EKSPERIMENTI IN VIVO NA NEANESTETISANIM ŽIVOTINJAMA

Dragan Obradović,Miroslav Savić

Tehnike istraživanja u biomedicini Kompjuterska simulacija (in silico) in vitro tehnike: na izolovanim

makromolekulama, ćelijama i tkivima (poreklo: humano, mikroorganizmi, životinje, biljke). Daju informacije o efektima i interakcijama među molekulama, do nivoa organa

Istraživanja na životinjama Istraživanja na ljudima i populacijama

U ispitivanju potencijalnog leka IN VITRO TESTOVI mogu da Pokažu efekte na izolovanim ćelijama i tkivima Ukažu na rizike od direktnih efekata Sugerišu opravdanost daljih ispitivanja

IN VITRO TESTOVI ne mogu da Kažu da li će se željeni efekat javiti u živom organizmu Kažu da li će se štetni efekat javiti pri primeni na živom organizmu

TESTOVI NA ŽIVOTINJAMA mogu da Sugerišu koje supstance bi, kao lekovi, mogle da budu korisne za ljude Daju snažnu naznaku da supstanca neće biti štetna za ljude

TESTOVI NA ŽIVOTINJAMA ne mogu da Predvide sa sigurnošću šta će se desiti pri primeni kod ljudi. Ipak,

omogućuju da se istraživač maksimalno približi situaciji realne primene na čoveku.

In vitro efekti vs. in vivo profilprimer: amlodipin

In vitro efekti amlodipina

Inhibicija L-tipa Ca2+ kanala u glatkim mišićima

Inhibicija K+-uzrokovanih kontrakcija u krvnim sudovima

Blokada preuzimanja Ca2+ u odgovoru na depolarizaciju

Smanjenje slobodnog Ca2+ u citosolu

Negativni inotropni efekat na srčani mišić

Inhibicija SA i AV čvora Smanjenje srčane frekvence i

brzina sprovođenja

In vivo efekti amlodipina

Klinički vs. eksperimentalni nalaziprimer: nimodipin

Meta-analiza 22 studije sa 6468 ispitanika sa akutnim ishemijskim moždanim udarom tretiranih nimodipinom: dovoljno dokaza za pouzdano odbacivanje povoljnog terapijskog efekta (Horn i Limburg (2001) Stroke 32: 570-76).

Sistematski pregled rezultata ispitivanja u animalnom modelu: nije bilo dovoljno dokaza za otpočinjanje kliničkih ispitivanja! (Horn i sar. (2001) Stroke 32: 2433-37).

Izvor citiranih statističkih podataka

Eksperimentalne životinje 85% pacovi, miševi i drugi

glodari 1% drugi mali sisari (kunići i

dr.) 2.7% ovce, krave, svinje i

drugi veliki sisari 0.3% psi i mačke 0.17% majmuni 11% ribe, amfibije, reptili i

ptice

Broj “procedura” na životinjama

Svrhe procedura na životinjama

Distribucija procedura po organskim sistemima

U Velikoj Britaniji 2003. godine, preko 60% procedura je bilo usmereno ka određenom organskom sistemu, najviše imunskom (18%) i nervnom (15%).

Udeo procedura usmerenih ka kardiovaskularnom, respiratornom i gastrointestinalnom sistemu bio je, pojedinačno, 2-3%.

18% procedura je bili usmereno ka više organskih sistema, a u više od 20% slučajeva podela na organske sisteme nije bila relevantna.

Anestezija u eksperimentu

Sprovođenje procedure bez anestezije ili analgezije dozvoljeno je samo ukoliko se procenjuje da primena anestetika ili analgetika predstavlja veću traumu od same procedure, ili kada je anestezija nekompatibilna sa postizanjem cilja procedure.

Više od 60% procedura u Velikoj Britaniji u 2003. godini nije koristilo anesteziju.

Opšta anestezija sa oporavkom je primenjena u 19% procedura, lokalna anestezija (uglavnom u svrhu prikupljanja materijala za genetske analize) u 11%, a opšta anestezija bez oporavka u 9.5% procedura.

Primena opšteg anestika kao metode žrtvovanja nije uzimana kao eksperimentalna procedura.

Eksperimentalni protokol Priprema protokola:

aktivnost slična pisanju manuskripta naučnog rada

Eksperimentalni protokol1. Naslovna strana (naziv studije, istraživači, osoblje,

sponzor, finansiranje) 2. Sadržaj3. Shematski prikaz planiranih istraživanja (radni

dijagram)4. Uvod5. Ciljevi6. Eksperimentalne metode7. Prikupljanje podataka i statistička analiza8. Mere zaštite osoblja9. Apendiksi10. Bibliografija

Primer in vivo eksperimenta:bihejvioralna istraživanja

Bihejvior (ponašanje) predstavlja celokupnost aktivnosti individue, posebno onaj njen segment koji je podložan (spoljašnjoj) opservaciji (Bureš i sar., 1983).

Bihejvioralni testovi i modeli: osnov istraživanja u psihofarmakologiji

Test vs. model

“Model”: pokušaj eksperimentalnog oponašanja humane patologije koja je predmet istraživanja

“Test”: termin se primenjuje opštije, za svaku proceduru koja se koristi za karakterizaciju eksperimentalnih uticaja na ponašanje životinje

Animalni modeli psihijatrijskih oboljenja: validnost

“Face validity”: sličnost bihejvioralnih znakova i simptoma kod čoveka i eksperimentalne životinje

“Construct validity”: jaka korelacija između specifičnih nalaza na nivou neurona i ponašanja u animalnom modelu, u odnosu na nalaze na bolesnicima

“Predictive validity”: dobro prognoziranje terapijske efikasnosti novog tretmana

Uloga prekliničkih modela u razvoju psihotropnih lekova(Geyer & Markou: Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress, 2003)

“Često je verovanje da animalni preklinički modeli predstavljaju usko grlo u otkrivanju psihotropnih lekova. Primena ovih modela kao “screening” tehnika se čini sporom u poređenju sa brzinom hemijske sinteze, high-throughput screening tehnikama i brzim tehnikama sekvencioniranja gena. Međutim, takvi preklinički modeli su neophodni da bi se dobila početna procena funkcionalnih efekata novih supstanci u integralnom organizmu. Jedino takve in vivo funkcionalne mere mogu da potvrde pretpostavke o mogućim efektima novih jedinjenja kod bolesnika. Pri pokušaju lečenja kompleksnih mentalnih, kognitivnih i emocionalnih smetnji koje još uvek nemaju jasno definisani neurobiološki supstrat, ili čak ni korelat, nije realističan pristup ići direktno iz test epruvete u kliniku...”

Bihejvioralna istraživanja

1. Zasnovana na ispitivanju neuslovljenog, ili spontanog ponašanja životinje; u osnovi ovog tipa ponašanja se nalazi biološki fenomen eksploracije – istraživanja, kao bihejvioralne aktivnosti podstaknute nepoznatom okolinom.

2. Zasnovana na uslovljenom ponašanju, kada se uspostavlja veza između percepcije određenog stimulusa (uslovna draž) i nagrade ili kazne (bezuslovna draž): bihejvioralna aktivnost je usmerena ka sticanju nagrade ili izbegavanju kazne.

Bihejvioralni rezultati Najčešće: parametri motorne aktivnosti

(lokomotorna aktivnost, propinjanje, njuškanje...)

Nemotorni parametri: primer ultrazvučne vokalizacije

Parametri (indeksi) ponašanja vs. dimenzije (faktori) ponašanja: statističko povezivanje (faktorska analiza)

Poistovećivanje pojedinih dimenzija ponašanja sa (pretpostavljenim) kognitivnim, emotivnim i motivacionim aspektima psihičkog statusa eksperimentalne životinje: biološko povezivanje

Nivoi bihejvioralnih istraživanja Opservacija (telesna masa, temperatura,

izgled krzna, aktivnost u kavezu) Neurološki refleksi (refleks uspravljanja,

treptanje, trzanje uva, orijentacija vibrisa) Motorne funkcije (spontana aktivnost,

testovi koordinacije, mišićna snaga) Specifični aspekti ponašanja: hranjenje,

učenje i pamćenje, reproduktivno ponašanje, socijalno ponašanje, testovi/modeli čiji su parametri povezani sa stanjima anksioznosti, depresije, shizofrenije, zavisnosti

Uzdignuti plus-lavirint: primer modela spontanog ponašanja

Aktivno izbegavanje: primer testa uslovljenog ponašanja

Pasivno izbegavanje: primer testa uslovljenog ponašanja

Zadatak:Na osnovu podeljenih separata radova, u zajedničkoj diskusiji,

izvesti zaključke o:

1. Broju eksperimentalnih životinja po pojedinačnom tretmanu koji zahtevaju bihejvioralni eksperimenti

2. Uticaju spoljašnjih faktora, uključujući eksperimentatora, na rezultate bihejvioralnog istraživanja

3. Parametrima ponašanja povezanim sa stanjem ankioznosti, odnosno sa memorijskom funkcijom

4. Eksperimentalnim uslovima pod kojima bi praćeni parametar motorne aktivnosti najbolje odražavao spontanu lokomotornu aktivnost, odvojenu od mogućih uticaja ispitivanog tretmana na stanje anksioznosti/emocionalne rektivnosti (koristiti separat rada na narednom slajdu)

5. Eksperimentalnim uslovima pod kojima bi praćeni bihejvioralni parametar najbolje odražavao stanje anksioznosti, odvojeno od mogućih uticaja ispitivanog tretmana na spontanu motornu aktivnost

Zadatak: uslovi za selektivno praćenje spontane lokomotorne aktivnosti