Exsudation von flavonoiden Verbindungen durch die Pflanze, die eine Expression der
nod Gene in den Rhizobien hervorrufen. Die nod Faktoren induzieren in den
Wirtspflanzen z.B. die Bildung neuer Wurzelhaare, die Bildung der so genannten
„Shepherd’s Crooks“ (Spaink, Kondorosi, Hooykaas, 1998). Außerdem induzieren sie zu
Beginn der Knöllchenbildung die erneute meristematische Aktivität im inneren Kortex der
Wurzel (Schultze & Kondorosi, 1998).
Die Morphologie der Wurzelknöllchen wird in erster Linie durch die Leguminosen
bestimmt. Grundsätzlich unterscheidet man zwei verschiedene morphologische Formen.
Zum einen gibt es die nicht-determinierten Knöllchen, die eine zylindrische bis
keulenförmige Gestalt haben und sich durch fortlaufendes Wachstum des weiterhin
aktiven Apikalmeristems auszeichnen. Bei diesem Wurzelknöllchentyp sind im
ausgereiften Knöllchen alle bakteriellen Entwicklungsstufen vorhanden. Diese
Wurzelknöllchen findet man z.B. bei Pisum sativum und Vicia hirsuta. Zum anderen
findet man determinierte Knöllchen, welche eine globuläre Struktur und ein nur zeitweise
aktives Meristem aufweisen. Bei diesem Typ durchläuft das Knöllchen als Ganzes den
Entwicklungsprozess zum reifen Wurzelknöllchen, in dem dann Stickstoff fixiert wird.
Einleitung
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Determinierte Wurzelknöllchen findet man besonders bei tropischen Leguminosen wie
z.B. Phaseolus vulgaris, Glycine max oder Sesbania rostrata (Hadri et al., 1998).
Zu den Leguminosen gehören ca. 600 Gattungen mit über 13.000 Arten. Sie gliedern
sich in drei Unterfamilien, die Mimosoideae, die Caesalpinioideae und die
Papilionoideae, von denen die Letzte die größte Gruppe darstellt. Die Leguminosen sind
weltweit zu finden und spielen eine bedeutende Rolle in der Landwirtschaft. Sie liefern
aufgrund ihres hohen Proteingehalts einen essentiellen Beitrag zur Ernährung
insbesondere in Entwicklungsländern. Wichtige Vertreter sind Bohnen (Phaseolus),
Erbsen (Pisum), Sojabohnen (Glycine) und Luzerne (Medicago). Die Leguminosen
erreichen durch ihre Fähigkeit, im Wurzelbereich Symbiosen mit Bakterien und Pilzen
einzugehen, eine optimale Versorgung mit Stickstoff, Phosphaten und Mineralien.
Dadurch können sie auch auf sehr nährstoffarmen Böden gut kultiviert werden. Sie
werden außerdem als Zwischenfrucht angepflanzt um den Boden zu lockern und als
Gründüngung den Nährstoffgehalt, besonders den Stickstoffgehalt des Bodens
nachhaltig zu verbessern. Ein Anbau von Leguminosen hinterlässt bis zu 300 kg/ha
Stickstoff, so dass bei der nachfolgenden Fruchtart entsprechend Stickstoffdünger
eingespart werden kann (Selbitschka et al., 1997). Wegen ihrer besonderen Bedeutung
für die weltweite Ernährung und ihrer Fähigkeit in enger Assoziation mit Rhizobien zu
leben, sind Leguminosen für die Versuche des Songlines EU-Projekts ideale
Versuchspflanzen.
Einleitung
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A.2 Rhizosphäre und Rhizoplane
Der Lebensraum im Boden lässt sich grob in drei Bereiche unterteilen: Rhizoplane,
Rhizosphäre und „wurzelfreier“ Boden. Die beiden erstgenannten Bereiche werden
durch die Interaktion zwischen Pflanzenwurzeln, Boden und Mikroorganismen
charakterisiert, während im letztgenannten Bereich Pflanzenwurzeln keine Rolle spielen.
Die Rhizoplane ist der räumlich sehr eng begrenzte Bereich direkt auf der
Wurzeloberfläche. Sie setzt sich aus der gelatinösen Mucigelschicht, die aus toten
Pflanzenzellen, Wurzelexsudaten, Diffusaten, Mucilaten und Lysaten besteht und
unmittelbar anhaftenden Bodenpartikeln zusammen. Die Rhizosphäre ist der etwa 3 mm
breite Bereich, der durch die Abgabe organischer Substanzen von der Wurzel direkt
beeinflusst wird (Gisi et al., 1997).
In unmittelbarer Umgebung der Pflanzenwurzel kommt es durch den Nährstoffbedarf der
Pflanze zu einer stark abgesenkten Nährstoffkonzentration, was zu einer Konkurrenz
zwischen Pflanzen und Mikroorganismen führen kann (Owen & Jones, 2001). Trotzdem
ist die Anzahl der Mikroorganismen in diesem Bereich sehr hoch, da die von der Pflanze
abgegebenen Wurzelexsudate eine leicht verfügbare Kohlen- und Stickstoffquelle für
Mikroorganismen darstellen. Dieser so genannte Rhizosphäreneffekt ist in der Region
der Wurzelspitze besonders ausgeprägt. Durch den Umbau und Abbau der
Wurzelexsudate, wie auch durch eigene Stoffwechselprodukte beeinflussen die
Rhizosphären-Bakterien nicht nur die Menge und Zusammensetzung der
Wurzelexsudate, sondern führen zusammen mit der Wurzelatmung zu einer starken
Senkung des pH-Werts (bis zu 2 pH-Einheiten) innerhalb der Rhizosphäre (Gisi et al.,
1997). Durch die Exsudation spezifischer Substanzen, wie z.B. der Flavonoide und
Tryptophan durch Leguminosen, werden Rhizobien chemotaktisch angelockt (Gage,
2004). Im Anschluss treten sie in Kontakt mit ihren Wirtspflanzen und sorgen durch die
Umwandlung des pflanzlichen Tryptophans in Indol-3-Essigsäure für die
Wurzelhaarkrümmung (Gisi et al., 1997). Diese Wurzelhaarkrümmung ist eine wichtige
Vorraussetzung für die Symbiose zwischen Leguminosen und Rhizobien (Schultze &
Kondorosi, 1998).
Rhizobien gehören zu den „plant growth promoting rhizobacteria“ (PGPRs). Diese
werden dadurch charakterisiert, dass sie durch rasche Mineralisierung organischen
Materials, zu einer verbesserten Versorgung der Pflanze z.B. mit Stickstoff, Phosphat
und Schwefel beitragen und somit einen positiven Effekt auf das Wachstum der Pflanzen
haben (Dolej, 1998; Bloemberg et al., 2001). PGPRS beeinflussen das
Pflanzenwachstum positiv zum einen durch die Fixierung von atmosphärischem
Stickstoff, der den Pflanzen in Form von Ammonium zur Verfügung gestellt wird, und
Einleitung
- 4 -
zum anderen die Exsudation wachstumsfördernder Substanzen. Beispiele hierfür sind
IAA produziert durch verschiedene Rhizobienstämme (Höflich, 1994; Antoun et al.,
1998) oder Indol-3-Buttersäure (IBA) insbesondere produziert durch Azospirillum
brasilense und Agrobacterium rhizogenes (Dobbelaere et al., 1998; Steenhaoudt et al.,
2000). Die verbesserte Nährstoffzufuhr der Pflanze schlägt sich wiederum in einer
veränderten Exsudation der Pflanzen nieder. Dieses komplexe Netzwerk von Interaktion
zwischen Pflanzen und Bakterien, das in der Rhizosphäre und Rhizoplane eine
essentielle Rolle spielt, ist im „unbepflanzten“ oder „wurzelfreien“ Boden von keiner
Bedeutung, da dieser Bereich landwirtschaftlich nicht genutzt wird und daher auch nicht
durch Pflanzen bzw. Wurzelexsudate beeinflusst wird. Im Gegensatz zur Rhizosphäre
besitzt er meist einen höheren pH-Wert und einen höheren Nährstoffgehalt.
Einleitung
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A.3 Wirkung von Indol-3-Essigsäure auf das Wachstum der Pflanzen
Die bakterielle Synthese von Phytohormonen, wie dem Auxin Indol-3-Essigsäure, durch
gentechnisch veränderte Rhizobien, wird im Rahmen des Songlines EU-Projekts auf
eine positive Wirkung hinsichtlich des Pflanzenwachstums und damit einer Erhöhung der
Ernteerträge analysiert. Da Indol-3-Essigsäure (IAA) für die Entwicklung und das
Wachstum der Pflanzen eine wichtige Rolle spielt, ist die Untersuchung einer
zusätzlichen Zufuhr dieses Phytohormons für die Pflanzen ein optimaler Ansatzpunkt. Im
normalen Stoffwechsel der Pflanzen interagiert IAA mit anderen Pflanzenhormonen, wie
Cytokinin, Ethylen und Gibberillin. Das Zusammenspiel dieser Hormone ist für die
Pflanzen von essentieller Bedeutung.
Die Synthese der IAA findet vor allem in der Sprossspitze statt und unterdrückt die
Ausbildung von Seitenknospen (Apikaldominanz), sie führt zur Bildung von
Adventivwurzeln, und zur Stimulierung der Mitoseaktivität z.B. im Kambium und in
Gewebekulturen (Schopfer et al., 2005). IAA wird in vielen Pflanzen aus Tryptophan
hergestellt, es gibt aber auch einige zusätzliche bzw. alternative, d.h. Tryptophan-
unabhängige Synthesewege (Woodward & Bartel, 2005). IAA liegt in der Pflanze zum
größten Teil in einer inaktiven, konjugierten Form, gebunden an Zucker, Aminosäuren
oder Peptiden vor. Die Funktion dieser Konjugate ist noch nicht eindeutig geklärt. Es
wird allgemein angenommen, dass sie zur Speicherung, für den Transport, die
Entgiftung eines Übermaßes an IAA und als Schutz der IAA vor Abbau dienen
(Woodward & Bartel, 2005). Einige IAA-Konjugate werden in den Samen gespeichert
und hydrolysiert sobald die Keimung beginnt, sodass den Keimlingen freie, aktive IAA für
die Entwicklung zur Verfügung steht. Die Menge an IAA, die der Pflanze zur Verfügung
steht, wird neben der Speicherung in Form von Konjugaten ebenfalls durch permanente
Oxidation, die zu einer Inaktivierung des Phytohormons führt, kontrolliert. So ist
gewährleistet, dass der Hormonspiegel im Gewebe von einer ständigen Neusynthese
abhängt und hierdurch reguliert werden kann. IAA wird in den Pflanzen über das
Parenchym basipetal von Zelle zu Zelle transportiert. Die Biosynthese von IAA, der
Abbau und der Transport sichern zusammen, dass in der Pflanze die richtige Menge an
Auxin zur richtigen Zeit am richtigen Ort vorhanden ist (Woodward & Bartel, 2005).
IAA wird nicht nur in Pflanzen, sondern auch in Bakterien produziert. IAA produzierende
Bakterien gehören zu den „plant growth promoting rhizobacteria“ (PGPR) und fördern
durch das von ihnen freigesetzte IAA die Bildung von Seitenwurzeln und Wurzelhaaren.
Dadurch kann die Pflanze mehr Nährstoffe aus dem Boden aufnehmen und besser
wachsen. Außerdem kann bei jungen Pflanzen durch die verstärkte Bildung von
Lateralwurzeln die Verankerung im Boden verbessert werden (Patten et al., 2002). 80%
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der Rhizosphären-Bakterien sind in der Lage, IAA zu synthetisieren (Zakharova et al.,
1999). Einige Vertreter sind Azotobacter vinelandii und Azotobacter chroococum,
Agrobacterium tumefaciens, Bradyrhizobium spp., Azospirillum spp. und Rhizobium spp.
(Martinez-Morales et al., 2003). Es wird vermutet, dass die bakterielle IAA Bildung die
Pflanze durch Förderung des Wachstums zur vermehrten Exsudation anregt, und das
wiederum die Nährstoffmenge für die Bakterien erhöhen würde (Patten et al., 2002). Es
ist bekannt, dass R. leguminosarum bv. viciae VF39 einen positiven Effekt auf das
Wachstum seiner Wirtspflanze hat. Dieser Effekt wird durch die Stickstofffixierung in den
Knöllchen während der Symbiose und die Produktion von IAA hervorgerufen. Es wurde
ebenfalls ein eindeutig positiver Effekt auf Pflanzen wie Raps und Salat gezeigt, der
unabhängig von der Stickstofffixierung vermutlich allein auf der Synthese von IAA beruht
(Noel et al., 1996). Aufgrund dieser Beobachtungen erhofft man sich eine Verbesserung
der landwirtschaftlichen Erträge durch die zusätzliche Zufuhr von bakteriell gebildeter
IAA für die Pflanzen.
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A.4 Die bakterielle Gemeinschaft im Boden
Der Boden ist ein hoch komplexes und zugleich sehr dynamisches Ökosystem. Die
Zusammensetzung und Aktivität der mikrobiellen Gemeinschaft ist von vielen Faktoren
abhängig. Diese beinhalten sowohl physikalische Faktoren, wie Porengröße, Temperatur
und Sauerstoff- und Wasser-Gehalt des Bodens, als auch chemische Faktoren, wie pH-
Wert oder Salzkonzentration im Boden. Des Weiteren spielen das Pflanzenwachstum,
die Verteilung der Mikroorganismen im Boden und der Nährstoffgehalt des Bodens eine
große Rolle (Hirsch, 1996). Der Boden ist ein strukturierter, heterogener, generell
nährstoffarmer und unstetiger Lebensraum (Stotzky, 1997). Die Vielzahl von Faktoren
bedingt, dass es im Boden eine große Zahl von „Mikrohabitaten“ gibt, die sich auf
kleinstem Raum stark unterscheiden und so Lebensräume für verschiedene Arten von
Mikroorganismen bilden.
Diese mikrobielle Diversität im Boden beschreibt die Komplexität und Variabilität
verschiedener Aspekte biologischer Strukturen innerhalb eines Ökosystems. Sie spiegelt
die Anzahl der Individuen „species richness“, die verschiedenen Arten zugeordnet
werden und ihre Verteilung innerhalb dieser Arten „Eveness“ (Lynch, 2004). Die
Stoffwechselleistungen von Bodenmikroorganismen (Ab-, Um- und Aufbau organischer
Substanzen, Mobilisierung und Immobilisierung anorganischer Nährstoffe) werden durch
die mikrobielle Diversität bestimmt. Jede Veränderung der Umweltbedingungen im
Boden, z.B. durch landwirtschaftliche Nutzung, führen zu einer Veränderung innerhalb
der Diversität. Um die Diversität zu beschreiben, gibt es verschiedene Ansätze. Ein Maß
für die Diversität ist der Shannon-Wiener Index H' (Odum, 1969).
Ein Gramm Boden kann bis zu 109 Mikroorganismen aus möglicherweise tausenden von
verschiedenen Arten enthalten (Torsvik, 2002). Von diesen Mikroorganismen konnten
bis jetzt nicht mehr als 10% kultiviert und in Reinkultur untersucht werden (Johnsen et
al., 2001). Traditionell angewandte Kultivierungsmethoden erfassen immer nur einen
kleinen Teil der Gesamtpopulation, da die natürlichen Bedingungen, die für das
Wachstum der Mikroorganismen notwendig sind, im Labor nicht vollständig nachgeahmt
werden können.
Weiterhin gehen viele Bakterien unter Stress, z.B. bei Änderungen des osmotischen
Milieus, niedrigen Temperaturen oder Nährstoffmangel in einen Zustand über, in dem sie
zwar lebensfähig, aber nicht mehr kultivierbar sind (Bleul, 2004; McKay, 1992). Dieser
Zustand soll das Überleben der Bakterien sichern. Ein großer Teil der Bakterien ist aber
auch unter optimalen Lebensbedingungen im Boden bis jetzt nicht kultivierbar. Ein
weiterer Faktor, der die Verlässlichkeit der Kultivierungsmethoden begrenzt, ist die
Aggregation der Mikroorganismen an Bodenpartikel. So werden im Boden nur circa 5%
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der vorhandenen Fläche besiedelt (Nannipieri et al., 2003), wobei eine „hot spot“ Zone
mit vermehrter biologischer Aktivität die Rhizosphäre ist.
Es gibt verschiedene Ansätze, mikrobielle Gemeinschaften in situ zu untersuchen. Dazu
gehören Untersuchungen der mikrobiellen Respiration, Bestimmung der Biomasse,
Bestimmung enzymatischer Aktivitäten, mikroskopische Analysen und Analysen
basierend auf Nukleinsäuren.
A.4.1 Molekularbiologische Analysen der bakteriellen Diversität im Boden
Um die mikrobielle Diversität im Boden zu erfassen, werden häufig molekularbiologische
Methoden angewandt, die auf der Extraktion von Nukleinsäuren (DNA und RNA)
beruhen.
Sie sind unabhängig von Kultivierungsmethoden detektieren auch unkultivierbare und
dormante Bakterien. Es gibt eine Vielzahl von molekularbiologischen Methoden zur
Untersuchung der mikrobiellen Rhizosphärengemeinschaft. Einige Beispiele sind: G+C
Gehaltanalyse, DNA fingerprinting von PCR amplifizierter rDNA und rRNA durch
„terminalen Restriktions-Fragment Längen Polymorphismus“ (tRFLP), „Denaturierende
Gradienten Gel Elektrophorese“ (DGGE) oder „Automated Ribosomal Intergenic Spacer
Analysis“ (ARISA) (Lynch et al., 2004). Hierbei werden bestimmte Bereiche der rDNA
analysiert, die sowohl konservierte als auch variable Regionen enthalten (Muyzer, 1995;
Torsvik, 1998). Die Sequenzunterschiede in diesen Regionen ist umso größer, umso
weiter entfernt die Verwandtschaft zwischen den verschiedenen Mikroorganismen ist.
Diese Korrelation zwischen Variabilität und Verwandtschaftsgrad stellt das Mittel für
phylogenetische Analysen bereit (Woese, 1992; Nakatsu, 2000).
Um die vorhandenen Bakterienarten in der Rhizosphäre mit den aktiven Arten
vergleichen zu können, muss eine parallele Extraktion von rRNA und rDNA erfolgen
(Costa, 2004; Bürgmann, 2003; Felske, 1998). Die rRNA wird nach Extraktion in
c-(r)DNA umgeschrieben und zusammen mit der rDNA in die PCR der 16S Fragmente
eingesetzt. In der DGGE Analyse werden die PCR-Fragmente dann über ihr
Schmelzverhalten aufgetrennt (Details siehe Material und Methoden). Da bei der
Extraktion der rDNA auch die Möglichkeit besteht, freie DNA, die an Bodenpartikel
angeheftet war, oder rDNA toter Bakterienzellen zu extrahieren, kann diese vorher mit
Ethidiummonoazid (EMA) entfernt werden (Nocker & Camper, 2006).
Die DGGE-Methode eignet sich zur Analyse verschiedener Populationen (Duineveld,
2001; Smalla, 2001; Nakatsu, 2000; Sapp, 2006). Auch für pilzliche Gemeinschaften
wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt (Gomes, 2003; de Souza, 2004; Haselier,
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2007). Die Diversität spezieller Gruppen wie z.B. von Stickstofffixierern kann ebenso
mittels DGGE analysiert werden. Für solche Analysen können statt der universellen 16S
rDNA Primer spezielle Primer für bestimmte Gene wie das nifH Gen benutzt werden. Zur
Identifizierung einzelner Spezies in der mikrobiellen Gemeinschaft können nach der
DGGE die gewünschten Banden aus dem Gel isoliert und zur Identifizierung sequenziert
werden.
Dadurch ist man in der Lage innerhalb einer Gemeinschaft direkte Veränderungen z.B.
am Auftreten einer Bande feststellen festzustellen, was theoretisch der Veränderung
einer bestimmten Spezies entsprechen kann.
Einleitung
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A.4.2 Mikroskopische Detektion von horizontalem Gentransfer (HGT)
Eine weit verbreitete Methode zur Erfassung der Gesamtzellzahl von Mikroorganismen
in einem Lebensraum wie z.B. dem Boden ist die Fluoreszenzmikroskopie.
Fluoreszenzfarbstoffe wie 4', 6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI), werden verwendet, um
Bakterien unabhängig von ihrem physiologischen Status und ihrer Stoffwechselaktivität
zu färben (Klauth et al., 2004). DAPI lagert sich in die Doppelhelix der DNA ein und färbt
alle Zellen, die Nukleinsäuren enthalten. Weitere Farbstoffe, wie Sytox Green®, dagegen
färben keine lebenden Zellen an. Er kann als ungeladenes Molekül die intakte
Zellmembran nicht überwinden. Aus diesem Grund muss die Membran der
anzufärbenden Zellen vorher mit Tensiden wie z.B. Tween 80 oder SDS permeabel
gemacht werden.
Die direkte Bestimmung der Zellzahl unter dem Mikroskop ergibt oft 100-1000-fach
höhere Zellzahlen, als das durch Ausplattieren und Auswertung der Kolonie-bildenden
Einheiten (KBE) der Fall wäre (Johnsen et al., 2001). Ein wichtiger Nachteil ist
allerdings, dass diese Farbstoffe nicht geeignet sind, um zwischen verschiedenen Arten
von Bakterien und zwischen lebenden und toten Zellen zu differenzieren. Im Habitat
Boden kommt noch hinzu, dass die meisten Zellen an Bodenpartikel gebunden vorliegen
und es zu einer unspezifischen Fluoreszenz dieser Partikel kommen kann. Zur
Vermeidung dieses Phänomens müssen die Zellen von den Bodenpartikeln getrennt
werden (Klauth, 2001), wobei die Präparation der Bodenproben das natürliche Gefüge
von Bakterien und Bodenpartikeln zerstört. Ein Kompromiss zwischen der Entfernung
der störenden Bodenpartikel und einer Quantifizierung der Mikroorganismen ist
notwendig. Diese Problematik ist in der Untersuchung ein limitierender Faktor. Hingegen
werden Fluoreszenzfarbstoffe, wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der
Qualle Aequorea victoria in der Molekularbiologie eingesetzt, um Proteinlokalisation und
Genexpression in vivo zu analysieren (Tsien, 1998; Zimmer, 2002). Ein weiterer
Farbstoff „DsRed“, das aus der tropischen Koralle Discosoma sp. isoliert wurde, wird
ebenfalls häufig benutzt (Jacobs et al., 2000). Diese Farbstoffe insbesondere GFP
konnten erfolgreich an eine Vielzahl bakterieller Proteine fusioniert werden. Mittels
solcher Fusionsproteine kann die Lokalisierung und räumliche Dynamik unter nicht
invasiven Bedingungen in lebenden Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet
werden. Des Weiteren werden diese Farbstoffe erfolgreich genutzt, um einen Einblick in
das Ökosystem des Bodens zu bekommen. Da der überwiegende Teil der
Bodenbakterien bis jetzt nicht kultivierbar ist, dienen Fusionsproteine zur gezielten
Analyse der Bakterien im Lebensraum Boden.
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In Versuchen mit Rhizobien ist es gelungen, die Interaktion zwischen Rhizobien und
Pflanze und die initialen Schritte der Nodulation in der Rhizosphäre in vivo zu
beobachten (Gage et al., 1996; Stuurman et al., 2000).
Die Möglichkeit Bakterien, die in der Lage sind Schadstoffe abzubauen in situ zu
beobachten, ist durch Anwendung dieser Fluoreszenzfarbstoffe ebenfalls möglich (Boldt
et al., 2004).
Eine andere Anwendungsmöglichkeit dieser Fluoreszenzfarbstoffe ist die in vivo
Untersuchung des horizontalen Gentransfers (HGT). Unter horizontalem Gentransfer
versteht man die Weitergabe genetischen Materials auch an nicht verwandte Arten über
Konjugation, Transformation und Transduktion. Der horizontale Gentransfer ist von
essentieller Bedeutung für die Entwicklung und Adaption von Bakterien. Eine Vielzahl
bakterieller Gene hat „fremde Vorfahren“, zum Beispiel das nifK Gen von Frankia ssp.
(Dahlberg et al., 1998a). Viele Antibiotikaresistenzen werden von Bakterien durch
horizontalen Gentransfer erworben. Ein Weg der Weitergabe genetischen Materials ist
die Konjugation, die bei Bakterien eine große Rolle spielt. Sie sorgt für die Weitergabe
der genetischen Information von einer Donor- in eine Rezipienten-Zelle. Vor allem
Plasmide werden auf diese Weise übertragen. In der Molekularbiologie hat man sich
diesen natürlichen Prozess zu Eigen gemacht und detektiert einen Plasmidtransfer
durch Wachstum der Rezipientenzellen auf Selektivmedien. Diese Methode benötigt
eine Antibiotikaresistenz auf dem Plasmid. Um horizontalen Gentransfer unter
Freilandbedingungen zu testen, ist dieser Selektionsmarker jedoch nicht erwünscht.
Leider ist die Verbreitung von Antibiotikaresistenzen in natürlichen
Bakterienpopulationen heutzutage eins der größten Probleme, mit dem die moderne
Medizin konfrontiert ist (Battermann, 2002). Ebenfalls stellt die Benutzung von
Antibiotika in der Landwirtschaft ein großes Risiko für die Verbreitung von
Antibiotikaresistenzen dar. Auch wenn die Weitergabe eines Plasmids über
Kultivierungsmethoden generell möglich ist, können Transferereignisse, bei denen das
Plasmid nicht stabil im Rezipienten verbleibt, oder über Rekombination teilweise ins
Genom eingebaut wird, mit der KBE-Methode nicht erfasst werden (Dahlberg et al.,
1998). Außerdem ist eine Detektion des HGT in Bakterien, die bis heute nicht kultivierbar
sind, durch KBE nicht möglich, so dass nach alternativen Detektionsmethoden gesucht
wurde.
Eine Methode zur Detektion von HGT, beruht nicht auf der Kultivierung der Bakterien,
sondern ausschließlich auf visueller Detektion. Diese Methode wurde von Christensen
(1996) entwickelt und in Marinen Ökosystemen erfolgreich eingesetzt (Christensen et al.,
1996; Dahlberg et al., 1998; Sørensen et al., 2003).
Einleitung
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lacI
eGFPplac eGFPplac
Abbildung 1: Donorzelle in der Donorzelle reprimiert der lac-Repressor den lac-Promotor, es wird kein eGFP gebildet lacI: Lac-Repressor, liegt chromosomal integriert vor plac: Lac-Promotor und eGFP liegen Plasmid-kodiert vor
Abbildung 2: Transkonjugand nachdem die Rezipientenzelle das Plasmid aufgenommen hat, wird das eGFP exprimiert, da kein LacI vorhanden ist, die Zellen fluoreszieren
Der Mechanismus basiert auf der Interaktion zwischen Lac-Repressor und Lac-
Promotor. Dazu wird ein konjugatives Plasmid eingesetzt, auf dem die Expression des
eGFP unter Kontrolle des lac-Promotors (plac) steht. Im Donorstamm wird der Lac-
Repressor (lacI) stabil integriert. Der Vorteil dieses Systems ist, dass kein „falsches“
eGFP-Signal aus den Donorzellen detektiert werden kann, da dort aufgrund der
Repression des plac durch lacI keine Expression des eGFP stattfinden kann. Nach der
Mobilisierung des Plasmids in einen Rezipientenstamm, der keinen Repressor trägt,
kann nun die Expression des eGFP erfolgen (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2). Durch
Hinzufügen von Isopropyl-thio-β-D-galactosid (IPTG) kann bei Bedarf ebenfalls die
Expression in Donorzellen induziert werden. Diese Methode eignet sich hervorragend für
die „flow cytometry“, bei der die fluoreszierenden Zellen aussortiert und gezählt werden
(Sørensen et al., 2003).
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A.5 Freisetzung von gentechnisch modifizierten Organismen (GMO) zur Verbesserung der Landwirtschaft – Vorteile und Problematiken
Eine Inokulation mit Rhizobien zur Steigerung von landwirtschaftlichen Erträgen wird seit
vielen Jahren erfolgreich praktiziert. Eine Verbesserung der Rhizobien durch
gentechnische Veränderungen soll die positiven Effekte der Bakterien auf das
Wachstum und die Nährstoffversorgung der Pflanzen weiter steigern. Doch diese
gentechnische Modifizierung (siehe Songlines EU-Projekt) birgt auch Gefahren für die
Umwelt. Folgende Fragen sind deshalb von Interesse.
Sind die GMO in der Lage, im Freiland zu überleben?
Können sie unter Freilandbedingungen mit den schon vorhandenen Rhizobien
konkurrieren?
Welche Effekte haben die GMO auf die einheimischen Lebensgemeinschaften in
der Umwelt?
Werden die veränderten Gene stabil exprimiert, oder gehen sie unter unselektiven
Bedingungen verloren?
Werden die veränderten Gene durch horizontalen Gentransfer weiter verbreitet?
Wie wirkt sich die erhöhte Expression von Indol-3-Essigsäure auf die Pflanzen und
die einheimische Bakterienpopulation der Rhizosphäre aus?
Es ist notwendig diese Fragen zu klären, bevor eine Freisetzung dieser GMO
durchgeführt werden kann. Einige Studien haben sich bereits mit der Problematik der
Freisetzung von GMO beschäftigt. Dabei waren viele Experimente zur Freisetzung von
Rhizobien erfolgreich. Die Kolonisierung der Rhizosphäre und Pflanzenwurzel fand in
zufrieden stellendem Maß statt (van Veen et al., 1997). Allerdings gab es auch einige
Fehlschläge, die vermutlich aus der schnellen Abnahme der aktiven GMO nach der
Einführung in den Boden resultieren (Akkermans, 1994; van Elsass & Heijnen, 1990).
Für jede Inokulation mit GMO ist es nötig, die abiotischen Faktoren, wie die
Zusammensetzung des Bodens, den pH-Wert, die Temperatur, Feuchtigkeit genau zu
analysieren, denn sie geben Ausschlag über das Überleben und die Aktivität des
eingebrachten Bakterienstamms (van Veen et al., 1997). Auch die Art der Bepflanzung
hat einen entscheidenden Effekt auf das Überleben der GMO. So war ein transgener
lacZY markierter P. aureofaciens Stamm in der Rhizosphäre von Weizenpflanzen nicht
in der Lage, bei einer Bodenfeuchte unter zwölf Prozent mit dem WT-Stamm zu
konkurrieren (Tappeser et al., 2000). Bei Maispflanzen hingegen war die
Konkurrenzfähigkeit beider Stämme gleichwertig - unabhängig von der Bodenfeuchte.
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Weitere Experimente mit R. leguminosarum bv. viciae fanden in Rothamsted in
Großbritannien, Dijon in Frankreich und Bayreuth in Deutschland statt und zeigten, mit
Ausnahme der Versuche in Rothamsted, kein Überleben der künstlich eingebrachten
GMO-Stämme nach 3 Monaten bzw. dem ersten Winter. Jedoch konnten in
Experimenten, die in Rothamsted durchgeführt wurden noch nach drei Jahren GMO
nachgewiesen werden. Ein weiteres Experiment mit gentechnisch veränderten
Pseudomonaden zeigte, dass es möglicherweise zu einer Verteilung der GMO in tiefere
Erdschichten kommen kann oder auch zu einer Auswaschung, bei heftigen Regenfällen
(Gillespie et al., 1995; Hekman et al., 1995).
Untersuchungen zum horizontalen Gentransfer der gentechnisch veränderten Stämme
unter Freilandbedingungen zeigten entweder keinen Plasmidtransfer in andere Bakterien
(Hirsch & Sokes, 1994) oder nur sehr geringe Frequenzen, die im Laufe des
Experiments abnahmen (Selbitschka, 2003). Es zeigte sich weiterhin, dass die
Transferfrequenzen innerhalb der Rhizosphäre im Gegensatz zu wurzelfreien Böden,
steigen (Hill & Top, 1998) wobei außerhalb der Rhizosphäre kein Transfer mehr
detektiert werden konnte (Smit & van Elsass, 1990; van Elsass, Nikkel & van Overbeek,
1989). Es können auch konjugative Plasmide aus der einheimischen
Bakterienpopulation in die gentechnisch veränderten Bakterien übertragen werden und
eine Konjugation der nicht transferierbaren gentechnisch veränderten Plasmide aus den
Bakterien bewirken (Tappeser et al., 2000). Doch nicht nur gentechnisch veränderte
Plasmide können mobilisiert werden, auch Transgene, die auf dem Chromosom
lokalisiert sind, werden mobilisiert (Troxler et al., 1997a).
Die möglichen Auswirkungen des gentechnisch veränderten R. leguminosarum Stamms
(Songlines) auf die einheimische Bakterienpopulation sind bisher unklar. Außerdem
kann die Freisetzung von Rhizobien mit verbesserter Stickstofffixierung die
Pflanzenpopulation über eine Erhöhung des Stickstoffgehalts im Boden verändern und
z.B. zur Ansiedlung neuer Unkräuter führen (Tappeser et al., 2000). Es gibt einige
Ergebnisse, die sowohl auf eine Störung der einheimischen Bakterienpopulationen
hinweisen, als auch eine lang anhaltende Reduktion der natürlichen Pilzpopulationen
(Doyle et al., 1991; Glandorf, 1998; Bakker et al., 2002) und Protozoenpopulationen
(Naseby & Lynch, 1998; Lynch et al., 2004).
Neuere Experimente zeigten wiederum keinerlei Einfluss auf die Bakteriengemeinschaft
(Lynch et al., 2004). Dennoch bleibt es zu Bedenken, dass sowohl die bakterielle als
auch die pilzliche Gemeinschaft im Boden ein kompliziertes Geflecht von Interaktionen
darstellt, so dass ein künstlich eingebrachter GMO die vorherrschende Balance
zwischen den einzelnen Arten anhaltend zerstören könnte.
Einleitung
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Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass das Überleben des gentechnisch
veränderten R. leguminosarum bv. viciae VF39 (pRD20) Stamms (Songlines) unter
Freilandbedingungen und seine Konkurrenzfähigkeit mit einheimischen Rhizobien
fraglich ist und die Möglichkeit eines horizontalen Gentransfers darüber hinaus nicht
ausgeschlossen werden kann. Ein möglicher Effekt auf die bakterielle
Rhizosphärengemeinschaft ist ebenfalls ungeklärt. Die verschiedenen Ergebnisse
anderer Studien lassen alle theoretischen Möglichkeiten für den VF39 (pRD20) Stamm,
auf den sich diese Arbeit konzentriert, offen. Um diese Lücke zu füllen ist es wichtig,
diese Punkte vor einer Freisetzung unter Zuhilfenahme moderner Methoden zu klären.
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A.6 Erntesteigerung bei Leguminosen durch bakterielle Phytohormonproduktion - das Songlines EU-Projekt
Das Songlines EU-Projekt „Improving legume yield by bacterial delivery of
phytohormones“ hat die Verbesserung der landwirtschaftlichen Erträge mithilfe von
gentechnisch modifizierten Bakterienstämmen als Zielsetzung. Die verwendeten
Bakterien sollen durch die Synthese des pflanzlichen Hormons Indol-3-Essigsäure (IAA)
insbesondere die Ernteerträge von Leguminosen (Hülsenfrüchtlern) steigern. In vielen
Entwicklungsländern werden Leguminosen als essentielle Bestandteile für die
Ernährung der Bevölkerung benötigt. Allerdings sind die landwirtschaftlichen
Bedingungen für die Kultivierung der Pflanzen in vielen dieser Länder nicht optimal. Der
Boden ist oft sehr nährstoffarm, doch eine Verbesserung des Bodens durch
Kunstdünger ist aus finanziellen Gründen meist nicht möglich.
Deswegen wird als Alternative zur Düngung eine Verbesserung der
Kultivierungsbedingungen durch Zugabe von so genannten „plant growth promoting
bacteria“ erreicht (Nobbe & Hiltner 1896; Elshanshoury, 1995; Tang & Yang, 1997;
Bashan, 1998). Diese Bakterien wie z.B. Azospirillum brasilense und verschiedene
Rhizobienstämme (Vessey et al., 2003) werden entweder unter das Saatgut gemischt
oder direkt auf dem Feld verteilt (Bashan, 1998; Okon & Labandera-Gonzalez, 1994;
Zaman-Allah, 2007). Die Bakterien versorgen die Pflanzen mit zusätzlichem Stickstoff
und führen dadurch zu einer Verbesserung des Wachstums. Ein Beispiel: Der in
Pakistan produzierte „BioPower“ Dünger, bestehend aus einer speziellen
Bakterienmischung, erhöht die Ernteerträge von Leguminosen um 60 - 70% und erspart
gleichzeitig 62 - 288 US $ pro Hektar pro Jahr (Bilal et al., 1993; Malik et al., 2005). Eine
Inokulation von Vicia sativa mit Rhizobium leguminosarum führte in der Türkei unter
Freilandbedingungen zu einer signifikanten Verbesserung der Erträge (Albayrak et al.,
2006).
Die Idee des Songlines EU-Projekts ist es, durch gentechnische Modifizierung von
Rhizobien die Ernteerträge weiter zu verbessern. Diese sollen durch die Produktion des
wachstumsfördernden Pflanzenhormons Indol-3-Essigsäure (IAA) die Entwicklung der
assoziierten Pflanzen stimulieren. Rhizobien produzieren normalerweise geringe
Mengen an IAA, die eine wichtige Rolle während des Nodulationsprozesses spielt.
Durch ein speziell entwickeltes Plasmid, das in die Rhizobien integriert wird, soll eine
zusätzliche IAA-Synthese in den Bakterienzellen stattfinden (US Patent, 20030190754).
Das Plasmid besitzt beide für die IAA-Synthese notwendigen Gene, die für die
Tryptophan-Monooxigenase (iaaM) und die Indolacetamid-Hydrolase (tms2) kodieren.
Das aus Pseudomonas syringae pv. Savstanoi stammende iaaM-Gen wandelt
Einleitung
- 17 -
Tryptophan in Indolacetamid um. Im Anschluss daran wird das Indolacetamid durch die
Indolacetamid-Hydrolase (tms2-Gen), ursprünglich aus Agrobacterium tumefaciens, in
Indol-3-Essigsäure umgewandelt (siehe Abbildung 3).
Abbildung 3: Synthese von Indol-3-Essigsäure
A: Darstellung der Kassette, die für die Synthese von IAA aus Tryptophan verwendet wird.
Das iaaM- und tms2-Gen stehen unter Kontrolle des rolA Promotors; iaaM: Tryptophanmonooxygenase; tms2: Indolacetamid-Hydrolase
B: schematische Darstellung der IAA-Synthese
(Abbildung verändert nach Bartel et al., 2005)
Die beiden Gene stehen unter der Kontrolle des rolA Promotors, ursprünglich aus
Agrobacterium rhizogenes, der besonders in der stationären Wachstumsphase der
Bakterien sowie durch niedrigen pH induziert wird (Pandolfini et al., 2000). Dieser
Promotor ist in der Lage, die Expression der beiden Gene sowohl in den freilebenden
Rhizobien als auch in den Bakteroiden, zu kontrollieren.
Da die IAA-Synthese nicht nur in der Symbiose stattfindet, sondern auch in den
freilebenden Rhizobien, vermutet man, dass auch Nicht-Wirtspflanzen von der
Produktion des Hormons profitieren können. Die als Grundlage des Songlines-EU
Projekts durchgeführten Vorversuche mit Erbsenpflanzen, die mit dem gentechnisch
modifizierten Rhizobium leguminosarum bv. viciae pRD20 Stamm inokuliert wurden,
zeigten eine deutliche Steigerung des Pflanzenwachstums (75% höheres
Trockengewicht der Pflanzen), und eine Ertragssteigerung der Samenproduktion von
50% (Trockengewicht), im Gegensatz zu den mit R. leguminosarum bv. viciae WT
(Wildtyp) inokulierten Pflanzen. In vitro wurde eine zehnfache, in den Wurzelknöllchen
der inokulierten Erbsen eine 80-fache Steigerung der IAA-Synthese durch den
modifizierten R. leguminosarum Stamm im Vergleich zum WT Stamm detektiert.
Weiterhin wurde nachgewiesen, dass in Wurzelknöllchen von Vicia hirsuta die Kapazität
der Stickstofffixierung durch pRD20 tragende Rhizobien stark erhöht wurde (US Patent,
20030190754). Die Ergebnisse dieser Vorversuche für das Songlines EU-Projekt sind
insgesamt sehr viel versprechend, weitere Experimente müssen allerdings noch folgen.
A
prolA iaaM tms2
A
B
Einleitung
- 18 -
B Zielsetzungen
Im Rahmen dieser Arbeit wurden im Wesentlichen zwei Zielsetzungen verfolgt:
B.1 Die Entwicklung eines kultivierungsunabhängigen Detektionssystems für den HGT bei Bodenbakterien
Die erste Zielsetzung gliedert sich in folgende Teile:
1. Etablierung des Detektionssystems Das in der Einleitung vorgestellte System zur Detektion des HGT basierend auf
Bestandteilen des Lac-Operons (plac, lacI) und der kontrollierten Expression von
eGFP in den Transkonjuganden, sollte in Rhizobium leguminosarum bv. viciae
VF39 etabliert werden. Diese Aufgabe beinhaltete:
Die Klonierung und Integration von lacI in den VF39 Stamm
Die Klonierung von eGFP in die zu untersuchenden Plasmide
Die Integration der Plasmide in VF39
Die Untersuchung der Funktionstüchtigkeit des Detektionssystems in VF39
2. Analyse des Gentransfers über KBE In diesem Teil der Arbeit sollte analysiert werden, ob die Möglichkeit eines HGT
des verwendeten Plasmids aus dem VF39 Stamm erfolgen kann. Folgende
Fragestellungen sollten beantwortet werden:
Findet ein HGT statt?
Wenn ja, mit welcher Frequenz findet er statt?
Wenn ja, unter welchen äußeren Bedingungen kann der HGT stattfinden?
3. Analyse des Gentransfers ohne Kultivierung Der HGT wurde in diesem Teil der Arbeit unabhängig von der Kultivierung der
Bakterien auf rein visuelle Detektion hin untersucht. Folgende Fragen wurden
dabei näher untersucht:
Kann der HGT sichtbar gemacht werden?
Welche Einschränkungen in der Detektion des HGT gibt es?
Einleitung
- 19 -
B.2 Die Analyse möglicher Veränderungen innerhalb der Zusammensetzung und Diversität der Bakteriengemeinschaft in Anwesenheit des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms
Neben der Entwicklung des Detektionssystems zur kultivierungsunabhängigen Detektion
von HGT (Zielsetzung 1) wurden die Veränderungen innerhalb der Zusammensetzung
und Diversität der Bakteriengemeinschaft in Anwesenheit des gentechnisch veränderten
Rhizobienstamms analysiert (Zielsetzung 2). Dazu wurden die Rhizosphäre und
Rhizoplane von Erbsenpflanzen in Anwesenheit des VF39 (pRD20) Stamms über
verschiedene Zeiträume untersucht.
Die zweite Zielsetzung gliedert sich in folgende Teile:
1. Analyse eines Effekts der gentechnisch veränderten Rhizobienstämme auf die natürlichen Bakterienpopulationen im Boden
Der Einfluss einer Inokulation mit gentechnisch veränderten VF39-Stämmen, die
das Phytohormon IAA produzieren, auf die bakterielle Gemeinschaft im Boden soll
untersucht werden. Dazu wird durch DGGE und tRFLP die Bakteriengemeinschaft
in der Rhizosphäre und Rhizoplane nach Inokulation mit verschiedenen
transgenen VF39-Stämmen untersucht. Des Weiteren wurden die
Versuchsansätze durch Analyse des DICE Koeffizienten und Shannon-Wiener
Diversitäts Index H’ ausgewertet.
2. Analyse des IAA-Gehalts in der Rhizosphäre der Pflanzen durch GC-MS Die Rhizosphäre der behandelten Versuchspflanzen wird durch GC-MS Analyse
auf einen durch bakterielle Synthese veränderten Gehalt an IAA untersucht.
3. Untersuchung des Pflanzenphänotyps Die inokulierten Pflanzen wurden hinsichtlich phänotypischer Veränderungen, wie
Stängel- und Wurzelwachstum, sowie Knöllchenbildung, ausgelöst durch die
veränderten IAA Konzentrationen in ihrer Umgebung untersucht.
Material und Methoden
- 20 -
C Material und Methoden
C.1 Material
C.1.1 Chemikalien und Enzyme
Die verwendeten Chemikalien wurden in Analysequalität von den Firmen BIO-RAD,
FLUKA, MERCK, Promega, ROTH, SERVA und SIGMA ALDRICH, Hefeextrakt und
Trypton von OXOID, Agar von ICN und ULTRA-CLEAN Agarose von GIBCO-BRL
bezogen.
Alle Restriktionsenzyme und weitere DNA-modifizierende Enzyme inklusive Puffer
stammten von MBI-FERMENTAS und New England Biolabs, Reaktionskits von
BOEHRINGER, Eppendorf, MACHEREY-NAGEL, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH
und QIAGEN (siehe Anhang).
Tabelle 1: weiteres Material
Material Hersteller und Einsatz
GeneRuler™ 1kb DNA Ladder FERMENTAS, Längenstandard und Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen in Agarosegelen
GeneRuler™100 bp DNA Ladder Plus FERMENTAS, Längenstandard
λ-EcoRI/HindIII Dig-Labelled Step Ladder ROCHE, Längenstandard für Southern-Blots
Nitrozellulose-Filter, Type 0,22 µm, 13 mm MILLIPORE, für Kreuzungsexperimente
Vermiculit APERG, Pflanzenanzucht
Folien für DGGE SERVA, GEL-FIX für PAG, 0.18 x 260 x, 204 mm
Qiabrane Nylonmembran für Southern-Blots
Übliche Materialien für molekularbiologische und mikrobiologische Arbeiten sind nicht
aufgeführt.
Material und Methoden
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Tabelle 2: verwendete Kits
Kit Hersteller
NucleoSpin® Plasmid Macherey-Nagel
Nucleo Spin® ExtractII Macherey-Nagel
Invisorb Spin DNA Extraction Kit Invitek
TOPO-TA Cloning® Kit for Sequencing Invitrogen
Dig-Labeling-Kit Roche
Dig-Detection-Kit Roche
Tabelle 3: verwendete Geräte
Gerät Hersteller und Typ
Überkopfschüttler GFL 3040
PCR-Thermocycler: BIOMETRA, TRIO-Thermoblock™ EPPENDORF Mastercycler personal
Kühlzentrifuge: HETTICH, Universal 30RF SORVALL, RC-5B mit SLA-3000 und SS-34 Rotor
Geldokumentationssystem B & L SYSTEMS, Imago compact imaging system
Fluoreszenzmikroskop OLYMPUS BX50F
Waage METTLER Toledo, PB3002-S Delta Range®
Feinwaage SCALTEC, SBA 32
Tischzentrifugen HERMLE Z200 M/H
Vakuumblot-Kammer PHARMACIA, Vacu-Gene XL
CCD-Kamera FUJIFILM
Übliche Geräte für molekularbiologische und mikrobiologische Arbeiten sind nicht
aufgeführt.
Material und Methoden
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C.1.2 Plasmide
Tabelle 4: verwendete Plasmide
Plasmid Genotyp/Eigenschaften Referenz
pBBRIAA pBBR1MCS-5 Derivat, iaaM, tms2, prolA Bulawa, nicht publiziert, RWTH Aachen, 2006
pBBR1MCS-5 broad host range Kloniervektor, lacZα, GmR Kovach et al., 1995
pCR2.1 TOPO lacZα, ApR, KmR Klonier- und Sequenziervektor Invitrogen
pHRdsRedplac pHRGFPGUS-Derivat, dsRed statt GFP/ uidA unter plac diese Arbeit
pHReGFPplac pHRGFPGUS-Derivat, eGFP statt GFP/ uidA unter plac diese Arbeit
pHRGFPGUS Kloniervektor, mob und rep aus pBBR1 uidA und GFP unter Kontrolle des aacC1 Promotors, GmR, KmR
Ramos et al., 2003; Genbank: AY237647
pHRGFPGUSIAA pHRGFPGUS-Derivat, zusätzlich prolA, iaaM und tms2 diese Arbeit
pHReGFPGUSplac pHRGFPGUS-Derivat, plac vor eGFP und uidA anstelle von paacC1
diese Arbeit
pJP2 pTR102-Derivat, ApR, Tc, mob, parDEABC Prell et al., 2002
pJP2neo pJP2-Derivat mit dem nptII-Gen (Neomycinresistenzgen) vor dem uidA.
Saeglitz, nicht publiziert, RWTH Aachen, 2002
pJP2plac pJP2-Derivat mit plac vor dem uidA und universeller Ribosomenbindungsstelle diese Arbeit
pJP5 (PRU1156) Kloniervektor, GFP mut3.1, uidA Karunakaran & Poole, 2004; Genbank: AJ851292
pJP5plac pJP5-Derivat mit plac vor dem eGFP diese Arbeit
pJPdsRedplac pJP2-Derivat mit dsRed statt uidA, plac diese Arbeit
pJPeGFPplac pJP2-Derivat mit eGFP statt uidA, plac diese Arbeit
pJPGFPplac pJP2-Derivat mit GFP+ statt uidA, plac diese Arbeit
pK19gabTgenta1LacI pK19mobgabT-Derivat, mit GmR und lacI im gabT-Gen integriert diese Arbeit
pK19mobgabT lacZα, KmR, mob, gab-Gene Prell et al., 2002
pRD20 pMB393-Derivate, SpecR, CMR Gage et al., 1996
pRD20GFP+plac pRD20-Derivat mit GFP+plac statt iaaM und tms2 diese Arbeit
pRD20dsRedplac pRD20-Derivat mit dsRedplac statt iaaM und tms2 diese Arbeit
pRK2013 ColE1 RK2-Mob+, RK2-Tra+; KmR Helferplasmid für konjugativen Transfer Figurski & Helinski, 1979
pRP4.4 pRP4-Derivate, KmS, Tra+ IncP, ApR, TcR Hedges et al., 1974
pSLE85 pUC19-Derivat, ApR, CmR, GmR Muth et al.,1989
Material und Methoden
- 23 -
C.1.3 Bakterienstämme
Tabelle 5: verwendete Bakterienstämme
Bakterienstamm Herkunft/Referenz Resistenz Temperatur
Agrobacterium tumefaciens Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C
Arthrobacter oxydans Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C
Arthrobacter spec. Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C
Azomonas macrocytogenes DSM Nr. 721 DSMZ, Braunschweig Sm 28°C
Azospirillum brasilense DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), Braunschweig
Nx 28°C
Azotobacter chroococcus Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Nx 28°C
Azotobacter vinelandii Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Nx 28°C
Bacillus subtilis Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C
E. coli DH5α Hanahan, 1983 − 37°C
E. coli S17-1 Simon et al., 1983 − 37°C
E. coli XL1 Blue Stratagene, Heidelberg − 37°C
Gluconobacter oxydans Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C
Herbaspirillum IIIb WT Stammsammlung Bodenökologie Sm 28°C
Klebsiella planticola Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C/37°C
Nocardia rubra Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm, Nx 28°C
Nocardioides simplex Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Nx 28°C
Paracoccus denitrificans Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Nx 28°C
Pseudomonas putida DSM 1693 DSMZ, Braunschweig Nx, Tc, Ap 28°C/37°C
Pseudomonas stutzeri DSM 4166 DSMZ, Braunschweig Nx, Tc, Ap 28°C-37°C
Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841 Johnston-Behringer, 1975 Sm 28°C
Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39 Priefer, 1989 Sm 28°C
Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39 [genta lacI] diese Arbeit Sm, Gm 28°C
Rhizobium tropici CIAT 899 Martinez-Romero et al., 1991 Nx 28°C
Sinorhizobium meliloti 2011 Denarié, Toulouse Sm 28°C
Sphingomonas paucimobilis Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C
Xanthobacter autotrophicus Stammsammlung, Biologie IV, Mikrobiologie Sm 28°C
Material und Methoden
- 24 -
C.1.4 Pflanzenmaterial
Folgende Pflanzen wurden zur Inokulation mit den Bakterienstämmen verwendet:
Erbsen (Pisum sativum cv. Rondo (Consorzio Agrario Parma))
Wicken (Vicia hirsuta)
Luzerne (Medicago sativa)
Material und Methoden
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C.2 Mikrobiologische Methoden
C.2.1 Bakterienkultivierung
Alle verwendeten Bakterienstämme wurden entsprechend in 10 ml LB- bzw. TY-Medium
bei geeigneter Temperatur (siehe Tabelle 5) durch Suspension einer Einzelkolonie im
Reagenzglas auf dem Roller angezogen. Ausgehend von einer Einzelkolonie wurden auf
Festmedium fraktionierte Ausstriche hergestellt und im Brutschrank inkubiert.
LB-Medium Luria-Bertani Broth, nach Sambrook et al., 1989
Substanz Menge [g/l]
Trypton 10
Yeast Extract 5
NaCl 5
Glucose 1
pH 7,2
TY-Medium Tryptone-yeast-extract, nach Beringer, 1974
Substanz Menge [ g/l]
Trypton 5
Yeast Extract 3
CaCl2 0,7
pH 7,5
Zur Herstellung von festen Nährmedien wurden dem jeweiligen Medium 15 g/l Agar
zugesetzt.
Material und Methoden
- 26 -
C.2.2 Herstellung von Glycerinkulturen
Zur dauerhaften Aufbewahrung von Bakterienstämmen wurden so genannte
Glycerinkulturen hergestellt. Dazu wurde eine Einzelkolonie auf einer LB- oder TY-Platte
ausgestrichen und im Brutschrank für 48 h bei entsprechender Temperatur inkubiert.
Dann wurde eine volle Impföse Bakterien in ein Eppendorfgefäß mit einer Mischung aus
0,5 ml entsprechendem Medium und 1 ml 87% (v/v) Glycerin gegeben. Die Lagerung
erfolgte bei –20°C.
Tabelle 6: Antibiotikazusätze für die Nährmedien
Antibiotikum Abkürzung Endkonzentration für E. coli [µg/ ml]
Endkonzentration für Rhizobien [µg/ ml]
Ampicillin Ap 100 -
Spectinomycin Spec 450 450
Nalidixinsäure Nx 20 20
Gentamycin Gm 10 20
Kanamycin Km 25 -
Neomycin Nm - 80
Streptomycin Sm 300 600
Tetracyclin Tc 10 10
Tabelle 7: weitere Zusätze
Substanz Stammlösung Lagerung
X-Gal 40 mg/ ml in N-N-Dimethylformamid –20°C
X-Gluc 40 mg/ ml in N-N-Dimethylformamid –20°C
IPTG 40 mg/ ml in Wasser + 4 – 6°C
Die Endkonzentration der Substanzen betrug im Medium jeweils 40 µg/ ml.
Material und Methoden
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C.2.3 Messung des Bakterientiters
Die Messung der Bakteriendichte (optische Dichte: o.D.) erfolgte in Halbmikroküvetten in
einem Photometer bei einer Wellenlänge von λ = 580 nm. Als Referenz diente
unbeimpftes Medium. Dabei entspricht eine o.D. von 0,1 bei E. coli einem Titer von 2x
107 Zellen/ ml, bei R. leguminosarum 1x 108 Zellen/ ml.
C.2.4 Herstellung kompetenter Zellen
Unter dem Begriff Transformation versteht man die Aufnahme nackter DNA aus der
Umgebung in eine Bakterienzelle. Im Gegensatz zu Arten wie z.B. Bacillus und
Pseudomonas besitzt E. coli keine natürliche Kompetenz um freie DNA aus der
Umgebung aufzunehmen. Allerdings gibt es die Möglichkeit, E. coli durch Behandlung
mit Rubidiumchlorid (RbCl2), Kalziumchlorid (CaCl2) oder durch Elektroporation
kompetent zu machen. Die Herstellung der kompetenten Zellen erfolgte nach dem
Protokoll von Hanahan (1983).
Über Nacht wurden Vorkulturen von E. coli im Reagenzglas bei 37°C inkubiert und am
nächsten Morgen in 250 ml Erlenmyerkolben überimpft (Hauptkultur). Die Hauptkulturen
wurden bis zu einer o.D. 580 von 0,4 bis 0,7 auf einem Schüttler inkubiert. Danach
wurden die Zellen 10 min bei 4000 rpm und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen und das Pellet (Bakterienzellen) vorsichtig in 30 ml eiskalten TfB I-Puffer
resuspendiert. Die Zellen wurden 30 min auf Eis inkubiert, dann wieder bei 4°C
abzentrifugiert Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet vorsichtig in 4 ml
eiskalten TfB II-Puffer resuspendiert. Aliquots von je, 200 µl wurden in Eppendorfgefäße
(auf Eis) pipettiert und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die kompetenten Zellen
wurden bei -80°C gelagert.
Material und Methoden
- 28 -
Tabelle 8 und 9: Zusammensetzung TfBI und TfBII Puffer
TfBI Puffer
Substanzen Menge
RbCl2 10 mM
Mops 10 mM
CaCl2 75 mM
Glycerin 15% (v/v)
pH 6,8
TfBII Puffer
Substanzen Menge
RbCl2 10 mM
Mops 10 mM
CaCl2 75 mM
Glycerin 15% (v/v)
pH 6,8
Alle Substanzen wurden gelöst und der pH–Wert eingestellt. Anschließend wurden die
Puffer steril filtriert und bei 4°C gelagert.
C.2.4.1 Transformation kompetenter E. coli Zellen
Für die Transformation der kompetenten E. coli- Zellen wurde ein Aliquot kompetenter
Zellen auf Eis aufgetaut. Die Zellen wurden vorsichtig mit dem entsprechenden Plasmid
oder Ligationsansatz gemischt und auf Eis inkubiert (30 min). Nach dem Hitzeschock bei
42°C im Wasserbad für circa 1 min wurden die Zellen zurück auf Eis gestellt und 600 µl
LB-Medium zugegeben. Zur Regeneration wurden die Zellen für 30-60 min bei 37°C (auf
dem Roller) inkubiert. Anschließend wurden die transformierten Zellen auf
entsprechende Selektionsplatten ausplattiert und über Nacht. bei 37°C inkubiert.
Material und Methoden
- 29 -
C.2.5 Mobilisierung von Plasmiden aus E. coli nach R. leguminosarum
Um Plasmide über Konjugation aus einem Donorstamm zu mobilisieren, muss dieser mit
dem gewünschten Rezipientenstamm gekreuzt werden. Der Stamm E. coli S17-1 trägt
die Transferfunktionen von RP4 (RK2) im Chromosom integriert (Simon et al., 1983) und
ist somit als Donor zur Konjugation geeignet. Im Folgenden werden das Prinzip sowie
die Durchführung der Filterkreuzung dargestellt.
Der Rhizobien Rezipientenstamm wurde in TY-Medium bis zur stationären Phase
kultiviert. Währenddessen wurde der E. coli S17-1 Stamm mit dem zu mobilisierenden
Plasmid selektiv in LB-Medium bis zur späten log-Phase kultiviert. 0,5 ml der Donorkultur
und 1 ml der Rezipientenkultur wurden gemischt und 1 min bei 12000 rpm
abzentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, das Pellet mit TY-Medium gewaschen
und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde im Rücklauf resuspendiert und auf einen
Nitrocellulose-Filter (Ø 1 cm), der auf einer unselektiven TY-Platte lag, pipettiert. Der
Konjugationsansatz wurde über Nacht bei 28°C inkubiert. Der Filter wurde anschließend
in 1 ml TY-Medium aufgenommen und die Bakterien durch Vortexen resuspendiert. Die
Suspension wurde verdünnt und auf geeignete selektive TY-Platten ausgestrichen.
Diese wurden solange bei 28°C inkubiert, bis Einzelkolonien zu erkennen waren.
Plasmidkonstrukte können auch durch „Übereinanderstreichen“ des Donor- und
Rezipientenstamms auf einer unselektiven TY-Platte und anschließender Inkubation
(über Nacht bei 28°C) mobilisiert werden. Anschließend wird eine Impföse Zellmaterial
auf Selektivmedium vereinzelt. Die Transferfrequenz bei dieser Methode ist deutlich
niedriger als bei einer Filterkreuzung, reicht aber zum einfachen Plasmidtransfer aus, um
genügend Transkonjuganden herzustellen.
Material und Methoden
- 30 -
C.2.6 Analyse der Plasmidstabilität
Da unter normalen Bedingungen sowohl in der Rhizosphäre und Rhizoplane einer
Pflanze, als auch in den Wurzelknöllchen kein Selektionsdruck durch Antibiotika
ausgeübt wird, sollte in diesem Test die Stabilität der einzelnen Plasmide im
Donorstamm R. leguminosarum VF39 ohne Selektionsdruck analysiert werden.
Optimalerweise sollten die Plasmide für die Versuche im Boden auch nach mehreren
Generationen noch im Donorstamm enthalten sein.
Je eine Kolonie R. leguminosarum VF39 (pHReGFPplac), R. leguminosarum VF39
(pBBRIAA) und R. leguminosarum VF39 (pRD20) wurden selektiv in Flüssigmedium
kultiviert. Sobald sie die stationäre Phase erreicht hatten, wurden sie unselektiv in
frisches Flüssigmedium überimpft. Gleichzeitig wurden 100 µl der Bakterienkultur
verdünnt und je sowohl selektiv (Titer der Bakterien mit Plasmid) als auch unselektiv
(Gesamttiter der Bakterien) ausplattiert und analysiert.
Material und Methoden
- 31 -
C.2.7 Horizontaler Gentransfer
Die Versuche zum horizontalen Gentransfer mit R. leguminosarum bv. viciae VF39
[genta lacI] als Donorstamm wurden mit unterschiedlichen Bodenbakterien als
Rezipienten durchgeführt. Dabei wurde analysiert, ob die verschiedenen Plasmide aus
dem Donorstamm (mit und ohne Helfer) in die jeweiligen Rezipientenstämme transferiert
werden können. Als Helfer wurde ein E. coli- Stamm, der das Plasmid RP4-4 oder
pRK2013 trägt, in einem so genannten „triparental mating“ eingesetzt. Der E. coli Stamm
besitzt dazu auf seinem Plasmid die Transferfunktion, die mit der mob-site des zu
mobilisierenden Plasmids interagieren kann. So bewirkt der Helfer dann den Transfer
des Plasmids. Durch selektives Ausplattieren können dann die Rezipientenzellen, die
das Plasmid erhalten haben, ermittelt werden.
C.2.8 Versuche auf Nitrocellulosefiltern
Um horizontalen Gentransfer auf Nitrocellulosefiltern durchzuführen, wurden die
Stämme im Reagenzglas selektiv kultiviert. Dann wurden sie im Verhältnis 2: 1
(Rezipient: Donor) oder 2: 1: 1 (Rezipient: Donor: Helfer) in einem Eppendorfgefäß
gemischt und zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, das Pellet mit TY-Medium
gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde im Rücklauf resuspendiert und auf
einen Nitrocellulose-Filter (Ø 1 cm), der auf einer unselektiven TY-Platte lag, pipettiert.
Der Konjugationsansatz wurde für 24 - 48 h bei 28°C inkubiert. Nach der Inkubation
wurde der Filter in 1 ml TY-Medium aufgenommen und die Bakterien durch Vortexen
resuspendiert. Die Suspension wurde verdünnt und auf geeignete selektive TY-Platten
ausgestrichen. Diese wurden so lange bei 28°C inkubiert, bis Einzelkolonien zu
erkennen waren. Die Transferfrequenz wurde anhand des Rezipienten- und Ereignis-
Titers berechnet.
Material und Methoden
- 32 -
C.2.9 Konjugationsversuche in steriler und unsteriler Erde
Um sich nativen Bedingungen innerhalb des Versuchsaufbaus anzunähern, wurde die
Analyse des horizontalen Gentransfers (HGT) in Ansätzen mit 1g steriler bzw. nativer
Erde durchgeführt. Im Gegensatz zu den Filterkreuzungen ist die Bakteriendichte in der
Erde nicht so konzentriert und die Umgebung, d.h. pH-Wert, Feuchtigkeit,
Nährstoffangebot usw., weniger optimal. Die schon in der nativen Erde vorliegende
einheimische Bakteriengemeinschaft ist ebenfalls ein wichtiger Faktor, der einen
möglichen Gentransfer beeinflussen kann. Deswegen wurden die Versuche sowohl in
sterilisierter, als auch unsteriler Erde durchgeführt.
Je 1 g tyndalisierte Erde oder native Erde wurden in Petrischalen eingewogen. Donor-
und Rezipientenkultur wurden bis zur log-Phase kultiviert. Die Kulturen wurden mit 10%
Glycerinlösung gewaschen um Mediumreste zu entfernen. Dann wurden je 108 – 1010
Zellen in 100 µl 10% Glycerin gelöst und unter die Erde gemischt. Mit dieser
Flüssigkeitsmenge ist die Wasserkapazität im Boden optimal auf 60% eingestellt. Als
Donorstamm diente VF39 [genta lacI], der das pHReGFPplac- oder pHRdsRedplac-
Plasmid trägt. Die Petrischale wurde verschlossen und der Versuchsansatz bei 28°C
inkubiert. Nach 24h und 48h erfolgte die Untersuchung auf Konjugationsereignisse unter
dem Mikroskop. Dazu wurde die Erde mit Natriumpyrophosphat geschüttelt um die
Bakterien von den Erdpartikeln zu lösen. Dann wurde kurz anzentrifugiert, um die
großen Erdklumpen zu sedimentieren. Der Überstand wurde mit Unterdruck auf einen
Nitrocellulosefilter (Ø 2,3 cm) abgesaugt und die Bakterien- Erdschicht konnte unter dem
Mikroskop auf fluoreszierende Transkonjuganden hin untersucht werden. Zusätzlich
wurden die Ansätze auf Selektionsmedien ausplattiert und anschließend die Titer- und
Transferfrequenz bestimmt.
Material und Methoden
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C.2.10 Mikroskopische Detektion von horizontalem Gentransfer
Zur mikroskopischen Detektion des HGT wurden die Zellen nach der Kreuzung auf einen
Nitrocellulosefilter (Ø 2,3 cm) gebracht. Auf die Zellen wurde ein Tropfen Vectashield
Mounting Medium (mit DAPI) für Fluoreszenzmikroskopie gegeben und das Deckglas
aufgelegt. Die Detektion der Zellen erfolgte mit 1000-facher Vergrößerung in Öl
(Mikroskop: Olympus BX50). Zur Detektion der DAPI gefärbten Zellen wurde mit
Anregung im ultravioletten Bereich gearbeitet. Die Detektion der eGFP und dsRed
exprimierenden Zellen erfolgte mit Anregung durch Blaulicht bzw. Grünlicht. Dazu
wurden die folgenden Filter genutzt:
UV-Filter 330- 385 nm, Sperrfilter 425 nm
Blaufilter Anregung von eGFP bei 450- 480 nm, Sperrfilter 515 nm
Emission 509 nm
Grünfilter (Cy3) Anregung von dsRed bei 520 -550 nm
Emission 565 nm
Material und Methoden
- 34 -
C.2.11 Konjugationsversuche auf Schrägagarplatten
Um die Konjugationsfrequenz ausschließlich innerhalb der Rhizosphäre und Rhizoplane
zu testen wurden Medicago sativa Keimlinge in Petrischalen auf Schrägagar gesetzt.
Der Agar besitzt keine C-Quelle, sodass die inokulierten Bakterienstämme als C-Quelle
nur die Wurzelexsudate der Pflanzen nutzen können. So ist gewährleistet, dass die
Bakterien nur in der sehr eng begrenzten Zone, der Rhizoplane und Rhizosphäre der
Wurzeln, wachsen können. Die Pflanzenwurzeln können mikroskopisch auf
Konjugationsereignisse untersucht werden ohne das System zu stören.
Donor- und Rezipientenkultur wurden bis zur log-Phase kultiviert. Dann wurden je 1010 –
1012 Zellen in 100 µl TY-Medium gelöst nacheinander auf die Wurzeln pipettiert. Als
Donorstamm diente VF39 [genta lacI], der das pHReGFPplac oder pHRdsRedplac
Plasmid trägt. Die Petrischale wurde verschlossen und der Versuchsansatz in der
Pflanzenkammer inkubiert. Nach 24h, 48h und 72h erfolgt die Untersuchung auf
Konjugationsereignisse unter dem Mikroskop. Zusätzlich wurden von einigen Ansätzen
die Bakterien aus der Rhizoplane und Rhizosphäre mit einer Impföse aufgenommen, in
ein mit TY-Medium gefülltes Eppendorfgefäß gegeben und zur Bestimmung der Donor-,
Rezipienten- und Ereignis-Titer auf Selektionsmedien ausplattiert.
Verwendete Donorstämme R. leguminosarum bv. viciae VF39 [genta lacI] pHReGFPplac/ pHRdsRedplac
Verwendete Rezipientenstämme R. tropici CIAT 899
S. meliloti 2011
R. leguminosarum bv. viciae VF39
Klebsiella planticola
Pseudomonas stutzeri
Verwendetes Medium Es wurden die NOD A, B, B1, D Lösungen des Pflanzennodulationsmediums verwendet,
wobei anstelle von NOD C eine FeCl3-Lösung. benutzt wurde, da sie im Gegensatz zu
Fe-Citrat nicht als C-Quelle genutzt werden kann. Als N-Quelle wurde 0,05% KNO3-
Lösung. zugegeben.
Material und Methoden
- 35 -
Baum wolldocht
Docht
Falcontube
Spritze
C.2.12 Untersuchung des horizontalen Gentransfers in sterilen Mikrokosmen
Ein weiterer Schritt in der Untersuchung des horizontalen Gentransfers des
pHReGFPplac-Plasmids ist die Analyse in sterilen Mikrokosmen. Diese bestehen aus
sterilisierter Erde, in der eine Erbsenpflanze wächst. Sie wurden mit Donor- und
Rezipientenstamm inokuliert und 4 Wochen in der Pflanzenkammer inkubiert.
Anschließend wurden die Bereiche Rhizoplane, Rhizosphäre und die verbleibende Erde
außerhalb der Rhizosphäre getrennt voneinander auf horizontalen Gentransfers mittels
mikroskopischer Detektion und Untersuchung der Kolonie-bildenden-Einheiten (KBE)
untersucht. Durch die Trennung in drei Bereiche sollte außerdem der Einfluss der
Pflanze auf die Transferfrequenz analysiert werden. Weiterhin wurde durch KBE die
Gesamtzahl der vitalen Donorzellen im Gegensatz zur Gesamtzahl der vitalen
Donorzellen mit Plasmid ermittelt. Dadurch sollte analysiert werden, wie stabil das
Plasmid bei vierwöchigem Wachstum unter den unselektiven Bedingungen im Boden in
den Donorzellen verbleibt.
Aufbau der Mikrokosmen
Abbildung 4: schematischer Aufbau der sterilen Mikrokosmen
Der sterilisierte Baumwolldocht wurde in die
Spitze der 60 ml Spritze geschoben, sodass
der obere Teil in die Erde hineinragte. Dann
wurde die Spritze mit Erde befüllt und
anschließend auf einem mit A. dest. gefüllten
Falcontube fixiert. Die Erde wurde mit
Alufolie abgedeckt und der Mikrokosmos 3 x
im Abstand von 48 h tyndalisiert.
Danach erfolgte das Bepflanzen mit einem
sterilisierten Erbsenkeimling. Eine Woche
nach Bepflanzen erfolgte die Inokulation mit
dem Donorstamm, 1 h später mit dem
Rezipientenstamm. Die Inkubationszeit
betrug vier Wochen.
Material und Methoden
- 36 -
C.3 Pflanzenkultivierung
C.3.1 Samensterilisierung
Zur Sterilisierung wurden die Pflanzensamen von Erbsen, Luzernen und Wicken in ein
steriles Falcongefäß gefüllt und zunächst zweimal kurz mit 96%igem Ethanol
gewaschen. Anschließend wurden die Samen mit konzentrierter Schwefelsäure für 15
min auf einem Schüttler inkubiert. Es folgten drei Waschschritte für jeweils zehn
Minuten. Nach dem Waschen wurden die Pflanzensamen zum Quellen über Nacht in
sterilem A. dest. bei 4°C gelagert. Dann wurden sie zur Sterilitätskontrolle mit einer
sterilen Pinzette aus dem Falcongefäß auf TY-Platten ausgebreitet. Die TY-Platten
wurden bei 28°C gelagert, bis die Samen deutlich gekeimt waren. Dann wurden die
Keimlinge von Erbsen und Luzernen in steriles Vermiculit gepflanzt. Die Wickensamen
wurden auf Schrägagarplatten gelegt.
Für die Rhizosphärenversuche in nativer Erde mussten die Samen nicht sterilisiert
werden. Sie wurden nur über Nacht zum Quellen bei 4°C gelagert und danach zum
Keimen in unsteriles Vermiculit gelegt. Anschließend wurden die Keimlinge in die mit
Erde gefüllten Töpfe eingepflanzt und mit den entsprechenden Bakterienstämmen
inokuliert. Das Pflanzenwachstum fand in einer Klimakammer bei konstanter Temperatur
von 24°C und 16h Belichtung (Langtag) statt.
Für den Versuch IV wurde die Erde im Verhältnis 2: 1 mit Vermiculit gemischt, damit der
Boden locker blieb.
Material und Methoden
- 37 -
C.3.2 Pflanzennodulationsmedium
Tabelle 10: Pflanzennodulationsmedium (nach Rolfe et al., 1980)
Lösungen Menge [g/l] Substanzen
Stammlösung A 294,0 CaCl2 x 2H2O
Stammlösung B 136,0 KH2PO4
Stammlösung B1 58,0 K2HPO4
Stammlösung C 6,7 Fe3-Citrat x 3H2O
Stammlösung D
123,0 87,0 0,333 0,25 0,288 0,10 0,056 0,048
MgSO4 x 7H2O K2SO4 MnSO4 x H2O H3BO3 ZnSO4 x 7H2O CuSO4 x 7H2O CoSO4 Na2MoO4
Die Stammlösungen A, B, B1, C, und D wurden mit A. dest. angesetzt und getrennt
autoklaviert. Zur Herstellung des Nodulationsmediums aus den Stammlösungen wurde
1l autoklaviertes A. dest. mit je 0,5 ml der Lösungen A, B, C, und D sowie 1 ml der
Lösung B1 versetzt.
Material und Methoden
- 38 -
C.3.3 Boden für die Pflanzenkultivierung
Zur Anzucht der Pflanzen wurde Erde von einem lokalen Rekultivierungsfeld bei Jülich
(Tagebau Inden West), NRW, Deutschland verwendet. Der Boden ist verdichtet und hat
nur einen geringen Humus- und Stickstoffgehalt. Um die Eigenschaften des Bodens
nachhaltig zu verbessern, wird dort Luzerne (Medicago sativa) angepflanzt. Nachdem
FAO-Klassifikationssystem handelt es sich um einen Regosol-Boden, d.h. eine
homogene Mischung aus Luvisol und glazialem Löss (Jahnke und Priefer, 2002). Die
oberen 10-15 cm des Bodens wurden abgetragen und im Labor bei 4 °C abgedeckt
gelagert. Vor Gebrauch wurde die nötige Menge bei Zimmertemperatur getrocknet und
anschließend gesiebt (zwei Millimeter). Für die Versuche in der nativen Erde wurden
Pflanztöpfe mit einer Schicht Kieselsteinen als Drainage und darüber ca. 230g Erde
befüllt. Das System wurde über 13mm dicke Baumwolldochte bewässert, deren Enden
sich einmal in der Erde und einmal in einer mit Wasser gefüllten Schale befanden. Durch
die Kapillarkräfte wurde das Wasser aufgesaugt bis die maximale Wasserhaltekapazität
des Bodens erreicht war. Dadurch konnte gewährleistet werden, dass die Ansätze in
allen Töpfen gleich feucht waren.
C.3.4 Eigenschaften des Bodens
Tabelle 11: Bodenparameter
(nach Dumbeck, Rheinisch Westfälische Energiewerke (RWE), 1992)
Parameter Anteil im Boden STABW
Sandfraktion 2-5 %
Schlufffraktion 70-80 %
Tonfraktion 14-17 %
CaCO3 10,4 % (0,7)
pH-Wert 7,5- 8 % (0,0)
Mg 94 µg/g Erde (5)
K2O 58 µg/g Erde (8)
P2O5 20 µg/g Erde (0)
Humusgehalt 0,4- 0,5 %
Gesamtstickstoffgehalt 0,025 % (0)
Gesamtkohlenstoffgehalt 0,24 % (0,04)
Porenvolumen 35 – 52 %
Feldkapazität 22 %
Material und Methoden
- 39 -
C.3.5 Inokulation der Pflanzen
Für die Inokulation wurden die entsprechenden Bakterienstämme in Medium mit
Antibiotika auf einem Roller bis zur späten log-Phase angezogen. Mit Hilfe der Thoma-
Kammer konnte die Zellzahl bestimmt werden. Anschließend wurden die Zellen
zentrifugiert, einmal mit A. dest. gewaschen und bis zu einem Titer von 106 Zellen/ ml
verdünnt. Auf jede zu beimpfende Pflanze wurde 1 ml der Zellkultur pipettiert. Dabei
wurde die Flüssigkeit direkt an der Wurzel in die Erde gespritzt, damit sich die Bakterien
direkt in der Rhizosphäre befinden.
C.3.6 Oberflächensterilisation von Wurzelknöllchen
Die Wurzelknöllchen wurden mit einem Stückchen verbleibender Wurzel in ein
Eppendorfgefäß mit 96% Ethanol gegeben und mehrmals kurz gevortext. Anschließend
wurden sie in einem neuen Gefäß mit 70% Ethanol gevortext. Zuletzt wurden sie
mehrmals mit sterilem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Wurzelknöllchen wurden in
ein Eppendorfgefäß mit TY-Medium gegeben, gevortext und 100 µl davon ausplattiert.
Die Knöllchen wurden anschließend mit einem sterilen Stößel zerdrückt, und je 100 µl
der Suspension auf geeignete Selektivmedien ausplattiert.
Material und Methoden
- 40 -
pk19gabTgenta1lacI8160 bps
2000
4000
6000
8000
Xba I
Nco I
Ecl136II
136IIEcl65IAcc
ISmaHIBam
IXba
dIIIHin
1407IBsp
RVEco
1407IBsp
RVEcoINot
'gabT
gabD'
aph(3`)-IIa
oriTgabR''
gabT''
LacI
aacC1
C.4 Plasmidkonstruktionen
C.4.1 pK19gabTgenta1lacI
Die Konstruktion des Plasmids pK19gabTgenta1lacI dient zur Herstellung der VF39
[genta lacI]-Mutante. Das pk19mobgabT Plasmid (Prell, 2002) besitzt die Sequenz für
das gabT-Operon aus VF39 und dient als Ausgangsbasis für die Klonierung. Die
Gentamycinresistenz wird über HindIII aus pSLE85 ausgeschnitten und in pk19mobgabT
eingefügt. Dazu muss das Plasmid pk19mobgabT erst mit EcoRV geöffnet und
anschließend mit SmaI partiell verdaut werden. Nach Integration der GmR in das Plasmid
wird das aus DH5α amplifizierte lacI-Gen über Bsp1407I integriert. Beide Gene lagen in
der gleichen Orientierung vor wie gabT. Das fertige Plasmid (Abbildung 5 Plasmidkarte)
wird zur Konstruktion der VF39 [genta lacI]-Mutante über homologe Rekombination in
das gabT benutzt.
Abbildung 5: Plasmidkarte pk19gabTgenta1lacI oriT: RP4 „origin of transfer“,
zur konjugativen Mobilisierung;
aacC1: GmR;
aph(3’)-IIa: KmR/NmR;
gabD, gabR, gabT: Gene des gab-Operons;
lacI: Inhibitor des Lactose-Operons
C.4.2 pPJ2plac
Für die Konjugationsversuche wurde ausgehend von pJP2 (Prell, 2002) pPJ2plac
konstruiert (Abbildung 5 Plasmidkarte), das das uidA als Reportergen unter der Kontrolle
des lac-Promotors trägt. Der lac-Promotor wurde aus pUC19 über KpnI/ HindIII
ausgeschnitten und anschließend vor das uidA des pJP2 integriert.
Material und Methoden
- 41 -
pJP2pLac12378 bps
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Eco RI
Pst IBsp 1407I
Bsp 1407I
Eco RV
Eco RV
Xba IEcl 136IIXho IHin dIII
Acc 65IISma
RVEcoINar
INot
INar
trfA
uidA
plac
parCBA
parDEoriT
bla
tetA
tetR
oriV
pJPdsRedplac11286 bps
2000
4000
6000
8000
10000
Eco RI
Pst IBsp 1407I
Nco IXba IEcl 136IIXho IHin dIII
Acc 65I
ISma
RVEcoINar
INot
INar
trfA
dsRed
plac
parCBA
parDE
oriT
bla
tetA
tetR
oriV
pJPeGFPplac11286 bps
2000
4000
6000
8000
10000
Eco RI
Pst IBsp 1407I
Nco IXba IEcl 136IIXho IHin dIII
Acc 65I
ISma
RVEcoINar
INot
INar
trfA
eGFP
plac
parCBA
parDE
oriT
bla
tetA
tetR
oriV
Abbildung 6: Plasmidkarte pJP2plac
trfA: Replikationsstart von RK2;
oriT: Konjugationsstart von RK2;
uidA: ß-Glukuronidase (GUS);
parCBADE: Stabilitätsfunktionen aus RK2;
bla: AmpR; tetA, tetR: TetR
oriV: Replikationsstart aus RK2
Alternativ dazu wurde das Plasmid pJP5plac konstruiert, das zusätzlich zu uidA das
eGFP unter Kontrolle von plac trägt (Abbildung siehe Anhang). Zusätzlich zum uidA
Reportergen unter plac werden pJP-Derivate erstellt, die nur das eGFP oder ein rot
fluoreszierendes Chromophor (dsRed) unter der Kontrolle von plac haben. Dazu wurden
die Gene für eGFP (aus pHRGFPGUS) und dsRed (aus pTRAkt rfp) über PCR
amplifiziert, mit HindIII und PstI geschnitten und in das ebenfalls so geschnittene
pJP2plac ligiert.
C.4.3 pJPeGFPplac und pJPdsRedplac
Abbildung 7: pJPeGFPplac
Abbildung 8: pJPdsRedplac
trfA: Replikationsstart von RK2; oriT: Konjugationsstart von RK2; parCBADE: Stabilitätsfunktionen aus RK2; bla: AmpR; tetA, tetR: TetR; oriV: Replikationsstart aus RK2
Aufgrund der Größe der pJP-Plasmide, die als „low-copy“ Plasmide vorlagen, wurden für
die HGT-Versuche zusätzlich die Plasmide pHRGFPGUS, pHReGFPGUSplac,
Material und Methoden
- 42 -
pHRGFPGUSplac9159 bps
2000
4000
6000
8000
Not I
Not ISpe IBam HI
Nco I
Hin dIII
Nco I
dIIIHinHIBam
INco
ISpe
IKpnIXho
aph(NPTII)
uidA
eGFP
plac
blamob site
pHReGFPplac8114 bps
2000
4000
6000
8000
Pst I
Bsp 1407INco IXba IEcl 136IIXho IHin dIII
Acc 65IXho I
INot
INar
INotIXbaISpe
HIBamIXbaIPst
ISmaINco
IPstINar
INardIIIHin
RIEco
trfA
eGFP
plac
blamob site
aph(NPTII)
pHRdsRedplac8075 bps
2000
4000
6000
8000
Eco RI
Pst I
Xba IEcl 136IIXho IHin dIII
Acc 65IXho I
INot
INar
INotIXbaISpe
HIBamIXbaIPst
ISmaINco
IPstINar
INardIIIHin
trfA
dsRED
plac
blamob site
aph(NPTII)
pHReGFPplac und pHRdsRedplac benutzt. Sie sind ebenso wie pRD20 Derivate des
pBBR-1 Plasmids, wiesen eine höhere Kopienzahl auf und waren kleiner. Das Plasmid
pHReGFPGUSplac wurde durch Verdau von pHRGFPGUS mit KpnI und EcoRI (fill in)
und Integration des placeGFP aus pJP5plac über KpnI und Ecl136II hergestellt. Die
Plasmide pHReGFPplac und pHRdsRedplac wurden aus dem pHReGFPGUSplac
hergestellt in dem das uidA über HindIII entfernt und anschließend das Plasmid religiert
wurde. Nun konnte über ACC65I und EcoRI das placeGFPtrfA bzw. placdsRedtrfA in
das pHR-Plasmid gesetzt werden. Durch Austausch des iaaM- und tms2-Gens in pRD20
gegen placdsRed wurde das Plasmid pRD20dsRed zu Testzwecken konstruiert.
C.4.4 pHR-Plasmide
pRD20dsRedplac7335 bps
1000
2000
30004000
5000
6000
7000
NotI
BclI
BclI
SspI
Ecl136IINotIXbaI
BamHISmaI
PstI
DraI
XbaIEcl136II
XhoIHindIII
Acc65IKpnIEcoRI
DraI
spec
dsRED
pLac
mob site
Abbildung 9: pRD20dsRedplac Abbildung 10: pHReGFPGUSplac
Abbildung 11: pHReGFPplac Abbildung 12: pHRdsRedplac
mob site: Replikations-/Konjugationsstart; spec: SpecR; bla: AmpR; aph(NPTII): KmR/NmR; uidA: ß- Glukuronidase; eGFP; dsRed; trfA: Replikationsstart von RK2; bla: AmpR;
Material und Methoden
- 43 -
C.5 Molekularbiologische Methoden
C.5.1 Isolierung von Plasmid-DNA
Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte über Adsorbtionschromatographie mit dem
Macherey-Nagel NucleoSpin® Plasmid-Kit. Dieses Kit ist sowohl zur Isolierung von
„high-copy“ als auch von „low-copy“ Plasmiden geeignet. Die Durchführung entsprach
den Herstellerangaben.
C.5.2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Bakterien (CTAB-Methode)
Mit der CTAB-Methode nach K. Wilson (in Ausubel et al., 1987) lässt sich sowohl
plasmidäre als auch chromosomale DNA aus Bakterienzellen isolieren. Dazu wurden 1,5
ml einer Bakterienkultur (o.D. 580 = 0,6-0,8) für 2 min bei 13000 rpm abzentrifugiert. Das
Pellet wurde in 567 µl TE-Puffer resuspendiert. Zur Lyse der Zellen wurde eine
Mischung aus 30 µl 10%iger SDS-Lösung und 3 µl Proteinkinase K-Lösung (20 mg/ ml
TE) zugegeben, gründlich gemischt und 1 h bei 37°C inkubiert. Danach wurde 100 µl 5
M NaCl-Lösung zugeben und erneut gründlich gemischt. Dann erfolgte die Zugabe von
80 µl erwärmter CTAB/NaCl-Lösung (10% /0,7M). Nach Mischen der Lösungen wurde
10 min bei 65°C inkubiert. Anschließend wurden 600 µl Phenol/ Chloroform/
Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugeben, gemischt und 10 min bei 13000 rpm zentrifugiert.
Die obere (wässrige) Phase konnte jetzt mit einer Pipette vorsichtig in ein frisches
Eppendorfgefäß überführt werden. Danach wurde 600 µl Chloroform/Isoamylalkohol (49:
1) zugesetzt, gründlich gemischt und 5 min bei 13000rpm zentrifugiert. Zur Fällung der
DNA aus der wässrigen Phase, wurde die obere Phase erneut in ein frisches
Eppendorfgefäß (1,5 ml) überführt, mit 500 µl Isopropanol versetzt und gründlich
gemischt. Dabei wurde die ausfallende DNA sichtbar, die dann 10 min bei 13000 rpm
abzentrifugiert wurde. Der Überstand wurde verworfen und das DNA-Pellet mit 700 µl
Ethanol (70%) gewaschen. Zuletzt wurde nach circa 5-15 min noch einmal zentrifugiert,
das Pellet getrocknet und dann in 100 µl A. dest. (steril) resuspendiert und bei 4°C
gelagert, oder direkt für weitere Analysen verwendet.
Material und Methoden
- 44 -
Lösungen für die CTAB Extraktion
TE-Puffer 10 mM Tris, 1mM EDTA, pH 8, 0
SDS-Lösung (10%) SDS in A. dest. lösen und autoklavieren
Proteinase K-Lösung 20 mg/ ml
CTAB/NaCl-Lösung 10% (w/v) Cethyltrimethylammoniumbromid (CTAB) in 0, 7 M NaCl-Lsg.
Material und Methoden
- 45 -
C.5.3 DNA-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentrationsbestimmung der DNA erfolgte bei 260 nm mittels UV-
Absorptionsspektrometrie. Bei dieser Wellenlänge entspricht eine Absorption von 1,0
einem Gehalt von 50 µg/ ml doppelsträngiger DNA. Es muss allerdings berücksichtigt
werden, dass RNA bei dieser Wellenlänge ebenfalls absorbiert wird und die Menge der
DNA-Konzentration dadurch eventuell nicht ganz richtig abgeschätzt werden kann.
C.5.4 DNA-Spaltung durch Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen bauen DNA durch die Spaltung „innerer“ Phosphodiester-
Bindungen ab. In dieser Arbeit wurden die Typ II Restriktionsendonukleasen verwendet.
Sie schneiden direkt an ihrer 4-8 bp langen palindromischen Erkennungssequenz. Die
hier verwendeten Restriktionsenzyme wurden zur Spaltung der DNA gemäß den
Herstellerangaben eingesetzt.
C.5.5 Agarose-Gelelektrophorese
Diese Methode dient zur Auftrennung von DNA-Molekülen gemäß ihrer Größe. Je höher
die Konzentration des Agarosegels, umso kleinere Fragmente lassen sich auftrennen.
Die Gele wurden je nach gewünschtem Auftrennungsverhalten aus 0,8-1,5% (w/v)
Agarose (in 1x TA Puffer) gegossen, abgekühlt und mit 1x TA Puffer überschichtet. Die
DNA-Proben wurden mit 0,2 Volumen Ladepuffer versetzt und aufgetragen. Die DNA-
Moleküle wurden mittels Elektrophorese aufgetrennt und anschließend in
Ethidiumbromid-Lösung gefärbt. Nach der Entfärbung im Wasserbad erfolgte die
Dokumentation im UV-Durchlicht mit dem ImaGo Compact Imaging System der Firma
B&L System.
Material und Methoden
- 46 -
Tabelle 12: TA-Puffer (50x)
Substanz Menge in g/l
Tris HCl (2M) 242,28
Natriumacetat (500mM) 41,02
EDTA (50mM) 18,61
pH 7,8
C.5.6 Größenabschätzung von DNA-Fragmenten
In dieser Arbeit wurden zur Größenabschätzung die Größenmarker EcoRI/HindIII-
geschnittene λ-DNA, die 1 kb DNA-Leiter und die 100 bp DNAplus-Leiter der Firma
Fermentas verwendet. Zusätzlich wurde für die Southern-Hybridisierung ein DIG-
markierter EcoRI/HindIII-Marker der Firma Roche verwendet.
C.5.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte nach Herstellerangaben
mit dem NucleoSpin® ExtractII-Kit von MACHEREY-NAGEL. Die gewünschten DNA-
Fragmente wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und aufgereinigt. Die Isolierung
der DNA basiert auf Adsorptionschromatographie, bei der die DNA aufgrund von hohen
Salzkonzentrationen und pH-Werten <7,5 an die Silicat-Membran der Spin-Säule bindet.
C.5.8 Auffüllen von Restriktionsenden (fill-in)
Einige Restriktionsendonukleasen schneiden mit so genannten „sticky“ Enden, d.h. sie
produzieren beim Schneiden überhängende Enden. Entstehen 5’-überhängende Enden,
so lassen sich diese mit Hilfe des Klenow-Fragments (große Untereinheit der DNA-
Polymerase I) in Anwesenheit von Nukleotiden „auffüllen“. Diese Reaktion lässt sich
molekularbiologisch auf verschiedene Arten nutzen. Zum einen können durch den
Einsatz von radioaktiv markierten Nukleotiden DNA-Fragmente effektiv markiert werden.
Zum anderen können durch das Auffüllen von „sticky“ Enden Schnittstellen zerstört
werden bzw. „blunt“ Enden erzeugt werden. Die Durchführung erfolgte nach
Herstellerangaben.
Material und Methoden
- 47 -
C.5.9 Dephosphorylierung linearer DNA-Moleküle
Die Abspaltung endständiger 5’-Phosphatgruppen verhinderte die Religation von
linearisierten Vektor-Molekülen. Die Dephosphorylierung wurde direkt nach dem
Restriktionsverdau mit alkalischer Phosphatase aus Kälbermägen (CIAP) im selben
Ansatz durchgeführt. Die Durchführung erfolgte gemäß Herstellerangaben.
C.5.10 Ligation von DNA-Fragmenten
Die durchgeführten Ligationen wurden mit dem Enzym T4-DNA-Ligase durchgeführt.
Das Enzym wird aus E. coli- Bakterien gewonnen, die mit dem Bakteriophagen T4
infiziert sind. Die Eigenschaft dieses Enzyms, Brüche in DNA-Doppelsträngen zu
reparieren, wurde dazu genutzt, verschiedene DNA-Moleküle miteinander zu
verknüpfen. Die Durchführung der Ligationsreaktion erfolgte nach Herstellerangaben.
Material und Methoden
- 48 -
C.5.11 Auftrennung von Plasmidprofilen (Eckhardt Lyse)
Um den Plasmidgehalt in Bakterien festzustellen, wurde innerhalb dieser Arbeit die
Eckhardt-Lyse durchgeführt. Sie erfolgte in den Geltaschen eines Agarosegels durch
Lysozym und SDS. Die anschließende Elektrophorese trennt die Plasmide nach ihrer
Größe auf, während das Bakterienchromosom in der Geltasche zurückbleibt. Die hier
beschriebene Vorgehensweise wurde nach Eckhardt (1978) modifiziert. Dazu wurde ein
0,8 – 1%iges Agarosegel (TB-Puffer) mit 0,2% SDS-Lösung genutzt. Es wurden
abhängig von ihrer optischen Dichte verschiedene Volumina der Bakterienkulturen
zentrifugiert. Das Zellpellet wurde sofort danach auf Eis gestellt und die Zellen in, 20 µl
kalter SRL-Lösung resuspendiert. Die erhaltenen Zellsuspensionen wurden sofort in eine
Tasche des Gels pipettiert. Die Gelelektrophorese wurde gestartet nachdem die
Zellsuspensionen klar waren (circa, 20 min). Die Elektrophorese wurde zunächst in
einem Vorlauf bei, 20 V für, 20-30 Minuten gestartet. Der Hauptlauf erfolgte bei 100-120
V für weitere ein bis drei Stunden. Nach Färbung der Agarosegele mit Ethidiumbromid
erfolgte die Detektion der angefärbten DNA im UV-Licht auf dem Transluminator.
Danach wurde die DNA zum Blotten auf eine Nylonmembran überführt.
Tabelle 13: TB Puffer 5x
Substanz Menge [g/ l]
Tris [90mM] 10,9
EDTA [2,5mM] 0,93
Borsäure [90mM] 5,57
auf pH 8,5 einstellen
SRL-Lösung 25% (w/v) Saccharose und 10% Ficoll in TB-Puffer lösen, direkt vor Gebrauch 40 µl/ ml
RNase und 1 mg/ ml Lysozym zusetzen
Ethidiumbromid-Färbelösung 1 mg/l Ethidiumbromid
Material und Methoden
- 49 -
C.5.12 Vakuumblotting von DNA
Die Übertragung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen auf eine Nylon-Membran
erfolgte mit Hilfe einer Vakuum-Blott-Apparatur. Dazu wurde eine Nylon-Membran auf
geeignete Größe zugeschnitten, auf die poröse Trägerplatte der Apparatur aufgelegt und
mit einer Plastikmaske abgedeckt. Der äußere Rand der Membran (0,5 cm) war dabei
bedeckt. Nach luftblasenfreiem Auflegen des Agarosegels auf die Membran, erfolgte das
Abdichten der Apparatur und das Anlegen des Vakuums (50-80 mbar), welches nur über
das Gel ausgeglichen werden kann. So wurden die DNA-Fragmente aus dem
Agarosegel auf die Nylon-Membran übertragen. Unmittelbar nach Anlegen des Vakuums
wurden folgende Schritte durchgeführt:
C.5.12.1 Depurinierung der DNA
Zur Depurinierung wurde das Gel 15 min mit Depurinierungspuffer überschichtet, wobei
das Bromphenolblau des Markers auf dem Gel von blau nach gelb umgeschlagen ist.
C.5.12.2 Denaturierung der DNA
Nach Entfernen des Depurinierungspuffers erfolgte die Denaturierung der DNA für 15
min durch Überschichten mit Denaturierungslösung. Ein erneuter Farbumschlag des
Indikators nach blau fand statt.
C.5.12.3 Neutralisierung des Gels
Nach Entfernen der Denaturierungslösung folgte für 10 min die Überschichtung mit
Neutralisierungslösung.
Material und Methoden
- 50 -
C.5.12.4 Transfer und Fixierung der DNA
Nach Entfernen der Neutralisierungslösung wurde das Gel für 60 min mit Transferpuffer
überschichtet und die denaturierte DNA auf die Nylonmembran überführt. Nach
Beendigung des Vakuums wurde das Gel entfernt und die an die Nylonmembran
gebundene DNA durch eine fünfminütige UV-Bestrahlung fixiert. Die Membran wurde
entweder einige Tage bei 4°C gelagert oder sofort für die Hybridisierung benutzt.
Lösungen für den Vakuumblott
Depurinierungslösung 0,25 M HCl
Denaturierungslösung 1,5 M NaCl
0,5 M NaOH
Neutralisierungslösung 2,0 M NaCl
1,0 M Tris-HCl auf pH 7,5 eingestellt
Transferpuffer (20 x SSC) 3,0 M NaCl
0,3 M Na3-Citrat
0,3 M mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt
Material und Methoden
- 51 -
C.5.13 Herstellung Digoxigenin-dUTP markierter Sonden
Bei der nicht-radioaktiven Hybridisierung wurden die als Sonden verwendeten DNA-
Fragmente durch Einbau von Digoxigenin-dUTP markiert. Die Herstellung der Sonde
erfolgte in dieser Arbeit mittels PCR und „random priming“. Dazu wurde die Plasmid-
DNA, die den als Sonde gewünschten DNA Bereich enthält, als template in die PCR
Reaktion eingesetzt und mit entsprechenden Primern (lacI forward und lacI reverse)
amplifiziert. Hierbei enthielt der Nukleotidmix DIG-dUTPs (BOEHRINGER), die bei der
Amplifikation anstelle von dTTPs eingebaut werden, sodass das PCR-Produkt markiert
wurde.
C.5.13.1 Sondenherstellung über PCR
Tabelle 14: Sondenherstellung
PCR Ansatz Endkonzentration
10 x PCR Puffer 1x
25 mM MgCl2 1,5 mM
dNTP-Mix für DIG (A,C,G: 1 mM; T: 0,65 mM) A,C,G: 100 µM; T: 65 µM
DIG-dUTP (0,35 mM) 35 µM
Primer (lacI forward) 10 µM 1 µM
Primer (lacI reverse) 10 µM 1 µM
Taq Polymerase (5U/ µl) 2,5 U
DNA-template 1 µl
Gesamtvolumen 25 µl (Auffüllen mit A. dest.)
Tabelle 15: PCR Programm für die Sondenherstellung
PCR Programm Temperatur Dauer
Primärdenaturierung 94°C 5 min
Denaturierung 94°C 45 sec
Annealing 55°C 45 sec 30 Zyklen
Elongation 72°C 1 min
Terminale Elongation 72°C 10 min
Material und Methoden
- 52 -
C.5.13.2 Sondenherstellung über „random priming“
Das zu markierende DNA-Stück (Gentamycin-Resistenzgen) wurde über HincII und NotI
aus dem Plasmid pSLE85 ausgeschnitten. Anschließend wurde das DNA-Stück mit
SauIIIA in kleine Stücke gespalten und denaturiert. Zu der denaturierten DNA wurde ein
Gemisch aus Hexanukleotiden mit zufälliger Sequenz (random priming) und ein
Gemisch aus Deoxynukleotiden (dNTPs) gegeben. Im Allgemeinen binden
Hexanukleotide statistisch verteilt an die einzelsträngige DNA, und das Klenow-
Fragment katalysiert an diesen Primer die Synthese des komplementären Stranges. Die
zugegebene dNTP-Mischung enthielt das DIG-dUTP, das in den neu synthetisierten
Strang alternativ zum dTTP eingebaut wurde. Die so markierte Sonden-DNA wurde
anschließend gereinigt. Die Reaktionen wurden mit dem „Labeling and Detection Kit“ der
Firma Roche durchgeführt.
C.5.13.3 Label-Kontrolle (Dot-Blot)
Die Label-Kontrolle zur Abschätzung der Effektivität der Sonde erfolgte über das
Anfärben von verschiedenen Verdünnungsstufen der Sonde und den Vergleich der
Farbintensität mit der Kontroll-DNA [10ng/ µl]. Es wurden sowohl Verdünnungsreihen
von der Sonden-DNA als auch von der DIG-markierten Kontroll-DNA (aus dem Labeling
und Detection Kit) von 100 – 10-5 angesetzt. Von jeder Verdünnungsstufe wurde je 1 µl
auf eine Nylonmembran pipettiert und durch UV-Bestrahlung an der Membran fixiert. Die
Membran wurde dann in eine Färbeschale überführt und gewaschen (siehe
Waschschritte bei Southern Hybridisierung) Die Farbintensität der Sonden- und der
Kontroll-DNA wurden miteinander verglichen und somit konnte jetzt die Nachweisgrenze
bzw. Effektivität der hergestellten Sonde bestimmt werden.
Material und Methoden
- 53 -
C.5.13.4 Southern Hybridisierung
Zunächst wurde die Nylon-Membran nach dem Vakuumblott durch die Vorhybridisierung
mit proteinhaltigem Blocking-Reagenz gegen unspezifische Bindungen abgesättigt.
Dabei besetzten die darin enthaltenen Proteine die freien Bindungsstellen auf der
Membran, sodass die Sonde nur noch an homologe DNA-Bereiche binden kann.
Anschließend erfolgte die Hybridisierung mit der eigentlichen DNA-Sonde.
C.5.13.5 Vorhybridisierung
Die Nylon-Membran mit der fixierten DNA wurde möglichst luftblasenfrei in einen
Hybridisierungszylinder gerollt, wobei die Seite mit der DNA nach innen zeigte. Es wurde
10 ml der Hybridisierungslösung (ohne Sonde) zugeben und für 1-3 h bei 68°C im
Hybridisierungsofen inkubiert.
C.5.13.6 Hybridisierung
Die markierte DNA-Sonde wurde zuerst zu 10 ml Hybridisierungslösung gegeben und 10
min bei 95 -100°C denaturiert. Die Lösung im Hybridisierungszylinder wurde durch die
Hybridisierungs-/DNA-Sonden-Lösung ersetzt. Anschließend wurde der Filter über Nacht
bei 68°C im Hybridisierungsofen inkubiert. Nach der Hybridisierung wurde die
Hybridisierungs-/DNA-Sonden-Lösung abgegossen und bei –20°C zur
Wiederverwendung gelagert. Die Nylon-Membran wurde 10 min gewaschen (50 ml 2 x
SSC; 0,1% SDS) und nochmals 30 min bei 68°C (in 50 ml 0,1 x SSC; 0,1% SDS) im
Ofen inkubiert, um die unspezifisch gebundene Sonde zu entfernen.
Zusammensetzung der Hybridisierungslösung 5 x SSC
1,00 % (w/v) Blocking-Reagenz (Casein)
0,10 % (w/v) N-Laurosylsarkosin
0,02 % (w/v) SDS
Material und Methoden
- 54 -
C.5.14 Immunologische Nachweisreaktion
Der spezifische Nachweis der DIG-markierten Sonde erfolgte über die Bindung eines
Antikörpers. Das Prinzip dieser Nachweisreaktion basiert darauf, dass der Antikörper
eine kovalent gebundene alkalische Phosphatase trägt, die bei der Reaktion das
Substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat (BCIP) dephosphoryliert und in das
entsprechende Indoxyl überführt. Dieses tautomerisiert zu einem Keton, das unter den
gewählten Detektionsbedingungen zu einem blauen Indigofarbstoff dimerisiert. Zur
Verstärkung der Farbe wurde Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT) zugesetzt, das durch die
freigesetzten Protonen zum purpurfarbenen Diformazan reduziert wurde.
Ablauf der Nachweisreaktion Nach Waschen des Filters wurde dieser für 30 min in 50 ml Puffer 2 inkubiert. Daraufhin
wurde 3 µl Anti-Digoxygenin-AP-Konjugat (BOEHRINGER) zu 10 ml Puffer 2
hinzugeben und der Filter 30 min damit inkubiert. Das ungebundene Antikörper-Konjugat
wurde durch zweimaliges Waschen (15 min) mit je 50 ml Puffer 1 entfernt. Die Nylon-
Membran wurde für zwei Minuten mit, 20 ml Puffer 3 gewaschen und anschließend in
einer Schale mit 5 ml Färblösung (DNA Seite nach unten) im Dunkeln inkubiert, bis die
Banden in der gewünschten Intensität sichtbar waren. Anschließend wurde die
Farbreaktion durch Zugabe von Puffer 4 gestoppt und der Filter zur Dokumentation der
Ergebnisse eingescannt.
Tabelle 16: Lösungen für den Antikörpernachweis
Puffer Zusammensetzung
Waschpuffer 0,3% (w/v) Tween, 20 in Puffer 1
Puffer 1 0,10 M Maleinsäure 0,15 M NaCl mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt
Puffer 2 1% (w/v) Blocking Reagenz in Puffer 1
Puffer 3 0,1 M Tris-HCl 0,1 M NaCl 50,0 mM MgCl2 auf pH 9,5 eingestellt
Puffer 4 10,0 mM Tris-HCl 1,0 mM EDTA
Färbelösung (hochgiftig und lichtempfindlich)
45 µl Nitroblau-Tetrazolium-Lösung (NBT) 35 µl 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat p-Toluidin-Salz (BCIP) in 10 ml Puffer 3 gelöst
Material und Methoden
- 55 -
C.5.15 Extraktion von DNA und RNA aus der Rhizosphäre
Der Einfluss des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms auf die mikrobielle
Gemeinschaft im Boden wurde parallel auf DNA- und auf RNA-Ebene untersucht. Durch
die parallele Extraktionsmethode ist gewährleistet, dass die Ergebnisse beider
Untersuchungen miteinander verglichen werden können. So kann ein möglicher Effekt
auf die in der Rhizosphäre und Rhizoplane der inokulierten Pflanze vorhandenen
Bakterienpopulationen wie auch auf die Aktivität der einzelnen Bakterienarten innerhalb
der Population sichtbar gemacht werden.
Ablauf der Extraktion Die Extraktion basiert auf Protokollen von Bürgmann et al. (2001); Felske et al. (1996);
Griffiths et al. (2000); Sessitsch et al. (2002); Ranjard et al. (2003) und eigenen
Vorversuchen. Zur Durchführung der Extraktion wurden 500 mg Rhizosphäre oder 300
mg Rhizoplane jeweils in eine Bio-101-Säule eingewogen und 1 ml Extraktionspuffer
(60°C) zugegeben. Der Zellaufschluss der Bakterienzellen erfolgte in der Fast Prep für
45 sec bei einer Geschwindigkeit von 5.5 m/s. Anschließend wurden die Proben für fünf
Minuten bei 4°C und 11000 rpm zentrifugiert. Nach diesem Schritt erfolgte die Aufteilung
des Überstands auf zwei Eppendorfgefäße zur getrennten Extraktion der DNA und RNA
aus den Bodenproben. Zum Überstand wurden je 400 µl Phenol/ Chloroform/
Isoamylalkohol (25: 24: 1) zugegeben und je 400 µl Guanidinthiocyanat [4 M]
hinzugefügt, die verhindern, dass die im Boden vorhandenen Huminsäuren die
Isolierung der Nukleinsäuren stören. Zum Schutz der RNA vor Oxidation und zur
Stabilisierung wurde hier zusätzlich 0,1% 8- Hydroxychinolin hinzu gegeben. Die Proben
wurden gevortext und dann für zehn Minuten bei 11000 rpm zentrifugiert. Die wässrige
Phase, in der sich die Nukleinsäuren befinden, wurde vorsichtig in ein frisches
Eppendorfgefäß überführt und 1 Vol. Chloroform/ Isoamylalkohol (24: 1) hinzugefügt. Die
Mischung wurde gevortext und anschließend für fünf Minuten bei 13000 rpm
zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde erneut in ein frisches Eppendorfgefäß gegeben
und die Nukleinsäuren durch Zugabe von 2 Vol. PEG-Lösung ü.N. bei Raumtemperatur
ausgefällt. Die ausgefallene Nukleinsäure wurde für zehn Minuten bei 4°C und 13000
rpm abzentrifugiert, dann mit 3 Vol. eiskaltem Ethanol (70%) gewaschen, erneut für 15
min bei 4°C und 13000 rpm zentrifugiert und bei RT getrocknet. Zum Schluss wurde das
Nukleinsäurepellet in 50 µl RNase-freiem A. dest. gelöst und bei -20°C gelagert.
Material und Methoden
- 56 -
Lösungen für die Extraktion von DNA und RNA
PEG-Lösung 30% Polyethylenglykol (PEG6000) in 1,6 M NaCl-Lsg.
Extraktionspuffer 0,7 M NaCl, 250 mM Dinatriumhydrogenphosphat,
50 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol
und 2% SDS (w/v), pH 8,0; RNase frei
Material und Methoden
- 57 -
C.5.16 Abbau der DNA und reverse Transkription (RT)
Um den Einfluss des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms auf die Aktivität der
einzelnen Bakterien innerhalb der Population zu untersuchen, musste die Gesamt-RNA
zuerst durch reverse Transkriptase (RT) in cDNA umgeschrieben werden. Damit DNA-
Reste die weiteren Analysen der RNA-Probe nicht stören können, wurde vor dem
Umschreiben eine Behandlung mit DNase-I durchgeführt.
Abbau der DNA 10 µl RNA-Lösung [1 µg] wurden mit 1 µl DNase-I Puffer und 1 µl DNase-I
(1U/ µl) gemischt
Inkubation bei 37 °C für 30 min
Hinzufügen von 1 µl EDTA (25 mM) zum Schutz der RNA
Inaktivierung der DNase-I bei 65 C für 10 min
Reverse Transkription Zu 4 µl RNA-Lösung wird ein Mastermix bestehend aus 0,5 µl Primer L-D-
Bact-132a-A-18 [100 pmol/ µl] und 10,25 µl A. dest. gegeben
Inkubation bei 70°C für 5 min
Abkühlen auf Eis
Hinzufügen des Reaktionsmixes bestehend aus 1,25 µl dNTPs [10mM], 1,5
µl MgSO4 [25mM], 1 µl M MLV-RT [200 U/ µl] und 5 µl (5 x) RT-Puffer
Reverse Transkription bei 48 °C für 45 min
Inaktivierung des Enzyms bei 99 °C für 5 min
Die cDNA kann bei -20 ° C gelagert werden
Sequenz des verwendeten L-D-Bact-132a-A-18 Primers [5' – CCG GGT TCC CCC ATT
CGG- 3']
Material und Methoden
- 58 -
C.5.17 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode zur Vervielfältigung eines bestimmten
DNA-Abschnitts. Zu diesem Zweck müssen jedoch die Sequenzen der flankierenden
Bereiche bekannt sein. Die PCR lässt sich in drei Schritte einteilen. Zuerst wird die DNA
denaturiert. Dann hybridisieren die Primer (kurze definierte Oligonukleotide) mit
komplementären Sequenzen der DNA-Matrize (Annealing). Die
Hybridisierungstemperatur wird durch die Sequenz und Länge der Primer bestimmt und
muss einerseits so niedrig gewählt sein, dass es zur Hybridisierung zwischen Primer und
Matrize kommt, und andererseits so hoch, dass sich keine falsch gepaarten Hybride
bilden können. In der anschließenden Elongationsphase heftet die zur Synthese der
DNA-Stränge verwendete DNA-Polymerase neue Nukleotide an das vorhandene freie
3’-OH Ende des Primers und synthetisiert so die Komplementärstränge. Als DNA-
Polymerase verwendet man gewöhnlich die hitzestabile Taq-Polymerase I aus dem
Bakterium Thermus aquaticus Nach diesem Reaktionsschritt folgt erneut die
Denaturierung der DNA, womit ein neuer Zyklus beginnt. In der Regel wählt man 30-35
Zyklen. Je größer die Anzahl der Zyklen, desto mehr PCR-Produkt erhält man, allerdings
ist dabei eine mögliche Erhöhung der Fehlerrate zu beachten. Nach dem letzten Zyklus
folgt die finale Extension. Die Auswertung der PCR erfolgt über Gelelektrophorese.
Material und Methoden
- 59 -
Zusammensetzung PCR Reaktionsansätze Tabelle 17: RedTaq-Ready Mix
Einzelkomponenten Menge in µl End- konzentration
RedTaq-Ready Mix (enthält Taq-Polymerase) 12 1x
Primer forward [10 µM] 1 0,4 µM
Primer reverse [10 µM] 1 0,4 µM
A. dest. 8,5
DNA template 1
Gesamtvolumen 25
Tabelle 18: 16S PCR Mix
Einzelkomponenten Menge in µl End- konzentration
Puffer (10x) 2,5 1x
dNTPs [je 10mM] 0,5 0,4 mM
Primer forward [10 µM] 0,5 0,4 µM
Primer reverse [10 µM] 0,5 0,4 µM
Taq-Polymerase (5U/ µl) 0,5
A. dest. X
DNA template 2-3
Gesamtvolumen 25
Für die DGGE wurden die Primer L1401 [5' – CGG TGT GTA CAA GAC CC- 3'] und
U986-GC [5' – (GC-Klammer)-AAC GCG AAG AAC CTT AC- 3'] nach Felske (1996)
verwendet.
Material und Methoden
- 60 -
Tabelle 19: 16S PCR
PCR Schritt Temperatur Dauer
Primärdenaturierung 94°C 5 min
Denaturierung 94°C 1 min
Annealing 48°C 1 min 30 Zyklen
Elongation 72°C 1 min
Terminale Elongation 72°C 10 min
Material und Methoden
- 61 -
C.5.18 Denaturierende Gradienten Gelelektrophorese (DGGE)
Die Denaturierende-Gradienten-Gel-Elektrophorese (Muyzer et al., 1993) ermöglicht es,
mikrobielle Gemeinschaften aufgrund des unterschiedlichen GC-Gehalts der 16S rRNA-
Gene verschiedener Mikroorganismen aufzutrennen. Dabei werden PCR-Produkte
gleicher Länge, jedoch unterschiedlicher Sequenz, unter denaturierenden Bedingungen
aufgetrennt. Das Grundprinzip beruht darauf, dass eine GC-reiche Sequenz allgemein
stabiler ist als eine AT-reiche Sequenz und daher nicht so schnell denaturiert. Das PCR-
Produkt denaturiert im DGGE-Gel zuerst an den Schmelzdomänen (AT-reichen
Regionen). Die denaturierte DNA läuft aufgrund der veränderten Sekundärstruktur
langsamer in Richtung des positiven Pols als nicht-denaturierte DNA, was zu einer
Auftrennung im Spannungsfeld führt. Damit das PCR-Produkt nicht vollständig
aufschmilzt und vollständig aus dem Gel wandert, wird in der PCR ein Primer mit einer
so genannten GC-Klammer, d. h. einer GC reichen Sequenz von circa 40 bp an einem
Ende angehängt. Zusätzlich zum GC-Gehalt der Sequenz ist die Position der Basen
innerhalb des Fragmentes entscheidend, sodass sich auch bei gleichem GC-Gehalt
Stabilitätsunterschiede ergeben können. Ein großer Vorteil der DGGE-Methode ist, dass
die Banden nach der Elektrophorese aus dem Gel eluiert und sequenziert werden
können.
C.5.18.1 Präparation der Polyacrylamidgele mit Gradienten und Ablauf der DGGE
Zunächst wurde auf die hintere Glasscheibe eine passende Polyester-Folie mit
Acrylatschicht luftblasenfrei mit A. dest. fixiert. Das Polyacrylamidgel wurde mit einem
Gradienten von 30-70% hergestellt. Dazu wurden die Lösungen mit einem
Gradientenmischer und daran angeschlossener peristaltischer Pumpe zwischen die
beiden Glasscheiben gegossen, wo das Gel kovalent an die Acrylatschicht der Folie
binden kann. Nach dem Auspolymerisieren wurden die mit Ladepuffer beschwerten
PCR-Proben und der Marker auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei
60°C und 50 V über einen Zeitraum von 16- 17 h durchgeführt. Nach der Elektrophorese
wurde das DGGE-Gel aus der Kammer genommen und mit Silbernitrat gefärbt. Für die
DGGE wurde das DCode-System der Firma BIORAD verwendet.
Material und Methoden
- 62 -
Reagenzien zur Herstellung des Polyacrylamidgels (6% PAA-Anteil) Tabelle 20: Stammlösungen PAA
Substanz 100% Lsg. 0% Lsg.
TAE-Puffer (50x) 2 ml 2 ml
Acrylamid (40%) 15 ml 15 ml
Harnstoff 42 g
Formamid 40 ml
A. dest. add 100 ml add 100 ml
Die Substanzen für beide PAA-Lösungen wurden in einen, 200 ml Kolben eingewogen
und zum Entgasen für ca. 15 min ins Ultraschallbad gestellt. Zur Herstellung des
Gradienten (70 %) wurden 10,5 ml (100% PAA-Lsg.) und 4,5 ml (0% PAA-Lsg.)
gemischt. Für die Herstellung von 30% wird die umgekehrte Menge genommen. Jeder
Gradient à 15 ml wird in einem Falconröhrchen gemischt und zur Polymerisation mit je
140 µl Ammoniumpersulfat (APS) und 15 µl TEMED versehen. Das Gel wird sofort
gegossen und für 45 – 60 min auspolymerisieren lassen.
Tabelle 21: TAE Puffer 50x
Substanz Menge [g/ l]
Tris [2 M] 242
EDTA [0,05 M] 18,61
Essigsäure [1 M] 60,05
auf pH 8,5 eingestellt
Material und Methoden
- 63 -
C.5.19 Silberfärbung (nach Radojkovica & Kusic, 2000)
Nach der Elektrophorese wird das auf der Folie fixierte Polyacrylamidgel in eine Schale
gelegt und gefärbt. Die Silberfärbung ähnelt in den einzelnen Schritten dem Verfahren
der Entwicklung aus der Fotografie. Zunächst wird die DNA im Gel fixiert. Danach wird
das Gel in einer Silbernitratlösung inkubiert. Die Silberionen lagern sich dabei an die
DNA an, überschüssige Ionen werden beim Waschen des Gels entfernt. Anschließend
erfolgt die Entwicklung durch Zugabe von alkalischer Formaldehydlösung. Die Silber-
Ionen werden nun zu elementarem Silber reduziert und somit die DNA-Banden schwarz
gefärbt.
Die Silberfärbung fand im Dunkeln, bei Raumtemperatur auf einem Schüttler statt.
Zuerst wurde die DNA durch Waschen des Gels mit Lösung A dreimal für je drei Minuten
fixiert. Anschließend erfolgte die Färbung mit Silbernitratlösung (Lösung B) für 10-15
min, danach wurde das Gel mit A. dest. gewaschen um überschüssiges Silber zu
entfernen. Zur Entwicklung wurde das Gel bis zur gewünschten Intensität der Banden
mit Lösung C inkubiert. Zum Schluss wurde die Silberfärbung durch Inkubation mit
Lösung D für fünfzehn Minuten gestoppt. Anschließend wurde das Polyacrylamidgel
vorsichtig abgetrocknet. Es wurde dann in eine Plastikhülle verpackt und im Dunkeln bei
Raumtemperatur aufbewahrt. Tabelle 22: Lösungen für die Silberfärbung
Lösung Funktion Zusammensetzung
A Fixierung 10% Ethanol, 0,5% Essigsäure
B Färbung 0,1% Silbernitrat (AgNO3)
C Entwicklung 1,5% NaOH, 0,01% Natriumborhydrid (NaBH4), 0,15% Formaldehyd (Zugabe direkt vor Gebrauch)
D Stoppen 0,75% Natriumcarbonat (Na2CO3)
Material und Methoden
- 64 -
C.5.19.1 Auswertung der Gele
Die Auswertung der DGGE-Gele erfolgte mit der GelCompar II-Software (Applied
Maths). Durch die Verwendung des DICE Koeffizienten (Dice, 1945; Nei & Li, 1979) und
der „unweighted pair-group method using arithmetic averages“ (UPGMA) wurde die
Ähnlichkeit der Bandenmuster in den einzelnen Versuchsansätzen bestimmt, was eine
vergleichende Aussage über die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft möglich
machte. Die Diversität in der bakteriellen Gemeinschaft der einzelnen Versuchsansätze
wurde durch den Shannon-Wiener Index H’ bestimmt. Dieser Index betrachtet die
Anzahl der Individuen (species richness), die verschiedenen Arten zugeordnet werden,
und ihre relative Abundanz innerhalb dieser Arten (Eveness).
H' = - Σ (n i /N) log (n i/ N)
= - Σ p i (log p i)
Eveness = H' / log s
Dabei ist n: Anzahl der Individuen dieser Art, N: Summe der Individuen und s: Anzahl
der Arten.
Da die Intensität der einzelnen Banden, die auf dem DGGE-Gel aufgetrennt wurden, mit
der Anzahl der Individuen korreliert, wurde innerhalb dieser Arbeit die Intensität jeder
DGGE-Bande einer Probe als n betrachtet. N wurde als die Summe der Intensität jeder
einzelnen Bande innerhalb dieser Probe angenommen. Der Faktor s steht für die Anzahl
der einzelnen Banden innerhalb der jeweiligen Probe.
Material und Methoden
- 65 -
C.5.19.2 Elution der DNA-Fragmente aus dem PAA-Gel
Das PAA-Gel wurde auf einen Leuchttisch gelegt und die ausgewählten Banden mit
einem Skalpell ausgeschnitten, in ein Eppendorfgefäß gegeben und mit 50 µl DNA-
Elutionspuffer versetzt. Die Gelstücke wurden für 3h bei 37°C auf einem Schüttler
inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand in einem neuen Eppendorfgefäß zur
Fällung der DNA mit 2 Vol. Ethanol gemischt und über Nacht bei -20°C inkubiert. Nach
erneuter Zentrifugation für 15 Minuten bei 4°C wurde das DNA-Pellet getrocknet und
danach in 15 µl A. dest. gelöst. Die DNA konnte sofort in die PCR eingesetzt werden.
Tabelle 23: DNA-Elutionspuffer
Substanz Menge
Ammoniumacetat 0,5 mM
Magnesiumacetat 10 mM
EDTA 1 mM
SDS 0,1%
pH 8,0
C.5.20 TOPO-TA-Klonierung®
Mit Hilfe des TOPO-TA® Cloning Kits (Invitrogen) werden PCR-Produkte kloniert. Das
Prinzip dieser Methode beruht auf der Tatsache, dass die Taq-Polymerase eine
terminale Adenosin-Transferase-Aktivität besitzt. Das Enzym produziert 3’-
Desoxyadenosin-Überhänge an den PCR-Produkten, die komplementär zu den 3’-
Desoxythymidin-Überhängen an einem liniearisierten Vektor sind. Die Ligation der
komplementären Enden erfolgte über eine an beiden Enden des Vektors kovalent
gebundene Topoisomerase. Zur Vermehrung des Plasmids wurde dieses in E. coli
transformiert. Die Kolonien mit integriertem PCR-Produkt wurden anschließend weiter
verwendet. Die Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben.
Material und Methoden
- 66 -
C.5.21 Sequenzierung
Für die Sequenzierung wurden PCR-Produkte oder Plasmide nach Herstellerangaben
der jeweiligen Firma (z.B. MWG; 4base-lab) verdünnt, mit den gewünschten Primern
versehen und zur Sequenzierung verschickt. Die erhaltenen Sequenzen wurden
anschließend mit der Software Chromas und BLAST ausgewertet.
C.5.22 Terminaler Restriktions-Fragment Längen Polymorphismus (tRFLP)
Eine weitere Methode mikrobielle Gemeinschaften zu untersuchen ist die tRFLP-
Analyse, die in einigen Versuchsansätzen zusätzlich angewendet wurde. Dabei werden,
im Gegensatz zur DGGE-Analyse, PCR-Produkte unterschiedlicher Länge, jedoch
gleicher Sequenz analysiert. In der PCR wird dazu einer der beiden Primer mit einer
Fluoreszenzmarkierung (FAM) am 5´-Ende versehen. Die PCR-Produkte werden
anschließend durch Behandlung mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen
„fragmentiert“. Das Ausmaß dieser Fragmentierung ist von der Anzahl der vorhandenen
Erkennungsstellen für das entsprechende Enzym in der jeweiligen Sequenz abhängig.
Es entstehen also fluoreszenzmarkierte DNA-Fragmente verschiedener Länge. Diese
werden dann in einem Polyacrylamidgel nach ihrer jeweiligen Länge aufgetrennt und mit
einem Lasersystem detektiert. Aus der Häufigkeit von Fragmenten einer bestimmten
Länge wird dann ein Peak-Muster generiert werden. Dabei entspricht ein Peak im
Idealfall genau einer Bakterienart. Diese Methode ist einerseits durch die
lasersystemgestütze Auswertung sensitiver als die DGGE-Methode und besitzt eine
höhere Reproduzierbarkeit, andererseits kann keine Sequenzierung der vorhandenen
Banden im Polyacrylamidgel und somit keine direkte Identifizierung der Bakterienarten
stattfinden.
Für die tRFLP-Analyse wurde der FAM-gelabelte Primer Bac27for [5' –FAM- GAG TTT
GAT MTG GCT CAG- 3'] und der ungelabelte Bac1378rev [5' – CGG TGTG TAC AGC
CCG GGA ACG- 3'] verwendet.
Material und Methoden
- 67 -
Tabelle 24: 16S PCR Programm für die tRFLP
PCR Programm Temperatur Dauer
Primärdenaturierung 94°C 3 min
Denaturierung 94°C 45 s
Annealing 48°C 1 min 30 Zyklen
Elongation 72°C 1 min
Terminale Elongation 72°C 10 min
Die PCR-Produkte wurden mit dem Invisorb PCRapid-Kit (Invitek) nach Angaben des
Herstellers aufgereinigt und zur tRFLP-Analyse in das Fraunhofer-Institut für
Angewandte Mikrobiologie in Schmallenberg geschickt. Die Auswertung der ermittelten
Rohdaten wurde ebenfalls mit Hilfe der Software GelCompar-II von Applied Maths
durchgeführt.
Material und Methoden
- 68 -
C.6 Analytische Methoden
C.6.1 Quantitative IAA-Messung (nach Glickmann & Dessaux, 1995)
Der Salkowski- Test dient dem quantitativen kolorimetrischen Nachweis von Indol-3-
Essigsäure (IAA) und basiert auf der Oxidationsreaktion von IAA durch eine organische
Säure. In dieser Arbeit wurde der Test dazu benutzt, die von den Bakterien synthetisierte
IAA-Menge zu messen. Die IAA wurde von den Bakterien ins Kulturmedium abgegeben.
Wenn nach Zentrifugation der Bakterienkultur das Salkowski- Reagenz zum Überstand
zugegeben wird, bilden die Eisenionen aus dem Reagenz mit der IAA im Medium pink
gefärbte Komplexe. Je mehr IAA im Medium vorhanden ist, desto kräftiger wird die
Färbung. Der Test wurde nach dem Protokoll von Glickmann und Dessaux (1995)
durchgeführt.
Nach Zentrifugation einer Flüssigkultur wurde der Überstand in ein Eppendorfgefäß
überführt und zwei Volumen Salkowski- Reagenz hinzugegeben. Gleichzeitig wurde eine
Verdünnungsreihe mit verschiedenen IAA-Konzentrationen erstellt und ebenfalls mit
Salkowski- Reagenz versehen. Alle Ansätze wurden bei Raumtemperatur für 30 min im
Dunkeln inkubiert. Danach konnte die Färbung bei einer OD von 540 nm gemessen
werde. Die Konzentration wurde anhand einer Eichgerade, die aus der
Verdünnungsreihe erstellt wurde, ermittelt.
Zusammensetzung des Salkowski- Reagenz 10,8 M H2SO4, 4,5 g/ l FeCl3
Material und Methoden
- 69 -
C.6.2 Gaschromatographie und Massenspektroskopie (GC-MS)
Die IAA-Konzentration in der Rhizosphäre wird durch GC-MS gemessen. Das Prinzip
der GC-MS beruht darauf, dass in der GC das Substanzgemisch aus der Rhizosphäre
mit Hilfe eines inerten Gases (z.B. Helium) als mobile Phase an einer stationären Phase
(Kapillarsäule mit Kieselgel) aufgetrennt wird. Dort verteilen sich die Substanzen
abhängig von ihren chemischen Eigenschaften in der stationären Phase und verlassen
die Säule nach für sie charakteristischen Retentionszeiten. Die Substanzen wurden im
Anschluss an die GC-Analyse massenspektroskopisch analysiert. Aus dem Ergebnis der
GC-MS-Analyse kann IAA sowohl quantitativ als auch qualitativ nachgewiesen werden.
Vorbereitung der Proben für die GC-MS-Analyse Zur Vorbereitung der GC-MS Analyse wurden die Proben durch Derivatisierung in leicht
verdampfbare und thermisch stabile Verbindungen überführt. Dazu wurde die Silylierung
benutzt. Sie diente der Umsetzung von Hydroxyl- und Carboxyl-Gruppen und erhöht die
Flüchtigkeit der Substanz. Pyridin wirkte dabei als Katalysator für die Umsetzung, bei der
sich die molekulare Masse von Indolessigsäure von 175 M auf 319 M erhöhte. In der
spektrometrischen Analyse fand eine Fragmentierung des Moleküls von 319 M zu, 202
M statt. Die Fragmente wurden anschließend ionisiert und die Detektion der
charakteristischen Fragmentionen (m/z 319, 202) der Indolessigsäure erfolgte im Single
Ion Monitoring (SIM) Modus.
Die Rhizosphärenproben wurden in Methanol aufgenommen und für eine Stunde auf
einem Schüttler inkubiert. Danach wurde die Erde abzentrifugiert und der Überstand je in
ein neues Gefäß überführt und getrocknet (ein bis drei Tage). Anschließend wurde das
Gefäß mit Ethylacetat ausgespült und die Flüssigkeit in ein GC-Fläschchen überführt.
Das Ethylacetat wurde ebenfalls getrocknet. Die Silylierung fand durch Zugabe von 30 µl
Pyridin (37°C, 1h) danach 35 µl MSTFA (70°C, 3h) statt. Nach der Silylierung konnte die
Probe zur Analyse in die GC-MS injiziert werden.
Material und Methoden
- 70 -
Tabelle 25: Verwendete Parameter für die GC-MS Analyse
Geräte und Bedingungen Hersteller und weitere Angaben
Gaschromatograph Hewlett-Packard HP 5890 Series III
Mass-Selective Detector Hewlett-Packard HP 5971A
Programm Metprof C (SIM-Mode; Ionen:, 202.00 und 319.00)
Säule
Hewlett-Packard HP-5, 5% Diphenyl-/ 95% Dimethylpolysiloxan 0.25mm (Ø) x 30m (Länge), 0.25µm Schichtdicke entsprechende Vorsäule (retention gap), 5m
Trägergas Helium (0,7 ml/min)
Injektor 250°C (Injection: splitless)
Gradient (Laufzeit: 38,86 min)
Anfangstemperatur: 70°C (5 min) Temperaturanstieg erfolgt mit 7°C/min Endtemperatur: 300°C (1 min) Ende des Laufs und Abkühlen auf 50°C
Material und Methoden
- 71 -
C.7 Statistik
C.7.1 Multidimensionale Skalierung (MDS)
Die Multidimensionale Skalierung (MDS) ist ein exploratives Verfahren, durch das
Ähnlichkeiten oder Unterschiede von Datenpunkten als Distanz im zwei- oder
dreidimensionalen Raum dargestellt werden können. Dabei entspricht die Distanz
zwischen zwei Objekten im Plot der Unähnlichkeit. Die Berechnungen der MDS und
Clusteranalyse basieren direkt auf (Un-) Ähnlichkeitswerten. Im Gegensatz zur
Faktorenanalyse können bei der MDS auch Daten eingesetzt werden, die an wenigen
Versuchspersonen und unter wenigen Grundannahmen erhoben werden.
Ausgehend von einer Proximitätsmatrix kann eine zweidimensionale „Karte“ konstruiert
werden, in der die Proben entsprechend ihrer Ähnlichkeit zueinander angeordnet sind
(Fromin, 2002; Carson, 2007). Die räumliche Distanz zwischen den Proben (dargestellt
als Einträge auf der Karte) entspricht dabei den Ähnlichkeiten nach Bray-Curtis. Dabei
berücksichtigt sie die Relation jedes Gegenstands zu jedem anderen gleich stark. Ein
Vorteil des MDS-Verfahrens liegt darin, dass keine Voraussetzungen für die Daten
bezüglich ihrer Linearität oder Verteilung bestehen müssen (Schmiing, 2005).
Anschließend projiziert die MDS die räumliche Anordnung der Objekte in zwei
Dimensionen und liefert so eine graphische Darstellung der Gesamtähnlichkeiten der
untersuchten Objekte in Form eines Streudiagramms. Je nach der Struktur der Daten ist
die Dimensionsreduktion (von den vielen Dimensionen des multidimensionalen Raums
zu den nur zwei Dimensionen der flächigen Darstellung) mit einem Anpassungsverlust
verbunden, d.h. die Ähnlichkeitswerte-Relationen lassen sich im zweidimensionalen
Raum normalerweise nicht vollständig maßstabsgerecht abbilden. Über die Güte der
Anpassung informieren die beiden Kenngrößen der MDS, Stress und RSQ.
Der Stress stellt ein deskriptives Maß für die Anpassungsgüte der Skalierung dar. Er
kann zwischen 0 bei einer fehlerfreien Umsetzung und 1 bei einer unmöglichen
Umsetzung betragen. Stress-Werte < 0,2 lassen immer noch eine brauchbare
Interpretation zu, während Werte > 0,3 auf eine zufällige Anordnung der Proben in der
Ordination hindeuten (siehe Beispiele zur Datenanalyse, 2001). Weiterhin gibt der Stress
Wert im 3D Raum Aufschluss darüber, ob die Proben zufällig angeordnet sind. Liegt er
unter 0,3 sind die Proben nicht zufällig angeordnet. Der RSQ-Wert (quadrierte
Korrelation zwischen den optimal transformierten Daten und den Distanzen) ist ein Maß
zur Beurteilung der Beibehaltung der proportionalen Differenzen zwischen den Objekten.
Material und Methoden
- 72 -
Auch er liegt zwischen 0 und 1, wobei 1 eine vollständige Erhaltung der Proportionen bei
der graphischen Umsetzung bedeutet. Je kleiner der RSQ-Wert wird, desto stärker ist
die Darstellung verzerrt. Generell gilt: Je kleiner der Stress und je größer der RSQ-Wert,
desto vollständiger und verzerrungsfreier gibt die zweidimensionale Darstellung die
Datenstruktur wider.
Die Proximitätsmatrizen zur MDS wurden mit dem der Ähnlichkeitskoeffizient nach Bray
und Curtis (1957) berechnet. Gegenüber anderen Ähnlichkeitskoeffizienten hat der Bray-
Curtis-Koeffizient den Vorteil, dass die gemeinsame Abwesenheit einer Art auf zwei oder
mehr Platten nicht als Ähnlichkeit gewertet wird (Field & McFarlane, 1968). Allerdings
gewichtet der Koeffizient individuenreiche Arten mehr als seltene (Field et al., 1982). Um
diesen Effekt zu reduzieren wurde die Bray-Curtis Proximitätsmatrix aus den
quadratwurzeltransformierten Werten berechnet.
Zur Durchführung der MDS wurde die XLStat, 2007.7 Software benutzt.
C.7.2 Bivariate Korrelationen – Mantel Test
Der einfache Mantel-Test (Mantel, 1967) besteht darin, den Grad und die Signifikanz der
linearen Korrelation zwischen zwei Proximitätsmatrizen zu testen. Der Korrelationswert
Rm, oder Mantel-r, ist als Verhältnis aus dem Kreuzprodukt der Matrizen und der
Quadratwurzel aus dem Produkt der Summenquadrate der Matrizen definiert.
Korrelationen decken lineare Zusammenhänge zwischen Variablen auf und beschreiben
das Ausmaß des Bezugs quantitativ. Die Daten, mit denen Korrelationen gerechnet
wurden, waren metrisch (z.B. IAA-Konzentration, Shannon-Index) skaliert. Im Folgenden
werden nur diejenigen Zusammenhänge vorgestellt, die einen statistisch abgesicherten
Zusammenhang aufweisen. Als Signifikanzgrenze wurde das 5%-Niveau gewählt.
Korrelation Signifikanz
p < 1% hochsignifikant
p < 0,1% höchstsignifikant
p 5%- 10% Tendenz in Richtung Signifikanz
Um die Korrelation der verschiedenen Matrizen zu berechnen müssen sie erst
linearisiert und anschließend randomisiert werden. Die Anzahl der
Randomisierungsdurchgänge ist frei wählbar. Laut Wasilewski (2003) sind für eine
Material und Methoden
- 73 -
zuverlässige Signifikanzprüfung auf dem 5%-Niveau 1000 oder mehr
Randomisierungsdurchläufe erforderlich, für eine Prüfung auf dem 0,1%-Niveau 5000
Durchgänge. Alle Mantel-Tests der vorliegenden Arbeit wurden zweiseitig und mit 10000
Randomisierungen gerechnet und erlauben daher Signifikanzbewertungen auf dem
höchsten Niveau. Durchgeführt wurde, für alle Matrizen zur Berechnung des Mantel-
Test, die Pearson-Korrelation.
p = Irrtumswahrscheinlichkeit
r = Korrelationskoeffizient
r2 = prozentuale Varianzaufklärung = Bestimmtheitsmaß
Zur Durchführung der Manteltests wurde die XLStat, 2007.7 Software benutzt.
C.7.3 Varianzanalyse
Über die Varianzanalyse (ANOVA, Analysis of Variance) wird der Einfluss eines oder
mehrerer unabhängiger Merkmale (deren Ausprägung) auf ein bzw. mehrere abhängiger
Merkmale geprüft. Es wird von einem Zusammenhang zwischen den Merkmalen
ausgegangen.
Die zweifaktorielle Varianzanalyse untersucht den Einfluss von zwei unabhängigen
Merkmalen auf ein abhängiges Merkmal z.B. Inokulation und Inkubationsdauer auf die
Shannon-Diversität der bakteriellen Gemeinschaft in der Rhizosphäre.
Eine der Hauptanwendungen der ANOVA sind die multiplen Vergleichstests, deren Ziel
es ist herauszufinden, ob die verschiedenen Parameter signifikant verschieden sind oder
nicht. Zum Beispiel im Fall von vier Behandlungen Rhizosphäre, möchten man nicht nur
wissen ob die Behandlungen einen signifikanten Effekt haben, sondern auch, ob die
verschiedenen Behandlungen einen unterschiedlichen Effekt haben. Als multipler
Vergleichstest wurde der Holm Sidak Test benutzt. Er kann die Daten untereinander
sowohl paarweise, als auch gegen eine ausgewählte Kontrollgruppe vergleichen. Die
Analyse erfolgte mit der SigmaStat 3.0 Software, das Signifikanzniveau betrug 0,5%.
Material und Methoden
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C.8 Software
Tabelle 26: Computersoftware zur Auswertung
Programm Verwendung Hersteller/ Internet link
BLAST Internetdatenbank zum Vergleich von Nukleotid- und Proteinsequenzen mit der NCBI-nr Datenbank (Altschul et al.,1997)
www.ncbi.nlm.nih.gov
Chromas Lite 1.51 Darstellung von Chromatogrammen www.technelysium.com.au/chrom
as.html
Clone Manager 5.03
Analyse von Nukeinsäuresequenzen, Planung der Klonierungsstrategie, Identifizierung von ORFs
Scientific & Educational Software, ©, 1995-98
ClustalX Internetdatenbank zum Vergleich von Nukleotidsequenzen www.ebi.ac.uk. clustalx/
Oligonucleotide-Properties Calculator
Bestimmung von Primer-Eigenschaften www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.htm
GelCompar II Version 2.5 Auswertung von DGGE Gelen Applied Maths
Sigmastat 3.0 Statistik-Software Sigmastat
Rhizobase Genomdatenbank für Rhizobien www.kazusa.or.jp.rhizobase/
Treeview 1.6.6 Betrachtung phylogenetischer Bäume http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html
XLStat, 2007.7 (Shareware) Statistik-Software Addinsoft; www.xlstat.com
Zeiss KS 400 V 3.0
Software zur Auswertung von mikroskopischen Bildern Carl Zeiss, Deutschland
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 75 -
D Ergebnisse und Diskussion
D.1 Teil 1 – Die Entwicklung eines kultivierungsunabhängigen Detektionssystems für den HGT bei Bodenbakterien
Innerhalb dieser Arbeit wurde das im Rahmen des Songlines EU-Projekts benutzte
pRD20 Plasmid hinsichtlich seiner Stabilität und der Möglichkeit einer Verbreitung durch
horizontalen Gentransfer (HGT) zwischen verschiedenen Bakterienstämmen vor einer
Freisetzung untersucht. Für diese Analysen wurden Derivate des pHR-Plasmids anstelle
des pRD20 benutzt, da sie im Gegensatz zu pRD20 das eGFP unter Kontrolle des lac-
Promotors tragen, das eine Detektion des HGT möglich macht. Sie basieren außerdem
auf demselben Ursprungsplasmid (pBBR1) und besitzen somit dieselben Eigenschaften.
Die in anderen Detektionsmethoden notwendige Kultivierung der Bakterien schränkt die
Detektion eines HGT sehr stark ein, da ein Transfer in nicht-kultivierbare Bakterien nicht
detektiert werden kann. Die in dieser Arbeit angewandte Methode ist unabhängig von
der Kultivierung und deswegen nicht auf den geringen Anteil der Bakterien, die
kultivierbar sind, beschränkt. Der pHR-Plasmid tragende VF39 Wildtyp-Stamm wies eine
starke Fluoreszenz des eGFP auf. Wie erwartet zeigte der gentechnisch veränderte
VF39 [genta lacI] Stamm dagegen keine Fluoreszenz, da der integrierte lac-Repressor
den lac-Promotor und das unter seiner Kontrolle stehende Plasmid-kodierte eGFP
vollständig unterdrückte (siehe Einleitung). Durch die Zugabe von IPTG konnte ebenfalls
eine starke Fluoreszenz in der VF39 [genta lacI] Mutante hervorgerufen werden und
somit die stabile Expression des eGFP überprüft werden.
D.1.1 Horizontaler Gentransfer auf Nitrocellulosefiltern
Um einen möglichen horizontalen Gentransfer zu untersuchen, wurden zuerst
Kreuzungen verschiedener Donor/ Rezipienten Kombinationen auf Nitrocellulosefiltern
durchgeführt, da angenommen werden kann, dass dort die Zelldichte und der Zell-Zell-
Kontakt der Bakterien optimal ist. Alle Derivate des pHR-Plasmids, z.B.
pHReGFPGUSplac ließen sich aus den Donorstämmen R. leguminosarum VF39 und R.
leguminosarum VF39 [genta lacI] in die ausgewählten Rezipienten konjugieren. Nach
Transfer des pHR-Plasmids aus dem VF39 [genta lacI] Donorstamm in die
Rezipientenstämme konnte die Übertragung des Plasmids sowohl durch die Fluoreszenz
der Transkonjuganden wie auch durch Selektion auf die Plasmid-kodierte
Antibiotikaresistenz nachgewiesen werden. Eine Detektion des eGFP in den
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 76 -
Transkonjuganden war wegen der starken Pigmentierung in einigen Bakterienstämmen,
wie S. paucimobilis und N. rubra, schwierig bzw. nicht möglich. Die Transkonjuganden
konnten aber durch Selektionsplatten und PCR in allen Fällen eindeutig nachgewiesen
werden (Daten nicht gezeigt). Um den Plasmidtransfer nicht ausschließlich durch KBE
sondern mikroskopisch zu detektieren, wurde in einigen Versuchen ein anderes pHR-
Derivat, das dsRed anstelle des eGFP trug, benutzt. Generell akkumuliert dsRed stärker
in den Zellen und ermöglichte somit die Detektion des pHR-Plasmids in einigen Zellen,
in denen das eGFP nicht detektiert werden konnte. Weiterhin wurde die Rhizobien-
spezifische Ribosomenbindungsstelle (TG GAG GAA GAA AAA ATG) vor dem eGFP/
dsRed Gen durch eine allgemeinere Sequenz (TA GGA GGA GGT AAT ATG)
ausgetauscht, um die Expression der Gene in den Transkonjuganden zu verbessern.
Einige Vorversuche wurden mit pHRGFPGUS durchgeführt, das die Gene eGFP und
uidA unter Kontrolle des starken konstitutiven Gentamycin-Promotors besitzt. Da die
Expression des eGFP unter diesem Promotor stärker war, konnte ein Plasmidtransfer
des pHR-Plasmids in S. paucimobilis durch Detektion der Fluoreszenz in den Kolonien
sichtbar gemacht werden, was bei einem Transfer des pHReGFPGUSplac Plasmids
aufgrund der schwächeren Promotoreigenschaften des lac-Promotors nicht möglich war.
Der Transfer des zum Vergleich ausgewählten pJP-Plasmids konnte wiederum nur
durch Zugabe eines Helferstammes, wie E. coli rp4-4 oder E. coli pRK2013 in einem so
genannten „triparental mating“ erreicht werden. Das pJP-Plasmid stammte ursprünglich
von pTR102 ab. Es wurde wegen seiner Stabilität und seinem weiten Wirtsbereich in
Gram-negativen Bakterien verwendet. Es besitzt den oriV, oriT und die par
Stabilitätsfunktionen aus RK2 (Prell, 2003). Diese sorgen für eine hohe Stabilität des
Plasmids in den Bakterien. Zusätzlich scheinen sie dafür verantwortlich zu sein, dass die
Mobilisierung des Plasmids aus dem VF39 oder VF39 [genta lacI] Stamm nicht
durchgeführt werden kann (Troxler et al., 1997). Eine Übersicht der ausgewählten
Konjugationspartner des Rhizobien-Donorstamms R. leguminosarum VF39 ist in
(Abbildung 13) zu sehen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 77 -
Die für die Analyse des HGT ausgewählten Bakterien waren zum großen Teil α-
Proteobakterien und γ-Proteobakterien. Es wurden auch einige Gram-positive
Bakterienstämme ausgewählt, da sie wie die Proteobakterien im Boden und der
Rhizosphäre in großer Anzahl zu finden sind. Die Wahrscheinlichkeit, dass diese
Bakterien im Freiland als Partner für mögliche Interaktionen wie den horizontalen
Gentransfer zur Verfügung stehen, ist sehr hoch, deswegen wurden sie in den
Filterkreuzungen unter optimalen Bedingungen hinsichtlich des horizontalen
Gentransfers als mögliche Rezipienten untersucht.
Abbildung 13: Phylogramm der verwendeten Bakterienstämme
Das Phylogramm der verwendeten Bakterienstämme basiert auf der Homologie der jeweiligen 16S DNA-Sequenzen; die Längenangabe 0.1 entspricht einem Sequenzunterschied von 10%; vollständige Bakteriennamen siehe Abkürzungsverzeichnis
S. paucimobilis
Sphingomonas spec.
N. rubraN. simplex
Arthrobacter spec.
C. glutamicum
B. subtilis
A. oxydans
A. chroococcusA. macrocytogenes
A. caulinodans
X. autotrophicus
R. leguminosarum VF39
S. meliloti 1021
R. tropici CIAT 899P. denitrificans
A. tumefaciens
G. oxydans
A. brasilense
α-Proteobacteria
P. stutzeri
K. planticola
P. putida
γ−Proteobacterien
P. oleovorans
„gram-Positive“
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 78 -
D.1.1.1 Transferfrequenzen für den HGT auf Nitrocellulosefiltern
In fast allen Fällen war es möglich, das pHR-Plasmid aus VF39 [genta lacI] in die
verschiedenen Rezipienten zu mobilisieren. Für einige Stämme wurden exemplarisch
Transferfrequenzen bestimmt (Tabelle 27). Für die übrigen Rezipientenstämme wurden
keine Transferfrequenzen ermittelt, es wurde lediglich mehrfach getestet, ob ein Transfer
stattfand. Die Überprüfung des HGT fand dabei durch Ausplattieren auf entsprechenden
Selektionsmedien und mikroskopische Analyse der Transkonjuganden-Kolonien auf
Expression des eGFP hin statt. Die durch KBE festgestellten Transferfrequenzen des
pHR-Plasmids aus VF39 [genta lacI] in die verschiedenen Rezipienten lagen zwischen
10 – 5 und 10 – 12 (Tabelle 26), abhängig davon, welcher Rezipient benutzt wurde.
Ansätze, in denen zusätzlich der Helferstamm E. coli rp4-4 benutzt wurde, zeigten
keinen Einfluss des Helfers auf die Transferfrequenz des Plasmids. In vielen
Kreuzungsexperimenten wurden Plasmide mit höherer Frequenz zwischen Partnern, die
näher verwandt sind, statt mit entfernter verwandten Bakterienstämmen transferiert
(Ramos-Gonzalez et al., 1991; Nancharaiah et al., 2003). In den durchgeführten
Filterkreuzungen gab es jedoch keinen Hinweis darauf, dass die Verwandtschaft
zwischen dem VF39 [genta lacI] Donorstamm und den einzelnen Rezipienten einen
Einfluss auf die Transferfrequenz hatte. In einige wenige Stämme wie z.B. A.
chroococcus, B. subtilis, C. glutamicum, N. simplex konnte das Plasmid nicht transferiert
werden.
Tabelle 27: Transfer auf Nitrocellulosefiltern
Rezipient Transferfrequenz n
Azospirillum brasilense 10 – 5 – 10 – 6 4
Klebsiella planticola 10 – 7 – 10 – 9 3
Pseudomonas aureofaciens 10 – 7 – 10 – 8 2
Pseudomonas stutzeri 10 – 5 – 10 – 7 5
P. stutzeri ( Helfer) 10 – 6 – 10 – 7 3
S. meliloti 1021 10 – 8 – 10 – 9 4
Sphingomonas paucimobilis 10 – 5 – 10 – 9 5
S. paucimobilis (Helfer) 10 – 7 – 10 – 9 2
Xanthobacter autotrophicus 10 – 8 – 10 – 12 3
n: entspricht der Anzahl der ausgewerteten Versuche;
Transferfrequenz: Wird aus dem Quotient des Transkonjuganden-/
Rezipienten Titer ermittelt; Helfer: E. coli rp4-4
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 79 -
Es sollte beachtet werden, dass einige Bodenbakterien wie Pseudomonas und Klebsiella
eine natürliche Kompetenz besitzen und somit in der Lage sind, freie DNA z.B. aus
zerstörten VF39 [genta lacI] Zellen aufzunehmen. Um auszuschließen, dass das pHR-
Plasmid durch Transformation in diese Bakterien gelangt ist, wurden Inkubationstests
nur mit dem jeweiligen Rezipientenstamm und Plasmid-DNA durchgeführt. Es konnte
jedoch in keinem Versuchsansatz ein Transformant auf den Selektionsmedien wachsen,
daher wurde diese Art der Aufnahme des pHR-Plasmids in den Kreuzungen
ausgeschlossen (Daten nicht gezeigt).
D.1.1.2 Nachweis des Plasmidtransfers mittels „colony-PCR“
In den Filterkreuzungen, die mit Nocardia rubra und R. tropici CIAT 899 als Rezipient
durchgeführt wurden, wuchsen auf den Selektionsmedien für die Transkonjuganden
viele Kolonien, die keine Fluoreszenz zeigten. Die Kolonien dieser „möglichen“ Nocardia
rubra Transkonjuganden zeigten nicht nur keine Fluoreszenz, sondern auch keine
intensive rote Koloniefärbung, wie dies bei Kolonien des Wildtyps der Fall war. Die Farbe
der Kolonien war hell-orange, statt rot. Die Transkonjuganden von R. tropici CIAT 899
waren optisch identisch mit denen des Wildtyps, allerdings fluoreszierte nur ein kleiner
Teil der Kolonien. Zur Überprüfung der N. rubra und R. tropici CIAT 899
Transkonjuganden-Kolonien auf den Erhalt des pHR-Plasmids wurden sie durch PCR
analysiert und gaben ein eindeutig positives Signal auf eGFP. Somit hat ein Transfer des
eGFP tragenden pHR-Plasmids aus VF39 [genta lacI] in N. rubra und R. tropici CIAT
899 stattgefunden (siehe Abbildung 14), obwohl keine Fluoreszenz der Kolonien
erkennbar war. Die Detektion der Grünfluoreszenz des eGFP wurde in N. rubra
vermutlich durch die sehr starke rote Pigmentierung der Kolonien verhindert. Da die
Transkonjuganden-Kolonien von R. tropici CIAT 899 nach Konjugation mit VF39
(pHReGFPplac) grüne Fluoreszenz zeigten, kann vermutet werden, dass zusätzlich zum
pHReGFPplac Plasmid bei den Konjugationen mit VF39 [genta lacI] als Donor das
Megaplasmid pRleVF39b mit integriertem lac-Repressor transferiert wurde.
Die Transferfrequenz von pRleVF39b (10-7) lag in demselben Bereich, wie die für das
pHR-Plasmid ermittelte Frequenz (Hynes et al., 1988). Um dieses Ergebnis zu
bestätigen, wurden die nicht fluoreszierenden Transkonjuganden-Kolonien von
Selektionsplatten mit Neomycin auf Selektionsplatten mit Gentamycin (GmR liegt auf
pRleVF39b) überimpft. Durch Wachstum auf diesen Selektionsmedien, Amplifikation von
eGFP und lacI (Abbildung 14 und 15) und anschließender Eckhardt-Lyse (Abbildung 16)
der Kolonien, wurde bestätigt, dass sie während des Transfers sowohl das pHR-
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 80 -
Plasmid, als auch das Megaplasmid pRleVF39b aus dem Donorstamm VF39 [genta lacI]
erhalten hatten. Deswegen konnte nur bei einem Teil der Transkonjuganden
Fluoreszenz nach Erhalt des pHR-Plasmids detektiert werden. In Abbildung14 sind die
PCR-Produkte zum Nachweis des horizontalen Gentransfers des pHR-Plasmids aus
VF39 [genta lacI] in R. tropici CIAT 899 und N. rubra aufgetragen. Für die Wildtyp
Stämme konnte in keiner PCR ein Produkt nachgewiesen werden.
1a2a3a4a+- 1234+- 56M
Abbildung 14 aufgetragene PCR-Produkte mit eGFP-Primern (Produkt ∼ 750 bp)
1a2a3a4a +- 1234+- 56M
Abbildung 15 aufgetragene PCR-Produkte mit lacI-Primern (Produkt ∼ 1100 bp)
Agarosegel 1%; Größenmarker M: 1kb Leiter;
Spur 1-5: R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden; Spur 2a-4a: N. rubra Transkonjuganden;
Spur 6: R. tropici CIAT 899 WT; Spur 1a: N. rubra WT;
+ Positivkontrolle (pHReGFPplac); - Negativkontrolle (H20)
Die Kolonien 2, 4 und 5 der R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden wuchsen auf
Selektionsmedium mit Neomycin und zeigten unter dem Mikroskop eine starke Grün-
Fluoreszenz. Die Kolonien 1 und 3 wuchsen ebenfalls auf Selektionsmedium mit
Neomycin, zeigte allerdings keine Fluoreszenz. Ein erneutes Ausstreichen auf ein
Selektionsmedium mit Gentamycin und Amplifikation von lacI (Abbildung 15) bestätigte
die Theorie, dass das Megaplasmid pRleVF39b ebenfalls transferiert wurde.
Die Kolonien 2a-4a der N. rubra Transkonjuganden zeigten alle ein eindeutiges Signal
auf eGFP. Sie wuchsen ebenfalls auf den entsprechenden Selektionsmedien. Die
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 81 -
Kolonien 3a und 4a waren zusätzlich positiv für lacI. Dass der Wildtyp N. rubra eindeutig
kein Signal mit den jeweils gewählten Primern in allen PCR-Ansätzen zeigte, gibt Anlass
zu der Vermutung, dass auch in diesem Fall das Megaplasmid aus VF39 [genta lacI] co-
transferiert wurde.
D.1.1.3 Analyse der Plasmidprofile durch Eckhardt-Lyse
Zusätzlich zur Überprüfung des pRleVF39b Megaplasmid Transfers durch PCR wurde
von den einzelnen Konjugationspartnern R. tropici CIAT 899, S. meliloti 1021 und VF39/
VF39 [genta lacI] eine Eckhardt Lyse der Plasmidprofile mit anschließender Southern
Hybridisierung durchgeführt (Abbildung 16). Die Stämme S. meliloti 1021 und R. tropici
CIAT 899 besitzen jeweils 2 Megaplasmide, die sich in ihrer Größe eindeutig von
Plasmiden aus VF39 unterscheiden lassen. In Spur 12 sind die Megaplasmide von S.
meliloti 1021, psym a (1300kb) und psym b (1600kb) dargestellt. In den
Transkonjuganden wurde nach der Filterkreuzung kein zusätzliches Megaplasmid
gefunden, obwohl sie in der Lage waren, auf Gentamycin zu wachsen. Eine Überprüfung
des S. meliloti 1021 Stamms zeigte eine hohe Frequenz spontan auftretender
Gentamycinresistenz. Der R. tropici CIAT 899 WT Stamm trägt zwei Megaplasmide
(200kb und 400kb), die in allen aufgetragenen Kolonien dieses Stammes zu sehen sind
(Spur 1-11). Durch die Eckhardt Lyse konnte wie erwartet bestätigt werden, dass die
Transkonjuganden ein zusätzliches Megaplasmid besaßen (Spur: 1- 4, 8, 9). Es
entsprach in seiner Größe (Spur 3 und 9) eindeutig pRleVF39b. In den anderen Spuren
(1, 2, 4 und 8) war das zusätzliche Megaplasmid deutlich kleiner. In Spur 13 sieht man
das charakteristische Profil der Megaplasmide von R. leguminosarum bv. viciae VF39.
Die Plasmide pRleVF39 a- f (siehe Abbildung 16, von oben nach unten gesehen) haben
die folgenden Größen:
600 kb (pRleVF39f)
495 kb (pRleVF39e)
330 kb (pRleVF39d; Symbiose-Plasmid)
308 kb (pRleVF39c)
240 kb (pRleVF39b)
130 kb (pRleVF39a)
Der gentechnisch veränderte VF39 [genta lacI] Stamm (Spur 14) hatte das kleinste
Plasmid pRleVF39a entweder verloren, oder ein Rekombinationsereignis mit einem der
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 82 -
anderen Megaplasmide führte zu einer Vergrößerung (Zhang et al., 2001). Diese
Veränderung innerhalb des Plasmidprofils hatte keinen Effekt auf die Mobilisierung der
Plasmide (eigene Versuche) oder auf die Konkurrenzfähigkeit, Nodulation oder
Stickstofffixierung. (Hynes et al., 1988)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1110 12 13 14
a
b
dc
e & f
Abbildung 16: Eckhardt-Lyse der R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden
Spur 1-4: R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden; 5 und 11: R. tropici CIAT 899 WT; 6-10 und 14: S. meliloti
1021 WT; 13: VF39 WT, 12: VF39 [genta lacI], a-f: Megaplasmide in VF39
Um eindeutig zu bestätigen, dass die R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden das
pRleVF39b Megaplasmid mit dem integrierten lac-Repressor und der
Gentamycinresistenz trugen, obwohl es nicht in allen Transkonjuganden die gleiche
Größe auf dem Eckhardt Gel zeigte, wurde in einem weiteren Versuch nach einer
Eckhardt Lyse eine Southern Hybridisierung mit zwei spezifischen Sonden, zum einen
lacI und zum anderen Gentamycin durchgeführt (siehe Abbildung 17).
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 83 -
D.1.2 Southern Hybridisierung zum Nachweis des Transfers von pRleVF39b aus VF39 [genta lacI]
1 2 3 4 5 6 7 8 M1 2 3 4 5 6 7 8 M1 2 3 4 5 6 7 8
A B C
M
10 kb
8 kb
6 kb
Abbildung 17 A-C: Eckhardt Lyse mit anschließender Southern Hybridisierung
A: Eckhardt Gel; B: Southern Hybridisierung lacI Sonde; C: Southern Hybridisierung GmR Sonde
Nr.5-8: R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden; Nr.4: R. tropici CIAT 899 WT;
Nr.3: S. meliloti 1021 Transkonjugand;
Nr.2: VF39 [genta lacI]; Nr.1: VF39 WT; M: Größenmarker 1kb DNA-Leiter; zu sehen sind die drei größten Banden: 10kb, 8kb und 6 kb
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 84 -
In Abbildung 17 ist eine Eckhardt-Lyse (17a) mit anschließender Southern
Hybridisierung dargestellt. Erwartungsgemäß hybridisierte im VF39 WT keine Bande mit
einer der Sonden. Im VF39 [genta lacI] Stamm hybridisierte die pRleVF39b Bande
sowohl mit der lacI-, als auch der Gentamycin-Sonde. Der spontan resistente S. meliloti
1021 Transkonjugand hybridisierte mit keiner der Sonden. Der R. tropici CIAT 899 WT
Stamm (Spur 4) und der fluoreszierende Transkonjugand (Spur 6) besaßen kein
zusätzliches Megaplasmid und hybridisierten deswegen ebenfalls mit keiner Sonde. Die
nicht fluoreszierenden R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden (Spur: 5, 7 und 8) besaßen
ein zusätzliches Megaplasmid unterschiedlicher Größe. Da alle zusätzlichen
Megaplasmide in R. tropici CIAT 899 sowohl mit der lacI-Sonde, als auch der
Gentamycin-Sonde hybridisieren konnten, wurde die Vermutung, dass es sich um
pRleVF39b handelt, eindeutig bestätigt. Rekombinationsereignisse des Megaplasmids
könnten zum Verlust eines Teils des Plasmids geführt haben, was die unterschiedliche
Größe erklären würde. Ein Transfer oder Co-Transfer des Megaplasmids pRleVF39b
konnte ebenfalls in anderen Bakterienstämmen wie Xanthobacter autotrophicus,
Azomonas macrocytogenes, Azospirillum brasilense nachgewiesen werden. Die
Kolonien zeigten keine Fluoreszenz. Das Auftreten der Gentamycinresistenz nach der
Kreuzung mit VF39 [genta lacI] und ein positives PCR-Signal mit lacI Primern bestätigte
aber den Erhalt des Megaplasmids. Eine Eckhardt-Lyse dieser Stämme war aus
technischen Gründen nicht möglich. Ein Transfer des Megaplasmids nach S. meliloti
1021 konnte nicht nachgewiesen werden.
D.1.3 Horizontaler Gentransfer in sterilem und unsterilem Boden
Da die Filterkreuzungen unter optimalen Bedingungen hinsichtlich der
Nährstoffversorgung und des Zellkontakts durchgeführt wurden, bleibt zu untersuchen,
ob es im natürlichen Boden auch zu einem Plasmidtransfer kommen kann. Um die
Möglichkeit eines horizontalen Gentransfers unter Bedingungen zu analysieren, die dem
natürlichen Lebensraum der Bakterien im Boden näher kommen, wurden die
Kreuzungspartner in Mikrokosmen aus sterilisiertem und unsterilem Boden inkubiert und
auf mögliche Transferereignisse des pHR-Plasmid analysiert. Der Vorteil dieser
Mikrokosmen ist die Kontrolle über die abiotischen Faktoren wie z.B. die Temperatur und
die Feuchtigkeit des Bodens, die das System stark beeinflussen können. Im Allgemeinen
sind Experimente in solchen Mikrokosmen ein weiterer Schritt auf dem Weg zum
möglichen Freilandversuch (Hill & Top, 1998).
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 85 -
Für diese weiterführenden Versuche im Boden wurden 7 verschiedene Rezipienten
ausgewählt (siehe Tabelle 28), da sie aufgrund der gut detektierbaren Fluoreszenz nach
Erhalt des pHReGFPplac Plasmids und des eindeutig zu identifizierenden Phänotyps
der Kolonien eindeutig zu detektieren sind.
Tabelle 28: HGT in sterilem und unsterilem Boden
Stamm Transferfrequenz (steriler Boden) n Transferfrequenz
(unsteriler Boden) n
Azomonas macrocytogenes 10 – 9 – 10 – 14 5 10 – 11 – 10 – 13 3
Azospirillum brasilense 10 – 9 – 10 – 11 3 -
Klebsiella planticola 10 – 10 – 10 – 13 5 10 – 10– 10 – 11 2
Pseudomonas aureofaciens 10 – 10 – 10 – 12 2 -
Pseudomonas stutzeri n.d. 10 – 10– 10 – 13 2
R. tropici CIAT 899 10 – 11 – 10 – 13 3 -
Sinorhizobium meliloti 1021 10 – 11 – 10 – 14 5 -
Xanthobacter autotrophicus 10 – 8 – 10 – 11 4 10 – 10 2
n: Anzahl der ausgewerteten Versuche;
Transferfrequenz: Transkonjuganden/ Rezipienten Titer;
n.d.: nicht bestimmt
Die Transferfrequenzen für das pHR-Plasmid waren in sterilisiertem und unsterilem
Boden kleiner (siehe Tabelle 28) als bei den Filterkreuzungen. In der Erde war die
Dichte der Bakterien reduziert, teilweise hefteten sich die Zellen an Bodenpartikel, was
den Zellkontakt und damit auch den Transfer beeinträchtigte. Die Transferfrequenzen in
sterilisiertem Boden lagen in ihrem Bereich zum Teil höher, als die in unsterilem Boden.
Zwar war das Nährstoffangebot in sterilisiertem Boden geringer als auf den Platten für
die Filterkreuzungen, jedoch höher als in unsterilem Boden. Dies ist darauf
zurückzuführen, dass durch das Tyndallisieren des Bodens die einheimischen
Mikroorganismen abgetötet wurden und als Nährstoffquelle zur Verfügung standen.
Nachdem für die ausgewählten Bakterienstämme ein horizontaler Gentransfer durch
KBE in sterilisiertem Boden bestätigt werden konnte, wurde analysiert, in welchem
Zeitraum dieses Ereignis stattfand. Einige Versuchsansätze (mit VF39 [genta lacI] als
Donor und A. brasilense, A. macrocytogenes, S. meliloti 1021, K. planticola, und P.
aureofaciens jeweils als Rezipienten) wurden nach der Inokulation unterschiedlich lange
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 86 -
inkubiert. Schon nach 24h konnte bei einigen Ansätzen durch Ausplattierung auf
Selektionsmedien ein Transfer-Ereignis festgestellt werden. Nach 48h wurde das
Transfer-Ereignis bei allen Ansätzen eindeutig festgestellt. Die Frequenz des Transfers
veränderte sich bei längerer Inkubationsdauer kaum. Der horizontale Gentransfer
scheint also in den ersten 48h stattzufinden (Daten nicht gezeigt).
Die ermittelten Transferfrequenzen in unsterilem Boden sind ebenfalls geringer als bei
den Filterkreuzungen. Der unsterile Boden bietet nur eine sehr begrenzte Menge an
Nährstoffen, um die sowohl die einheimischen Mikroorganismen, als auch die
hinzugefügten Konjugationspartner konkurrieren müssen. Weitere Faktoren, wie der pH-
Wert, die Temperatur, der Wassergehalt des Bodens und die Konkurrenz um
Lebensraum und Nährstoffe führten zu Stressbedingungen für die Bakterien. Es darf
angenommen werden, dass dies den Eintritt in eine physiologische Ruhephase
verursachte. Das wiederum führte zu einer starken Beeinträchtigung der
Transferfrequenzen im Boden. Bei einigen Stämmen konnte durch Ausplattieren auf den
Selektivmedien keinerlei Transferereignis mehr detektiert werden.
Ein weiterer Faktor, der die Transferfrequenzen im Boden beeinträchtigte, ist die
Extraktion der Bakterien aus dem Boden, bei der es möglicherweise zu Verlusten
kommen kann. Diese beeinflussen aufgrund ihrer Größenordnung eher den Ereignis-
Titer, der relativ gering war, als den Rezipiententiter, der um ein Vielfaches größer war.
Des Weiteren ist ein horizontaler Gentransfer nach dem Ausplattieren auf den
Selektivmedien bei besseren Nährstoffbedingungen nicht ausgeschlossen (Walter et al.,
1991). In unsterilem Boden kam es in vielen Versuchen zu einer starken Abnahme des
Donor- und Rezipiententiters, der die Frequenz des HGT nachhaltig beeinträchtigt hat.
Innerhalb kurzer Zeit wurden die zusätzlich inokulierten Bakterien von den
einheimischen Bakterienpopulationen vollständig verdrängt, da diese wahrscheinlich
besser an die Lebensbedingungen im Boden angepasst waren (Wellington, 1990; van
Veen et al., 1997; Selenska-Pobell, 1994; Dröge et al., 1999; Hill & Top, 1998).
D.1.4 Zusammenfassung
Das pHR-Plasmid ist in der Lage, aus VF39 [genta lacI] in eine Auswahl von
verschiedenen Bodenbakterien über horizontalen Gentransfer weitergegeben zu
werden. Die Transferfrequenz ist dabei abhängig vom jeweiligen Rezipienten und den
Konjugationsbedingungen. So sind die Transferfrequenzen auf Nitrocellulosefiltern stets
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 87 -
höher als in sterilisiertem und unsterilem Boden. In unsterilem Boden lag die mögliche
Transferfrequenz teilweise unterhalb der Nachweisgrenze durch KBE. Da viele Bakterien
bei Inokulation in den Boden in einen dormanten oder physiologischen VBNC Status
übergehen, sind sie teilweise nicht mehr in der Lage, auf den Selektionsmedien zur
Detektion des HGT zu wachsen. Einige Bakterien verlieren aufgenommene Plasmide
während der ersten Zellteilung wieder und können durch KBE nicht detektiert werden
(Sørensen et al.;, 2005). Vor allem der Anteil der Transkonjuganden innerhalb der nicht
kultivierbaren Bodenbakterien kann mit dieser Methode nicht erfasst werden.
Die angestrebte mikroskopische Detektion von Transferereignissen setzt keine
Kultivierung voraus und ist deswegen nicht auf den kleinen Anteil an kultivierbaren
Bakterien beschränkt (Hill & Top, 1998; Sørensen, 2005; Wolska, 2003). Deswegen
vermittelt sie ein realistischeres Bild über die Möglichkeiten der Verbreitung des pHR-
Plasmids durch HGT.
Es ist allerdings nicht auszuschließen, dass Rezipienten, die ebenfalls das in pRleVF39b
integrierte Megaplasmid erhalten, keine Fluoreszenz zeigen werden und nicht zu
detektieren sind. Das stellt in dem bis jetzt entwickelten System eine nicht zu
unterschätzende Einschränkung dar. Die Gene für den lac-Repressor müssen an einer
stabileren Stelle im Genom von VF39 integriert werden können ohne essentielle Gene
des VF39 Donors zu zerstören. Ein Ansatz ist die Integration des lacI in das mcpd-Gen,
das auf dem Chromosom von VF39 liegt. Diese Verbesserung wurde in der Diplomarbeit
von Ute Neumann vorgenommen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 88 -
D.1.5 Fluoreszenzmikroskopische Detektion des horizontalen Gentransfers
Die mikroskopische in situ Analyse von horizontalem Gentransfer bietet viele Vorteile
gegenüber der Detektion über KBE, denn die Kultivierbarkeit der Bakterien ist keine
Vorraussetzung mehr für die Detektion des Plasmidtransfers. Dies bietet die Möglichkeit,
horizontalen Transfer auch in nicht kultivierbaren Bakterien zu untersuchen. Somit liegen
die Transferfrequenzen, die mikroskopisch ausgewertet wurden, vermutlich näher an
den natürlich vorkommenden Transferfrequenzen. Die Detektion der Ereignisse mittels
Fluoreszenzmikroskopie auf Einzelzellniveau wurde in Jülich mit Unterstützung von Dr.
Peter Klauth durchgeführt. Um auszuschließen, dass Transferereignisse durch den Co-
Transfer des Megaplasmids und die daraus resultierende Unterdrückung der
Fluoreszenz im Transkonjuganden eventuell mikroskopisch nicht sichtbar sind, wurden
die beiden Bakterienstämme Klebsiella planticola und Pseudomonas stutzeri als
Rezipienten gewählt, da bei ihnen bis jetzt kein Transfer des pRleVF39b nachgewiesen
werden konnte.
a) b)
c) d)
Abbildung 18 a-b: Mikroskopische Detektion grün-fluoreszierender Einzelzellen
nach Filterkreuzungen, c-d: Mikroskopische Detektion grün-fluoreszierender Einzelzellen nach
horizontalem Gentransfer in 1g sterilem Boden; rote Pfeile markieren die fluoreszierenden Einzelzellen
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 89 -
Wie anhand von Abbildung 18 a und b deutlich wird, ist die Detektion der eGFP
exprimierenden Transkonjuganden auf Einzelzellniveau nach dem horizontalen
Plasmidtransfer des pHReGFPplac auf Nitrozellulosefiltern sehr gut zu sehen (Abbildung
18 a, b). Die Detektion fluoreszierender Einzelzellen in der sterilisierten Erdprobe
(Abbildung 18 c, d) erwies sich als schwierig. Man konnte zwar fluoreszierende Zellen
finden, allerdings nur sehr wenige, da ein Teil der Zellen vermutlich von Erdpartikeln
verdeckt wurde. Darüber hinaus war die Hintergrundfluoreszenz des Bodens sehr
intensiv und beeinträchtigte die eindeutige Detektion der fluoreszierenden Einzelzellen
stark. Um sicher zu stellen, dass eine fluoreszierende Bakterienzelle und keine
fluoreszierenden Bodenpartikel detektiert wurden, wurde die Bodenprobe mit einem
DAPI enthaltenden Einbettmedium versehen, das die Mikroorganismen spezifisch
eingefärbt hat. Des Weiteren sollte das Einbettmedium das Ausbleichen des eGFP bei
länger andauernden Untersuchungen zur eindeutigen Identifizierung der
fluoreszierenden Einzelzellen verhindern (Bongaerts et al., 2002), da diese im Laufe der
Zeit ihre Fluoreszenz vollständig verlieren.
Trotz dieser Vorkehrungen konnten viele fluoreszierende Punkte nicht eindeutig als
Bakterienzellen identifiziert werden. Ein Nachteil der mikroskopischen Detektion ist die
Verschlechterung der eGFP Expression durch Bedingungen im Boden, wie hohen
Salzgehalt, niedrigen pH-Wert und Sauerstoffmangel (Tsien, 1998). Bakterien, deren
Stoffwechsel nur wenig aktiv oder inaktiv ist, exprimieren nur sehr geringe Mengen an
eGFP oder gar kein eGFP. Diese Zellen können mikroskopisch nicht erfasst werden.
Theoretisch können auch Transkonjuganden vorliegen, die zwar aktiv sind, das Plasmid
aber nicht replizieren oder das eGFP nicht effizient transkribieren können und deswegen
nicht fluoreszieren. (Sørensen, 2005; Wolska, 2003) Auch diese Bakterien werden nicht
detektiert. Um diese Möglichkeiten, in denen der Transfer mikroskopisch nicht detektiert
werden kann, in die Analyse der Transferfrequenz des pHR-Plasmids über HGT mit
einzubeziehen, wurden sieben Proben parallel zum Vergleich mikroskopisch und durch
Auswertung der KBE analysiert.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
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D.1.6 Vergleichende Auswertung durch Fluoreszenzmikroskopie und KBE
Um die Transferfrequenzen, die parallel durch Fluoreszenzmikroskopie und KBE ermittelt wurden, zu vergleichen, wurde die
Transferfrequenz des pHReGFPplac Plasmids aus dem Verhältnis von Transkonjuganden zur Gesamtzellzahl statt Transkonjuganden zu
Rezipienten berechnet. Da die Zellen bei der mikroskopischen Analyse mittels einer Sytox Green Färbung gezählt wurden, war es dabei
nicht möglich, Donor- und Rezipienten-Titer getrennt voneinander zu bestimmen.
Tabelle 29: Vergleich der Transferfrequenzen durch KBE versus Mikroskopischer Auswertung
Probe Zellzahl (Donor)
Zellzahl (Rezipient)
Gesamtzellzahl (KBE)/g
Trans- konjuganden (KBE)/g
Transfer- frequenz (KBE)
Gesamtzellzahl/g (Sytox Green)
Trans- konjuganden (visuelle Detektion)
Transfer-frequenz (visuelle Detektion)
1 3,66x1010 1,53x1013 1,53x1013 5,50x101 3,58x10-12 8,86x1010 2,68x105 3,03x10-6
2 5,16x1011 4,70x1011 9,86x1011 1,00x101 1,02x10-11 4,82x1010 6,93x103 1,44x10-7
3 1,73x1011 1,35x1012 1,52x1012 5,00x101 3,28x10-11 1,16x1011 9,24x103 7,97x10-8
1s 6,72x1012 5,20x1011 7,24x1012 1,70x102 2,35x10-11 1,77x109 1,74x105 2,17x10-5
2s 1,24x1010 2,20x1013 2,20x1013 4,00x104 1,82x10-9 8,01x109 1,35x103 7,63x10-8
3s 3,19Ex109 5,15x1012 5,15x1012 1,37x102 2,65x10-11 1,77x1010 1,35x103 7,62x10-8
1u 4,89Ex109 2,07x1012 2,07x1012 4,00x101 1,93x10-11 2,42x1010 0 0
Donor: VF39 [genta lacI] pHReGFPplac; Rezipient: Klebsiella planticola
Ansatz 1,2 und 3: Filterkreuzungen, parallel mit gleichem Donor-/Rezipiententiter inokuliert, 24h inkubiert;
Ansatz 1s, 2s und 3s: Kreuzungen in sterilisierter Erde, parallel mit gleichem Donor-/Rezipiententiter inokuliert, 24h inkubiert;
Ansatz 1u: Kreuzung in unsteriler Erde, 24h inkubiert
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 91 -
Wie man in Tabelle 29 erkennt, ist die mikroskopisch ermittelte Transferfrequenz des
pHReGFPplac Plasmids viel höher als bei Auswertung über KBE. Die ermittelte
Gesamtzahl der Bakterien, die durch Ausplattieren auf den verschiedenen
Selektionsmedien ermittelt wurde, ist um zwei bis drei Zehnerpotenzen höher als die
automatisch nach Sytox Green Färbung ausgezählte Zellzahl.
Es entspricht den Erwartungen, dass der mikroskopisch detektierte Ereignis-Titer höher
lag, als der durch KBE ermittelte, denn nur ein Teil der in den Boden eingebrachten
Bakterien war nach der Extraktion noch in der Lage, auf den Selektivmedien zu
wachsen. Da die nicht kultivierbaren Bakterien durch KBE nicht erfasst wurden, lagen
die Frequenzen der mikroskopischen Auswertung höher und sind als realistischer
einzuschätzen, als die Ergebnisse, die durch KBE erreicht werden konnten.
Die Feststellung, dass die Berechnung der Gesamtzellzahl durch KBE ein deutlich
höheres Ergebnis hat, als die Auswertung über die Sytox Green Färbung, ist unerwartet.
Das Ergebnis lässt sich zwar dadurch begründen, dass die Zellen im Boden Aggregate
bilden können, die unter dem Mikroskop nicht eindeutig ausgezählt werden können.
Allerdings können solche Aggregate beim Ausplattieren einen höheren Zelltiter
vortäuschen (Klauth, 2001). Da beide Auswertungen in dreifachen Parallel-Ansätzen
ausgewertet wurden, kann davon ausgegangen werden, dass eine ausreichend
statistische Absicherung der Ergebnisse vorliegt.
In unsterilen Bodenproben konnte mikroskopisch kein Transferereignis festgestellt
werden. Es kann davon ausgegangen werden, dass die Bakterien in unsterilem Boden
wegen des hohen Konkurrenzdrucks durch die einheimischen Bakterien und den
geringen Nährstoffen nur sehr schwach aktiv oder inaktiv waren. Eine Expression des
eGFP fand wahrscheinlich deswegen zu kaum, oder gar nicht statt (Sørensen, 2005).
Über KBE war die Detektion eines HGT möglich. Es ist allerdings nicht auszuschließen,
dass der Transfer nicht im Boden, sondern nach Ausplattieren auf der Selektionsplatte
stattgefunden hat.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 92 -
D.1.7 Untersuchung des horizontalen Gentransfers in sterilen Mikrokosmen
Ein weiterer Schritt in der Untersuchung des horizontalen Gentransfers des
pHReGFPplac Plasmids ist die Analyse von HGT in der Rhizosphäre der Erbse (Pisum
sativum). Dazu wurden sterilisierte Samen in sterilen Mikrokosmen (Henschke &
Schmidt, 1989) kultiviert, die ein Volumen von circa 50g Boden besaßen. Diese
Mikrokosmen waren den realen Bedingungen im Freiland einen Schritt näher als die
Mikrokosmen mit 1g Boden ohne Bepflanzung (Hill & Top, 1998). Da die Rhizosphäre
als so genannter „hot spot“ für HGT gilt, sollte ihr Einfluss auf den Transfer des pHR-
Plasmids analysiert werden. Daher wurden die drei Bereiche Rhizoplane, Rhizosphäre
und die wurzelfreie Erde nach der Inkubation getrennt voneinander auf horizontalen
Gentransfer untersucht. Weiterhin wurde die Gesamtzahl der vitalen Donorzellen im
Vergleich zur Gesamtzahl der vitalen Donorzellen mit Plasmid durch KBE ermittelt. Die
Inokulation der Mikrokosmen fand über vier Wochen statt. In diesem Zeitraum sollten
sich die Bakterien an ihren Lebensraum angepasst haben. Des Weiteren sollte
analysiert werden, wie stabil das Plasmid bei vierwöchigem Wachstum unter den
unselektiven Bedingungen im Boden in den Donorzellen verbleibt. Die Rhizoplane der
Pflanzen wurde parallel zur Auswertung über KBE auch mikroskopisch auf
fluoreszierende Transkonjuganden untersucht.
Tabelle 30: Transfer in Mikrokosmen
Rezipient Transferfrequenz % Donor mit Plasmid
Klebsiella planticola (a) 10 – 8 – 10 – 9 7- 51%
Klebsiella planticola (b) 10 – 7 – 10 – 9 6- 56%
Klebsiella planticola (c) - 18- 92%
Pseudomonas stutzeri (a) 10 – 10 – 10 – 11 23- 30%
Pseudomonas stutzeri (b) 10 – 10 – 10 – 11 9- 18%
Pseudomonas stutzeri (c) 10 – 11 16- 47%
a: wurzelfreier Boden; b: Rhizosphäre; c: Rhizoplane
Donor: VF39 [genta lacI] pHReGFPplac
Die ausgewerteten Mikrokosmen (a-c) der jeweiligen Inokulation mit P. stutzeri und K.
planticola wurden mit dem gleichen Verhältnis von Donor zu Rezipiententiter inokuliert.
Die Auswertung der KBE erfolgte jeweils durch Ausplattieren von drei parallelen
Selektionsplatten. In den Bereichen des wurzelfreien Bodens und der Rhizosphäre
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 93 -
wurden die Bakterien während der Extraktion durch kurzes Anzentrifugieren von den
größeren Erdpartikeln abgetrennt, damit diese die mikroskopische Analyse des HGT
nicht stören konnten.
Trotzdem war es durch Fluoreszenzmikroskopie nicht möglich, Transkonjuganden zu
finden. Nur durch KBE auf den Selektivmedien konnte der Plasmidtransfer detektiert
werden. Ebenso wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop keine eGFP exprimierenden
Einzelzellen an der Rhizoplane der Erbsenpflanzen gefunden. Die ausgewerteten
Transferfrequenzen (Tabelle 30) beruhen deswegen ausschließlich auf Analyse der
KBE. Wie zu sehen ist, sind die Transferfrequenzen des pHReGFPplac Plasmids aus
VF39 [genta lacI] in Klebsiella planticola viel höher als die in Pseudomonas stutzeri. Die
in diesem Versuch ermittelten Transferfrequenzen des pHR-Plasmids nach Klebsiella
planticola sind mit den Frequenzen aus den vorherigen Versuchen vergleichbar. Sie
liegen um etwa zwei Zehnerpotenzen höher als die Transferfrequenzen in Pseudomonas
stutzeri. Insgesamt sind die Transferfrequenzen in den drei Bereichen der Mikrokosmen
mit P. stutzeri als Rezipient vergleichbar.
Die Nähe zur Wurzel zeigte keinen Einfluss auf die Transferfrequenz. Im Allgemeinen
hat die Besiedlung der Mikrokosmen ebenfalls einen Einfluss auf den Zellkontakt und
damit auf den horizontalen Gentransfer (van Veen, 1997). Deswegen wurde die
Verteilung der Bakterien auf die drei Bereiche hin untersucht. Dabei wurde festgestellt,
dass die höchsten Zelltiter für Klebsiella planticola vor allem im wurzelfreien Boden,
dagegen die des Donorstamms VF39 [genta lacI] pHReGFPplac in der Rhizosphäre zu
finden waren. Das Verhältnis von Donor zu Rezipient war in wurzelfreiem Boden und der
Rhizosphäre am größten. Dort lagen wesentlich mehr Donor- als Rezipientenzellen vor.
Da in diesen Bereichen die Transferfrequenz am größten war, ist anzunehmen, dass
sich die große Anzahl an Donorzellen positiv auf den Transfer ausgewirkt hat.
Weiterhin gab es eine klare Korrelation zwischen der Transferrate und dem Anteil an
VF39 [genta lacI] Donor, der das Plasmid besaß. Umso kleiner der Anteil an Plasmid-
tragenden Donorzellen war, umso größer war die Frequenz des HGT in diesem Bereich.
In der Kreuzung mit P. stutzeri war die größte Zellzahl des VF39 [genta lacI] Donors in
wurzelfreiem Boden und der Rhizosphäre zu finden, während der Zelltiter des
Rezipienten P. stutzeri in der Rhizoplane mit Abstand am höchsten war. Die Anzahl der
Donorzellen ist in keinem Bereich größer als die der Rezipientenzellen. Die Korrelation
zwischen dem Anteil an Plasmid-tragenden Donorzellen und der Transferfrequenz ist
nicht so eindeutig wie bei den Experimenten mit K. planticola, die Tendenz ist jedoch die
gleiche.
Der in einigen Experimenten eindeutig gezeigte positive Einfluss der Rhizosphäre auf
den horizontalen Gentransfer (van Elsass et al., 1989; Schwaner et al., 2001) konnte
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 94 -
mittels der in dieser Doktorarbeit gezeigten Ergebnisse nicht nachgewiesen werden. Da
dieser Effekt vermutlich nicht darauf beruht, dass Wurzelexsudate den Transfer
stimulieren, sondern auf die höhere Dichte der Bakterien in der Rhizosphäre
zurückzuführen ist (Kroer et al., 1998) und sich Donorstamm und der jeweilige Rezipient
in den analysierten Mikrokosmen in den drei verschiedenen Bereichen unterschiedlich
angesiedelt haben ist dieser Effekt nicht zu sehen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 95 -
D.1.8 Konjugationsversuche auf Schrägagarplatten
Die Konjugationsversuche in Mikrokosmen haben gezeigt, dass es innerhalb von vier
Wochen Inkubation zu einer Reihe von HGT Ereignissen zwischen VF39 [genta lacI]
pHReGFPplac und P. stutzeri bzw. K. planticola gekommen ist. Die in situ Detektion der
Transkonjuganden war nicht erfolgreich, da einige Faktoren wie fluoreszierende
Erdpartikel oder mögliche Aggregatbildungen der Zellen die Besiedlung der Donor- und
Rezipienten-Stämme in unterschiedlichen Bereichen der Mikrokosmen zu Problemen
geführt haben. Deswegen sollte in einem Rhizosphärensystem ohne Boden versucht
werden, die Ereignisse in situ zu detektieren.
Dazu wurden zwei Luzernepflanzen auf einer Schrägagarplatte, bestehend aus
Pflanzennodulationsmedium ohne Kohlenstoffquelle jedoch mit zusätzlicher
Stickstoffquelle, kultiviert. Die Pflanzen wuchsen auf der Schrägagarplatte und bildeten
ihre Wurzeln auf der Oberfläche aus. Die inokulierten Bakterien konnten somit auf den
Schrägagarplatten ausschließlich in dem eng begrenzten Bereich der Rhizosphäre und
Rhizoplane, in dem durch die Exsudation der Wurzel essentielle Substanzen für die
Kohlenstoffversorgung des bakteriellen Stoffwechsels vorliegen, wachsen. Dadurch war
gewährleistet, dass die Bakteriendichte und der Zellkontakt zwischen den Bakterien in
diesem Raum am höchsten ist und somit die Wahrscheinlichkeit für Interaktionen wie
z.B. Konjugationen steigt.
Die mikroskopische Analyse der Wurzeloberfläche auf fluoreszierende Einzelzellen hin
war ohne Störung des Rhizosphärensystems durchführbar. Trotzdem war es in keinem
der Versuchsansätze möglich, ein Konjugationsereignis zu detektieren. Das könnte
einerseits daran liegen, dass die Ereignisfrequenz sehr niedrig war, andererseits hatten
Wurzel und Wurzelhaare der Luzerne ebenfalls eine recht hohe Autofluoreszenz, die die
Detektion gestört hat. Auf den zusätzlich ausplattierten Selektionsmedien zur
Untersuchung möglicher Konjugationsereignisse wurden einige wenige
Transkonjuganden ausschließlich in den Ansätzen mit R. tropici CIAT 899 als Rezipient
gefunden. Die Frequenz lag dabei sehr niedrig (<10-12). In Experimenten, in denen das
Überleben GFP-exprimierender Pseudomonas putida und Enterobacter cowanii Zellen in
der Rhizosphäre von Tomatenpflanzen untersucht wurde, verursachte die
Autofluoreszenz der Wurzeln ebenfalls erhebliche Probleme. (Unge & Janson, 2001;
Götz et al., 2006)
Es konnten mikroskopisch keine fluoreszierenden Zellen detektiert werden, obwohl die
vorliegenden fluoreszierenden Zellen bezogen auf das Gewicht der Wurzel mehr als 104
Zellen betrugen. Diese Zellzahl war weitaus größer, als die der Transkonjuganden in
dem hier durchgeführten Versuch. Trotzdem lag sie schon unterhalb der
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 96 -
Detektionsschwelle (Götz et al., 2006). Möglicherweise war die Bakteriendichte auch zu
hoch, sodass nicht genug Wurzelexsudate vorhanden waren um die Bakterien mit
ausreichenden Nährstoffen zu versorgen, was zur Folge hatte, dass sie in eine
physiologisch inaktive Phase übergetreten sind. Auch könnte R. tropici als einziger
Stamm in der Rhizosphäre bzw. Rhizoplane seiner Wirtspflanze hinsichtlich der
Nährstoffversorgung und ihrer Nutzung einen Vorteil gegenüber den anderen
Bakterienstämmen haben. Die verschiedenen Rhizobienstämme verfügen über
unterschiedliche Enzyme, die ihnen einen kompetitiven Vorteil in der Rhizosphäre ihrer
Wirtspflanze gegenüber anderen Rhizobienstämmen verschaffen. Die Wurzelexsudate
von Erbsen enthalten z.B. Homoserin, das von Rhizobium leguminosarum bv. viciae
metabolisiert werden kann, von S. meliloti jedoch nicht. Dies führt zu einer selektiven
Stimulation des Rhizobienwachstums in der Rhizosphäre ihrer kompatiblen Wirtspflanze
(Brockwell et al., 1995; Hirsch, 1996). Allgemein kann jede Pflanze so die für sie
passenden Bakterien in ihrer Rhizosphäre auswählen (Smalla et al., 2001).
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 97 -
D.1.9 Plasmidstabilität
Um einen Effekt der Bakterien, die das Indolessigsäure synthetisierende Plasmid pRD20
tragen, auf die Kultivierung und die Erträge zu untersuchen (siehe Songlines EU-
Projekt), muss gewährleistet sein, dass das Plasmid auch unter unselektiven
Bedingungen in den Bakterien erhalten bleibt. Die Versuche mit dem pHR-Plasmid, das
anstelle des pRD20 zu Testzwecken in den Mikrokosmenexperimenten im Zeitraum von
vier Wochen benutzt wurde, zeigten ein sehr heterogenes Ergebnis. Um die Stabilität
der Plasmide ausführlicher zu testen, wurden die Plasmid-tragenden VF39 [genta lacI]
Kulturen nach selektiver Anzucht über einen Zeitraum von 18 Tagen alle 48h unselektiv
in neues Medium überimpft und der Titer der VF39 [genta lacI] Zellen mit dem der VF39
[genta lacI] Zellen, die das Plasmid besitzen, verglichen. Aus den Ergebnissen ließ sich
ableiten, wie stabil das Plasmid unter unselektiven Bedingungen im VF39 [genta lacI]
Stamm verblieb, bzw. ob es bei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben
wurde.
1,00E+06
1,00E+09
2,00E+09
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Gesamttiter VF39 VF39 (pRD20)
3x 10-9
2x 10-9
1x 10-6
1x 10-9
Zellen/ml
Tage
Plasmidstabilität von pRD20 in VF39
Abbildung 19: Plasmidstabilität pRD20 in VF39
Gesamttiter: VF39 Zellen mit und ohne pRD20 Plasmid (unselektiv ermittelt); VF39 (pRD20): Zellen, die das
pRD20 Plasmid tragen (selektiv ermittelt); Fehlerbalken: Standardabweichung von drei parallelen
Messungen
Wie aus Abbildung 19 ersichtlich ist, verliert der VF39 [genta lacI] Stamm das pRD20
Plasmid ohne Selektionsdruck sehr schnell. Nach 10 Tagen besitzen noch circa 10% der
Zellen das Plasmid. Die Plasmide pHReGFPplac und pBBRIAA hingegen sind auch
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
- 98 -
ohne Selektionsdruck relativ stabil. Nach insgesamt 18 Tagen Wachstum in
Flüssigmedium besitzt ein Großteil (>80%) der Zellen nach wie vor das jeweilige
Plasmid. (Daten nicht gezeigt) Dieses Ergebnis ist überraschend, da alle drei
verwendeten Plasmide Derivate desselben Ursprungsplasmids (pBBR1) sind und sich
deswegen gleich verhalten sollten (siehe Plasmide in Material und Methoden). Das
pBBR1 Plasmid wurde schon vielfach benutzt und erwies sich in allen Fällen als sehr
stabil (Kovach et al., 1995; Stuurman, 2000; Ramos, 2006).
Es könnte jedoch möglich sein, dass die Belastung des Stoffwechsels der Rhizobien
durch die hohe Syntheserate von Indolessigsäure zu hoch war und das Plasmid aus
diesem Grund verloren ging. In einigen Versuchen wurde festgestellt, das die
plasmidtragende Zellen metabolisch durch die Plasmidgröße, Replikation der Plasmide
und vor allem plasmidkodierte Gene hinsichtlich ihrer Fitness und Konkurrenzfähigkeit
stark benachteiligt sind (Mølbak, 2003; Joquera et al., 2006).
Die für die IAA-Synthese essentielle Aminosäure Tryptophan musste unserem
Versuchsansatz von den Bakterien selber zu Verfügung gestellt werden und ist damit ein
limitierender Faktor für die Synthese. Es wäre interessant, diesen Test in mit Tryptophan
angereichertem Medium zu wiederholen, da in mehreren Studien die Synthese von
Indol-Derivaten durch Zugabe von Tryptophan um ein Vielfaches gesteigert werden
konnte (Müller et al., 1989; Martens & Frankenberger, 1993).
Es besteht weiterhin die Möglichkeit, dass die Stabilität des pRD20 Plasmids in der
Rhizosphäre höher ist, da die Bakterienzellen dort durch die Wurzelexsudate mit
zusätzlichem Tryptophan versorgt werden.
Ergebnisse und Diskussion Teil 1
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D.1.10 Zusammenfassung – Ergebnisse und Diskussion Teil 1
Die Idee HGT innerhalb eines Ökosystems durch mikroskopische Detektion in vivo
sichtbar zu machen, bietet die Chance Mikroorganismen, möglichst ungestört, in ihrer
natürlichen Umgebung zu untersuchen. Weiterhin können Transferereignisse in nicht
kultivierbare Bakterien und Bakterien in denen das Plasmid nicht stabil verbleibt nur so
erfasst werden (Dahlberg et al., 1998a). Die von Christensen (1996) entwickelte
Methode zur visuellen Detektion des HGT hat sich in Marinen Ökosystemen bewährt
(Christensen et al., 1996; Dahlberg et al., 1998; Sørensen et al., 2003).
Ein limitierender Faktor dieser Methode ist allerdings nach wie vor die Nutzung in
Bodenökosystemen. Im Gegensatz zu Marinen Ökosystemen fluoreszieren hier unter
Fluoreszenzanregung auch Bodenpartikel wie Mineralien. Die Anheftung der Bakterien
an Bodenpartikel und die Hintergrundfluoreszenz erschweren die Detektion erheblich.
Besonders da horizontaler Gentransfer mit einer relativ niedrigen Frequenz < 10- 7
Zellen/ Rezipient auftritt (Dröge et al., 1999; Schwaner et al., 2001; Walter et al., 1991).
Es kann also nur eine qualitative Aussage über den horizontalen Transfer eines
Plasmids gemacht werden, keine quantitative.
Die Detektion des Chromophor in den Transkonjugandenzellen wird durch verschiedene
Faktoren nachhaltig beeinflusst. Die Stärke der Fluoreszenz ist in verschiedenen
Bakterien unterschiedlich stark, wobei die Stärke unter anderem davon abhängt, wie
lange sich das Plasmid schon im jeweiligen Transkonjugand befindet. Metabolisch
inaktive Zellen exprimieren GFP nicht, schwach aktive Zellen nur sehr geringe Mengen.
Die Detektion dieser Zellen ist oft nicht möglich (Joquera, 2006; Musovic, 2006).
Untersuchungen in der Rhizosphäre der Gerste ergaben, dass nur circa 60% der
vorhandenen Rhizosphärenbakterien metabolisch aktiv waren. Folglich kann durch
visuelle Analyse ein großer Teil der Bakterien nicht erfasst werden.
Des Weiteren hat die Kopienzahl des Plasmids einen Einfluss auf die Stärke der
Fluoreszenz. Die Expression von GFP auf so genannten „low copy“ Plasmiden reicht
laut Joquera (2006) vermutlich für die Detektion in den Zellen nicht aus. Die Expression
einer im Chromosom integrierten Kopie des GFP kann visuell nicht detektiert werden
(Errampali, 1997; Joquera, 2006).
Abschließend kann man sagen, dass das Konzept der rein visuellen Detektion in
Ökosystemen viele Vorteile, leider aber auch einige Schwächen bietet. Eine
Verbesserung der Detektionsmethoden ist aufgrund dieser Vorteile erstrebenswert und
wird aktuell verfolgt. Zum jetzigen Zeitpunkt ist diese Methode, meiner Meinung nach,
als alleinige Auswertung des HGT in Bödenökosystemen ungeeignet.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 100 -
D.2 Teil 2 – Einfluss der gentechnisch veränderten Rhizobienstämme auf die bakterielle Gemeinschaft im Boden
In diesem Teil der Arbeit wird der Einfluss der gentechnisch veränderten
Rhizobienstämme, die das Pflanzenhormon IAA produzieren, auf die Erbsenpflanze
(Pisum sativum) und die bakterielle Gemeinschaft in ihrer Rhizosphäre und Rhizoplane
diskutiert. Dabei standen die folgenden Fragestellungen im Vordergrund:
Gibt es einen Einfluss auf die Zusammensetzung und die Diversität der einheimischen
Bakterienpopulation in der Rhizosphäre und Rhizoplane der Pflanzen, bedingt durch die
Inokulation mit gentechnisch veränderten VF39-Stämmen?
Welche Bakterien werden beeinflusst?
Gibt es eine Veränderung des IAA-Gehalts in der Rhizosphäre von Pisum sativum
bedingt durch die Inokulation mit einem gentechnisch veränderten VF39 Stamm?
Gibt es Anzeichen für eine Veränderung des Phänotyps der Erbsenpflanzen, die sich
durch die Inokulation mit den gentechnisch veränderten VF39-Stämmen begründen
lässt?
Um die ersten beiden Fragestellungen zu beantworten, wurden die Mikrokosmen mittels
Gemeinschafts- und Diversitätsanalyse einschließlich der Identifizierung der
prominenten Bakterienpopulationen untersucht.
Die durchgeführten Analysen gliedern sich in vier verschiedene Versuchsansätze. Diese
Ansätze unterscheiden sich hinsichtlich der benutzten Pflanze und/ oder der jeweiligen
Versuchsdauer.
Versuchsansatz 1 (Versuchspflanze: Erbse, Dauer: neun Wochen)
Versuchsansatz 2 (Versuchspflanze: Erbse, Dauer: zehn Tage)
Versuchsansatz 3 (Versuchspflanze: Luzerne, Dauer: zehn Tage)
Versuchsansatz 4 (Versuchspflanze: Erbse, Dauer: zwölf Wochen)
Abschließend folgte eine statistische Auswertung der Ergebnisse aus den
unterschiedlichen Versuchsansätzen. Zur Beantwortung der dritten Frage wurden
Änderungen des IAA-Gehalts in der Rhizosphäre mittels GC-MS ermittelt.
Änderungen im Phänotyp wurden durch optische Auswertung und Messung des
Trockengewichts der zu untersuchenden Pflanzen analysiert.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 101 -
D.2.1 In vitro IAA Synthese
Um den Einfluss der gentechnisch veränderten VF39-Stämme auf die Pflanzen zu
analysieren, wurde zunächst die Synthese des Hormons unter optimalen
Wachstumsbedingungen der Bakterien in Zellkulturüberständen gemessen. Dieser
Schritt sollte sicherstellen, dass die verschiedenen VF39-Stämme in der Lage sind,
größere Mengen an IAA zu synthetisieren und ermöglicht gleichzeitig die Menge des
produzierten Hormons abzuschätzen.
1,00E-08
1,00E-07
1,00E-06
1,00E-05
1,00E-04
1,00E-03
1,00E-02
1,00E-01
VF39 WT VF39 (pHReGFPplac) VF39 (pRD20)
VF39 (pJPpCAT) VF39 (pJProlA) VF39 (pBBRIAA)
10-1
10-2
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-3
[IAA] IAA-Konzentration (in vitro)
Abbildung 20: Wachstum der Erbse bei verschiedenen Auxinkonzentrationen
Aufgetragen ist das Wachstum (y-Achse) gegen die IAA Konzentration in M (x-Achse) grau gestreifte Zone: optimale IAA-Konzentration für das Stängelwachstum (Abbildung aus: Wareing P.F. & Phillips I.D.J)
Abbildung 21: IAA Synthese in vitro
Quantitative Messung des IAA Gehalts im Zellkulturüberstand der verschiedenen Rhizobienstämme; die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung von drei parallelen Messungen
In Abbildung, 20 und 21 ist der Effekt verschiedener IAA Konzentrationen auf das
Wachstum der einzelnen Teile der Erbsenpflanze, wie Wurzel, Stängel und
Seitenknospen, und die Menge an in vitro synthetisiertem IAA der gentechnisch
veränderten VF39-Stämme gegenübergestellt. Die optimale Konzentration für das
Wachstum der Stängel liegt bei 10-5 M, das Wachstum der Wurzeln wird durch
niedrigere Konzentrationen, die zwischen 10-11 M und 10-8 M liegen, gefördert. IAA-
Konzentrationen, die zwischen 10-8 M und 10-6 M liegen bewirken eine Hemmung des
Wurzelwachstums, fördern aber die Ausbildung von Seitenknospen. Zusammengefasst
bewirkt die nötige IAA-Konzentration zur Förderung eines Teils der Pflanze in den
meisten Fällen die Hemmung des Wachstums in einem anderen Teil der Pflanze. Um
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 102 -
einen positiven Effekt auf die Pflanze zu haben sollte die bakteriell synthetisierte IAA-
Menge entweder größer als 10-5 M oder kleiner als 10-8 M sein.
Wie man in Abbildung 21 sieht, ist der IAA Gehalt in den Kulturüberständen der
verschiedenen Rhizobienstämme, der mit Hilfe des Salkowski-Tests quantitativ bestimmt
wurde, in allen Kulturen größer als 10-5 M und somit theoretisch optimal um das
Wachstum der Erbsenpflanzen zu fördern. Die höchste IAA Konzentration wird von VF39
(pRD20) produziert, die niedrigste Konzentration vom VF39 WT Stamm. Die
zweithöchste Konzentration wird von VF39 (pJPpCAT) produziert, der die Gene zur
Produktion von IAA genau wie VF39 (pRD20) unter Kontrolle des konstitutiven CAT
Promotors hat, allerdings eine niedrigere Kopienzahl besitzt. Die beiden Stämme VF39
(pBBRIAA) und VF39 (pJProlA) besitzen die Gene zur Produktion von IAA unter
Kontrolle des schwachen induzierbaren rolA Promotors. Abschließend kann man
deutlich erkennen, dass alle Plasmid-tragenden VF39-Stämme zwischen 10-4 und 10-3 M
IAA produzieren. Diese IAA- Menge ist 10-mal höher, als die des VF39 WT Stamms.
Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit den Daten, die im Rahmen des Songlines EU-
Projekts erfasst wurden. Dort hatte der modifizierte Rhizobienstamm in vitro ebenfalls
eine 10-fach höhere Menge IAA produziert. Die Konzentration von 10-4 – 10-3 M liegt
zwar etwas höher als die optimale IAA Konzentration für das Wachstum der Stängel
(siehe Abbildung, 20), dennoch ist eine Förderung des gesamten Stängelwachstums der
Pflanze gewährleistet (Wareing & Phillips, 1978).
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 103 -
D.2.2 Versuchsansatz 1: Analyse der bakteriellen Gemeinschaft in der
Rhizosphäre und Rhizoplane der Erbse nach neunwöchiger Inkubationszeit
In diesem Versuchsansatz wurde der Einfluss des VF39 (pRD20) Stammes auf die
Bakterienpopulation in der Rhizosphäre und Rhizoplane über eine Inkubationszeit von
neun Wochen analysiert. Um auszuschließen, dass ein Effekt lediglich durch die
zusätzliche Inokulation hervorgerufen wurde, wurden Kontrollansätze ohne Inokulation,
Ansätze mit VF39 WT und Ansätze mit VF39 (pHReGFPplac) inokuliert. Das
pHReGFPplac „Leerplasmid“, das keine Gene für die zusätzliche IAA-Synthese trägt,
diente in diesem Versuchsansatz als Kontrolle dafür, dass der plasmidtragende VF39
Stamm sich nicht anders als VF39 WT verhält. Weiterhin wurden einige Ansätze nicht
zusätzlich inokuliert, aber mit IAA-Lösung (10-6 M) gegossen, um auszuschließen, dass
ein Effekt nicht durch VF39 (pRD20), sondern nur durch den unterschiedlichen IAA
Gehalt der Rhizosphäre ausgelöst wird. Alle Ansätze wurden zu vier verschiedenen
Zeitpunkten untersucht: vor der Inokulation, nach 7, 21 und 72 Tagen.
Die Untersuchung jedes Versuchsansatzes (V1-4) wurde in folgende Aspekte
untergliedert:
A.) Untersuchung der Rhizosphäre; 16S rDNA
B.) Untersuchung der Rhizosphäre;16S c-(r)DNA)
C.) Untersuchung der Rhizoplane; 16S rDNA
D.) Untersuchung der Rhizosphäre; 16S c-(r)DNA)
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 104 -
Analyse der 16S rDNA (Rhizosphäre)
vor A
nim
pfun
g
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Mar
ker
Mar
ker
1.10.
Abbildung 22: DGGE-Gel für die16S rDNA V1
aus der Rhizosphäre nach 7 Tagen, 21 Tagen und 72 Tagen Inkubation und
daraus resultierende DICE-Analyse
Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
9590858075
1-3 DNA RZ
1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ
1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ
1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ
1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ
1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ
1-3 DNA RZ1-3 DNA RZ
14
151618
1723
1012
4119
86
51vor Animpfung
VF39 WT
VF39 (pHReGFPplac)
Kontrolle
VF39 WT
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
IAA
VF39 (pHReGFPplac)
VF39 (pHReGFPplac)
IAA
%
Rhizosphäre V1 16S rDNA
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 105 -
D.2.2.1 V1 A: Analyse der 16S rDNA (Rhizosphäre)
In Abbildung 22 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des Versuchsansatzes 1 (V1
A) auf Basis der 16S rDNA der Rhizosphäre dargestellt. Da die Rhizosphäre reich an
Nährstoffen ist, ist sie von verschiedenen Bakterien dicht besiedelt, was deutlich an der
Vielzahl von Banden zu erkennen ist. Die Anzahl der Banden in den aufgetragenen
verschiedenen Versuchsansätzen lag zwischen 38 und 55. Weiterhin kann man sehen,
dass alle aufgetragenen Proben eine hohe Ähnlichkeit in ihrem Bandenprofil aufwiesen.
Insgesamt war die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft in den einzelnen
Versuchsansätzen zum überwiegenden Teil identisch. Dieses Ergebnis wird durch die
anschließende DICE-Analyse des Gels bestätigt. Weiterhin bedeutet es, dass die
unterschiedliche Behandlung der einzelnen Versuchsansätze z.B. durch die Inokulation
mit VF39 (pRD20) oder die Behandlung mit IAA, keinen großen Einfluss auf die
Zusammensetzung der Rhizosphärengemeinschaft hat. Die rot markierten Banden 1 und
10 fallen in den Proben dadurch auf, dass sie in den anderen Proben, desselben
Probenzeitpunkts, schwächer oder nicht vorhanden sind. Zur weiteren Untersuchung
wurden sie deshalb aus dem Gel ausgeschnitten und sequenziert.
Die DICE-Analyse des 16S rDNA DGGE-Gels zeigt erwartungsgemäß, dass die
Bakterienzusammensetzung in der Rhizosphäre bei allen Proben eine über 70%ige
Übereinstimmung zeigt. Die Probe „vor Animpfung“ fällt allerdings aus dem Cluster. Das
lässt sich dadurch erklären, dass die Rhizosphärengemeinschaft zu diesem Zeitpunkt
noch keine Zeit hatte sich zu „einzustellen“, da die Probe direkt zu Beginn des
Experiments genommen wurde. Die anderen Proben clustern in Korrelation zu ihrer
Inkubationszeit, nicht jedoch in Abhängigkeit der Behandlung. Da die 3 Parallelproben
aus einer Rhizosphäre (nur) zu 85- 95% übereinstimmen, ist die Ähnlichkeit der
verschiedenen Versuchsansätze untereinander sehr hoch. Ebenso verhält es sich mit
Versuchsansätzen, die mit IAA behandelt wurden. Da die mit VF39 (pRD20) inokulierten
Proben bis zur dritten Woche (Probennahme eins und zwei) nicht mit den
korrespondierenden Wildtyp oder den Kontrollansätzen clustern, kann auf einen leichten
Effekt dieses Stamms auf die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft in der
Rhizosphäre geschlossen werden. Dieser Effekt ist allerdings bis zur dritten
Probennahme verschwunden. Da die Ähnlichkeit der mit VF39 (pRD20) behandelten
Versuchsansätze mit den anderen Versuchsansätzen immer mehr als 80% beträgt, wird
allerdings nicht von einem deutlichen Einfluss ausgegangen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 106 -
Analyse der 16S c-(r)DNA (Rhizosphäre)
18.
20.
24.
25.
vor A
nim
pfun
g
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Mar
ker
Mar
ker
Abbildung 23: DGGE-Gel für die16S c-(r)DNA V1
aus der Rhizosphäre nach 7 Tagen, 21 Tagen und 72 Tagen Inkubation und
daraus resultierender DICE-Analyse
Dice (Opt:0.50%) (Tol 0.5%-0.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
95908580757065
1-3 cDNA RZ
1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ
1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ
1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ
1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ
1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ
1-3 cDNA RZ1-3 cDNA RZ
4
536
879
1615
171413
1011
212
Rhizosphäre V1 16S c-(r)DNA
vor Animpfung
VF39 WT
VF39 (pHReGFPplac)
Kontrolle
VF39 WT
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
IAA
VF39 (pHReGFPplac)
VF39 (pHReGFPplac)
IAA
%
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 107 -
D.2.2.2 V1 B: Analyse der 16S c-(r)DNA (Rhizosphäre)
In Abbildung 23 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des Versuchs I (V1 B) auf
Basis der 16S c-(r)DNA der Rhizosphäre dargestellt. Die Ähnlichkeit der Bandenprofile
ist nicht hoch verglichen mit den 16S rDNA Proben. Das lässt dich dadurch erklären,
dass in der Analyse auf Basis der extrahierten 16S rDNA kein Unterschied zwischen
aktiven und dormanten Bakterien gemacht wurde, da bei dieser Methode alle
vorhandenen Bakterien erfasst wurden. Um die Analyse eines Einflusses des
gentechnisch veränderten VF39 (pRD20) Stammes auf die Rhizosphärengemeinschaft
zu vervollständigen, wurde in der 16S c-(r)DNA Analyse untersucht, ob sich die
„Aktivität“ der bakteriellen Gemeinschaft verändert. Da die vorhandene Menge an rRNA
direkt mit der metabolischen Aktivität der Bakterien korreliert, kann so eine Aussage
über das Profil der Aktivität innerhalb der bakteriellen Gemeinschaft gemacht werden
(Sessitsch et al., 2002; Fromin et al., 2007).
Eine Reaktion der einheimischen Bakterien z.B. ein Anstieg oder das Einstellen des
Stoffwechsels, beim Übergang in eine Ruhephase, kann als Indiz für den Einfluss VF39
(pRD20) oder die Behandlung der Rhizosphärengemeinschaft mit IAA gewertet werden.
Diese Reaktionen treten schneller und oft in stärkerem Maß auf als Veränderungen auf
rDNA-Ebene. Wie zu erwarten, zeigt die Gemeinschaftsanalyse, dass die Diversität der
aktiven bakteriellen Gemeinschaft sehr hoch ist. Jede Probe besitzt zwischen 40 und 62
Banden. Es ist allerdings auch sichtbar, dass die Bandenprofile keine so hohe
Ähnlichkeit mehr besitzen, wie bei der 16S rDNA Analyse. Die PCR- Produkte der
letzten Probennahme sind, bei gleicher Menge an aufgetragener DNA-Konzentration,
viel intensiver. Dies könnte auf einen stärkeren Anteil aktiver Bakterien innerhalb der
bakteriellen Gemeinschaft hindeuten. Die Banden 18, 20, 24 und 25 sind auffällig
intensiv. Das deutet auf eine sehr hohe Aktivität dieser Bakterien in der Gemeinschaft
hin. Deshalb wurden sie zur weiteren Untersuchung sequenziert, um die Bakterien
identifizieren zu können.
Die DICE-Analyse der 16S c-(r)DNA DGGE-Profile zeigt, dass die Gemeinschaftsprofile
aktiver bakterieller Populationen in der Rhizosphäre bei allen Proben eine über 65%ige
Ähnlichkeit besitzen. Die Probe „vor Animpfung“ fällt aus dem Cluster, genau wie bei der
16S rDNA Analyse. Die anderen Proben clustern ebenfalls größtenteils in Korrelation zu
ihrer Inkubationszeit. Die Ähnlichkeit der mit VF39 (pRD20) behandelten
Versuchsansätze beträgt stets mehr als 65% im Verhältnis zu den mit VF39 WT
inokulierten Versuchsansätzen oder der Kontrolle. Sie wird im Verlauf des Experiments
sogar größer 70% - 75% - 85%. Gegen Ende des Experiments ist deutlich zu sehen,
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 108 -
dass sich die bakteriellen Aktivitätsprofile in den einzelnen Versuchsansätzen sehr
ähnlich sind. Ein Einfluss einer Inokulation mit VF39 (pRD20) ist nicht sichtbar. Ein Effekt
der Behandlung mit IAA auf die Aktivität der Bakterien deutet sich nach der ersten
Woche an und ist nach der dritten Woche deutlich sichtbar. Er schwächt sich allerdings
zum Ende des Experiments hin wieder ab und ist nach neun Wochen Inkubation nicht
mehr zu sehen. Das deutet auf eine Anpassung der Bakterien an die veränderten
Bedingungen durch den unterschiedlichen IAA-Gehalt innerhalb der Rhizosphäre hin.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 109 -
D.2.2.3 Versuchsansatz V1 A und B: Shannon Index und Eveness
Abbildung 24: Shannon Diversitätsanalyse für Versuchsansatz V1
Die Analyse der Shannon-Diversität innerhalb der Rhizosphäre während des Versuchs
V1 basiert im Gegensatz zur DICE-Analyse nicht ausschließlich auf der Position der
Banden, sondern auch auf der Intensität der einzelnen Banden. Deswegen gibt sie nicht
nur Aufschluss über die Zusammensetzung der Bakterien innerhalb der Rhizosphäre in
Bezug auf ihre Anwesenheit oder Abwesenheit, sondern auch in Bezug auf die
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 110 -
Abundanz der anwesenden Bakterien. Die Diversität der Rhizosphäre in V1 befindet sich
bei allen Proben nach der ersten und letzten Woche ungefähr im selben Bereich. Die
Anzahl der Banden im DGGE-Gel, die die vorhandenen Bakterienarten repräsentieren,
nehmen bis zur neunten Woche zu (detaillierte Werte siehe Tabelle im Anhang).
Die Eveness Werte zeigen, dass alle vorhandenen Rhizosphärenbakterien in
vergleichbarer Anzahl vorhanden sein müssen. Der Kontrollansatz nimmt in seiner
Diversität erst ab, dann wieder zu und ist am Ende vergleichbar mit den anderen
Proben. Die Diversität im IAA behandelten Versuchsansatz nimmt während des
Versuchs stark ab. Die Anzahl der Banden und somit die der Bakterienarten liegt nach
neun Wochen unterhalb der Anzahl nach der ersten Probennahme. Die Eveness sinkt
von der dritten bis zur neunten Woche von 0,86 auf 0,49. Dieses Ergebnis zeigt, dass
die Behandlung mit IAA einen starken Einfluss auf die Diversität der
Bakteriengemeinschaft hatte. Sie weist einen Rückgang ihrer Artenzahl auf, zusätzlich
dazu ist die Verteilung der Bakterien am Schluss sehr ungleich, d.h. es gibt einige
Bakterien, die in ihrer Anzahl, als Reaktion auf das IAA, stark ab- bzw. zugenommen
haben und nun als prominente oder schwache Banden vorliegen. Dieser Einfluss ist
allerdings nicht signifikant.
Es gibt insgesamt keinen signifikanten Einfluss der Behandlung und Inkubationszeit auf
die Diversität der vorhandenen Rhizosphärenbakterien.
Die Auswertung der Diversität der aktiven Bakterienpopulation schwankt lediglich ein
wenig. Es zeigt sich kein Hinweis darauf, dass eine unterschiedliche Behandlung der
einzelnen Versuchsansätze das Aktivitätsprofil der Rhizosphärenbakterien beeinflusst.
Alle vorliegenden Bakterien sind in etwa gleichem Maß aktiv.
Abschließend kann man für die Gemeinschaft der Bakterien innerhalb der Rhizosphäre
sagen, dass es keinen signifikanten Einfluss der Inokulation mit VF39pRD20 gibt. Es ist
allerdings ein signifikanter Einfluss der IAA-Behandlung auf das Artenreichtum des
aktiven Bakterienprofils detektierbar, der sich auf die Diversität der vorhandenen
Bakterien auswirkt. Weiterhin spielt die Inkubationszeit für die Diversität (H’), die Anzahl
der Banden (s) und die Abundanz (Eveness) der aktiven Rhizosphärenbakterien eine
signifikante Rolle.
Die unterschiedliche Behandlung der einzelnen Versuchsansätze übt, mit Ausnahme der
IAA-Behandlung, keinen signifikanten Einfluss aus (siehe Statistik im Anhang).
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 111 -
Analyse der 16S rDNA (Rhizoplane)
42.
44.
45.49.
54.
vor A
nim
pfun
g
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Mar
ker
Mar
ker
Abbildung 25: DGGE-Gel für die 16S rDNA V1
aus der Rhizoplane nach 7 Tagen, 21 Tagen und 72 Tagen Inkubation und
daraus resultierender DICE-Analyse
Dice (Opt:0.06%) (Tol 0.3%-0.3%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
90807060504030
1-3 DNA RP
1-3 DNA RP1-3 DNA RP1-3 DNA RP
1-3 DNA RP1-3 DNA RP1-3 DNA RP
1-3 DNA RP1-3 DNA RP
1-3 DNA RP1-3 DNA RP1-3 DNA RP
1-3 DNA RP1-3 DNA RP
1-3 DNA RP1-3 DNA RP
2
541
181416
89
101211
63
1517
VF39 WT
VF39 (pHReGFPplac)
Kontrolle
VF39 WT
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
vor Animpfung
%
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
VF39 (pHReGFPplac)
VF39 (pHReGFPplac)
IAA
IAA
Rhizoplane V1 16S rDNA
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 112 -
D.2.2.4 Versuchsansatz V1 C: Analyse der 16S rDNA (Rhizoplane)
In Abbildung 25 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des Versuchs 1 (V1 C) auf
Basis der 16S rDNA der Rhizoplane dargestellt. Die Bandenprofile der Versuchsansätze
nach Inkubation von 7 und 21 Tagen sind sich sehr ähnlich. Nach Inkubation von 72
Tagen sehen die Bandenmuster der einzelnen Ansätze allerdings unterschiedlich aus.
Zur weiteren Analyse wurde die Bande 44 sequenziert, da sie in allen Ansätzen mit der
gleichen Intensität auftrat. Die Bande 49 trat nur bei den Versuchsansätzen der 3.
Probennahme nach 72 Tagen Inkubation auf. Diese Bakterienart brauchte entweder
länger um ihre Population zu vergrößern, weil sie sich in einer Ruhephase befunden hat,
oder sie war anfangs nur in einer sehr kleinen Anzahl vorhanden. Die Banden 42, 45
und 54 sind nur bei einzelnen Proben zu sehen. Das könnte ein Hinweis auf einen
Einfluss der unterschiedlichen Behandlungen der Versuchsansätze auf die Rhizoplane-
Gemeinschaft sein. So traten im Versuchsansatz VF39 (pRD20) nach 72 Tagen einige
Banden auf, die in keinem anderen Versuchsansatz zu finden waren.
Die DICE-Analyse für die rDNA Proben der Rhizoplane zeigt, dass sich die
Bakteriengemeinschaft nach der Behandlung mit IAA nach 72 Tagen Inkubation sehr
deutlich von den anderen Proben mit gleicher Inkubationszeit unterscheidet. Dies wird
auch anhand von Abbildung 25 ersichtlich. Die Probe „vor Animpfung“ fällt aus dem
Cluster, genau wie bei der Analyse der Rhizosphäre. Die Versuchsansätze VF39
(pHReGFPplac) und IAA nach 7 Tagen clustern mit den Versuchsansätzen nach 21
Tagen. Die Versuchsansätze VF39 WT und VF39 (pHReGFPplac) nach 72 Tagen
clustern ebenfalls nicht mit den korrespondierenden Versuchsansätzen nach 72 Tagen.
Schon das DGGE-Gel hat gezeigt, dass alle Versuchsansätze zu diesem Zeitpunkt sehr
unterschiedliche Bandenprofile aufwiesen. Die DICE-Analysen der einzelnen
Versuchsansätze zeigen zu allen drei Zeitpunkten nur eine Ähnlichkeit der
Bandenmuster von 70- 90%. Diese Streuung könnte sich durch die unterschiedliche
bakterielle Besiedlung der Wurzeln ergeben (Herschkovitz et al., 2005), da nicht ganz
ausgeschlossen werden kann, das teilweise unterschiedliche Abschnitte der Wurzeln für
die rDNA/ rRNA Extraktion benutzt wurden. Da sich bakterielle Gemeinschaften der
Rhizoplane als zeitlich sehr stabil erwiesen haben und auch in der Rhizoplane von Mais
nicht durch zusätzliche Inokulation mit dem IAA-synthetisierenden Stamm A. brasilense
SP245 beeinflusst wurden (Herschkovitz et al., 2005), wird ein Effekt der Behandlung mit
VF39 (pRD20) ausgeschlossen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 113 -
Analyse der 16S c-(r)DNA (Rhizoplane)
62.
vor A
nim
pfun
g
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Kon
trol
le
VF39
(pH
ReG
FPpl
ac)
VF39
(pR
D20
)
VF39
WT
IAA
10-6
Mar
ker
Mar
ker
Abbildung 26: DGGE-Gel für die 16S c-(r)DNA V1
aus der Rhizoplane nach 7 Tagen, 21 Tagen und 72 Tagen Inkubation und
daraus resultierender DICE-Analyse
Dice (Tol 0.2%-0.2%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
90807060504030
1-3 cDNA RP
1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP
1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP
1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP
1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP
1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP
1-3 cDNA RP1-3 cDNA RP
14
161513
387
1011
1296
54
217
VF39 WT
VF39 (pHReGFPplac)
Kontrolle
VF39 WT
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
vor Animpfung
%
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
IAA
VF39 (pHReGFPplac)
VF39 (pHReGFPplac)
IAA
Rhizoplane V1 16S c-(r)DNA
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 114 -
D.2.2.5 Versuchsansatz V1 D: Analyse der 16S c-(r)DNA (Rhizoplane)
In Abbildung 26 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des Versuchs 1 (V1 D) auf
Basis der 16S c-(r)DNA der Rhizoplane dargestellt. Es fällt deutlich auf, dass nach 72
Tagen Inkubation wesentlich mehr Bakterienarten aktiv sind als vorher. Die
Bandenprofile der einzelnen Versuchsansätze nach Inkubation von 7 und 21 Tagen sind
bis auf einige Ausnahmen im Bandenmuster sehr ähnlich. Erst zwischen 21 und 72
Tagen divergieren die Bandenmuster der einzelnen Versuchsansätze. Besonders im
oberen Teil des Gels kommen viele Banden neu hinzu. Das deutet darauf hin, dass
diese Bakterien vorher entweder nicht aktiv waren, oder so wenig aktiv, dass sie nicht
detektiert werden konnten. Wenn man die Banden mit denen des 16S rDNA-Gels
vergleicht, fällt auf, dass auch nach 72 Tagen Inkubation im oberen Bereich noch neue
Banden sichtbar werden. Das gibt Anlass zur Vermutung, dass einige dieser Bakterien
inaktiv waren oder in der PCR aufgrund ihrer geringen template-Menge kaum amplifiziert
wurden (Zhang & Fang, 2000; Fromin et al., 2007). Zur weiteren Analyse wurde bisher
nur die Bande 62 erfolgreich sequenziert, weitere Banden werden vorbereitet.
Die DICE-Analyse der aktiven Bakteriengemeinschaft innerhalb der Rhizoplane zeigt,
dass der Versuchsansatz IAA nach 72 Tagen sehr wenig Ähnlichkeit mit den anderen
hat. Das kann jedoch daran liegen, dass die PCR für diese Probe nicht optimal
funktionierte und deswegen weniger rDNA auf das DGGE-Gel geladen wurde, was zu
einer schwierigen Auswertung dieser Probe führte. Die beiden Kontrollansätze sehen
sich in den ersten 21 Tagen ähnlich. Sie liegen allerdings außerhalb der anderen
Cluster. Nach 72 Tagen clustert die Kontrolle allerdings mit den anderen Proben zu
diesem Zeitpunkt. Insgesamt läst sich ablesen, dass der Einfluss durch die zusätzliche
Inokulation vorhanden ist, sich die Bakterien nach 72 Tagen aber offensichtlich daran
gewöhnt haben. Das Profil der aktiven Bakteriengemeinschaft der Rhizoplane ist in allen
Versuchsansätzen nach dieser Zeit in einem Cluster gelegen.
Es ist kein deutlicher Einfluss durch Inokulation oder die Behandlung mit IAA sichtbar.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 115 -
D.2.2.6 Versuchsansatz V1 C und D: Shannon Index und Eveness
Abbildung 27 Shannon Diversitätsanalyse für Versuchsansatz V1
Die Diversitätsanalyse ergibt eine starke Abweichung der Probe VF39 (pHReGFPplac)
nach 72 Tagen. Das liegt allerdings an einem Fehler innerhalb des DGGE-Gels (siehe
Abbildung 25). Deswegen konnten die Werte für den Shannon Index nicht eindeutig
ermittelt werden. Ansonsten ist erkennbar, dass alle Versuchsansätze innerhalb der 72
Tage an Diversität zunehmen. Das ist allerdings eine normale zeitabhängige Reaktion,
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 116 -
die durch das Altern der Pflanzen und die dadurch veränderte Wurzelexsudation
begründet werden kann (Ikeda et al., 2005; Herschkovitz et al., 2005).
Die Eveness Werte für die 16S rDNA der Rhizoplane zeigen eine Ungleichverteilung der
Bakterien, was schon anhand des DGGE-Gels deutlich erkennbar war. Es gab
prominente und schwache Banden. Die Eveness Werte der 16S c-(r)DNA liegen alle
zwischen 0,81 und 0,90 (detaillierte Werte siehe Tabelle im Anhang).
Die statistische Auswertung zeigt allerdings keinen signifikanten Einfluss der
Behandlung und/ oder der Inkubationszeit auf die Zusammensetzung der Bakterien und
ihrer Aktivität innerhalb der Rhizoplane.
D.2.2.7 Zusammenfassung der Ergebnisse der Versuchsansätze V1 A- D
Abschließend kann man sagen, dass kein signifikanter Einfluss einer Inokulation mit
dem modifizierten Stamm VF39 (pRD20) zu sehen ist. Ein leichter Einfluss dieses
Stammes ist lediglich in der ersten Woche nach Inokulation in der DICE Analyse der 16S
rDNA zu sehen und beruht auf der zusätzlichen Einführung dieses Stamms in den
Boden (Lynch et al., 2004;). Da die Zellzahl inokulierter Bakterienstämme im nativen
Boden generell innerhalb kurzer Zeit sehr stark abnimmt (van Elsass, et al., 1997) ist
davon auszugehen, dass dieser Effekt nach der zweiten Probennahme bereits
verschwunden ist.
Die Inokulation mit VF39 WT und VF39 (pHReGFPplac) (als Leerplasmid) zeigte keine
starke Veränderung in den Versuchsansätzen. Es ist allerdings deutlich, dass die
Entwicklung der Bakterien und ihre Aktivität, sowohl in der Rhizosphäre, als auch in der
Rhizoplane, zeitabhängig waren. Das liegt vermutlich daran, dass sie auf das Wachstum
der Erbse und die zeitlich bedingten Veränderungen der Wurzelexsudate reagieren
(Herschkovitz et al., 2005; Ikeda et al., 2005; Scherwinski, 2007). Die Wurzelexsudate
sind zu allen drei Zeitpunkten der Probennahme in Korrelation zur Inkubationszeit sehr
verschieden (siehe Haselier, 2006).
Ein Effekt der Behandlung mit IAA auf die bakterielle Gemeinschaft der Rhizosphäre ist
nicht auszuschließen. Die Diversität des Versuchsansatzes nach 72 Tagen war extrem
gesunken. Die statistische Auswertung ergab sowohl einen signifikanten Effekt der
Behandlung mit IAA, als auch der Inkubationszeit auf die Diversität, Anzahl der
bakteriellen Gruppen und Abundanz innerhalb der aktiven bakteriellen Gemeinschaft der
Rhizosphäre.
Für die Rhizoplane wurde kein signifikanter Einfluss der Behandlung oder
Inkubationszeit gefunden. Da die Bakterien innerhalb der Rhizoplane in einem
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 117 -
komplexen Aggregat leben und interagieren, wird vermutet, dass sie auf externe
Faktoren weniger sensitiv reagieren als das in der Rhizosphäre der Fall ist.
Zusätzlich erfolgt die Besiedlung von Pflanzenwurzeln und einzelnen Wurzelabschnitten
durch inokulierte Bakterien keineswegs gleichmäßig (Zimmer, 2003). Da aufgrund
weiterer Analysen nicht die Rhizoplane der kompletten Wurzel zur
Nukleinsäureextraktion verwendet wurde, kann es dadurch zu vermehrten
Unterschieden zwischen den DGGE-Profilen der verschiedenen Versuchsansätze
gekommen sein.
In einer zusätzlich durchgeführten tRFLP-Analyse (siehe Anhang) zeigte sich ebenfalls
ein Effekt der IAA Behandlung auf die Zusammensetzung der Bakterien in Rhizosphäre
und Rhizoplane nach 72 Tagen. Dieses Ergebnis bestätigt die DICE-Analyse. Ein
weiterer Vergleich der Ergebnisse mit der ARISA Analyse (Haselier, 2006) zeigte, dass
auch dort nach 72 Tagen ein Effekt von IAA auf die bakterielle Gemeinschaft sichtbar
wurde.
Die molekularbiologisch ermittelten Ergebnisse stehen allerdings im Gegensatz zu den
Ergebnissen der GC-MS Messungen der IAA in der Rhizosphäre. Der IAA Gehalt war für
alle Rhizosphären-Ansätze etwa gleich. Da IAA nicht sehr stabil ist, könnte allerdings in
der Rhizosphäre oder bei der Probenaufbereitung ein Teil abgebaut worden sein.
D.2.3 Versuchsansatz V2: Analyse der bakteriellen Gemeinschaft in der
Rhizosphäre und Rhizoplane der Erbse nach zehntägiger Inkubationszeit
Da sowohl in der GC-MS Analyse, wie auch in Versuchsansatz V1 und Daten aus der
Diplomarbeit von André Haselier Hinweise darauf zu sehen waren, dass ein möglicher
Effekt der Inokulation mit dem IAA-synthetisierenden VF39 (pRD20) Stamm innerhalb
der ersten Woche der Inkubationszeit auftraten, wurde der Versuchsansatz V2 mit einem
kürzeren Zeitrahmen angelegt. Zusätzlich zu VF39 (pRD20) wurde der Stamm VF39
(pBBRIAA) für die Inokulation benutzt. Er besitzt die gleichen Gene für die IAA-Synthese
(iaaM und tms2), allerdings unter dem schwachen, induzierbaren rolA Promotor. Die
Probennahme erfolgte vor Animpfung, nach drei und zehn Tagen Inkubation.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 118 -
Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V2; Rhizosphäre)
VF39
(pB
BR
IAA
)
vor A
nim
pfun
g
Mar
ker
Mar
ker
vor A
nim
pfun
g
VF39
(pB
BR
IAA
)
VF39
WT
VF39
WT
VF39
(pR
D20
)
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
Kon
trol
le
VF39
(pB
BR
IAA
)
VF39
(pB
BR
IAA
)
VF39
WT
VF39
WT
VF39
(pR
D20
)
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
Kon
trol
le
Inkubation 10 Tage Inkubation 3 Tage
Abbildung 28: DGGE-Gel für die16SrDNA und c-(r)DNA V2
aus der Rhizoplane nach 3 Tagen und 10 Tagen Inkubation und daraus
resultierender DICE-Analyse;
DGGE Gel: aufgetragen sind in grau: c-(r)DNA; schwarz: rDNA Proben
Dice (Opt:0.20%) (Tol 0.2%-0.2%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
95908580757065605550454035
2.Versuch c.
2.Versuch c.2.Versuch c.2.Versuch c.
2.Versuch c.2.Versuch c.2.Versuch c.
2.Versuch c.2.Versuch c.
10
141216
8184
62
Dice (Tol 0.4%-0.4%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
9590858075706560555045
2.Versuch cD.
2.Versuch cD.2.Versuch cD.2.Versuch cD.
2.Versuch cD.2.Versuch cD.2.Versuch cD.
2.Versuch cD.2.Versuch cD.
VF39 WT
VF39 (pBBRIAA)VF39 (pRD20)
KontrolleVF39 WT
VF39 (pBBRIAA)VF39 (pRD20)
Kontrolle
vor Animpfung
Rhizosphäre V2 16S rDNA
%
VF39 WT
VF39 (pBBRIAA)VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 WT
VF39 (pBBRIAA)
VF39 (pRD20)
Kontrolle
vor Animpfung
Rhizosphäre V2 16S c-(r)DNA
%
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 119 -
Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V2; Rhizoplane)
VF39
(pB
BR
IAA
)
vor A
nim
pfun
g
Mar
ker
Mar
ker
vor A
nim
pfun
g
VF39
(pB
BR
IAA
)
VF39
WT
VF39
WT
VF39
(pR
D20
)
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
Kon
trol
le
VF39
(pB
BR
IAA
)
VF39
(pB
BR
IAA
)
VF39
WT
VF39
WT
VF39
(pR
D20
)
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
Kon
trol
le
Inkubation 10 Tage Inkubation 3 Tage
Abbildung 29:DGGE-Gel für die 16SrDNA und c-(r)DNA V2
aus der Rhizoplane nach 3 Tagen und 10 Tagen Inkubation und daraus
resultierender DICE-Analyse
DGGE Gel: aufgetragen sind in grau: c-(r)DNA; schwarz: rDNA Proben
Dice (Opt:0.10%) (Tol 0.1% -0.1%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
90
8070
605040
2.Versuch .
2.Versuch .2.Versuch .2.Versuch .
2.Versuch .2.Versuch .2.Versuch .
2.Versuch .2.Versuch .
9
71117
151319
53
VF39 WT
VF39 (pBBRIAA)
VF39 (pRD20)Kontrolle
VF39 WTVF39 (pBBRIAA)
VF39 (pRD20)Kontrolle
vor Animpfung
%Rhizoplane V2 16S c-(r)DNA
Dice (Opt:0.20%) (Tol 0.1%-0.1%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
90807060504030
2.Versuch c.
2.Versuch c.2.Versuch c.2.Versuch c.
2.Versuch c.2.Versuch c.2.Versuch c.
2.Versuch c.2.Versuch c.
6
161012
8142
418
VF39 WTVF39 (pBBRIAA)
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 WTVF39 (pBBRIAA)
VF39 (pRD20)
Kontrolle
vor Animpfung
%
Rhizoplane V2 16S rDNA
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 120 -
D.2.3.1 V2 A- D: Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (Rhizosphäre und Rhizoplane)
In Abbildung 28 und Abbildung 29 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse des
Versuchs 2 auf Basis der 16S rDNA und c-(r)DNA der Rhizosphäre dargestellt. Die
DICE-Analyse der Rhizosphäre für den Versuchsansatz V2 zeigte für die rDNA
Auswertung einen leichten Effekt, durch die Inokulation mit VF39 (pRD20) und VF39
(pBBRIAA). Die Versuchansätze clustern, unabhängig ihrer Inkubationszeit. Dieses
Ergebnis bestätigt die Vermutung aus dem Versuchsansatz V1, in dem ausschließlich in
den ersten sieben Tagen des Versuchs V1 ein leichter Effekt der VF39 (pRD20)
Inokulation festgestellt werden konnte. Dieses Ergebnis wurde ebenfalls in der
Diplomarbeit von André Haselier durch DGGE-Analyse der pilzlichen Gemeinschaft
gezeigt.
Die Ansätze mit VF39 (pRD20) und VF39 (pBBRIAA) nach drei Tagen Inkubation bilden
ein gemeinsames Cluster, was auf einen möglichen Effekt hindeuten könnte. Dieser
Effekt war für VF39 (pRD20) nach zehn Tagen Inkubation allerdings nicht mehr sichtbar,
dann clusterte der mit VF39 (pRD20) behandelte Versuchsansatz mit der VF39 WT
Probe. Ein eindeutiger Effekt der VF39 (pBBRIAA) Inokulation auf das Profil der aktiven
Rhizosphärenbakterien ist nach zehn Tagen Inkubation feststellbar. Das Bandenmuster
der Probe hatte wenig Ähnlichkeit mit denen der anderen Versuchsansätze. Der Effekt
einer Inokulation mit VF39 (pRD20) schwächt sich also wahrscheinlich im Verlauf von
zehn Tagen ab, während der Einfluss der Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) in diesem
Zeitraum vermutlich noch zunimmt.
Die Untersuchung der Rhizoplane zeigte für die rDNA ebenfalls einen Effekt der
Inokulation mit VF39 (pRD20). Die mit VF39 (pRD20) inokulierte Probe (zehn Tage)
clustert mit der Kontrolle nach drei Tagen Inokulation und umgekehrt. Weiterhin befinden
sich beide VF39 (pRD20) inokulierten Ansätze im Cluster mit allen korrespondierenden
Ansätzen zum anderen Zeitpunkt der Probennahme. Das könnte ein Hinweis darauf
sein, dass die bakterielle Gemeinschaft dieses Ansatzes sich in den sieben Tagen
zwischen beiden Probennahme nicht weiterentwickelt und verändert hat. Da VF39
(pRD20) (zehn Tage Inkubation) mit den Proben nach drei Tagen Inkubation ein
gemeinsames Cluster bildet könnte eine Veränderung in der
Gemeinschaftszusammensetzung auch zum Stillstand gekommen sein. Diese Theorie
wird durch die Diversitätsanalyse (Abbildung 31) unterstützt.
Die Analyse der Bandenmuster für die c-(r)DNA der Rhizoplane zeigte keinen Effekt für
Inokulation mit VF39 (pRD20). Die Probe bildet stets Cluster zusammen mit dem WT
oder der Kontrolle. Ein leichter Effekt ist für VF39 (pBBRIAA) (nach drei Tagen
Inkubation) sichtbar. Diese Probe bildet ein Cluster mit der Kontrolle und VF39 (pRD20)
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 121 -
nach zehn Tagen Inkubation. Eine eindeutige Aussage über einen Effekt der Inokulation
mit den gentechnisch veränderten Stämmen kann allerdings nicht gemacht werden, da
die Auflösung der Banden im unteren Bereich des DGGE-Gels nicht sehr gut ist.
D.2.3.2 Versuchsansatz V2 A– D: Shannon Index und Eveness
Abbildung 30: Diversitätsanalyse der Rhizosphäre V2 rDNA und c-(r)DNA rot-schwarzes Dreieck: Diversität rDNA vor Animpfung rotes Dreieck: Diversität c-(r)DNA vor Animpfung rDNA: durchgezogene Linien; c-(r)DNA: gestrichelte Linien
Abbildung 31: Diversitätsanalyse der Rhizoplane V2 rDNA und c-(r)DNA rot-schwarzes Dreieck: Diversität rDNA vor Animpfung rotes Dreieck: Diversität c-(r)DNA vor Animpfung rDNA: durchgezogene Linien; c-(r)DNA: gestrichelte Linien
In Versuchsansatz V2 wird ein starker Effekt hinsichtlich der Diversität der bakteriellen
Gemeinschaft in den mit VF39 (pRD20) inokulierten Versuchsansätzen der Rhizosphäre
und Rhizoplane sichtbar. Die Diversität der rDNA Analyse dieser Ansätze nimmt
während des Versuchs kontinuierlich ab, während die der anderen Versuchsansätze
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 122 -
ansteigt. Die Diversität der c-(r)DNA nimmt hingegen zu. Das Vorhandensein eines
Einflusses von VF39 (pRD20) auf die Rhizosphärengemeinschaft wurde ebenfalls in der
vorangegangenen DICE-Analyse detektiert.
Die Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) beeinflusst die Diversität der bakteriellen
Gemeinschaft und ihre Aktivität innerhalb der Rhizosphäre, nicht jedoch innerhalb der
Rhizoplane. Die Diversität in der Zusammensetzung der aktiven Bakterien (c-(r)DNA)
nimmt während des Versuchs stark ab, während sie in den anderen Versuchsansätzen
zunimmt. Dieses Ergebnis bestätigt die DICE-Analyse, in der für diesen Versuchsansatz
ebenfalls ein Effekt sichtbar wird.
Die Diversitätsanalyse der Rhizoplane zeigt keinen signifikanten Effekt einer Behandlung
auf die Diversität. Bis auf die Kontrolle und VF39 (pRD20) zeigen alle Versuchsansätze
für die rDNA Auswertung eine Zunahme in der Diversität. Das lässt sich durch die
zeitlich bedingte Weiterentwicklung der bakteriellen Gemeinschaft innerhalb der
Rhizoplane begründen. Die Zusammensetzung der Bakterien wird scheinbar mit der Zeit
diverser und die Aktivität der einzelnen Bakterien ebenfalls. Das liegt vermutlich an der
PCR, die verschiedene rDNA-templates unterschiedlich bevorzugt amplifiziert (Zhang &
Fang, 2002).
Die Eveness der Versuchsansätze zeigt ebenfalls, dass die Verteilung der Bakterien und
die Aktivität innerhalb der Rhizoplane relativ gleichmäßig verteilt ist (Herschkovitz,
2005). Zwar tauchen im Gel prominente und schwache Banden auf, allerdings sind diese
in fast allen Proben vorhanden. Durch statistische Auswertung konnte allerdings kein
signifikanter Einfluss von Inokulation oder Inkubationsdauer auf die Diversität in
Rhizosphäre und Rhizoplane festgestellt werden.
D.2.4 Versuchsansatz V3: Analyse der bakteriellen Gemeinschaft in der
Rhizosphäre und Rhizoplane der Luzerne nach zehntägiger Inkubationszeit
Parallel zu Versuchsansatz 2 wurde der Versuchsansatz 3 analysiert. In diesem
Versuchsansatz wurde der Einfluss des VF39 (pRD20) Stammes auf die Rhizosphäre
und Rhizoplane der Luzerne, die keine Wirtspflanze des R. leguminosarum bv. viciae
VF39 Stammes ist, getestet. Die Frage, ob VF39 in der Rhizosphäre der Erbse
möglicherweise anders reagiert als in der Rhizosphäre der Luzerne, sollte durch diesen
Versuchsansatz genauer untersucht werden. Zum Vergleich mit den Ergebnissen aus
Versuchsansatz V2 wurde dieselbe Inkubationszeit von drei und zehn Tagen auch für
diesen Versuchsansatz übernommen. Weiterhin sind alle Kultivierungsbedingungen für
V2 und V3 identisch.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 123 -
Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V3; Rhizosphäre)
cDNAvo
r Ani
mpf
ung
Mar
ker
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
vor A
nim
pfun
g
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
DNA
Abbildung 32: DGGE für 16SrDNA und c-(r)DNA V3
aus der Rhizosphäre nach 3 Tagen und 10 Tagen Inkubation und
daraus resultierender DICE-Analyse
Dice (Opt:0.50%) (Tol 0.5%-0.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
98969492908886848280787674
Versuch3RZ cD
Versuch3RZ cDVersuch3RZ cDVersuch3RZ cD
Versuch3RZ cD
Dice (Opt:0.50%) (Tol 0.5%-0.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
989694929088868482
Versuch3RZ DNA
Versuch3RZ DNAVersuch3RZ DNAVersuch3RZ DNA
Versuch3RZ DNA
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Kontrolle
vor Animpfung
%
Rhizosphäre V3 16S rDNA
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Kontrolle
vor Animpfung
%
Rhizosphäre V3 16S c-(r)DNA
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 124 -
Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V3; Rhizoplane)
cDNAvo
r Ani
mpf
ung
Mar
ker
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
vor A
nim
pfun
g
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
VF39
(pR
D20
)
Kon
trol
le
DNA
Abbildung 33:DGGE für 16SrDNA und c-(r)DNA V3
aus der Rhizoplane nach 3 Tagen und 10 Tagen Inkubation und
daraus resultierender DICE-Analyse
Dice (Opt:0.50%) (Tol 0.1%-0.1%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
9080706050403020
Versuch3 RP cD
Versuch3 RP cDVersuch3 RP cDVersuch3 RP cD
Versuch3 RP cD
Dice (Tol 0.2%-0.2%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
9080706050403020
Versuch3 RP D.
Versuch3 RP D.Versuch3 RP D.Versuch3 RP D.
Versuch3 RP D.
01.0
25.024.022.0
31.0
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Kontrolle
vor Animpfung
%
Rhizoplane V3 16S rDNA
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Kontrolle
vor Animpfung
%
Rhizoplane V3 16S c-(r)DNA
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 125 -
D.2.4.1 V3 A- D: Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (Rhizosphäre und Rhizoplane)
In Versuchsansatz V3 mit Luzerne (Medicago sativa) einer „Nicht-Wirtsplanze“ für R.
leguminosarum bv. viciae VF39 zeigt sich ein Einfluss der Inokulation mit VF39 (pRD20)
auf die Rhizosphäre. Nach drei Tagen Inkubation bildet der Versuchsansatz VF39
(pRD20) ein Cluster mit dem Versuchsansatz vor Beginn des Experiments. Es scheint in
diesem Zeitraum innerhalb der bakteriellen Gemeinschaft keine Veränderung
stattgefunden zu haben. Nach zehn Tagen ist dieser Effekt für VF39 (pRD20) nicht mehr
sichtbar. Allerdings deutet sich auch für die Struktur der aktiven Bakteriengemeinschaft
ein Effekt durch VF39 (pRD20) an. Zwar bildet der Versuchsansatz stets ein Cluster mit
VF39 WT, jedoch nicht mit der jeweils korrespondierenden Probe zum selben Zeitpunkt
der Probennahme.
Das könnte bedeuten, dass die Aktivität der Bakterien bei VF39 (pRD20) (drei Tage
Inkubation) zuerst Ähnlichkeit mit denen der Kontrolle (zehn Tage Inkubation) hatte, sich
anschließend die Struktur der aktiven bakteriellen Gemeinschaft verändert hat und die
Diversität der aktiven Bakterienpopulationen, im Gegensatz zu den anderen Proben,
nicht konstant geblieben ist, sondern abgenommen hat.
Für die Auswertung der Rhizoplane lässt sich keine Aussage über einen Effekt machen,
da die Ähnlichkeit der Proben maximal 40% betrug. Alle Versuchsansätze zeigten sehr
unterschiedliche Bandenmuster. Die Diversitätsanalyse zeigte eine Abnahme innerhalb
der Diversität des mit VF39 (pRD20) behandelten Versuchsansatzes. Die Bakterien
innerhalb der Rhizosphäre sind nach zehn Tagen Inkubation weniger divers als am
Anfang des Versuchs. Bei gleicher Anzahl der Phylotypen sinkt die Eveness. Das
bedeutet, dass die Zellzahl einiger Bakterienarten gesunken oder gestiegen ist. Das
könnte ein Effekt der Inokulation mit VF39 (pRD20) sein.
Die Auswertung für diesen Versuchsansatz wurde durch die Tatsache, dass die Luzerne
nur wenige Wurzeln hatte, erschwert. Es gab keine klare Begrenzung zwischen
Rhizosphäre und umgebender Erde. Auch war die Probennahme der Rhizoplane durch
die geringe Anzahl der Wurzeln sehr erschwert.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 126 -
D.2.4.2 Versuchsansatz V3 A- D: Shannon Index und Eveness
Abbildung 34 Diversitätsanalyse der Rhizosphäre V3 rDNA und c-(r)DNA rot-schwarzes Dreieck: Diversität DNA vor Animpfung rotes Dreieck: Diversität c-(r)DNA vor Animpfung rDNA: durchgezogene Linien; c-(r)DNA: gestrichelte Linien
Abbildung 35 Diversitätsanalyse der Rhizoplane V3 rDNA und c-(r)DNA rot-schwarzes Dreieck: Diversität DNA vor Animpfung rotes Dreieck: Diversität c-(r)DNA vor Animpfung rDNA: durchgezogene Linien; c-(r)DNA: gestrichelte Linien
Wie man in der Diversitätsanalyse der unterschiedlich behandelten Versuchsansätze der
Rhizosphäre und Rhizoplane sieht, scheint die Inokulation mit VF39 (pRD20) einen
Einfluss auf die Bakterien der Rhizoplane zu haben. Die Diversität innerhalb dieses
Versuchsansatzes sinkt während des Versuchs, die der anderen Proben steigt an.
Dieses Ergebnis wurde ebenfalls in der Diversitätsanalyse der Rhizosphäre des
Versuchs V2 sichtbar. Da in der Rhizoplane sowohl die Diversität der Kontrolle als auch
die Diversität der mit VF39 (pRD20) inokulierten Versuchsansätze auf Basis der rDNA
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 127 -
ansteigt, während die Diversität auf Basis der c-(r)DNA sinkt, kann davon ausgegangen
werden, dass es keinen Effekt durch VF39 (pRD20) gibt.
Die statistische Auswertung bestätigt, dass weder einen signifikanten Einfluss der
Inokulation, noch der Inkubationszeit auf die Diversität vorhanden ist.
D.2.4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der Versuchsansätze V2 und V3
Nach Auswertung der Ergebnisse für den Versuchsansatz V2 (mit Pisum sativum) und
V3 (mit Medicago sativa) kann sicher davon ausgegangen werden, dass es keinen
länger anhaltenden Effekt einer Inokulation mit VF39 (pRD20) auf die bakterielle
Gemeinschaft und die Struktur der aktiven bakteriellen Gemeinschaft innerhalb der
Rhizosphäre und Rhizoplane gibt.
Weiterhin gilt dieses Resultat nicht nur für die Beimpfung der Wirtspflanze (V2), sondern
auch die der Nicht-Wirtspflanze (V3). Die möglichen Effekte der Inokulation mit VF39
(pRD20) sind zu Beginn der Experimente sichtbar und reduzieren sich dann. Auch sind
diese Effekte lediglich bei Untersuchung der 16S rDNA sichtbar. Die Aktivität der
bakteriellen Gemeinschaft, ausgewertet in der 16S c-(r)DNA, scheint unbeeinflusst.
Bemerkenswerterweise hat die Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) im Gegensatz zu VF39
(pRD20) einen offensichtlichen Einfluss auf die bakterielle Gemeinschaft und ihre
Aktivität. Ein Grund dafür könnte die größere Stabilität des pBBRIAA-Plasmids,
vermutlich bedingt durch die geringere metabolische Belastung der Rhizobien (Mølbak,
2003; Joquera et al., 2006; Sørensen, 2005), im Gegensatz zum pRD20-Plasmid sein
(siehe Analyse der Plasmidstabilität).
Die Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) und VF39 (pRD20) beeinflusste in diesem
Versuchsansatz ebenfalls die Zusammensetzung der Wurzelexsudate (Daten siehe
André Haselier). Das hat wiederum Auswirkungen auf die Zusammensetzung der
bakteriellen Gemeinschaft und ihrer Aktivität, innerhalb der Rhizosphäre. Diese
Auswirkungen betreffen auch diesmal nicht die Bakteriengemeinschaft der Rhizoplane,
da die dort vorliegenden Bakterien in einem komplexen Aggregat vorliegen und deshalb
unempfindlicher gegenüber transienten Veränderungen sind (Herschkovitz et al., 2005;
Zimmer, 2003).
Zusammenfassend ist der Einfluss der Inokulation mit VF39 (pRD20) nicht deutlich, der
von VF39 (pBBRIAA) zwar offensichtlicher, aber insgesamt scheint ein Effekt nicht
dauerhaft. Der Einfluss beider Stämme auf die Diversität innerhalb der Rhizosphäre und
Rhizoplane ist nicht signifikant.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 128 -
Um die Langzeitwirkung der inokulierten Stämme auf die bakterielle Gemeinschaft in der
Rhizosphäre und Rhizoplane der Erbse zu untersuchen wurde anschließend an die
Experimente V2 und V3 noch ein vierter Versuchsansatz V4 angeschlossen.
D.2.5 Versuchsansatz V4: Analyse der bakteriellen Gemeinschaft in der
Rhizosphäre und Rhizoplane der Erbse nach zwölfwöchiger Inkubationszeit
In diesem Versuchsansatz wurde die „Langzeitwirkung“ der gentechnisch veränderten
Bakterien näher betrachtet. Da nicht (eindeutig) sicher war, ob die Expression der
Plasmid-kodierten Gene, die der zusätzlichen IAA-Synthese dienen auch in den
Bakteroiden gewährleistet ist, wurden zwei neu konstruierte VF39-Stämme getestet, die
eine stabile Erhaltung des Plasmids innerhalb der Bakterien so wie eine Expression der
Gene für die IAA-Synthese in den Bakteroiden gewährleisten. Die Gene für die IAA-
Synthese wurden sowohl unter dem konstitutiven CAT-Promotor als auch unter dem
induzierbaren rolA Promotor in das pJP2-Plasmid (siehe Jürgen Prell) integriert, um die
entstandenen Plasmide pJPpCAT und pJProlA analog zu pRD20 und pBBRIAA
benutzen zu können. Als Vergleich diente wiederum der VF39 WT Stamm und der
unbehandelte Kontrollansatz. Die Inkubation betrug zwölf Wochen. Dieser Zeitraum
wurde gewählt, weil die verwendeten Erbsen innerhalb dieser Zeit ihren vollständigen
Generationszyklus bis zur Seneszenz (der Pflanzen) durchlaufen (siehe Abbildung 36). Abbildung 36: Wachstumskurve der Einzelteile einer Erbsenpflanze (nach Geisler, 1988) a: Schoten; b: Stamm; c: Blätter; d: Wurzeln;
aufgetragen ist die Dauer des Wachstums (x-Achse)
gegen die Trockenmasse (TM) in Gramm der einzelnen
Pflanzenteile (y-Achse)
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 129 -
Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (V4; Rhizosphäre und Rhizoplane)
Mar
ker
VF39
(pJP
rolA
) [R
P]
VF39
(pJP
rolA
) [R
P]
VF39
(pJP
pCA
T) [R
Z]
VF39
(pJP
pCA
T) [R
Z]
VF39
WT
[RZ]
VF39
WT
[RZ]
Kon
trol
le [R
P]
Kon
trol
le [R
P]
Mar
ker
VF39
(pJP
rolA
) [R
P]
VF39
(pJP
rolA
) [R
P]
VF39
(pJP
pCA
T) [R
Z]
VF39
(pJP
pCA
T) [R
Z]
VF39
WT
[RZ]
VF39
WT
[RZ]
Kon
trol
le [R
P]
Kon
trol
le [R
P]
Abbildung 37:DGGE-Gel für die 16SrDNA und c-(r)DNA V4
aus der Rhizosphäre und Rhizoplane nach 12 Wochen Inkubation und daraus
resultierender DICE-Analyse; RZ: Rhizosphäre, RP: Rhizoplane;
schwarz: PCR Produkte der 16S rDNA
grün: PCR Produkte der 16S c-(r)DNA
Dice (Opt:0.50%) (Tol 0.5%-0.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
9590858075706560555045
Versuch4 rolA 1-4 R
Versuch4 ohne 1-3 Versuch4 pCAT1-4 Versuch4 WT1-3 R
Versuch4 pCAT1-4 Versuch4 WT1-3 RVersuch4 ohne 1-3
Versuch4 rolA 1-4 RKontrolle
Kontrolle
VF39 (pJProlA)
VF39 (pJProlA)
VF39 (pJPpCAT)
VF39 (pJPpCAT)
VF39 WT
VF39 WT
%
Rhizoplane V 4 16S rDNA und c-(r)DNA
Dice (Opt:0.50%) (Tol 0.5%-0.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE1
100
9590858075706560
Versuch4 rolA1-4
Versuch4 ohne1-3Versuch4 pCAT1-4Versuch4 WT1-3 R
Versuch4 pCAT1-4Versuch4 WT1-3 RVersuch4 rolA 1-4
Versuch4 ohne 1-3
VF39 (pJProlA)
VF39 (pJProlA)
VF39 (pJPpCAT)
VF39 (pJPpCAT)
VF39 WT
VF39 WT
Kontrolle
Kontrolle
Rhizosphäre V 4 16S rDNA und c-(r)DNA
%
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 130 -
D.2.6 V4 A- D: Analyse der 16S rDNA/c-(r)DNA (Rhizosphäre und Rhizoplane)
In Abbildung 37 sind die Profile der Gemeinschaftsanalyse auf Basis der 16S rDNA und
c-(r)DNA der Rhizosphäre und Rhizoplane nach zwölf Wochen Inkubationsdauer
aufgetragen. Es lassen sich jeweils zwei getrennte Cluster erkennen. Eins für die 16S
rDNA, das andere für die 16S c-(r)DNA. In der Analyse der Rhizosphäre bilden die mit
VF39 (pJProlA) und VF39 (pJPpCAT) inokulierten Ansätze immer Cluster mit den
Kontroll- oder VF39 WT inokulierten Ansätzen. Das gilt sowohl für die Analyse der 16S
rDNA, als auch der 16S c-(r)DNA. Die Ähnlichkeit der Bandenmuster liegt dabei für die
rDNA oberhalb von 85%, die der c-(r)DNA über 65%. Daraus lässt sich schließen, dass
es keinen Einfluss der Inokulation mit den gentechnisch veränderten Stämmen nach 12
Wochen Inkubation gab. In der Rhizoplane hingegen fällt auf, dass der Versuchsansatz,
der mit VF39 (pJProlA) inokuliert wurde, hinsichtlich der Zusammensetzung der
Bakterien wenig Ähnlichkeit mit den korrespondierenden Versuchsansätzen hatte. Das
kann daran liegen, dass die Menge der aufgetragenen PCR-Produkte zu gering war und
deswegen die Auswertung erschwert wurde. Die Profile der übrigen Versuchsansätze
clustern ähnlich wie die der Rhizosphären-Ansätze zusammen. Die Versuchsansätze,
die mit VF39 (pJProlA) und VF39 (pJPpCAT) inokuliert worden sind, haben hinsichtlich
ihrer Bandenmuster in allen Fällen mehr als 80% Übereinstimmung mit der Kontrolle
oder den VF39 WT inokulierten Versuchsansätzen.
Es ist kein Effekt einer Inokulation auf die Zusammensetzung der bakteriellen
Gemeinschaft oder der vorherrschenden Struktur innerhalb der Aktivität dieser Bakterien
zu erkennen. Ein offensichtlicher Effekt der Inokulation mit VF39 (pJProlA) wird
abhängig von früheren Ergebnissen aus den vorangegangenen Versuchen
ausgeschlossen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 131 -
D.2.6.1 Versuchsansatz V4 A- D: Shannon Index und Eveness
Abbildung 38 Diversitätsanalyse der Rhizosphäre V4 rDNA und c-(r)DNA Die c-(r)DNA Werte sind schraffiert dargestellt.
Abbildung 39 Diversitätsanalyse der Rhizoplane V4 rDNA und c-(r)DNA Die c-(r)DNA Werte sind schraffiert dargestellt.
Wie man in der Diversitätsanalyse der unterschiedlich behandelten Versuchsansätze der
Rhizosphäre und Rhizoplane sieht, hat die Inokulation mit den zwei verschiedenen
VF39-Stämmen keinen signifikanten Einfluss auf die Bakterien innerhalb der
Rhizosphäre und Rhizoplane. Die Diversität der 16S c-(r)DNA Proben liegt niedriger als
die der 16S rDNA Ansätze. Die Probe VF39 (pJProlA) fällt aus diesem Muster, was sich
allerdings durch die Menge an PCR-Produkt (siehe Auswertung der DICE-Analyse)
erklären lässt. Ein Effekt der gentechnisch veränderten Stämme auf die Diversität und
Abundanz der bakteriellen Gemeinschaft ist nach zwölf Wochen nicht zu sehen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 132 -
D.2.7 Analyse der IAA Konzentration in der Rhizosphäre (Versuchsansatz 1- 4)
D.2.7.1 IAA Konzentration der Rhizosphäre V 1
Die in vitro Messung der IAA Konzentration der einzelnen VF39 Mutanten gibt an,
welche Menge unter optimalen Kultivierungsbedingungen synthetisiert wird. Sie gibt
jedoch keinen Aufschluss darüber, wie viel IAA unter natürlichen Bedingungen in der
Rhizosphäre der Wirtspflanze gebildet bzw. freigesetzt wird. Durch die GC-MS Analyse
wurde deswegen die Konzentration von IAA in der Rhizosphäre der Erbsenpflanzen bei
den verschieden behandelten Versuchsansätzen gemessen. Es wurden je drei Pflanzen
pro Ansatz dreifach parallel gemessen.
1,0E-08
1,0E-07
1,0E-06
1,0E-05
1,0E-04
1,0E-03
1,0E-02
1,0E-01
Woche 0 Woche 1 Woche 3 Woche 9
vor Animpfung Kontrolle VF39 (pRD20) VF39 WT IAA VF39 (pHReGFPplac)
10-1
10-2
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-3
[IAA] V1: IAA-Konzentration in der Rhizosphäre
Abbildung 40: Versuchsansatz 1 IAA Konzentration in der Rhizosphäre
Y-Achse: IAA Konzentration in M/ g Erde; X-Achse: Probennahme vor Beginn des Versuchs,
nach 1, 4 und neun Wochen Inkubationsdauer; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von drei
parallelen Messungen
Wie man in Abbildung 40 sehen kann liegt die IAA-Konzentration in der Rhizosphäre in
der ersten Woche im Bereich zwischen 10-4 und 10-5 M. Die Menge an IAA ist höher als
vor Beginn des Versuchs (Woche 0). Zu diesem Zeitpunkt wurden die Erbsenpflanzen in
die Erde eingepflanzt, was den geringen Gehalt an IAA erklären könnte. Im Bereich der
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 133 -
Standardabweichung zeigt nur die mit VF39 (pRD20) beimpfte Rhizosphäre nach der
ersten Woche einen etwas höheren Gehalt an IAA. Nach drei Wochen Inkubation hat bei
allen Versuchsansätzen die Konzentration an IAA stark abgenommen.
Nach neun Wochen Inkubation liegt die IAA Konzentration wieder etwas höher,
zwischen 10-5- 10-6 M. Zu diesem Zeitpunkt ist das Wachstum der Erbse bis auf die
Hülsenproduktion bereits abgeschlossen. In Woche 0 konnten die vorliegenden
Bakterien vermutlich noch nicht durch die Exsudation der Erbsenwurzeln zu einer
vermehrten IAA Synthese angeregt werden. Außerdem hat zu diesem Zeitpunkt die
Inokulation mit zusätzlichen IAA synthetisierenden VF39-Stämmen noch nicht
stattgefunden. Allerdings hatten nach der ersten Woche sowohl die einheimischen
Bakterien, als auch die hinzugefügten Bakterien Zeit durch ihre IAA Synthese die in der
Rhizosphäre vorliegende Konzentration zu erhöhen. Nach vier Wochen hat die
Konzentration von IAA in der Rhizosphäre jedoch wieder abgenommen. Ein Grund dafür
könnte der größere Bedarf an IAA der Pflanze sein, die in dieser Zeit das Wachstum
aller Pflanzenteile stark erhöht (siehe Abbildung 20). Nach neun Wochen Inkubation ist
das Wachstum der Erbsenpflanze zum größten Teil abgeschlossen, die Pflanze benötigt
jetzt vermutlich weniger IAA.
Die IAA Produktion der Rhizosphärenbakterien ist ebenfalls abhängig von Signalen, die
die Pflanze mit bzw. durch ihre Wurzelexsudate vermittelt, z.B. die Abgabe von
Tryptophan. Da sich diese bekanntlich im Laufe der Zeit verändern, verändert sich
abhängig davon auch die bakterielle Gemeinschaft. Das könnte ebenfalls Auswirkungen
auf die Synthese der bakteriell produzierten Phytohormone haben.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 134 -
D.2.7.2 IAA Konzentration der Rhizosphäre V 2
In der Analyse der einheimischen Bodengemeinschaft durch DGGE wurde im Zeitraum
von drei bis zehn Tagen Inkubation ein möglicher Effekt der gentechnisch veränderten
VF39-Stämme auf die bakterielle Rhizosphärengemeinschaft detektiert, weshalb der IAA
Gehalt in der Rhizosphäre der Erbsenpflanze ebenfalls innerhalb dieses Zeitrahmens
untersucht wurde.
1,0E-08
1,0E-07
1,0E-06
1,0E-05
1,0E-04
1,0E-03
1,0E-02
1,0E-01
Tag 0 Tag 3 Tag 10
vor Animpfung Kontrolle VF39 (pRD20) VF39 WT VF39 (pBBRIAA)
10-1
10-2
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-3
[IAA] V2: IAA-Konzentration in der Rhizosphäre
Abbildung 41: Versuchsansatz 2 IAA Konzentration in der Rhizosphäre
Y-Achse: IAA Konzentration in M/ g Erde; X-Achse: Probennahme vor Beginn des Versuchs,
nach 3 und 10 Tagen Inkubationsdauer; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von drei
parallelen Messungen
Die GC-MS Analyse des IAA Gehalts in der Rhizosphäre der Erbsenpflanze lag bei allen
Versuchsansätzen nach drei und zehn Tagen Inkubation zwischen 10-4 und 10-5 M/g
Rhizosphäre. Ausnahme war der Kontrollansatz nach drei Tagen Inkubation. Die IAA-
Menge in der Rhizosphäre der inokulierten Versuchsansätze war im Bereich der
Standardabweichung vergleichbar. Nach zehn Tagen Inkubation waren die
Versuchsansätze bis auf VF39 (pBBRIAA) wieder im Rahmen ihrer Standardabweichung
vergleichbar. Die mit VF39 (pBBRIAA) inokulierte Rhizosphäre hatte einen etwas
höheren IAA-Gehalt. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse die Ergebnisse der GC-MS
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 135 -
Analyse für Versuchsansatz V1 in diesem Zeitraum. Wie in Versuchsansatz V1 schon
gezeigt, ist die IAA Konzentration vor Beginn des Versuchs niedriger, was sich durch die
noch nicht stattgefundene Reaktion der Bakterien auf das Vorliegen der Erbsenpflanze
erklären lässt.
D.2.7.3 IAA Konzentration der Rhizosphäre V 3
In Versuchsansatz V3 wurde der Einfluss der modifizierten VF39-Stämme auf den IAA
Gehalt in der Rhizosphäre der Luzerne über einen Zeitraum von 10 Tagen untersucht.
Die Luzerne wurde als Nicht-Wirtspflanze der VF39-Stämme vergleichend zur Erbse, der
Wirtspflanze untersucht.
1,0E-08
1,0E-07
1,0E-06
1,0E-05
1,0E-04
1,0E-03
1,0E-02
1,0E-01
Tag 0 Tag 3 Tag 10
vor Animpfung Kontrolle VF39 (pRD20)
10-1
10-2
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-3
[IAA] V3: IAA-Konzentration in der Rhizosphäre
Abbildung 42: Versuchsansatz 3 IAA Konzentration in der Rhizosphäre
Y-Achse: IAA Konzentration in M/ g Erde; X-Achse: Probennahme vor Beginn des Versuchs,
nach 3 und 10 Tagen Inkubationsdauer; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung von drei
parallelen Messungen
Die GC-MS Analyse des IAA Gehalts in der Rhizosphäre der Luzerne lag vor Beginn des
Versuchs zwischen 10-3 M und 10-4 M und sank in den Kontrollansätzen dann bis auf
10- 5 M pro Gramm Boden ab. Nach dreitägiger Inkubation mit VF39 (pRD20) konnte im
Rahmen der Standardabweichung ein Anstieg des IAA Gehalts in der Rhizosphäre
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 136 -
beobachtete werden, der aber nach zehn Tagen wieder gesunken und somit
vergleichbar mit der Menge an IAA im Kontrollansatz war. Die Konzentration der IAA in
der Rhizosphäre der Luzerne war vergleichbar mit der Konzentration in der Rhizosphäre
der Erbse (Versuchsansatz V2). Aus technischen Gründen konnte die Inokulation mit
VF39 (pBBRIAA) nicht ausgewertet werden.
D.2.7.4 IAA Konzentration der Rhizosphäre V4
In Versuchsansatz 4 wurde der IAA-Gehalt in der Rhizosphäre nach 12 Wochen
Inkubationsdauer gemessen. Es sollte analysiert werden, ob nach dieser langen
Inkubationszeit ein Unterschied in der vorliegenden IAA Konzentration zu sehen ist.
Dadurch könnten Rückschlüsse auf die Persistenz bzw. anhaltende Stoffwechselaktivität
der inokulierten VF39-Stämme, die vermehrt IAA synthetisieren, geschlossen werden.
1,0E-08
1,0E-07
1,0E-06
1,0E-05
1,0E-04
1,0E-03
1,0E-02
1,0E-01
Kontrolle VF39 (pJPpCAT)VF39 (pJProlA) VF39 WT
12 Wochen
10-1
10-2
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-3
[IAA] V4: IAA-Konzentration in der Rhizosphäre
Abbildung 43: Versuchsansatz 4: IAA Konzentration in der Rhizosphäre
Y-Achse: IAA Konzentration in M/ g Erde; X-Achse: Probennahme nach 12 Wochen Inkubationsdauer;
Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung von drei parallelen Messungen
Die Messung des IAA-Gehalts nach 12 Wochen Inkubation in Versuchsansatz IV beträgt
für alle Versuchsansätze 10-6 M. Es ist kein Einfluss einer Inokulation auf die Menge an
IAA in der Rhizosphäre sichtbar. Alle gemessenen Konzentrationen sind im Rahmen
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 137 -
ihrer Standardabweichung gleich hoch und mit den Konzentrationen, die in V1 nach
neun Wochen gemessen wurden, vergleichbar. Daraus kann man schließen, dass die
inokulierten Bakterien entweder von den einheimischen Bakterienpopulationen verdrängt
wurden, oder aufgrund des Stresses nicht in der Lage waren, die Synthese von IAA, die
ihren Stoffwechsel zusätzlich belastet, weiterhin zu gewährleisten.
Die DGGE-Analyse zeigte eine hohe Ähnlichkeit zwischen den verschieden inokulierten
Ansätzen, weiterhin liegen die Eveness Werte für alle Ansätze zwischen 0,87 und 0,92.
Das lässt auf eine sehr gleichmäßige Verteilung innerhalb der vorliegenden
Bakteriengemeinschaft und bakteriellen Aktivitätsstruktur in der Rhizosphäre schließen.
Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass die einheimischen Bakterien die
zusätzlich inokulierten Bakterienstämme durch Reduzierung der Zellzahlen in ihre
Gemeinschaftsstruktur eingegliedert haben könnten, so dass sie keinen starken Einfluss
auf den IAA-Gehalt der Rhizosphäre ausüben können.
D.2.8 Zusammenfassung IAA Synthese der verschiedenen VF39-Stämme
In der in vitro Messung (Abbildung 21) wurden Unterschiede in der IAA Konzentration
des Kulturüberstands der verschiedenen VF39-Stämme gemessen, die sich anhand der
einzelnen Plasmide erklären lassen.
Tabelle 31: Plasmideigenschaften – IAA Synthese
Plasmid IAA Gehalt Eigenschaft Eigenschaften des Promotors
pRD20 2,5x 10-4 mittlere Kopienzahl stark, konstitutiv
pJPpCAT 1,5x 10-4 geringe Kopienzahl stark, konstitutiv
pJProlA 1,2x10-4 geringe Kopienzahl schwach, induzierbar
pBBRIAA 0,9x 10-4 mittlere Kopienzahl schwach, induzierbar
WT 2,3x 10-5 - -
pHReGFPplac (Leerplasmid) 2,0x10-5 - -
VF39 WT und VF39 (pHReGFPplac) besitzen beide kein Plasmid zur zusätzlichen IAA-
Synthese. Da R. leguminosarum bv. viciae VF39 unter natürlichen Bedingungen in der
Lage ist IAA zu synthetisieren, wurden diese beiden Stämme als Referenz benutzt.
Die Konzentration an IAA im Zellkulturüberstand des VF30 pRD20 ist am höchsten, das
Plasmid liegt in mittlerer Kopienzahl vor, die Gene für die IAA-Synthese stehen unter
Kontrolle des starken konstitutiven CAT Promotors. Dieser Promotor reguliert ebenfalls
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 138 -
die Expression in pJPpCAT, das Plasmid hat aber eine niedrigere Kopienzahl,
weswegen die IAA Konzentration etwas niedriger ist. Die Menge an synthetisiertem IAA
liegt für pJProlA und pBBRIAA unterhalb der Menge, die für pRD20 und pJPpCAT
gemessen wurde. Das entspricht den Erwartungen, da in diesen Plasmiden die Kontrolle
der IAA-Synthese vom schwachen, induzierbaren rolA Promotor gesteuert wird. Die
Menge an gebildetem IAA sollte allerdings für den VF39 (pBBRIAA) Stamm größer sein,
als für VF39 (pJProlA), da das Plasmid in höherer Kopienzahl vorliegt. Das ist allerdings
nicht der Fall. Da der Promotor durch niedrigen pH und die stationäre Wachstumsphase
induziert wird, ist es möglich, dass Unterschiede hinsichtlich dieser Bedingungen für das
Ergebnis verantwortlich sind. Möglich ist auch, dass der Salkowski-Test für diesen
Nachweis hinsichtlich der quantitativen Messung nicht sensitiv genug ist und lediglich
eine qualitative Aussage über die Synthese von IAA getroffen werden kann. Weiterhin
liegt die im Kulturüberstand von VF39 (pBBRIAA) weitaus höher, als die von Camerini
für diesen Stamm durch GC-MS ermittelte (76 nmol/ ml).
Die Bestimmung der IAA Konzentration in der Rhizosphäre wurde durch GC-MS Analyse
gemessen, da diese Methode sensitiver für die geringen Mengen ist. Die Ergebnisse der
Analyse zeigen, nach statistischer Auswertung (Mantel-Test) für die verschiedenen
Versuchsansätze innerhalb der Rhizosphäre der Erbse keinen signifikanten
Zusammenhang zwischen Inokulation und IAA-Gehalt. Die Menge an IAA ist in allen
Ansätzen in etwa vergleichbar und korreliert mit der Inkubationsdauer. Da laut Literatur
über 80% der Rhizosphärenbakterien in der Lage sind IAA zu produzieren (Perrine, et
al., 2004), bewirkt die Inokulation mit den verschiedenen VF39-Stämmen vermutlich
keine starken Veränderung innerhalb des IAA-Gehalts der Rhizosphäre. Der vorliegende
IAA-Gehalt, der in der Rhizosphäre der jeweiligen Versuchsansätze gemessen wurde,
liegt in allen Fällen in einem Bereich, der sich positiv auf das Stängelwachstum der
Pflanzen auswirkt. Trotzdem sah man in Versuchsansatz V1 eine sehr deutliche
Wachstumshemmung der Erbsenpflanzen, die mit IAA (10-6 M) behandelt wurden
(Dobbelaere et al., 1999). Da das Wachstum der Wurzeln bei einer Konzentration <10-6
M gehemmt wird (siehe Abbildung, 20) kann die Pflanze nicht optimal wachsen. Die
Stängel waren dicker und die Internodien kürzer als bei den anderen Pflanzen. Bei den
anderen Pflanzen war kein Einfluss der Inokulation auf das Wachstum sichtbar, während
der Zusatz von künstlichem Auxin das Wachstum nachteilig beeinflusst hat. Die mit
VF39 (pRD20) inokulierten Erbsen hatten etwas früher Schoten, als die anderen
Erbsenpflanzen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 139 -
1.1
20.1
25.1
42.1
10.1
42.2
42.3
54.1
54.2
62.1
24.1
42.4
57.1
62.2
24.2
25.2
44.1
45.1
1.2
54.3
49.1
D.2.9 Sequenzierte DGGE Banden
Spezielle Banden in den DGGE-Profilen, die durch ihre Position und/ oder Intensität
auffällig waren, wurden ausgeschnitten, aufgereinigt und kloniert. Je drei Klone pro
ausgeschnittener DGGE-Bande wurde amplifiziert und zum Sequenzieren geschickt.
Des Weiteren wurden die erhaltenen Sequenzen identifiziert und ein phylogenetischer
Baum erstellt. Dadurch konnte man einen Eindruck über die Bakterienarten gewinnen,
die in den vorangegangenen Versuchen beeinflusst wurden.
Abbildung 44: Phylogenetischer Baum der ausgeschnittenen und sequenzierten DGGE Banden
erstellt durch den Vergleich der homologen Bereiche nach der Sequenzierung; 0,1 ≙ 10% Unterschied in der
Sequenz; die erste Zahl ist die Nummer der DGGE Bande; die zweite Zahl ist die Nummer der Kolonie, die
zur Sequenzierung geschickt wurde
Wie man in Abbildungen 44 sehen kann, unterscheiden sich die verschiedenen
sequenzierten Klone einer speziellen DGGE-Bande oft schon sehr stark. Daraus lässt
sich schließen, dass zur 100%igen Identifizierung einer Bande, die möglicherweise nicht
nur von einer Bakterienart stammte, sondern verschiedenen Phylotypen, noch viel mehr
Klone sequenziert werden müssten. Aufgrund der sequenzierten Banden innerhalb
dieser Arbeit kann man nur bedingt auf den Bakterienstamm schließen. Es wurde
lediglich ein allgemeiner Eindruck der bakteriellen Gemeinschaft bzw. der Bakterien, die
möglicherweise durch die Inokulation oder IAA-Behandlung beeinflusst wurden,
gewonnen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 140 -
Tabelle 32: Sequenzierte DGGE Banden
DGGE-Bande Sequenzierung Bakterium Länge der
Sequenz Sequenz-Homologie Acession number
1 1 unkultivierbares Bakterium 427/430 99% EF397320
1 2 Microbacterium sp. 223/225 99% AM500663
10 1 unkultivierbares Bakterium 393/405 96% AF269015
20 1 unkultivierbarer Variovorax sp. 429/434 98% AM489659
24 1 Desulfotomaculum reducens 415/450 92% CP000612
24 2 Pseudomonas sp. 432/436 99% DQ990885
25 1 unkultivierbares Proteobakterium 441/447 98% EF019822
25 2 unkultivierbares Bakterium 432/434 99% DQ057366
42 1 Clostridium fimetarium 405/436 93% AF126687
42 2 unidentifiziertes Eubakterium 397/405 98% AJ229231
42 3 Clostridium sp. 426/429 99% DQ196630
42 4 Pisum sativum Chloroplast 427/429 99% X55033
44 1 R. leguminosarum bv. viciae 430/433 99% DQ835308
45 1 Pseudomonas sp. oder Xanthomonas sp.
432/436 99%
EF027004 oder EF027001
49 1 γ-Proteobacterium 431/435 99% AB174846
54 1 unkultivierbares β-Proteobakterium 424/430 98% AB286277
54 2 Streptomyces mirabilis 298/303 98% EF371422
54 3 R. leguminosarum bv. viciae 431/435 98% DQ835308
62 1 Oxalobacteraceae Bakterium 427/431 99% DQ113445
62 2 unkultivierbares Bakterium 343/346 99% DQ822391
Die sequenzierten DGGE Banden der Gele entsprechen der Nummerierung in der Tabelle; Sequenzierung
1-3 entspricht der Nummer des Klons der jeweiligen Bande, der sequenziert wurde; die Länge der Sequenz
entspricht der Größe des Fragments, das automatisch zur Identifizierung durch BLAST benutzt wurde
Die sequenzierten Phylotypen gehören zu Bakterienarten, die natürliche Bewohner des
Bodens darstellen. Dazu gehören Mikrobakterien (Bande 1), gram-positive,
unbewegliche, aerobe, nicht pathogene Bakterien, die im Boden und Oberflächenwasser
vorkommen. Weiterhin wurden Sequenzen gefunden, die Ähnlichkeit mit den Vertretern
der Gattung Burkholderiales haben. Dazu gehören Variovorax (Bande, 20), die teilweise
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 141 -
in der Lage sind, Phenole abzubauen und im Belebtschlamm vorkommen. Acidovorax
sp., ein Pflanzenpathogen und ein Bakterium der Familie Oxalobacteraceae (Bande 62),
die Oxalsäure als Kohlenstoffquelle benötigen. Die Bakterien dieser Gattung kommen
ubiquitär vor und sind bewegliche, aerobe Gramnegative Stäbchen, die ebenfalls
teilweise in der Lage sind, Pestizide und organische Umweltgifte z.B. PCB abzubauen.
Burkholderiales werden vielfach auch als „plant growth promoting rhizobacteria“ genutzt.
Es konnten ebenso Sequenzen gefunden werden, die zu den Clostridien (Bande 24 und
42) gehören, welche Grampositive, stäbchenförmige Bakterien sind, die mehr oder
weniger streng anaerob wachsen und hitzeresistente Endosporen bilden. Sie kommen
im Boden (in anaeroben Zonen), in Wasser, Staub und Lebensmitteln, aber auch im
Darm von Mensch und Tier vor. Im Boden zählen Clostridien zu den wichtigsten anaerob
Cellulose-Abbauenden Mikroorganismen.
Bande 54 repräsentiert Streptomyces mirabilis, ein Grampositives GC-reiches
Bodenbakterium, das Sporen bilden kann. Streptomyceten produzieren Antibiotika z.B.
Streptomycin, Spectinomycin und Tetracyclin. Des Weiteren sind sie am Abbau
organischer Stoffe im Boden beteiligt.
Die ebenfalls detektierten Pseudomonaden und Rhizobien gehören zu den
Proteobakterien. Sie sind ebenfalls sehr häufig vorkommende Bodenbakterien und
gehören zu den „plant growth promoting rhizobacteria“. Pseudomonaden werden unter
anderem genutzt, um Pilzwachstum auf den Pflanzenwurzeln zu inhibieren.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 142 -
D.2.10 Phänotypische Veränderungen
D.2.10.1 Veränderungen im Wachstum der Erbsenpflanzen
Um einen Effekt der Inokulation auf das Wachstum und den Phänotyp der
Erbsenpflanzen zu analysieren, wurden Erbsenkeimlinge in sterilem Vermiculit mit
verschiedenen VF39-Stämmen inokuliert oder mit IAA-Lösung gegossen. Der sterile
Versuchsansatz sollte dafür sorgen, dass die Nodulation nur mit dem ausgewählten
Rhizobienstamm stattfand, und keine Konkurrenz durch andere Rhizobienstämme
vorlag.
Tabelle 33: Pflanzenwachstum mit unterschiedlicher Inokulation in Vermiculit
Ansatz Anzahl Pflanzen
Größe der Pflanzen [cm]
STD Fehler [cm]
Anzahl Schoten
Ø Schoten/ Pflanze
TG Wurzel [g]
TG Pflanze [g]
1.Messung
VF39 (pRD20) 2 48,5 16,5 9 4,5 0,7 7,8
VF39 WT 3 30 16,0 10 3,3 0,7 7,3
VF39 WT + IAA 10-6 2 45 2,0 8 4 0,5 5,6
IAA 10-6 3 29 6,7 8 2,7 0,6 5,2
IAA 10-4 2 15,5 2,5 1 0,5 0,1 0,6
2.Messung
VF39 WT (Trp) 3 45,7 3,7 6 2 1,1 5,3
VF39 (pRD20) (Trp)
3 38,7 6,2 5 1,7 0,5 4,5
VF39 (pBBRIAA) (Trp)
3 47,5 3,8 9 3 2,1 6,8
VF39 NifA– (Trp) 3 30,7 7,5 0 0 0,7 1,9
STD: Standardfehler der Messungen; TG: Trockengewicht; Trp: Pflanzen wurden zusätzlich zur Inokulation
mit 1g/l Tryptophan-Lösung. gegossen; TG: Trockengewicht in g
Wie man in Tabelle 33 erkennen kann, spielt die Inokulation in beiden Messungen im
Rahmen der jeweiligen Standardabweichungen für das Wachstum de Erbsen keine
Rolle. Die mit VF39 WT, VF39 (pRD20) und VF39 (pBBRIAA) inokulierten Pflanzen sind
allen ungefähr gleich groß. Pii (2007) stellte in Experimenten fest, dass die Luzerne
Pflanzen hinsichtlich ihrer Größe durch die Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) gefördert
wurden, während es keinen feststellbaren Effekt auf Bohnen gab.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 143 -
Ein Effekt der Inokulation mit den IAA-synthetisierenden Stämmen scheint also vor allem
abhängig davon zu sein, welche Pflanze inokuliert wird. Die mit IAA-Lsg. gegossenen
Pflanzen zeigten einige wenige Knöllchen, da das Vermiculit wohl nicht ganz steril
erhalten blieb. Es waren allerdings so wenige, dass sie vermutlich bei Betrachtung der
Ergebnisse zu vernachlässigen sind. Es ist offensichtlich, dass je höher die Menge an
künstlich zugeführtem IAA ist, desto kleiner bleiben die Pflanzen.
Da IAA empfindlich gegenüber Licht ist (Perrine et al., 2004) und schnell degradiert wird
aus diesen Ergebnissen geschlossen, dass die Konzentration an zugeführtem IAA im
Vermiculit durch die Beleuchtung der Pflanzen und die Reflektion des Lichts an den
Vermicullitpartikeln dafür gesorgt hat, dass das IAA teilweise zerfallen und die in den
Pflanztöpfchen vorliegende Konzentration so niedrig war, dass sie das Wachstum der
Wurzeln gefördert, das der Stängel hingegen inhibiert hat. Das erklärt das sich
verschiebende Verhältnis Wurzelmasse zu Pflanze (siehe Tabelle 33).
Es wurde weiterhin vermutet, dass die Zugabe von Tryptophan die Wirkung einer
Inokulation mit VF39 (pRD20) oder VF39 (pBBRIAA) deutlich hervorhebt, da sie die
Vorstufe des IAA darstellt und dadurch die Synthese in diesen Stämmen gefördert wird
(Dobbelaere et al., 1999). Unterschiede in der Inokulation der Pflanzen wurden in der 1.
Messung nur hinsichtlich der Anzahl der Schoten pro Pflanze deutlich. Die mit VF39
(pRD20) inokulierten Erbsen hatten insgesamt mehr Schoten, als die anderen
Erbsenpflanzen. Die mit VF39 NifA- inokulierten Pflanzen dienten nur dazu, einen
Vergleich mit einem nicht stickstofffixierenden Stamm zu haben. Wie erwartet hatten
diese Pflanzen ausschließlich weiße Knöllchen und waren vermutlich wegen des
Stickstoffmangels etwas kleiner. Sie besaßen als einzige Pflanzen keine Schoten.
Da Pflanzen verschiedene Stoffwechselwege besitzen um die Menge an aktivem IAA
konstant zu halten bzw. zu kontrollieren, hat die Inokulation mit den modifizierten VF39
vermutlich keinen Einfluss auf die IAA-Konzentration in der Pflanze, weswegen keine
Veränderung im Wachstum festgestellt werden konnte (Östin et al., 1998; Kai et al.,
2007). Es wurde an Arabidopsis Pflanzen nachgewiesen, dass nur bis zu vier Stunden
nach Applikation von IAA ein erhöhter Gehalt in der Pflanze nachgewiesen werden
konnte. Dieser sank anschließend steil ab, was mit der raschen Zunahme an inaktiven
IAA-Konjugaten, wie z.B. IAA-Glu, oder IAA-Asp korrelierte (Kai et al., 2007).
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 144 -
D.2.11 Veränderungen im Erscheinungsbild der Wurzelknöllchen
Die Wurzelknöllchen der inokulierten Erbsenpflanzen wurden hinsichtlich möglicher
Unterschiede in ihren Phänotypen untersucht. Diese Auswertung wurde visuell
durchgeführt und fotografisch dokumentiert.
Das Aussehen der Wurzelknöllchen an Pflanzen, die mit den Stämmen VF39 WT und
VF39 (pHReGFPplac) inokuliert wurden, war normal. Sie entsprachen in Farbe und
Form der Literatur.
Abbildung 45
Typisches Aussehen von
Wurzelknöllchen nach Inokulation mit
R. leguminosarum bv. viciae VF39 WT
An Pflanzen, die mit VF39 (pRD20) inokuliert wurden, gab es etwas mehr kleinere weiße
Wurzelknöllchen, die rosa gefärbten Knöllchen sahen ähnlich wie die der mit VF39 WT
inokulierten Erbsen aus.
Abbildung 46
Typisches Aussehen von
Wurzelknöllchen nach Inokulation mit
R. leguminosarum bv. viciae VF39 (pRD20)
Die mit VF39 (pJProlA) und VF39 (pJPpCAT) inokulierten Pflanzen zeigten verlängerte
Wurzelknöllchen, die bei Inokulation mit VF39 (pJPpCAT) in mehrere Lappen aufgeteilt
wurden, während sie bei VF39 (pJProlA) nur aus einem Lappen bestehen.
Abbildung 47
Typisches Aussehen von
Wurzelknöllchen nach
Inokulation mit
R. leguminosarum bv.
viciae VF39 (pJPpCAT)
Abbildung 48
Typisches Aussehen von
Wurzelknöllchen nach
Inokulation mit
R. leguminosarum bv.
viciae VF39 (pJProlA)
Auffallend war das Erscheinungsbild der mit VF39 (pBBRIAA) inokulierten
Wurzelknöllchen. Sie waren bräunlich-rosa, glänzend und von „matschiger“ Konsistenz.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 145 -
Diese Beobachtung wurde an allen Pflanzen gemacht, die mit diesem Stamm inokuliert
wurden. Da von jeder Pflanze die Wurzelknöllchen nur visuell analysiert und nicht
ausgezählt wurden, ist ein Einfluss der Inokulation auf das Aussehen der
Wurzelknöllchen nicht statistisch auswertbar.
Abbildung 49
Typisches Aussehen von
Wurzelknöllchen nach
Inokulation mit
R. leguminosarum bv. viciae
VF39 (pBBRIAA)
Der Einfluss der verschiedenen Rhizobien auf den Phänotyp der Wurzelknöllchen wurde
ebenfalls in der Songlines EU Projektschrift beschrieben. Knöllchen an Erbsen, die mit
einem IAA-synthetisierenden Rhizobienstamm inokuliert wurden, waren teilweise
länglicher, oder sie wiesen mehrere „Lappen“ auf, wie auch von Camerini (noch nicht
veröffentlicht) festgestellt wurde. Diese Beschreibung trifft in den vorliegenden
Versuchen für den Phänotyp der mit VF39 (pRD20) und VF39 (pJPpCAT) inokulierten
Pflanzen zu. Die phänotypischen Veränderungen der Wurzelknöllchen, die mit VF39
(pBBRIAA) inokuliert wurden, kann nicht direkt auf eine Wirkung des vermehrt
gebildeten IAA zurückgeführt werden. So fand Pii (2007) keine Veränderungen im
Aussehen der Wurzelknöllchen der mit dem modifizierten pRD20 tragenden S. meliloti-
Stamm inokulierten Medicago-Pflanzen.
Ein möglicher Grund für das Veränderte Erscheinungsbild (bräunlich-rosa, glänzend)
könnte auf eine Störung in der Knöllchenkortexbildung zurückzuführen sein. Weiterhin
deutet die „kollabierte“ Form der Knöllchen darauf hin, dass es sich um Fix- Knöllchen
handeln könnte (Vermutung von Dr. Dieter Kapp, Universität Bielefeld).
Eine eindeutige Ursache für diese Veränderungen wurde bis jetzt allerdings noch nicht
gefunden. Zusätzlich könnte es in den Knöllchen zu einer Tryptophan-Verknappung
gekommen sein. Die Pflanze ist eventuell nicht in de Lage den IAA-produzierenden
Bakteroiden genügend Tryptophan für die IAA-Synthese zu liefern (Vermutung von Dr.
Dieter Kapp, Universität Bielefeld). Da die Nodulation zum großen Teil von der Pflanze
kontrolliert wird (van Noorden et al., 2006), könnten die Veränderungen im Aussehen der
Knöllchen auch abhängig von der Wirtspflanze sein.
Ein eindeutiger Einfluss der Inokulation auf die Anzahl der Knöllchen und die
Vergrößerung des oberirdischen Teils der Erbsenpflanzen konnte im Gegensatz zu
Versuchen mit M. sativa nicht detektiert werden (Pii et al., 2007).
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 146 -
D.2.12 Veränderungen im Erscheinungsbild der Wurzeln
Das Aussehen der mit VF39 (pRD20) und VF39 (pBBRIAA) inokulierten sowie der mit
IAA gegossenen Wurzeln, war auffällig anders, als das der mit VF39 WT oder VF39
(pHReGFPplac) inokulierten Pflanzen (siehe Abbildung 50). Die Pflanzen hatten
teilweise sehr stark verdickte Seitenwurzeln, die sich kaum verzweigten und relativ kurz
waren.
Abbildung 50
Verändertes Erscheinungsbild der Wurzeln nach Inokulation mit VF39 (pRD20) und VF39 (pBBRIAA) bzw.
Gießen mit IAA-Lösung
Das veränderte Aussehen der Wurzeln könnte eine Reaktion auf eine IAA
Konzentrationen sein, die das Wurzelwachstum inhibiert. Es ist möglich, dass das
zugefügte IAA [10-6 M] durch das Licht in der Pflanzenkammer teilweise hydrolysiert
wurde und die Konzentration auf 10-7 – 10-8 M gesunken ist und somit die Entwicklung
der Wurzeln gehemmt hat. Das könnte dann indirekt zu einer Hemmung des gesamten
Wachstums (z.B. der mit IAA-Lsg. behandelten Erbsen) geführt haben. Eine hohe IAA-
Konzentration könnte möglicherweise auch zur Förderung der Ethylenbiosynthese und
damit zur Hemmung des Wurzel- und Sprosswachstums, was zu der Verkürzung und
Verdickung der Wurzelstücke geführt (Plazinski & Rolfe, 1985) haben kann. Eine
Störung des Infektionsschritts der Rhizobien kann zu einer stark aufgeblähten Zone in
den von Rhizobien infizierten Wurzelästen führen. Diese sind dann extrem voluminös
und enthalten dicht an dicht sehr viele veg. Exo-Rhizobien (Vermutung von Dr. Dieter
Kapp, Universität Bielefeld). Ein eindeutiger Rückschluss ist allerdings im Rahmen der
durchgeführten Versuche nicht möglich.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 147 -
D.2.13 Statistische Auswertung
D.2.13.1 Ergebnisse für die Multidimensionale Skalierung (MDS) und den Manteltest der Gemeinschaftsprofile
Die Auswertung der DGGE Profile über MDS wurde durchgeführt um Veränderungen in
im Gemeinschaftsprofil der Bakterien zu visualisieren. Dabei werden komplexe DGGE-
Muster auf einen Punkt im 2D Raum reduziert (Fromin, 2002; Schauer et al., 2000;
Carson, 2007). Geringe Abstände zwischen den Punkten bedeuten dabei eine hohe
Ähnlichkeit zwischen den bakteriellen Gemeinschaften der einzelnen Versuchsansätze.
D.2.13.2 V 1 A- B: MDS Ergebnisse der Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA
VF39 WT
VF39(pHReGFPplac)
Kontrolle
VF39 WTVF39 WT
VF39 (pRD20)
KontrolleVF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
IAA
VF39 (pHReGFPplac)
VF39(pHReGFPplac)
IAA
Dimension 1
Dim
ensi
on 2
Kruskals Stress: 0,278
MDS V1: Rhizosphäre 16S c-(r)DNADimension 1
Dim
ensi
on 2
MDS V1: Rhizosphäre 16S rDNA
Kruskals Stress: 0,264
VF39 WT
VF39(pHReGFPplac)
Kontrolle
VF39 WT
VF39 WT
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
IAA
VF39 (pHReGFPplac)
VF39(pHReGFPplac) IAA
VF39 (pRD20)
Abbildung 51: Rhizosphäre 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 1 (9 Wochen Inkubation) grün: Woche eins;
blau: Woche drei;
schwarz: Woche neun
Bray-Curtis Koeffizient,
Modell: Absolut, Kruskals Stress,
Anhaltebedingungen:
Konvergenz= 0,00001/ Iterationen= 500
Anfangskonfiguration: zufällig
Vierecke mit Kreuz:
Klassendurchschnitt der
Gemeinschaftsprofile aller Versuchsansätze
zur korrespondierenden
Inkubationszeit
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 148 -
Zusätzlich zur MDS-Analyse wurde ein Manteltest durchgeführt um analysieren, ob es
eine Korrelation in der Ähnlichkeit der Gemeinschaftsprofile zwischen allen Proben
verschiedener Zeitpunkte, z.B. Woche eins versus Woche neun gibt. Weiterhin sollte
damit herausgefunden werden, ob es eine Korrelation zwischen den Profilen der
vorliegenden Bakteriengemeinschaft und der aktiven Bakteriengemeinschaft gibt.
Wie man in der grafischen Darstellung der MDS für die 16S rDNA (Abbildung 51) sieht
bilden, mit Ausnahme der Rhizosphärengemeinschaft, die mit VF39 WT (neun Wochen
Inkubation) inokuliert wurde, alle Versuchsansätze eigene Cluster. Wie man deutlich
sehen kann verlagern sich die Gemeinschaften der unterschiedlichen Versuchsansätze
abhängig ihrer Inkubationszeit. Die Gemeinschaft „vor Animpfung“ liegt weit außerhalb
der anderen Cluster. Die des Ansatzes IAA nach neun Wochen Inkubation ebenfalls.
Daraus kann man einen Unterschied in der Gemeinschaftsstruktur dieser beiden
Ansätze zu den anderen schließen, was bei IAA (neun Wochen Inkubation) auf einen
Einfluss der Behandlung mit IAA zurückzuführen sein könnte. Allerdings liegen die
Stress-Werte für die 16S rDNA über 0,2, was die Aussage dieses Ergebnisses
einschränkt. Die Stress-Werte für die Analyse der Aktivitätsprofile der
Rhizosphärengemeinschaft liegen über 0,3. Sie sind deswegen nicht aussagekräftig
(siehe Beispiele zur Datenanalyse, 2001).
Da die Stress Werte für den 3D Raum unter 0,3 liegen (16S rDNA: 0,183; 16S c-(r)DNA:
0,203) ist auszuschließen, dass die Proben rein zufällig angeordnet sind.
Der durchgeführte Manteltest zeigte, dass die Gemeinschaftsprofile für die 16S rDNA
Proben der Woche eins und neun sind korreliert; die Proben der anderen Zeitpunkte sind
nicht korreliert. Daraus kann man schließen, dass die Zusammensetzung der
bakteriellen Gemeinschaft nur in einem kurzen Zeitraum durch die Inokulation oder
Behandlung beeinflusst wird. Sie „pendelt“ sich wieder auf ihr normales Level ein.
Die Gemeinschaftsprofile für die 16S c-(r) DNA Proben der Woche eins und drei sind
korreliert, die Proben der anderen Zeitpunkte sind nicht korreliert.
Das zeigt, dass die Aktivität der Bakterien in der weiter entwickelten Rhizosphäre nach
neun Wochen der Aktivität innerhalb der Rhizosphäre zu Beginn ihrer Entwicklung nicht
ähnlich ist.
Da die Gemeinschaftsprofile für die rDNA und c-(r)DNA Proben der Wochen eins und
neun korrelieren könnte man daraus schließen, dass die in größerer Zahl vorliegenden
Bakterienphyllotypen auch in größerem Maß aktiv sind – und umgekehrt.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 149 -
D.2.13.3 V 1 C- D: MDS Ergebnisse der Rhizoplane 16S rDNA und c-(r)DNA
VF39 WT
VF39(pHReGFPplac)
Kontrolle
VF39 WT
VF39 WTVF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Kontrolle VF39 (pRD20)
IAA
IAA
VF39 (pHReGFPplac)
VF39(pHReGFPplac)
IAA
Dimension 1
Dim
ensi
on 2
Kruskals Stress: 0,222
MDS V1: Rhizoplane 16S c-(r)DNA
Dimension 1
Dim
ensi
on 2
MDS V1: Rhizoplane 16S rDNA
Kruskals Stress: 0,307
VF39 WTVF39
(pHReGFPplac)Kontrolle
VF39 WT
VF39 WTKontrolle
VF39 (pRD20)
KontrolleVF39 (pRD20)
IAA
IAA
VF39 (pHReGFPplac)
VF39(pHReGFPplac)IAA
VF39 (pRD20)
Abbildung 52: Rhizoplane 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz eins (9 Wochen Inkubation)
grün: Woche eins;
blau: Woche drei;
schwarz: Woche neun
Bray-Curtis Koeffizient,
Modell: Absolut, Kruskals Stress,
Anhaltebedingungen:
Konvergenz= 0,00001/ Iterationen= 500
Anfangskonfiguration: zufällig
Vierecke mit Kreuz:
Klassendurchschnitt der Gemeinschaftsprofile aller
Versuchsansätze zur korrespondierenden
Inkubationszeit
Wie man in grafischen Darstellung der MDS für die Rhizoplane (Abbildung 52) sehen
kann, clustern die Gemeinschaftsprofile der vorliegenden Bakterien, innerhalb der
Rhizoplane, nicht in Korrelation mit Behandlung oder der Zeit. Die Profile der 16S -(r)
DNA Proben bilden hingegen Cluster in Korrelation mit der Inkubationszeit.
Der durchgeführte Manteltest zeigte, dass die Gemeinschaftsprofile für die 16S rDNA
Proben der Woche eins und neun, und der Woche drei und neun korrelieren; die Proben
(Woche eins und drei) korrelieren nicht. Die Gemeinschaftsprofile für die 16S c-(r) DNA
Proben sind alle nicht korreliert. Die Gemeinschaftsprofile für die rDNA und c-(r)DNA
Proben der Wochen eins bis neun sind nicht korreliert.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 150 -
D.2.13.4 V 2 MDS Ergebnisse der Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA
VF39 WT
Kontrolle
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
VF39 (pBBRIAA)
VF39(pBBRIAA)
Dimension 1
Dim
ensi
on 2
Kruskals Stress: 0,246
MDS V2: Rhizosphäre 16S rDNA
VF39 WTKontrolle
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
VF39 (pBBRIAA)
VF39(pBBRIAA)
Dimension 1
Dim
ensi
on 2
Kruskals Stress: 0,242
MDS V2: Rhizosphäre 16S c-(r)DNA
Abbildung 53: Rhizosphäre 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 2 (10 Tage Inkubation) obere Grafik: 16s rDNA
untere Grafik: 16S c-(r) DNA
grün: drei Tage Inkubation
blau: zehn Tage Inkubation
Bray-Curtis Koeffizient,
Modell: Absolut, Kruskals Stress,
Anhaltebedingungen:
Konvergenz= 0,00001/ Iterationen= 500
Anfangskonfiguration: zufällig
Vierecke mit Kreuz:
Klassendurchschnitt der Gemeinschaftsprofile
aller Versuchsansätze zur korrespondierenden
Inkubationszeit
Wie man in der grafischen Darstellung der MDS für die 16S rDNA erkennen kann,
bilden, mit Ausnahme der Rhizosphärengemeinschaft, die mit VF39 (pBBRIAA) (zehn
Tage Inkubation) inokuliert wurde, alle Versuchansätze eigene Cluster. Das könnte der
Einfluss der Inokulation mit diesem Stamm sein. Wie man deutlich sehen kann,
verlagern sich die Gemeinschaften der unterschiedlichen Versuchsansätze abhängig
ihrer Inkubationszeit. Die anderen Versuchsansätze liegen alle recht weit auseinander.
Daraus lässt sich schließen, dass die Ähnlichkeit der verschiedenen Gemeinschaften
nicht sehr hoch ist (3D Stress liegt bei 0,173 und 0,157).
Der durchgeführte Manteltest zeigte, dass die Gemeinschaftsprofile für die 16S rDNA
Proben der Tage drei und zehn sind nicht korreliert. Die Gemeinschaftsprofile für die
16S c-(r) DNA Proben der Tage drei und zehn sind korreliert.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 151 -
Die Gemeinschaftsprofile für die rDNA und c-(r)DNA Proben nach Tag drei und Tag10
sind nicht korreliert.
D.2.13.5 V 2 MDS Ergebnisse der Rhizoplane 16S rDNA und c-(r)DNA
VF39 WT Kontrolle
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
VF39 (pBBRIAA)
VF39(pBBRIAA)
Dimension 1
Dim
ensi
on 2
Kruskals Stress: 0,262
MDS V2: Rhizoplane 16S rDNA
VF39 WT
Kontrolle
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
VF39 (pBBRIAA)
VF39(pBBRIAA)
Dimension 1
Dim
ensi
on 2
Kruskals Stress: 0,423
MDS V2: Rhizoplane 16S c-(r)DNA
Abbildung 54: Rhizoplane 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 2 (10 Tage Inkubation) obere Grafik: 16s rDNA,
untere Grafik: 16S c-(r) DNA,
grün: drei Tage; blau: zehn Tage
Bray-Curtis Koeffizient,
Modell: Absolut, Kruskals Stress,
Anhaltebedingungen:
Konvergenz= 0,00001/ Iterationen= 500
Anfangskonfiguration: zufällig
Vierecke mit Kreuz:
Klassendurchschnitt der Gemeinschaftsprofile
aller Versuchsansätze zur
korrespondierenden
Inkubationszeit
Wie man in der grafischen Darstellung der MDS für die Rhizoplane erkennen kann,
bilden sich generell Cluster in Korrelation zur Inkubationszeit. Auffällig ist das
Gemeinschaftsprofil der mit VF39 pBBRIAA inokulierten Probe (16S rDNA, zehn Tagen),
dass nur wenig Ähnlichkeit mit den anderen Gemeinschaften zu diesem Zeitpunkt hat.
Das ist ein starker Hinweis auf einen möglichen Einfluss der Inokulation mit VF39
pBBRIAA.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 152 -
Der durchgeführte Manteltest zeigte, dass die Gemeinschaftsprofile für die 16S rDNA
Proben der Tage drei und zehn sind korreliert.
Die Gemeinschaftsprofile für die 16S c-(r) DNA Proben der Tage drei und zehn sind
nicht korreliert. Die Gemeinschaftsprofile für die rDNA und c-(r)DNA Proben nach Tag
drei sind nicht korreliert, aber nach Tag zehn.
D.2.13.6 V 3 MDS Ergebnisse der Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA
Vor Animpfung
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
Dimension 1
Dim
ensi
on 2
Kruskals Stress: 0,191
MDS V3: Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA
Vor Animpfung
Kontrolle
VF39 (pRD20)
VF39 (pRD20)Kontrolle
Abbildung 55: Rhizosphäre 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 3 (10 Tage Inkubation) 16S c-(r) DNA: schwarz umrandete
Vierecke
grün: drei Tage Inkubation
blau: zehn Tage Inkubation
Bray-Curtis Koeffizient,
Modell: Absolut, Kruskals Stress,
Anhaltebedingungen: Konvergenz= 0,00001/
Iterationen= 500
Anfangskonfiguration: zufällig
Wie man in Abbildung 55 sieht liegen die Punkte im MDS Plot, die die DGGE Profile der
Rhizosphärengemeinschaft bzw. der aktiven Rhizosphärenbakterien repräsentieren, in
zwei eindeutig getrennten Gruppen vor.
Da die Stress-Werte relativ niedrig sind (2D: 0,191; 3D: 0,099) lässt sich hier mit großer
Sicherheit sagen, dass die „Zusammensetzung“ der aktiven Bakterien sich von der
Zusammensetzung der vorhandenen Bakterien, hinsichtlich ihrer Abundanz und
Phylotypen unterscheidet. Das lässt sich allerdings anhand der Einschränkungen
hinsichtlich der PCR und DGGE-Methode erklären. Sie bevorzugt nur Bakterien, die in
größerer Menge vorliegen (Fromin, 2002).
Es ist kein offensichtlicher Einfluss der Inokulation mit VF39 (pRD20) zu sehen.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 153 -
Kruskals Stress: 0,221
Dimension 1
Dim
ensi
on 2
MDS V4: Rhizosphäre 16S rDNA und c-(r)DNA
VF39 (pJProlA)
VF39 (pJPpCAT)
VF39 WT
Kontrolle
VF39(pJProlA)
VF39(pJPpCAT)
VF39 WT
Kontrolle
Abbildung 56: Rhizosphäre 2-Dimensionaler MDS Plot für Versuchsansatz 4 (12 Wochen Inkubation)
schwarz: 16s rDNA,
grün: 16S c-(r) DNA,
Bray-Curtis Koeffizient,
Modell: Absolut, Kruskals Stress,
Anhaltebedingungen: Konvergenz= 0,00001/
Iterationen= 500
Anfangskonfiguration: zufällig
Wie man in Abbildung 56 sieht liegen die Punkte im MDS Plot, die die DGGE Profile der
Rhizosphärengemeinschaft bzw. der aktiven Rhizosphärenbakterien repräsentieren in
zwei eindeutig getrennten Gruppen vor. Der Versuchsansatz mit VF39 (pJProlA) liegt
relativ weit entfernt von den anderen 16S c-(r) DNA Versuchsansätzen. Daraus kann
man schließen, dass es einen Effekt der Inokulation mit VF39 (pJProlA) auf die
Aktivitätsstruktur innerhalb der Rhizosphärengemeinschaft nach zwölfwöchiger
Inkubation gegeben hat (3D Stress: 0,113). Doch aufgrund der Auswertung des DGGE-
Gels, in dem sichtbar wurde, dass für diese Probe die aufgetragene 16S rDNA-Menge
nicht optimal war, kann dieser Effekt ausgeschlossen werden.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 154 -
D.2.14 Ergebnisse der weiteren bivariaten Manteltests
Im zusätzlichen bivariaten Manteltests sollte überprüft werden, ob es eine Korrelation
zwischen der durch GC-MS in der Rhizosphäre gemessenen IAA-Konzentration und der
Diversität, Anzahl der Bakteriengruppen oder Eveness der verschiedenen
Versuchsansätze gibt.
Tabelle 34: bivariater Manteltest
Versuchsansatz 1 Rhizosphäre 16S rDNA und 16S c-(r) DNA
Matrix A Matrix B r p p % IAA Konzentration
Diversität -0,09 0,79 79,29
IAA Konzentration
Anzahl der Banden 0,10 0,76 76,37
IAA Konzentration Eveness -0,17 0,64 63,63
IAA Konzentration Diversität 0,16 0,64 64,17
IAA Konzentration
Anzahl der Banden -0,32 0,38 38,05
IAA Konzentration Eveness 0,29 0,41 40,69
Versuchsansatz 2 Rhizosphäre 16S rDNA und 16S c-(r) DNA
Matrix A Matrix B r p p % IAA Konzentration Diversität -0,36 0,50 50,42
IAA Konzentration
Anzahl der Banden 0,32 0,62 62,36
IAA Konzentration Eveness -0,41 0,45 45,42
IAA Konzentration Diversität -0,21 0,54 54,31
IAA Konzentration
Anzahl der Banden -0,47 0,35 35,42
IAA Konzentration Eveness -0,20 0,53 53,47
schwarze Schrift: 16S rDNA, rote Schrift: 16S c-(r) DNA
Testinterpretation:
H0: Die Matrizen sind nicht korreliert.
Ha: Die Matrizen sind korreliert.
Da der berechnete p-Wert größer als das Signifikanz-Niveau alpha=0,05 ist,
kann die Null-Hypothese H0 bestätigt werden.
Der p-value wurde mittels der Verteilung der r(AB) geschätzt auf Basis von 10000
Permutationen berechnet.
Das Risiko die Null-Hypothese H0 zurückzuweisen, obwohl sie wahr ist, beträgt für den
ersten Fall p= 79,29%.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 155 -
Nach Auswertung des bivariaten Manteltests konnte keine Korrelation zwischen IAA-
Konzentration und Diversität, Anzahl der Bakterienarten oder Eveness gefunden
werden. Allerdings ist zu bemerken, dass das Risiko H0 zurückzuweisen, bei
Untersuchung der Korrelation zwischen IAA-Konzentration und Anzahl der Banden
innerhalb der Struktur des Aktivitätsprofils der Rhizosphärenbakterien, am geringsten ist.
Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass es doch einen, wenn auch nur geringen,
Zusammenhang zwischen den aktiven Bakterien und der vorliegenden IAA-
Konzentration innerhalb der Rhizosphäre gibt.
D.2.15 Ergebnisse der Varianzanalyse
In der Varianzanalyse sollte untersucht werden, ob es einen Einfluss der Inokulation mit
den verschiedenen VF39-Stämmen bzw. der Behandlung mit IAA und der
Inkubationsdauer auf die Diversität der bakteriellen Gemeinschaft in der Rhizosphäre
gibt.
Für die Diversität der Rhizosphärenbakterien ist die Inkubationszeit ein signifikanter
Faktor. Weiterhin wird die Anzahl der Bakterien, die das Aktivitätsprofil der
Rhizosphärenbakterien bestimmt, sowohl von der Behandlung/ Inokulation als auch von
der Inkubationszeit beeinflusst. Die Abundanz der aktiven Bakterien wird hingegen nur
von der Inkubationszeit beeinflusst.
Bis auf diese Ausnahmen gibt es keinen signifikanten Einfluss der Inokulation/
Behandlung oder der Inkubationszeit auf die Diversität, Anzahl der Banden oder die
Eveness.
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 156 -
D.2.16 Zusammenfassung Ergebnisse und Diskussion Teil 2
Der Einfluss des gentechnisch veränderten Rhizobienstamms auf die vorhandene
bakterielle Gemeinschaft wurde durch die kultivierungsunabhängige DGGE-Methode
untersucht. Diese basiert auf der parallelen Extraktion von 16S rDNA und rRNA aus dem
Boden.
Das Profil der vorhandenen Bakterienarten in der Rhizosphäre und Rhizoplane wurde
mit dem der aktiven Bakterienarten verglichen. Weiterhin wurden die durch den
gentechnisch veränderten Rhizobienstamm bedingten Unterschiede im IAA-Gehalt der
Rhizosphäre durch GC-MS Analyse gemessen.
Nach Auswertung der Ergebnisse für die Versuchsansätze V1-4 steht fest, dass es
keinen anhaltenden Effekt einer Inokulation mit VF39 pRD20 auf die bakterielle
Gemeinschaft und die Struktur der aktiven bakteriellen Gemeinschaft innerhalb der
Rhizosphäre und Rhizoplane gibt. Dieses Resultat gilt nicht nur für die Beimpfung der
Wirtspflanze (V1, 2 und 4), sondern auch die der Nicht-Wirtspflanze (V3).
Bemerkenswerterweise zeigte die Inokulation mit VF39 pBBRIAA in Versuchsansatz V2
einen offensichtlichen Einfluss auf die bakterielle Gemeinschaft und ihre Aktivität.
Ein Grund dafür könnte die größere Stabilität des pBBRIAA-Plasmids im Gegensatz zum
pRD20-Plasmid sein, vermutlich bedingt durch die geringere metabolische Belastung der
Rhizobien (siehe Analyse der Plasmidstabilität). Die Inokulation mit VF39 pBBRIAA und
VF39 pRD20 beeinflusste in diesem Versuch ebenfalls die Zusammensetzung der
Wurzelexsudate.
Im Langzeitversuchsansatz V4 ist kein Effekt einer Inokulation mit den verschiedenen
gentechnisch veränderten VF39 Stämmen auf die Zusammensetzung der bakteriellen
Gemeinschaft oder der vorherrschenden Struktur innerhalb der Aktivität dieser Bakterien
zu erkennen.
Die Analyse der Diversität in allen Versuchsansätzen zeigt keinen statistisch
signifikanten Zusammenhang zwischen der Inokulation oder Inkubationszeit und der
Diversität innerhalb der 16S rDNA und c-(r)DNA Profile der Rhizosphäre und
Rhizoplane.
Ein Effekt der Behandlung mit IAA auf die bakterielle Gemeinschaft der Rhizosphäre ist
nicht auszuschließen. Die statistische Auswertung verdeutlichte hier einen signifikanten
Effekt der Behandlung mit IAA auf die Diversität, Anzahl der bakteriellen Gruppen und
Abundanz innerhalb der aktiven bakteriellen Gemeinschaft der Rhizosphäre. Der
Ergebnisse und Diskussion Teil 2
- 157 -
Einfluss der IAA-Behandlung konnte ebenfalls in der zusätzlich durchgeführten tRFLP-
Analyse und der ARISA Analyse von André Haselier gezeigt werden.
Die MDS Analysen der Gemeinschaftsprofile zeigen ebenfalls einen Effekt der IAA-
Behandlung auf die bakterielle Gemeinschaft.
Auch ist ein möglicher Einfluss der Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) auf die
Gemeinschaft der Rhizoplane sichtbar.
Nach Auswertung des bivariaten Manteltests konnte allerdings keine Korrelation
zwischen IAA-Konzentration und der Diversität, Anzahl der Bakterienarten und der
Eveness gefunden werden.
Die Varianzanalyse zeigte, dass die Inkubationszeit für die Diversität der
Rhizosphärenbakterien ein eindeutig signifikanter Faktor ist. Die Anzahl der Bakterien,
die das Aktivitätsprofil der Rhizosphärenbakterien bestimmt, wird sowohl von der
Behandlung/ Inokulation als auch von der Inkubationszeit beeinflusst. Die Abundanz der
aktiven Bakterien wird hingegen nur von der Inkubationszeit beeinflusst.
Die molekularbiologisch ermittelten Ergebnisse stehen allerdings im Gegensatz zu den
Ergebnissen der GC-MS Messungen der IAA in der Rhizosphäre. Der IAA Gehalt war für
alle Rhizosphären-Ansätze etwa gleich. Da IAA nicht sehr stabil ist, könnte allerdings in
der Rhizosphäre oder bei der Probenaufbereitung ein Teil abgebaut worden sein.
Die phänotypischen Veränderungen der Wurzelknöllchen und der Wurzeln lassen nicht
eindeutig auf die Inokulation mit den gentechnisch veränderten Rhizobienstämmen oder
die Behandlung mit IAA schließen.
Abschließend kann man sagen, dass sich in den durchgeführten Versuchen kein
einheitliches Bild ergibt. Es ist lediglich eine starke Tendenz zu sehen, dass die
Behandlung mit IAA einen Effekt auf die gesamte bakterielle Gemeinschaft hat.
Ein Einfluss der gentechnisch veränderten Stämme auf die bakterielle Gemeinschaft im
Boden – und damit die Umwelt – kann nicht vollständig ausgeschlossen werden.
Ein positiver Einfluss der Inokulation mit den IAA-synthetisierenden Stämmen auf die
Wirtspflanzen hinsichtlich ihrer Größe und ihres Ertrags, wurde in keinem der Versuche
sichtbar.
Zusammenfassung
- 158 -
E Zusammenfassung und Ausblick
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss eines gentechnisch veränderten Auxin
produzierenden Rhizobienstammes auf die bakterielle Gemeinschaft im Boden
untersucht.
Dazu sollte ein Detektionsverfahren, mit dem sich horizontaler Gentransfer ohne
Kultivierung der Bakterien nachweisen lässt, etabliert werden.
Dabei wurde festgestellt, dass die lacI-Gene, die die Expression des zur Detektion des
HGT verwendeten eGFP im Donorstamm reprimieren, ebenfalls transferiert wurden. Aus
diesem Grund wurde in einigen Rezipienten ebenfalls die Expression des eGFP
unterdrückt.
Damit der Transfer detektiert werden kann, ist es notwendig diese Gene stabil ins
Chromosom zu integrieren.
Der Transfer der verwendeten IAA-synthetisierenden Plasmide ließ sich in die Mehrheit
der getesteten Bakterien (Gram- und Gram+) nachweisen.
In einigen Stämmen war die Expression des eGFP jedoch nicht zu sehen. In den
analysierten Kolonien störte die starke Pigmentierung. Die Expression in „nicht
kultivierten“ Einzelzellen ist von der Stoffwechselaktivität abhängig, weswegen das
eGFP in metabolisch inaktiven Rezipientenzellen nicht detektiert werden konnte.
Zusätzlich dazu besitzt der Boden viele fluoreszierende Partikel und die Bakterien liegen
oft an Bodenpartikel assoziiert vor. Aus diesem Grund war es im Rahmen dieser Arbeit
nicht möglich, das Detektionssystem, das ursprünglich für aquatische Systeme
entwickelt wurde, auf das Ökosystem Boden zu übertragen.
Die Untersuchung des möglichen Einflusses, den der gentechnisch veränderte
Rhizobienstamm auf die bakterielle Gemeinschaft im Boden ausübt, wurde mittels
DGGE-Analyse der 16S rDNA und 16S c-(r)DNA durchgeführt.
Ein entscheidender Faktor für die Zusammensetzung der Bakterien und ihre Aktivität ist
die Zeit. Sie hat einen signifikanten Einfluss auf die Diversität und Abundanz der aktiven
Rhizosphärengemeinschaft. Die Anzahl der Phylotypen innerhalb der aktiven
Zusammenfassung
- 159 -
Rhizosphärengemeinschaft wird nicht nur von der Inkubationszeit, sondern auch von der
Behandlung beeinflusst. Abschließend wurden allerdings keine anhaltenden
Veränderungen in der Zusammensetzung und Diversität der Bakteriengemeinschaft und
ihrer Aktivitätsstruktur durch die modifizierten Rhizobienstämme festgestellt.
Da die Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaft stark von der Pflanze und von
der Art des Bodens abhängt, ist es empfehlenswert, sowohl weitere Pflanzen als auch
verschiedene Böden zu testen, um dann eine generelle Aussage über einen möglichen
Effekt der gentechnisch veränderten Rhizobienstämme treffen zu können.
Weiterhin ist es möglich, dass durch den raschen Verlust des pRD20 Plasmids in den
veränderten Stämmen nur am Anfang des Experiments Veränderungen in der
Bakteriengemeinschaft festgestellt werden konnten. Die stabile Expression der IAA-
Synthese Gene könnte durch die Integration ins Chromosom der Rhizobien
gewährleistet werden. Es ist allerdings fraglich, ob eine einzelne Kopie der Gene
ausreichend ist, um die IAA-Synthese zu verändern.
Die Analyse des IAA-Gehalts in der Rhizosphäre der Pflanzen ist durch die Inokulation
nicht beeinflusst worden. Auch gab es keine signifikante Veränderung hinsichtlich des
Pflanzen- und Wurzelwachstums.
Die eingehende Untersuchung der Wurzelknöllchen, die von den gentechnisch
veränderten Stämmen gebildet wurden, sowohl auf den IAA-Gehalt als auch auf die
morphologische Struktur der Knöllchen und ihre Nitrogenase-Aktivität hin, scheint mir
vielversprechend.
Die Sequenzierung der speziellen Banden ergab ein eher allgemeines Bild der
vorliegenden Bakteriengemeinschaft. Dies weist darauf hin, dass es in diesem Fall
besser ist, die bakterielle Gemeinschaft mit speziellen Primern, wie z.B. nifH in mehrere
Gruppen zu unterteilen und diese dann unabhängig voneinander auf Veränderungen zu
untersuchen.
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Anhang
- 183 -
G Anhang
G.1 Shannon Diversitätsanalyse
Tabelle 35 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V1 Rhizosphäre
Rhizosphäre 16S RDNA 16S c-(r)DNA
Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon Index H s Eveness
vor Animpfung 3,16 42 0,85 2,40 41 0,65
IAA 10-6 2,72 38 0,75 3,56 55 0,89
IAA 10-6 3,16 40 0,86 3,30 53 0,83
IAA 10-6 1,77 37 0,49 3,19 62 0,77
Kontrolle 3,29 46 0,86 3,47 53 0,87
Kontrolle 2,34 32 0,67 3,40 53 0,86
Kontrolle 2,99 55 0,75 3,19 59 0,78
VF39 (pHReGFPplac) 3,47 47 0,9 3,51 54 0,88
VF39 (pHReGFPplac) 2,96 39 0,81 3,05 44 0,81
VF39 (pHReGFPplac) 3,16 53 0,8 3,31 54 0,83
VF39 (pRD20) 3,08 39 0,84 3,20 53 0,80
VF39 (pRD20) 3,26 48 0,84 3,10 45 0,81
VF39 (pRD20) 3,21 50 0,82 3,24 54 0,81
VF39 WT 2,94 37 0,81 3,57 52 0,90
VF39 WT 3,06 40 0,83 3,29 47 0,85
VF39 WT 3,25 44 0,86 3,02 54 0,81
s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen Tabelle 36 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V1 Rhizoplane
Rhizoplane 16S RDNA 16S c-(r)DNA
Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon
Index H s Eveness
vor Animpfung 1,59 14 0,6 2,82 30 0,83
IAA 10-6 2,13 26 0,65 3,03 41 0,82
IAA 10-6 2,09 26 0,64 3,18 39 0,87
IAA 10-6 2,42 32 0,7 3,14 33 0,9
Anhang
- 184 -
Rhizoplane 16S RDNA 16S c-(r)DNA
Kontrolle 1,66 22 0,54 2,92 33 0,84
Kontrolle 2,42 27 0,74 3 41 0,81
Kontrolle 2,43 38 0,67 3,54 53 0,89
VF39 (pHReGFPplac) 2,48 28 0,74 3,6 39 0,98
VF39 (pHReGFPplac) 2,34 30 0,69 3,2 41 0,85
VF39 (pHReGFPplac) 1,64 23 0,52 3,33 47 0,86
VF39 (pRD20) 1,63 24 0,51 3,14 43 0,84
VF39 (pRD20) 2,37 29 0,7 3,17 41 0,85
VF39 (pRD20) 2,32 34 0,66 3,31 47 0,86
VF39 WT 2,16 26 0,66 3,2 39 0,87
VF39 WT 2,16 28 0,65 3,37 45 0,89
Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon
Index H s Eveness
VF39 WT 2,33 34 0,66 3,52 53 0,89
s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen Tabelle 37 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V2 Rhizosphäre
Rhizosphäre 16S RDNA 16S c-(r)DNA
Ansatz Shannon Index H
s Eveness Shannon Index H
s Eveness
vor Animpfung 1,33 42 0,36 1,02 37 0,28
Kontrolle 1,97 44 0,52 0,69 49 0,18
Kontrolle 2,51 51 0,64 2,25 48 0,58
WT 1,31 50 0,33 1,52 47 0,40
WT 1,65 47 0,43 2,29 50 0,58
pRD20 1,98 48 0,51 2,26 45 0,59
pRD20 1,53 48 0,40 2,55 49 0,65
pBBRIAA 2,96 47 0,77 2,75 46 0,72
pBBRIAA 2,37 51 0,60 2,38 43 0,63
s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen
Anhang
- 185 -
Tabelle 38 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V2 Rhizoplane
Rhizoplane 16S RDNA 16S c-(r)DNA
Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon
Index H s Eveness
vor Animpfung 2,29 41 0,62 2,83 49 0,73
Kontrolle 3,03 48 0,78 3,14 46 0,82
Kontrolle 2,70 47 0,70 3,27 49 0,84
WT 3,02 47 0,78 2,97 50 0,76
WT 3,06 54 0,77 3,07 47 0,80
pRD20 3,20 52 0,81 3,00 46 0,78
pRD20 2,60 44 0,69 3,33 56 0,83
pBBRIAA 2,98 41 0,80 2,64 41 0,71
pBBRIAA 3,18 53 0,80 3,31 50 0,85
s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen Tabelle 39 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V3 Rhizosphäre
Rhizosphäre 16S RDNA 16S c-(r)DNA
Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon
Index H s Eveness
vor Animpfung 3,17 55 0,79 2,99 34 0,85
Kontrolle 3,32 54 0,83 2,67 32 0,77
Kontrolle 3,35 51 0,85 2,77 31 0,81
pRD20 3,31 52 0,84 2,7 31 0,79
pRD20 3,26 48 0,84 2,82 32 0,81
s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen Tabelle 40 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V3 Rhizoplane
Rhizoplane 16S RDNA 16S c-(r)DNA
Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon
Index H s Eveness
vor Animpfung 2,50 33 0,71 2,52 30 0,74
Kontrolle 2,12 29 0,63 2,38 37 0,66
Kontrolle 2,09 38 0,58 1,92 44 0,51
pRD20 2,65 37 0,73 3,08 43 0,82
pRD20 2,44 34 0,69 2,29 36 0,64
s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen
Anhang
- 186 -
Tabelle 41 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V4 Rhizosphäre
Rhizosphäre 16S RDNA 16S c-(r)DNA
Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon
Index H s Eveness
Kontrolle 3,35 38 0,92 3,14 37 0,87
WT 3,52 50 0,9 3,32 42 0,89
pJPpCAT 3,57 53 0,9 3,28 37 0,91
pJProlA 3,31 37 0,92 3,24 33 0,93
Tabelle 42 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V4 Rhizoplane
Rhizoplane 16S RDNA 16S c-(r)DNA
Ansatz Shannon Index H s Eveness Shannon
Index H s Eveness
Kontrolle 3,32 39 0,88 2,95 33 0,84
WT 3,38 52 0,86 2,82 34 0,8
pJPpCAT 3,33 50 0,85 2,97 34 0,84
pJProlA 2,39 22 0,77 2,78 29 0,82
s: Anzahl der Phylotypen, Eveness: Abundanz der Phylotypen
Anhang
- 187 -
G.2 Auswertungen der tRFLP-Analysen des Versuchsansatzes V1
Pearson correla tion [6.4%-57 .9%]ILS600
100
50
ILS600
50.0
0
100
.00
150.
00
200.
00
250.
00
300
.00
350
.00
400.
00
450
.00
500.
00
550.
00
600.
00
650.0
0
700.
00
800.
00
900
.00
1000
1100
1200
1300
1400
bp
13.03.DNA (-)
17.03.DNA (Auxi
15.03.DNA (RD2
16.03.DNA (WT)
Pearson co rre lation [6 .4%-57.9%]ILS600
100
500
ILS600
50.0
0
80.0
0
150.
00
200
.00
250.0
0
300.
00
350.
00
400
.00
450.
00
500.
00
550.
00
600.
00
650.
00
700.
00
750.
00
900.0
0
1000
1100
1200
1300
1400
bp
15.05.DNA (
17.05.DNA (
18.05.DNA (
19.05.DNA (
VF39 WT
Kontrolle
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
IAA
%
%
Rhizosphäre V1 16S (r)DNA nach Woche 1
Rhizosphäre V1 16S (r)DNA nach Woche 9
Abbildung 57: tRFLP-Analyse der 16S rDNA der Rhizosphäre Versuchsansatz 1
Pearson co rre lation [6 .4%-57.9%]ILS600
100
908070
ILS600
50.0
0
100.
00
150
.00
200.
00
250.
00
300.0
0
350.0
0
400.
00
450.
00
500.
00
550.0
0
700.0
0
800.
00
900.
00
1000
1100
1400
bp
15.03.DNA Rp
17.03.DNA Rp
16.03.DNA Rp
13.03.DNA (-)
Pearson correla tion [6.4%-57 .9%]ILS600
100
806040
ILS600
100.
00
150.
00
200.
00
250.
00
300.
00
350.
00
400.
00
450.
00
500.
00
550.
00
600.
00
650.0
0
800.
00
900.
00
1000
110
0
1200
1300
bp
15.05.DNA Rp.
17.05.DNA Rp.
18.05.DNA Rp.
19.05.cDNA .
VF39 WT
Kontrolle
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
IAA
Rhizoplane V1 16S (r)DNA nach Woche 1
Rhizoplane V1 16S (r)DNA nach Woche 9
Abbildung 58: tRFLP-Analyse der 16S rDNA der Rhizoplane Versuchsansatz 1
Anhang
- 188 -
Pearson correlation [6.4%-5 7.9%]ILS600
100
908070
ILS600
50.0
0
100.0
0
150
.00
200
.00
250.0
0
300.
00
350.
00
400.
00
450.
00
500
.00
550.0
0
600.0
0
700.
00
800
.00
900.
00
1000
1100
1200
1400
bp
17.05.cDNA (RD.
18.05.cDNA (WT)
15.05.cDNA (-)
19.05.cDNA (Auxi.
Pe arson correlation [6.4%-57.9%]ILS600
100
90807060
ILS600
50.0
0
80.0
0
150.
00
200
.00
250.0
0
300.
00
350
.00
400.
00
450.
00
500.
00
550
.00
600.
00
650
.00
700.
00
750
.00
900.
00
100
0
110
0
1200
130
0
140
0
bp
15.03.cDNA (RD
16.03.cDNA (W
17.03.cDNA (Au
13.03.cDNA (-)
VF39 WT
Kontrolle
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
IAA
Rhizosphäre V1 16S c-(r)DNA nach Woche 1
Rhizosphäre V1 16S c-(r)DNA nach Woche 9
Abbildung 59: tRFLP-Analyse der 16S c-(r)DNA der Rhizosphäre Versuchsansatz 1
Pearson correla tion [6.4%-57 .9%]ILS600
100
9080706050
ILS600
50.0
0
100.0
0
150.
00
200.0
0
250.
00
300.
00
350.
00
400.
00
450.
00
500.
00
550.
00
600.
00
700.
00
800.
00
900.
00
1000
1100
1200
1400
bp
15.05.cDNA Rp (-
18.05.cDNA Rp (W
17.05.cDNA Rp (R
19.05.cDNA Rp (A
Pearson co rre lation [6 .4%-57.9%]ILS600
100
806040
ILS600
100.0
0
150.
00
200.
00
250.0
0
300.
00
350.
00
400.
00
450.0
0
500.
00
550.
00
600.0
0
650.
00
700.
00
800.
00
900.
00
1000
1100
1200
1300
1400
bp
15.03.cDNA R
16.03.cDNA R
17.03.cDNA R
13.03.cDNA (-
VF39 WT
Kontrolle
VF39 WT
VF39 (pRD20)
Kontrolle
VF39 (pRD20)
IAA
IAA
Rhizoplane V1 16S c-(r)DNA nach Woche 1
Rhizoplane V1 16S c-(r)DNA nach Woche 9
Abbildung 60: tRFLP-Analyse der 16S c-(r)DNA der Rhizoplane Versuchsansatz 1
Anhang
- 189 -
GC-MS Analyse
Abbildung 61: beispielhafte Darstellung eines Ergebnisses der GC-MS Analyse
Dazu wurde der IAA-Standard in die GC-MS injiziert. Im oberen Teil ist der für die Indol-3-Essigsäure
charakteristische Peak zu sehen. Im unteren Teil sind die gebildeten Fragmentionen (m/z 319, 202) der IAA
und ihr „Mengen“- Verhältnis zu sehen.
Anhang
- 190 -
Plasmidkarten: pRD20 und pBBRIAA
pBBRIAA7776 bps
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
NarI
SspI
NotIXbaIBamHIEcoRIEcoRVHindIII
StuIEcoRI
EcoRVBglIINcoI
BamHIXbaISphI
HindIIIHindIII
EcoRV
BamHI
Acc65IEcoRIEcoRI
EcoRV
BglIIEcoRV
NotI
tms2
iaaM
rolA
gentamicinmob site
pRD209707 bps
2000
40006000
8000
NotINarI
SspI
Ecl136IISacINotI
XbaIBamHI
PstIEcoRI
EcoRVStuI
EcoRINheI
EcoRVBglII
NcoIBamHI
XbaIPstI
SphI
PstI
EcoRV
BamHI
Acc65IKpnIEcoRI
DraI
spec
tms2
iaaM
prolApCAT
mob site
Abbildung 62: Plasmidkarte pBBRIAA
Abbildung 63: Plasmidkarte pRD20
Anhang
- 191 -
G.3 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Donorzelle ............................................................................................................... - 12 - Abbildung 2: Transkonjugand ...................................................................................................... - 12 - Abbildung 3: Synthese von Indol-3-Essigsäure ........................................................................... - 17 - Abbildung 4: schematischer Aufbau der sterilen Mikrokosmen ................................................... - 35 - Abbildung 5: Plasmidkarte pk19gabTgenta1lacI.......................................................................... - 40 - Abbildung 6: Plasmidkarte pJP2plac............................................................................................ - 41 - Abbildung 7: pJPeGFPplac .......................................................................................................... - 41 - Abbildung 8: pJPdsRedplac ......................................................................................................... - 41 - Abbildung 9: pRD20dsRedplac .................................................................................................... - 42 - Abbildung 10: pHReGFPGUSplac ............................................................................................... - 42 - Abbildung 11: pHReGFPplac ....................................................................................................... - 42 - Abbildung 12: pHRdsRedplac ...................................................................................................... - 42 - Abbildung 13: Phylogramm der verwendeten Bakterienstämme................................................. - 77 - Abbildung 14: PCR eGFP ............................................................................................................ - 80 - Abbildung 15: PCR lacI ................................................................................................................ - 80 - Abbildung 16: Eckhardt-Lyse der R. tropici CIAT 899 Transkonjuganden .................................. - 82 - Abbildung 17 A-C: Eckhardt Lyse mit anschließender Southern Hybridisierung......................... - 83 - Abbildung 18 a-b: Mikroskopische Detektion grün-fluoreszierender Einzelzellen ....................... - 88 - Abbildung 19: Plasmidstabilität pRD20 in VF39 .......................................................................... - 97 - Abbildung 20: Wachstum der Erbse bei verschiedenen Auxinkonzentrationen ........................ - 101 - Abbildung 21: IAA Synthese in vitro........................................................................................... - 101 - Abbildung 22: DGGE-Gel für die16S rDNA V1 .......................................................................... - 104 - Abbildung 23: DGGE-Gel für die16S c-(r)DNA V1..................................................................... - 106 - Abbildung 24: Shannon Diversitätsanalyse für Versuchsansatz V1 .......................................... - 109 - Abbildung 25: DGGE-Gel für die 16S rDNA V1 ......................................................................... - 111 - Abbildung 26: DGGE-Gel für die 16S c-(r)DNA V1.................................................................... - 113 - Abbildung 27 Shannon Diversitätsanalyse für Versuchsansatz V1 ........................................... - 115 - Abbildung 28: DGGE-Gel für die16SrDNA und c-(r)DNA V2..................................................... - 118 - Abbildung 29:DGGE-Gel für die 16SrDNA und c-(r)DNA V2..................................................... - 119 - Abbildung 30: Diversitätsanalyse ............................................................................................... - 121 - Abbildung 31: Diversitätsanalyse ............................................................................................... - 121 - Abbildung 32: DGGE für 16SrDNA und c-(r)DNA V3 ................................................................ - 123 - Abbildung 33:DGGE für 16SrDNA und c-(r)DNA V3 ................................................................. - 124 - Abbildung 34: Diversitätsanalyse Rhizosphäre V3 .................................................................... - 126 - Abbildung 35: Diversitätsanalyse Rhizoplane V3 ...................................................................... - 126 - Abbildung 36: Wachstumskurve der Einzelteile einer Erbsenpflanze (Geisler, 1988)............... - 128 - Abbildung 37:DGGE-Gel für die 16SrDNA und c-(r)DNA V4..................................................... - 129 - Abbildung 38: Diversitätsanalyse Rhizosphäre V4 .................................................................... - 131 - Abbildung 39: Diversitätsanalyse Rhizoplane V4 ...................................................................... - 131 -
Anhang
- 192 -
Abbildung 40: Versuchsansatz 1 IAA Konzentration in der Rhizosphäre .................................. - 132 - Abbildung 41: Versuchsansatz 2 IAA Konzentration in der Rhizosphäre .................................. - 134 - Abbildung 42: Versuchsansatz 3 IAA Konzentration in der Rhizosphäre .................................. - 135 - Abbildung 43: Versuchsansatz 4: IAA Konzentration in der Rhizosphäre................................. - 136 - Abbildung 44: Phylogenetischer Baum sequenzierter DGGE Banden ...................................... - 139 - Abbildung 45: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 WT ................................................ - 144 - Abbildung 46: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 (pRD20) ........................................ - 144 - Abbildung 47: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 (pJPpCAT) .................................... - 144 - Abbildung 48: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 (pJProlA)....................................... - 144 - Abbildung 49: Wurzelknöllchen nach Inokulation mit VF39 (pBBRIAA) .................................... - 145 - Abbildung 50: Verändertes Erscheinungsbild der Wurzeln........................................................ - 146 - Abbildung 51: Rhizosphäre MDS V1.......................................................................................... - 147 - Abbildung 52: Rhizoplane MDS V1............................................................................................ - 149 - Abbildung 53: Rhizosphäre MDS V2.......................................................................................... - 150 - Abbildung 54: Rhizoplane MDS V2............................................................................................ - 151 - Abbildung 55: Rhizosphäre MDS V3.......................................................................................... - 152 - Abbildung 56: Rhizosphäre MDS V4.......................................................................................... - 153 - Abbildung 57: tRFLP-Analyse der 16S rDNA der Rhizosphäre Versuchsansatz 1 ................... - 187 - Abbildung 58: tRFLP-Analyse der 16S rDNA der Rhizoplane Versuchsansatz 1 ..................... - 187 - Abbildung 59: tRFLP-Analyse der 16S c-(r)DNA der Rhizosphäre Versuchsansatz 1.............. - 188 - Abbildung 60: tRFLP-Analyse der 16S c-(r)DNA der Rhizoplane Versuchsansatz 1................ - 188 - Abbildung 61: beispielhafte Darstellung eines Ergebnisses der GC-MS Analyse..................... - 189 - Abbildung 62: Plasmidkarte pBBRIAA ....................................................................................... - 190 - Abbildung 63: Plasmidkarte pRD20 ........................................................................................... - 190 -
G.4 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: weiteres Material ......................................................................................................... - 20 - Tabelle 2: verwendete Kits........................................................................................................... - 21 - Tabelle 3: verwendete Geräte...................................................................................................... - 21 - Tabelle 4: verwendete Plasmide .................................................................................................. - 22 - Tabelle 5: verwendete Bakterienstämme..................................................................................... - 23 - Tabelle 6: Antibiotikazusätze für die Nährmedien........................................................................ - 26 - Tabelle 7: weitere Zusätze ........................................................................................................... - 26 - Tabelle 8 und 9: Zusammensetzung TfBI und TfBII Puffer.......................................................... - 28 - Tabelle 10: Pflanzennodulationsmedium (nach Rolfe et al., 1980) ............................................. - 37 - Tabelle 11: Bodenparameter........................................................................................................ - 38 - Tabelle 12: TA-Puffer (50x).......................................................................................................... - 46 - Tabelle 13: TB Puffer 5x .............................................................................................................. - 48 - Tabelle 14: Sondenherstellung .................................................................................................... - 51 -
Anhang
- 193 -
Tabelle 15: PCR Programm für die Sondenherstellung............................................................... - 51 - Tabelle 16: Lösungen für den Antikörpernachweis...................................................................... - 54 - Tabelle 17: RedTaq-Ready Mix ................................................................................................... - 59 - Tabelle 18: 16S PCR Mix............................................................................................................. - 59 - Tabelle 19: 16S PCR.................................................................................................................... - 60 - Tabelle 20: Stammlösungen PAA ................................................................................................ - 62 - Tabelle 21: TAE Puffer 50x .......................................................................................................... - 62 - Tabelle 22: Lösungen für die Silberfärbung ................................................................................. - 63 - Tabelle 23: DNA-Elutionspuffer.................................................................................................... - 65 - Tabelle 24: 16S PCR Programm für die tRFLP ........................................................................... - 67 - Tabelle 25: Verwendete Parameter für die GC-MS Analyse ....................................................... - 70 - Tabelle 26: Computersoftware zur Auswertung........................................................................... - 74 - Tabelle 27: Transfer auf Nitrocellulosefiltern ............................................................................... - 78 - Tabelle 28: HGT in sterilem und unsterilem Boden ..................................................................... - 85 - Tabelle 29: Vergleich der Transferfrequenzen durch KBE versus Mikroskopischer Auswertung- 90 - Tabelle 30: Transfer in Mikrokosmen........................................................................................... - 92 - Tabelle 31: Plasmideigenschaften – IAA Synthese ................................................................... - 137 - Tabelle 32: Sequenzierte DGGE Banden .................................................................................. - 140 - Tabelle 33: Pflanzenwachstum mit unterschiedlicher Inokulation in Vermiculit......................... - 142 - Tabelle 34: bivariater Manteltest ................................................................................................ - 154 - Tabelle 35 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V1 Rhizosphäre............................................... - 183 - Tabelle 36 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V1 Rhizoplane................................................. - 183 - Tabelle 37 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V2 Rhizosphäre............................................... - 184 - Tabelle 38 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V2 Rhizoplane................................................. - 185 - Tabelle 39 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V3 Rhizosphäre............................................... - 185 - Tabelle 40 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V3 Rhizoplane................................................. - 185 - Tabelle 41 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V4 Rhizosphäre............................................... - 186 - Tabelle 42 Diversitätsanalyse Versuchsansatz V4 Rhizoplane................................................. - 186 -
Anhang
- 194 -
G.5 Abkürzungsverzeichnis
verwendete Abkürzungen
% (v/v) Volumenprozent (volume per volume)
% (v/w) Gewichtsprozent (volume per weight)
(v/v) Volumenanteil
(w/v) Gewichtsanteil
° C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
A Adenin
A. dest destilliertes Wasser
aacC1 Gentamycinresistenzgen
Ap Ampicillin
aph(3’)-Iia Kanamycin-/Neomycinresistenzgen
APS Ammonium-persulfat
ARISA Automated ribosomal intergenic spacer amplification
ATG Startkodon
ATP Adenosintriphosphat
BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat (p-Toluidin-Salz)
bla Ampicillinresistenzgen
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bp Basenpaare
bv. Biovarietät
C Cytosin
ca. Circa
c-(r)DNA Komplementäre DNA
CIA Chloroform-Isoamylalkohol
cm Zentimeter
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
DDT Dithiothreitol
DEPC Diethylpyrocarbonat
DGGE denaturing gradient gel electrophoresis
DIG Digoxigenin
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure
DNase Deoxyribonuclease
dNTP Desoxynukleosid-Triphosphate
dsDNA Doppelsträngige DNA
dsRed „red fluorescent protein“
Anhang
- 195 -
verwendete Abkürzungen
DTT Dithiothreitol (Reduktionsmittel)
dTTP Desoxythmidintriphosphat
dUTP Desoxyuraciltriphosphat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
et al. Und andere
EtBr Ethidiumbromid
EtOH Ethanol
g Gramm
G Guanin
gabC/gabR Regulatorgen des gab Operons
gabD Strukturgen der Succinatsemialdeyd
GFP green fluorescent protein”
GUS β-Glukuronidase
h Stunde
H2O Wasser
IPTG Isopropylthiogalactosid
kb Kilobase(n)
Km Kanamycin
l Liter
lacZ Strukturgen der β-Galactosidase
LB Luria Broth
log logarithmisch
Lsg. Lösung
M Molar
m Meter
MCS “multiple cloning site”
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mob Siehe oriT
mRNA messenger-RNA
MSTFA N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide
NBT Nitroblau-Tetrazolium-Salz
NCBI National Center for Biotechnology Information
ng Nanogramm
nm Nanometer
nM Nanomolar
Nm Neomycin
Anhang
- 196 -
verwendete Abkürzungen
Nx Nalidixinsäure
o.D. Optische Dichte
ORF “open reading frame”
oriT Transferstartpunkt der Konjugation
oriV Replikationsstartpunkt
PAA Polyacrylamid
parCBADE Stabilitätsfaktor von RK2
PCR Polymerasekettenreaktion
pH negativer dekadischer Logarithmus der [H+]
PNPG 4-Nitrophenyl-β-D-glucuronid R resistent
RBS Ribosomenbindungsstelle
rDNA ribosomale DNA
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuclease
rpm Umdrehungen „rounds per minute“
rRNA Ribosomale RNA
RT Reverse Transcriptase
SDS Natriumdodecylsulfat
sek. Sekunden
Sm Streptomycin
T Thymin
Tab. Tabelle
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TBE Tris-Borsäure-EDTA- Puffer
Tc Tetracyclin
TE Tris-EDTA-Puffer
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethyl-ethyldiamin
tetAR Tetracyclinresistenzgene
TGA,TAA,TAG Stopkodons
Tm Schmelztemperatur
trfA siehe oriV
tRFLP terminal restriction fragment length polymorphism
Tris Tris-(Hydroxymethyl)-Ammonium
TY-Medium Tryptone Yeast-Medium
U Enzymeinheit (Unit)
uidA Strukturgen der β-Glucuronidase
UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean
Anhang
- 197 -
verwendete Abkürzungen
UV ultraviolettes Licht
V Versuch
WT Wildtyp
X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid
X-Gluc 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronid
z.B. Zum Beispiel
Danksagung
- 198 -
H Danksagung
Bei Frau Prof. Dr. U. B. Priefer möchte ich mich für die Bereitstellung des Themas und
die Erstellung des Erstgutachtens bedanken. Prof. Dr. A. Schäffer danke ich für die
Erstellung des Zweitgutachtens.
Vielen Dank auch an Prof. Dr. A. Slusarenko für seine freundliche Hilfe und die
konstruktiven Gespräche über Pflanzenhormone und „Bonsai- Erbsen“.
Mein ganz besonderes Dankeschön geht an Ina Horst. Ohne dich hätte ich diese Zeit
wohl kaum gut überstanden!
Charlotte Lahaye danke ich ebenfalls ganz besonders für Ihre Unterstützung und die
Wochenend-Korrekturen.
Jürgen Prell danke ich ganz herzlich für die Einführung und die Unterstützung zu Beginn
dieser Arbeit.
Bei Beata Bulawa möchte ich mich für die Unterstützung während der zweiten Phase
dieser Arbeit und für die angenehme Begleitung nach Kapstadt sehr herzlich bedanken.
André Haselier danke ich für die gute Zusammenarbeit. Wie hätte ich mich ohne dich
bloß durch diese ganzen Proben durchkämpfen sollen?
Bei Melanie Sapp möchte ich mich für Ihre Unterstützung beim Schreiben dieser Arbeit
und besonders für die Einführung und Hilfe bei der „Multivariaten Statistik“ ganz herzlich
bedanken.
Bei Herrn Jahnke und Peter Klauth bedanke ich mich für die Unterstützung bei der
Fluoreszenzmikroskopie.
Für das Korrigieren dieser Arbeit und die hilfreiche konstruktive Kritik geht ein herzliches
Dankeschön an Ina Horst, Ute Neumann und Melanie Sapp. Vielen Dank auch an Maria
Krämer, Richard Ottermanns und Bob Kosier für die kleinen und großen Hilfen während
dieser Arbeit.
Ein herzlicher Dank gilt meinen Eltern, die mir das Studium ermöglicht haben.
Lebenslauf
- 199 -
I Lebenslauf
Persönliche Angaben
Name: Corinna Lantin
Geboren: 23.09.1977 in Aachen
Anschrift: Vaalser Str. 182
52074 Aachen
Schulische Laufbahn
1984 - 1988 Grundschule Gut Kullen Aachen
1988 - 1997 Privates St. Ursula Gymnasium Aachen
Studium
1997 - 2000 Grundstudium Biologie RWTH Aachen
2001 - 2002 Hauptstudium Biologie RWTH Aachen
2003 Diplomarbeit im Institut für Biologie II der RWTH Aachen
2003 - 2008 Promotion im Institut für Biologie I der RWTH Aachen