el disfrute del vino-placer - enobiotec.files.wordpress.com · 3 desarrollo de la spme...

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Antonio TomásPALACIOS GARCÍA

Universidad de la RiojaLaboratorioEXCELL Ibérica, S.L.

26006 Logroño – La Riojawww.labexcell.comUnivers idad de la RiojaUnivers idad de la RiojaUnivers idad de la Rioja

Lista de riesgos químicos:• Productos fitosanitarios y herbicidas,

• Metales pesados: plomo, mercurio, arsénico...,

• Productos de limpieza y desinfección,

• Grasas y aceites,

• Migraciones de los envases: bisfenol A y diglicidil-éter de bisfenol A, ftalatos, nonilfenoles,

• Etilenglicol y dietilenglicol,

• Carbamato de etilo, aminas biógenas, ocratoxina A

• Antifermentos: natamicina, benzoico, sórbico.

• Ferrocianuro,

• Substancias liberadas del roble, virutas o chips de roble o por exceso de tostado: hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), migraciones de los tapones: contaminantes orgánicos persistentes, bifenilos policlorados y HAP,

• Familia de compuestos considerados como alergénicos: anhídrido sulfuroso, derivados de productos de leche y huevo.

LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD :El Consumidor

2 – LA SATISFACCIÓN:

a) Ausencia de defectosb) La caracterización o tipicidad

3 - LOS SERVICIOS:

Aquisición cultural, recuerdos, sentimientos

1 – LA SEGURIDAD ALIMENTARIA:

La salud

Las exigencias del consumidorLas exigencias del consumidor

El disfrute del vino-placer

Aromas y Bouquets:El aroma es el olor percibido por olfacción directa y el bouquet se percibe por vía retronasal.

TIPOS DE AROMAS:•Primario o varietal•Secundario o fermentativo•Terciario o de crianza

Gustos Elementales

El disfrute del vino-placer

Número infinito de sabores.• DULCE: Sacarosa. Reacción inmediata. Punta de la lengua.• ÁCIDO : Tartárico o cítrico. Mayor persistencia. Laterales y base de la lengua.• SALADO: Cloruro sódico. Mayor persistencia. Bordes de la lengua.• AMARGO : Quinina. Lento en percepción pero más constante. Parte posterior de la lengua.• UMAMI : Glutámico.

Sam Harrop: International Wine Challenge, 2012

Calidad: sensibilidad del catador

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Mercaptanos y Sulfuros• SULFUROS:

– 2-Metil-3-tiofanona : miga de pan (0,1-1,0 µg/L)

– Sulfuro de etilo: ajo (15-18 µg/L)– Sulfuro de dimetilo: o liva (1,4-8,5 µg/L)

• DISULFUROS:– Disulfuro de dimetilo : col (30- 45 µg/L)– Disulfuro de dietilo : cebolla, caucho (25-40 µg/L)

• TIOLES:– Metano-tio l: podrido (0,3 µg/L)– Etanotio l: cebolla, gas, ajo (1,1 µg/L)– Mercato-etanol: corral, palo de gallinero (1-10 µg/L)

• ALCOHOLES:– 3-Metil-Sulfanil-propano : patata cruda, tubérculo

– 2-Metil-sulfanil-etanol: judía verde (1-10 mg/L)– Metionol: coliflor, col cocida (3,2-4,5 mg/L)

• ÉSTERES:– Acetato de tio-metilo: vegetales podridos, queso (10-40 µg/L )– Acetato de tio-etilo: quemado, sulfurado (10-30 µ/(L)– Acetato de metil-sulfanol-propilo: ajo, champiñón (100-115 µg/L)

35%

2% 2% 2%5%

12%

7%

19%

12%

4%

No identificado Cuadra Cuero Animal

Boñiga Caballo Betún Laca

Madera mojada Brett

Serie Etil-fenolSerie Etil-fenol

Calidad: sensibilidad del consumidor

Contaminaciones/Alteraciones del VinoLas fuentes son numerosas !

• De la uva– Contaminaciones fitosanitarias (parásitos, pesticidas).

– Alteraciones de la vendimia (parásitos, accidentes de vendimia mecánica).

• En el curso de la vinificación (fermentación)– Alteraciones microbianas

– Contaminaciones externas (accidentes de extracción, fluidos refrigerantes )

• En el curso de la crianza– Alteraciones microbianas– Oxidación y reducción– Contaminaciones por materiales de contacto (revestimiento s de cubas, madera)

– Contaminación ambiental (atmósfera)

• En el curso del embotellado– Alteraciones microbianas

– Oxidación– Contaminaciones por materiales de contacto (revestimiento s, filtros, productos

enológicos)

• En el curso de la evolución en botella– Alteraciones microbianas en el curso del envejecimiento

– Oxidación– Reducción– Contaminación por embalajes de contacto (corcho)

– Condiciones de transporte/alm ac en ami en to (a parte de la temperatura)

Fuentes de Contaminación :Numerosas y diversas, pero las principales son

f recuentemente los mismas

• Alteraciones microbianas sobre el vino:

– Levaduras• Brettanomyces intermedius

• Zygosaccharomyces bailii

– Bacterias acéticas:• Acetobacter/Gluconobacter

– Bacterias lácticas :• Lactobacillus sp.• Pediococcus sp.

• Defectos de materias primas:– Uvas insuficientemente maduras

– Estado sanitario insuficiente

• Ambiente de bodegas de vinificación y crianza:– Fuente contaminante indirecta

• Materiales de contacto directo:

– Madera de roble y alternativos– Sistemas de taponado y

netamente de corcho– Revestimientos de cubas

Identificación Precisa de la Naturaleza y del Origen de las Contaminaciones:

Comprensión, Prev ención y Solución de los

problemas!

• El análisis sensorial (degustación) es siempre la primera herramienta de diagnóstico a la disposición del técnico.

• Ello permite seguir orientando la investigación, pero nunca diagnosticar precisamente la naturaleza ni el origen del problema, llevando incluso a confusión.

• Ello no permite detectar niveles bajos del problema, solo cuando la alteración es ya efectiva en el vino …

• Raramente posible anticipar acciones con esta herramienta !

• El factor tiempo en el diagnóstico es siempre crítico !

Técnicas analíticas finas: Rápida evolución tecnológica

- . Mejores técnicas separativas .

- . Mejor sensibilid ad en la detección.

- . Mejores p rocedimientos de ex tracción.

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Desarrollo de la SPME (micro-extracción en fase sólida)

Utilización de la SPME en modo espacio de cabeza (HSSPME) para aislar y concentrar las moléculas específicas sin utilización de solventes y de manera automática:

- . Fase PDMS (apolar) para los haloanisoles (poco polares)(Chatonnet et al., J Int Sci Vigne Vin. 39, n°3 (2005), 137-147)

- . Fase Poliacrilato (polar) para los fenoles volátiles (polares)(Mejias et al., Journal of Chromatography A 995 (2003), 11–20)

Optimización del método Check List

-. A juste del pH (7).-. U tilización de la SPME, fibra DVB/CAR/PDMS ( m ezcla).-. A juste de la polaridad por dilución 1/2 .

0

1

2

3

4

5

6

7

F ibr aDVB/ CAR/PDMS

Fibr a PDMS

Ti po de fi bra

Res

pue

stas

rela

tivas

2M35DPTCAGeosminaIB MP

0

1

2

3

4

5

6

sin dilución dilució n=1/2Di luc ión

Res

pue

stas

rela

tivas

2M35DPTCAGeosminaIBMP

Optimización del método

• Op t imización de la temp eratura de extracción: La temperatura controla la evaporación y absorción en la fibra. El valor seleccionado es de 45ºC, (máximo de

absorción de pirazinas).

• Op t imización del tiem po de extracción: Para incrementar la productividad y no llegar al equilibrio de absorción de algunos compuestos, se eligió 60 minutos.

Check List

Detección simultánea específicapor SIDA-HSSPME-GC-MS

Aplicaciones del

CHECK LIST:

Análisis simultáneo de 26

moléculas implicadas en

defectos organolépticos en

un nivel inferior o igual a sus

umbrales de percepción:

-. Identificación de defectos

complejos (combinación de

defectos).

-. Prevención de defectos

organolépticos.

-. Asistencia en compra-venta de

vinos.

-. Coupages y mezclas.

-. Control de calidad en general.

-. Peritaje jurídico.

0

0, 0 02

0, 0 04

0, 0 06

0, 0 08

0, 0 1

0, 012

0, 014

0, 016

0, 018

mg/l

Mercatoetanol

Dietilsulfuro

Umbralde tección

Conc. real

U. olfativas = 8

U. olfativas = 10

Influencia del umbral de detección y las unidades olfativas en los “coupages”

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La Tradición versusLa Tecnología


Lo hago yo mismo, igual que mi tatarabuelo lo hacía……. Nada de nuevas tecnologías, levaduras o esas porquerías…….


¿Que es terroir?¿Que es terroir?

Cuevas de la Villa de Requena cuyo subsuelo está ocupado por

antiguas bodegas

¿Que es Terroir ?¿Que es Terroir ?

Control de Calidad versus

Identificación de Problemas

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Ejemplo 1 : Defecto « humedad+corcho » detectado por cata

Synergie des effets:

Concentración

TCA 1,5 ng/lTeCA nd (<0,2 ng/l)PCA 1,0 ng/lTBA 2,6 ng/l

Sinergia!

Equivalente TCA 4.1 ng/l > umbral

Contaminación de origen estrictamente medioambiental:

-. Ambiente de bodega

-. Materiales de contacto, contaminación indirecta

Vino tinto D.O.Ca. Rioja Contaminación corcho:

-. una polución por tapones de corcho de la botella ?

Ejemplo 2 : Carácter « vegetal »Vino de Shyraz de la D.O. Valencia que presenta una desviación

organoléptica importante con un carácter «vegetal»

2-hetoxi-3-hexadieno 3,3 µg/L Check List

Concentración superior al umbral de percepción medido por Excell (0,25 µg/L)

Degradación de ácido sórbico utilizado para la estabilización de taninosenológicos líquidos por bacterias lácticas después del envasado.

Concentration Método

alcoholes/aldeh idos insaturados C6 nd (<0,1 mg /l ) (ot ro método)

2-isobutil -3 -metoxipirazina nd (<3 ng /l ) Check Lis t

2-isopropil -me toxipi ra zina nd (< 4 ng/l) Check Lis t

Ejemplo 3 : Carácter « terroso »Vino blanco de la D.O. Mancha que presenta durante la vinificación una

desviación organoléptica importante del «tipo terroso».

ORIGEN:

-. Productos enológicos (chips) ?

-. P o r el corcho utilizado

-. Estado sanitario de la uva ?

2M3,5DMP 16,2 ng/l2-metoxi-3,5-dimetil-pirazina

Contenido muy superior al umbral definido por

SIMPSON et al. 2004: 2 ng/L en vino

Concentración

Geosmina nd (< 1,5 ng /l)

2-MIB nd (<6,0 ng/l)IPMP nd (<4,0 ng/l)

Metoxi-Iso-BorneolIsopropil-Metoxipiraz ina

Aspergillus sp

Aspergillus sp

Mohos en madera o en corcho :

-. Penicillium-. Aspergillus-. Monilia s itophila-. Candida sp

Ejemplo 4 : Carácter « vegetal, cartón mojado, papel, champiñón »

Trans-nonenalTrans-octenal

Vino de la D.O. Ribera del Duero con falta de fruta y aromas de cartón mojado, sin madera neta.

Bacterias en corcho :

-. Bacillus-. Corinobaterium sp-. Flavobacterium sp-. Kurthia sp-. Micrococcus-. Nocardia sp-. Pseudomonas sp-. Streptomyces sp-. Listeria sp

Ejemplo 5 : Carácter « ahumados, tizón, químico, abrillantador de metal »

Guaiacol

Vino del Priorat con exceso de madera tostada, ahumados.

Ejemplo 6 : Partículas en suspensión «insolubles » en botella.

Vino del Alentejo (Portugal) embotellado con partículas en suspensión

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Ejemplo 7 : ¿Adición de « glicerina »?

Vinos de D.O. Mancha y Rueda parados en Alemania por detección de «3-Metoxi-1,2-Propanediol 3-MPD y Diglicerol cíclico DC».

Compuesto Vino A Vino B

3-MPD n.d. 0,2 mg/L

DC 1,1 mg/L n.d

Concentración superior al límite legal OIVProviene de glicerina de hidrocarburos

Concentración superior al límite legal OIVProviene de glicerina de grasa vegetal o animal

El Vino con 3-MPD puede provenir de la utilización de chips de roble americano.

Contaminaciones Microbiológicas del Vino:

P ueden aparecer en todos los estadios de la elaboración

A- UvaA- Uva B- VinificaciónFermentaciónB- VinificaciónFermentación

C- CrianzaC- Crianza

D- Envejecimientoen botella


A- Uva B- VinificaciónFermentación

C- Crianza


Principales micro-organismos contaminantes del Vino

• Levaduras– Brettanomyces intermedius

• Producción de fenoles volátiles (etil-fenoles)

– Zigosaccahromyces baïlli• Refermentación de azúcares

residuales por la presencia de antisépticos

• Bacterias acéticas– Acetobacter sp., Gluconobacter

sp. :• Producción de ácido acético,

acetato de etilo y ácidos grasos volátiles.

• Bacterias lácticas– Lactobacillus sp.

• Producción de aminas biógenas

• Degradación láctica de glicerol

– Pediococcus sp.• Producción de aminas

biógenes• Producción de acetil-

tetrahidropiridinas• Producción de acroleína

Como detectarlos y cuantificarlos rápidamente y

selectivamente ?

a) Cultivos de microorganismos sobre medios sintéticos

• Un medio específico para cada micro-organismo:-. Muy difícil diferenciar entre bacterias lácticas en cultivos

genéricos.

-. El control de Brettanomyces necesita un medio de cultivo específico que casi ningún laboratorio utiliza.

-. Muchos falsos positivos .

• Retraso de crecimiento en cultivos variable según

los micro-organismos y sus estados fisiológicos (2

a 8 días):- Respuesta muy tardía para ser verdaderamente útil en

casi todos los casos de bodega !.

• No toma en cuenta los gérmenes viables no cultivables en función de su estado fisiológico en el

momento del control !.

b) Evolución de los cultivos simples sobre medios sintéticos

Cult ivo so bre med io es pecíf ico Suiv iBrett Exc ell

Cult ivo / PCR mig ració n so bre g el

Cultiv o/ de tecció n d e m icro colo nias

Pr incip io Cultivo sobre medio sintético específ ico

Cultivo sobre medio se miespecífico / PCR /

E lectrofo resis

Cultivo sobr e medio se miespecífico + ide ntificació n de

colonias / anticuer pos flueresce ntes

Ti empo de resp uest a 5-8 dí as 6-9 días 2- 4 días

Específ icoDep ende de la especificid ad del

medio d e cultivo

Específico segú n los m icr oorga nismos apun tados por la

elección de lo s fragm entos

Semi esp ecífico según m edio de cultivo + especificidad d e los

a nticuerpos

Sens ibilid ad

Detección de gérm enes quiescentes aleat orios = sub-estimación de la población po tencialmente pelig rosa

De tección de gér menes quiescente s aleatorios = sub- estim ación de la po bla ció n potencialmen te peligrosa

10 ufc/m L

Precis ión Defe ct os de funciona miento

Aplic ación de la t écnica

F ácil d e puesta a punto, equ ip amiento p oco costoso

Man o de obr a cualitativo / Equipamiento específico

Costo so / Mater ial específico / Precauciones de manipu lación

severas

La ba ja viab ilidad de las células debido a las condiciones "e stresantes" del vino pu ede condu cir a resulatd os de falsos neg ativos

Cult ivo so bre med io esp ecífico SuiviBrett Excell

Cultiv o / PCR m igración sobre gel

Cult ivo/ d etecció n d e m icro colo nias

Pri ncipi o Cultivo sobre m edio sintético específico

Cultivo sobr e medio semiespecíf ico / PCR /

Electr oforesis

Cultivo sobr e medio semiespecífico + identificación de

colonias / anticuer pos fluer escentes

Tie mpo de resp uest a 5- 8 días 6-9 días 2-4 días

Específ icoDepen de de la espe cificidad d el

medio de cu ltivo

Espe cífico según los microo rganismos a puntados po r la

elecció n de los fra gmentos

Sem i específico según m edio de cultivo + espe cificidad de los

anticuerpos

Sensi bilida d 10 uf c/ mL

Precisi ón Def ectos de fun cion amiento

Aplica ción de la t écnica

Fá cil de p uesta a pun to, equipam iento poco co st oso

Mano de o bra cualitativo / Equipam iento específico

Costoso / Mate rial específico / Precaucion es de manipu la ción

severas

La baja viabilidad de la s célu la s debido a las cond icione s "estresan tes" del vin o puede co nducir a result ados de fa lsos n egat ivos

Detecci ón d e gérmen es qu iescen tes ale ator ios = sub - estim ació n d e la po blaci ón p oten cialm ente peligrosa

Poco costoso

Retraso en la respuesta

No detecta los gérmenes

viables no cultivables (VNC)






Electr oforesis



Tie mpo de resp uest a

5- 8 días 6- 9 días 2-4 días

Específ ico Depen de de la espe cificidad d el medio de cu ltivo




anticuerpos


Precisi ón Def ectos de fun cion amiento




Costoso / Mate rial específico / Precaucion es de manipu la ción

severas

La baja viabilidad de la s célu la s debido a las cond icione s "estresan tes" del vin o puede co nducir a r esult ados de fa lsos n egat ivos


Retraso en la respuesta

No detecta los VNC






Electr oforesis



Tie mpo de resp uest a 5- 8 días 6- 9 días 2-4 días

Específ icoDepen de de la espe cificidad d el

medio de cu ltivo




anticuerpos


Precisi ón De fecto s de fun ciona mien to




Costo so / M ater ial esp ecífico / Prec aucio nes d e man ipu lación

se veras


La baja viabilidad de la s célu la s debido a las cond icione s "estresan tes" del vin o puede co nducir a result ados de fa lsos n egat ivos

Defecto de

funcionamie nt o

Los gérmenes viables no cultivables (VNC)

Distr ibución caracter ística de las poblacion es Distr ibución caracter ística de las poblacion es

microbianas de Brett en una muestra de vinomicrobianas de Brett en una muestra de vino

•• Células viables yCélulas viables ycultivablescultivables

••Células muer tasCélulas muer taso mor ibundaso mor ibundas

•• Células viablesCélulas viablesNo cultivablesNo cultivables

Distr ibución caracter ística de las poblacion es

microbianas de Brett en una muestra de vino

• Células viables ycultivables

•Células muer taso mor ibundas

• Células viablesNo cultivables

Una parte importante de los micro-organismos pueden sin embargo

desarrollarse después de un tiempo de aclimatación variable con la

desaparición del estrés fisiológico (antiséticos, temperatura,….)

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c) Técnicas alternativas en desarrollo

Interés limitado por ser no específicasAlgo interesante:

no específica, semi-cuantitativa y retrasos

muy prolongados

Epif lour escenciaC itometría de flujo para detectar

BrettanomycesA nálisis microscópico Snif f " Brett"

Pr incipioMarcaje de células por

flourescencia /Cuanti ficación de la señal flourescente

Marcaje por flourescencia no espec ífica de células viv ientes

Observación microscópicaC ultivo sobre medio l íquido semi-

espec ífico / detecc ión de metabol itos por anál isis sensorial

Tiempo de respuesta

24 horas < 15 minutos 15 minutos 2-13 días

Específico No espec ífico No espec ífico No espec íficoD etección de poblac iones v iables

en el curso del c recimiento

Sensibilidad 100.000 cel/mL 200 cel/mL 100.000 cel/mL Tes t semi-cuanti tativo

Precisión

La baja v iabi lidad de células debido a las condiciones

estresantes del v ino conduce a resultados de falsos negativos

Aplicación de la técnica

Mano de obra cual ificada / Material espec ífico

Mano de obra cual iti ficado / Material específico / Aplicable

solamente cuando la fermentac ión alcohólica es tá terminada o

bloquedada

Fáci l puesta a punto / Cos to bajo Fác i l pues ta a punto / Costo bajo

Las morfologías ambiguas de microorganismos pueden fáci lmente desenvocar en identi ficaciones erroneas





Marcaje por f lour escencia no específica de células v iv ientes



Tiempo de respuesta


Específico No específico N o específico No específicoD etección de poblac iones v iables

en el curso del c recimiento

Sensibilidad 100.000 cel/mL 200 cel/mL 100.000 cel/mL Tes t semi-cuanti tativo

Precisión

La baja v iabi lidad de células debido a las condiciones

estresantes del v ino conduce a resultados de falsos negativos





bloquedada


Las morf ologías ambiguas de micr oor ganismos pueden fácilment e desenvocar en identificaciones erroneas





Marcaje por f lour escencia no específica de células v iv ientes



Tiempo de respuesta


Específico No específico N o específico No específicoDetección de poblaciones

viables en el curso del crecimiento

Sensibilidad 100.000 cel/mL 200 cel/mL 100.000 cel/mL Test semi-cuantitativo

Precisión

La baja viabilidad de células debido a las condiciones

estresantes del vino conduce a r esultados de falsos negat ivos





bloquedada


Las morf ologías ambiguas de micr oor ganismos pueden fácilment e desenvocar en identificaciones erroneas

Med io s co n p recu rso res d e aro mas

Técnicas Moleculares: Aplicaciones PrácticasTécnicas Moleculares: Aplicaciones Prácticas

Ventajas:

� Alta sensibilidad

� Alta especificidad� Rapidez

Otras ventajas:

• Detección a partir de cualquier muestra biológica (sangre,

piel, cabellos, saliva, líquido cefaloraquídeo, etc…)• No es necesario que la muestra sea estéril.

• Detección de un patógeno en particular aún en presencia

de otros patógenos.

1983 – 1985: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)1983 – 1985: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

¿ Que es la PCR ?¿ Que es la PCR ?

Kary MullisKary MullisKary Mullis

� Diagnóstico clínico

� Seguimiento y Evaluación de terapia

� Detección de cepas resistentes a antibióticos

� Detección de mutaciones puntuales

� Polimorfismo genético

� Filiación humana

� Medicina Forense

� Pedigrí animal

� Control de calidad

Aplicaciones de la PCR:Aplicaciones de la PCR:

PCR Clásica:PCR Clásica:

Gel de agarosa teñido con

bromuro de etidio

• Desarrollo de la técnica para detectar contaminantes:

>> ExcellGen Levaduras>> ExcellGen Bacterias

d) Medida de los principales micro-organismos contaminantes del v ino por análisis biomoleculares cuantitativ os en

tiempo real

PCR a tiempo real:PCR a tiempo real:

8

Gran superficie de

calentamiento interno

Gran superficie de


Tapón de cierre a presiónTapón de cierre a presión

Ventanas ópticas

pulidas

Ventanas ópticas

pulidas

Reflectores

ópticos

Reflectores

ópticos

Gran superficie de


Tapón de cierre a presión

Ventanas ópticas

pulidas

Reflectores

ópticos

Equipamiento de la PCR a Tiempo Real:


Mg 2+

dCTP

dGTP

dUTP

dATP

Taq DNA Polimerasa

Control Interno (CI)

IC Scorpiontarget Scorpion



Ventilador

Bloques Ópticos

Tubo de reacción

Cuerpo electrónico

Calentador



El fluoróforo emite señal cuando el agente

bloqueador (Quencher) se encuentra alejado por

efecto de la hibridación a la secuencia target

PCR a Tiempo Real:Generación de señal por deshibridación de la sonda

(Scorpions)

PCR a Tiempo Real:Generación de señal por deshibridación de la sonda

(Scorpions)

[Población] = [Población] CT X(1/ ECT)

Gracias a una curva de calibración efectuada para cada tipo de micro-organismos diana,

es posible cuantificar

precisamente la cantidad de células presentes en las

muestras

La especificidad y la multiplicidad de fragmentos y

de sondas fluorescentesutilizadas permite la detección

simultánea de diferentes tipos de micro-organismos !

PCR a Tiempo Real

Características del métodoGen Levaduras / Bacterias

• El método de extracción de las moléculas de ADN microbiano desarrolladoes original y muy eficaz .

• Muy bajo nivel de ruido, permite obtener señal en relación al nivel de ru ido

muy importante y así una gran sensibilidad (límites de detección muybajos , ejemplo: Brettanomyces <10 células /100 mL ).

• Los sistemas de marcaje de las moléculas de ADN diana son muysofisticados y discriminantes; se utilizan fragmentos y sondas específicas

que hacen posible la detección simultánea de varios microorganismos.

• Para la utilización de un patrón interno, el riesgo de resultado “falsopositivo” es casi nulo.

• Es muy rápido: 8 horas.

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Características comparativas de los métodos cuantitativos «Tiempo Real»

Rápido / Sensible / Altamente específico.

Detección de 5 tipos de gérmenes

Menos rápido / menos sensible / menos

específico / Detección de un solo germen

Rápido / Sensible / Específico. Ideal para el seguimiento regular del

vino con riesgos

Ex cell Ge n Otros labo ra tor ios

Pr inc ipio

T iempo de re spu esta 8 h oras 4 0 hor as

Esp ecífi co Fra gmen tos + Sond as espe cíficas Fra gmen tos ún ica ment e esp ecíficos

Sen sib ilida d 1 0 cel viables / 100 mL 1 000 ce l / 100 m L

Pre cisió n Contr ol intern o No falsos ne gativos

No contr ol inter no Rie sgo de falsos n egativos

Ap licació n d e la técn ica

PCR cuan titativo en tiemp o rea l

Ma no de obra cualificada / Mate rial espe cífico


Pr inc ipio

T iempo de re spu esta 8 ho ra s 4 0 hor as

Esp ecífi co Frag men to s + Son das es pecíf icas

Fra gmen tos ún ica ment e esp ecíficos

Sen sib ilida d 1 0 cel viab les / 1 00 mL 1 000 ce l / 100 m L

Pre cisió n Co nt ro l int ern o No f also s ne gat ivos

No contr ol inter no Rie sgo de falsos n egativos





Pr inc ipio

T iempo de re spu esta 8 ho ra s 40 horas

Esp ecífi co Frag men to s + Son das es pecíf icas

F rag me nto s ú nica men te e spec ífico s

Sen sib ilida d 1 0 cel viab les / 1 00 mL 100 0 cel / 100 mL

Pre cisió n Co nt ro l int ern o No f also s ne gat ivos

No c on tro l in terno Rie sgo de fals os n ega tivo s




Exce ll Gen Otros lab orato rio sSegu imi ento de pro du cto s de sínt esis d e micro organ ismo s

diag nós tico Brett Ex cell

Pr incip ioAnálisis por cr omato grafía

g aseosaT iemp o d e res pue sta 8 ho ras 40 ho ra s 2 horas

Espec ífico Frag men tos + Sond as esp ecífi cas

Frag men tos únic amen te esp ecíf icos

Alta: dete cción de etilfen oles (pr oductos de síntesis de

Br ettano myces )

Sen sibilid ad 10 cel v iable s / 100 mL 1000 cel / 10 0 mLLím ete de d etección ba ja (etil-4-f enol = 27 microg /L; umb ral de

pe rcepción: 450 micr og/L)

Prec isión Co ntrol i nterno No f alsos neg ativo s

No co ntrol i nterno Rie sgo de f alsos neg ativo s

I ncertidum bre = 31 m icr og/L

Apli cació n de la t écnic a Poco tra bajo / Ma terial espe cífico

PCR cuantitativo en tiempo real

Mano de obr a cualificada / Mater ial específico

Exce ll Gen Otros lab orato rio sSegu imi ento de pro du cto s de sínt esis d e micro organ ismo s

diag nós tico Brett Ex cell

Pr incip ioAnálisis por cr omato grafía

g aseosaT iemp o d e res pue sta 8 ho ras 40 ho ra s 2 h ora s

Espec ífico Frag men tos + Sond as esp ecífi cas

Frag men tos únic amen te esp ecíf icos

Alta: d ete cción de e tilfe nole s (p ro du ctos de s íntes is de

Bre ttan omyces)

Sen sibilid ad 10 cel v iable s / 100 mL 1000 cel / 10 0 mLL ímet e de d ete cción baja (et il-4-f eno l = 27 microg /L; umb ra l de

percepci ón: 450 microg/L )

Prec isión Co ntrol i nterno No f alsos neg ativo s

No co ntrol i nterno Rie sgo de f alsos neg ativo s

Incer tid umbre = 31 microg /L

Apli cació n de la t écnic a Poco tra bajo / Ma terial espe cífico

PCR cuantitativo en tiempo real

Mano de obr a cualificada / Mater ial específico

Otras metodologíasGen levaduras / bacterias

Source: Bruce Zoecklein; Enology—Grap e Chemistry

Group, Virginia Tech; USA; Am. J. Enol. Vitic. 54:2 94-300

invierno primavera verano

Ejemplo 8: comparación de técnicas analíticas en el seguimiento de «Brettanomyces»

LQ: Cromatografía

LQ: Medios cultivo

LQ: PCR tr

LD: Cata

Ejemplo 9: Gen Levaduras

2013 2014 2015

- . Re sul tados en el día :

-. A daptaci ón de l a prepa raci ón en el e mbote llado ,

-. S e lec ción de un medio de fil tra ción antes del embote lla do,

-. C ontro l de esteri li zac ión después de l a fil tra ción en e l curso del

e m b otel lado

Ejemplo 10 : Gen Bacterias

mg/l Histamina Putrescina Tiramina

Tiempo(días)

0 30 60 300 0 30 60 300 0 30 60 300

Testigo 0,2 11,1 11,2 35,7 0,0 0,8 20,0 84,6 0,0 0,2 5,7 9,5

Inoculado 0,2 3,4 8,7 35,9 0,0 0,9 1,3 82,0 0,0 0,4 2,1 8,6

30 días después fin

FML

Recontaminación

evidente de vino inoculado con bacterias

lácticas por bacterias productoras de

histamina

(Pediococcus)

Recontaminación

evidente de vino inoculado con bacterias

lácticas por bacterias productoras de histamina

y de putrescina

(Lactobacillus)

Bacterias lácticas en el curso de la crianza y aminas biógenas

mg/L Histamina Putrescina Tiramina

Tiempo(días) 0 30 60 300 0 30 60 300 0 30 60 300

Testigo 0,2 11,1 11,2 35,7 0,0 0,8 20,0 84,6 0,0 0,2 5,7 9,5

Inoculado 0,2 3,4 8,7 35,9 0,0 0,9 1,3 82,0 0,0 0,4 2,1 8,6

300 días después fin de FML(células/mL)

3

13 1612 12 5000

66 12

1316 12

Ba ct. Ac ét i ca s

Ba cteri as l ác t ic as

L ac to ba ci ll us sp .

Pe di coc oc cu s sp .

C o n la utilización de Gen Histidina Descarboxilasa habría sido posible anticiparse al c a mbio de composición del vino en aminas biógenas por el incremento

f i nal de la población de bacterias lácticas del vino

60 días después fin d e la FML

(células/mL)

4 0

310 90

55 90

25 500

3 10 90

Bact. Acé t ic as

Bacte ria s l áct i ca s

La ctob ac il l us s p.

Pedi c oco cc us s p.

Aplicaciones de la PCR a Tiempo RealAplicaciones de la PCR a Tiempo Real

Control de relleno de barricas

El vino utilizado para el relleno de barricas debe ser continuamente vigilado para evitar la diseminación de contaminantes.

10

Aplicaciones de la PCR a Tiempo RealAplicaciones de la PCR a Tiempo Real

Control de la eficacia de lavado de barricas

Aplicaciones de la PCR a Tiempo Real:Aplicaciones de la PCR a Tiempo Real:

Identificación de contaminantes

LEVADURAS y BACTERIAS en MOSTOS

Acetobacter acetiAcetobacter pasteurianusBrettanomyces bruxellens isGluconobacter oxydansHanseniaspora uvarumLactobacillus brevisLactobacillus hilgardiiLactobacillus plantarumPediococcus damnosusPediococcus parvulusPichia membranaefaciensZygosaccharomyces bailii

CONTAMINANTES en PARADAS y FERMENTACIONES LENTAS

Acetobacter acetiAcetobacter pasteurianusGluconobacter oxydansLactobacillus brevisLactobacillus hilgardiiLactobacillus plantarumOenococcus oeniPediococcus damnosusPediococcus parvulus

CONTAMINANTES en VINOS

Acetobacter acetiAcetobacter pasteurianusBrettanomyces bruxellens isGluconobacter oxydansLactobacillus brevisLactobacillus hilgardiiLactobacillus plantarumPediococcus damnosusPediococcus parvulusZygosaccharomyces bailiiHanseniaspora uvarumPichia membranaefaciensSaccharomyces cerevisiaeZygosaccharomyces bailii

EMBOTELLADOS

Brettanomyces bruxellens isSaccharomyces cerevisiaeZygosaccharomyces bailii

Tetra cla dium maxil liforme

Phoma herba rum

Mortierel la hya lina

Phoma eupy rena

Embell isia a llii

Fusarium equis eti

Alterna ria radicina

Botry ospha eria dothidea

Gibberella a venac ea

Cla dospori um cla dosporioi des

Aspergil lus fumiga tus

Epicoccum ni grum

Fusarium sporotrichioides

Mortierel la alpina

Preussi a tenerifae

Cosmospora g iga s

Fusarium oxy sporum

Acrostal ag mus luteoalbus

Fusarium redolens

238 especies de hongos diferentes

Madurez microbiológica: en el SueloMadurez microbiológica: en el Suelo

WineSeq

Aplicaciones de la METAGENÓMICA:Aplicaciones de la METAGENÓMICA:

Sacchar omyces cerevis iae

Pichia membr anifac iens

Torulas pora delbrueckii

Debaryomyces hansenii

Malass ezia res tric ta

Clitocybe s ubditopoda

Wickerhamomyces anomalus

Penic illium paneum

Aureobas idium pullulansBotrytis elliptica

Penic illium corylophilum

Wallemia s ebi

Fus arium equis eti

Phoma eupyr ena

Tetracladium maxilliforme

Uloc ladium cons ortiale

Exophiala spinifera

Gibberella avenacea

Mortierella alpinaSacchar omyces kudriavz evii

Clados porium clados por ioidesEpicoccum nigrum

Fus arium oxysporum

Humicola fus coatr a

Lewia inf ectoria

Penic illium br evicompactum

Penic illium commune

Penic illium expansum

Peyronellaea pinodella

Preuss ia intermedia

Alternaria arbust i

Alternaria longipes

Alternaria radicina

Alternaria radicina

As pergillus caes iellus

As pergillus fumigat us

As pergillus sc lerotiorum

As pergillus tubingens is

Bionectria ochroleucaBoeremia exigua

89 especies de hongos diferentes

Madurez microbiológica: en la UvaMadurez microbiológica: en la Uva

Botryot inia fuc kelianaBotryot inia porri

Candida railenens is

Candida tropic alis

Candida zeylanoides

Cibor inia c amelliae

Clados porium s phaer os permum

Cosmos pora vilior

Crypt oc oc cus adeliensis

Cyberlindnera jadinii


11

Weighted UniFrac PCoA plot showing the dissimilarit ies among all sample types from Suffolk Merlot and including Cali fornian must.

•Iratxe Zarraonaindia et al. mBio 2015; doi:10.1128/mBio.02527-14

Madurez microbiológica: Suelo y la UvaMadurez microbiológica: Suelo y la Uva


Figure 1. Spatial distribution of yeast and bacteria in the environment of the winery through vintage.

Bokulich NA, Ohta M, Richardson PM, Mills DA (2013) Monitoring Seasonal Changes in Winery-Resident Microbiota. PLoS ONE 8(6): e66437. doi:10.1371/journal.pone.0066437http://127.0.0.1:8081/plosone/article?id=info:doi/10.1371/journal.pone.0066437

Microbiologycalstatement of w ineries:

Microbiologycalstatement of w ineries:

Nicholas A. Bokulich et al. PNAS 2014;111:E139-E148• ©2014 by National Ac ademy of Sc iences

Bacterial community in grape must with different re gional patterns.

Microbiologycal maturity of grapesMicrobiologycal maturity of grapes

•Representation of the community of bacteria (left) and fungi (right) in Zinfandel, Cabernet Sauvignon and Chardonnay

Nicholas A. Bokulich et al. PNAS 2014;111:E139-E148• ©2014 by National Ac ademy of Sc iences

Microbiologycal maturity of grapesMicrobiologycal maturity of grapes

Estado microbiológico del suelo del viñedo:

Estado microbiológico del suelo del viñedo:

Ejemplo 11 : Contaminación embotellado vinos dulces (Navarra)

Control microbiológico del aire (ufc/m3)

Picchia sp

12

Ejemplo 12 : Crescate Levaduras “Fósiles” autóctonas (4 Kilos)

Análisisambientales

Q uick Trap

Inspección de la atmósferade bodega

2007/2008 -Innovación QUICK TRAP: Control de los ambientes sensibles.Método patentado (n° de depósito: 07-59164)

(Stir Bar Sorptive Extraction)

Características del método:- Extracción de las moléculas por un polímero absorbente (SBSE).- ~ 120 moléculas buscadas: Haloanisoles, Halofenoles, HAP, BTEX, Pesticidas, Terpenos, Alergenos químicos…- Termodesorpción, análisis GC/MS- Expresión de los resultados en µgde compuestos/m3.

- Investigación de otras moléculas no prioritariamente buscadas.- 15 minutos de adsorción- Resultados sobre las 24h.

Sistema robusto

Muestreo simplificado!

Sensibilidad de los métodos:

Para un mismo tiempo de exposición

Método de polvo SPME SBSE

TBA 1 (referencia)

X16.000 X 5

TCP 1 (referencia)

X 50 X 20

Ejemplo 13:Análisis de un contenedor

15 minutos

Cromatograma en modo SIM de muestreos del container

Método Quick Trap

- Cuantificación de TBA a 220 ng/m3

- Presencia importante de estireno.

Comparación con los umbrales de aceptabilidad definidos.

R e chazo del contenedor: no apto para transporte de materiales sensibles como barricas, r i esgo de alteración de los materiales transportados .

Ejemplo 14:Análisis de una bodega que presenta un defecto olfativo mal identificado

Cromatograma en modo Scan y en modo SIM de muestreo de la atmósfera

Isoborneol Borneol 2-metilisoborneol Geosmina

1,26 0.43 nd trazas

Scan

SIM

Concentración en ng/m3

Presencia de TCA que no explica el defecto olfativo.

Identificación de Borneol y de Isoborneol

Isoborneol

TCA TCP TeCA PCA TBA TBP

24 9 trazas trazas nd trazas

Presencia de Borneol e Isoborneol que explica

el defecto olfativo

Cuantificación a

posteriori

Concentración en µg/m3

4 horas

Método Quick Trap

13

Check List Atmosfera

En ng/g de absorbente

TCA TCP TeCA TeCP PCA PCP TBA TBP Ventilación

Nave 1 nd nd nd nd nd nd 2,3 8,5 +++

Sala Barricas 1 0,9 nd nd nd 6,8 nd 4,7 12,3 - -

Sala Barricas Subterráneo trazas nd nd nd nd nd 9,4 78,2 - - -

Nave 2 nd nd nd nd nd nd 1,4 nd +

Sala Guarda Botella trazas nd trazas trazas 16,3 64,8 12,225,6 -

Sala Insumos nd nd nd nd 3,6 trazas 5,3 Trazas - -

Sala Producción nd nd nd nd nd nd 3,5 Trazas +

Ejemplo 14:Análisis de una bodega que presenta un defecto genérico de corcho

Check List Insumosen ng/g

TCA TCP TeCA TeCP PCA PCP TBA TBP

Estructura madera nave 1 nd nd nd nd nd nd 38,2 463,2

Ladrillo nave 1 nd nd nd nd nd nd 1,3 trazas

Techo sala barricas Subterráneo nd nd nd nd nd nd 178,3 683,5

Pilares sala barricas Subterráneo nd nd nd nd nd nd 32,0 82,1

Ladrillo sala barricas Subterráneo nd nd nd nd nd nd 12,0 trazas

Estructura madera nave 2 nd nd nd nd nd nd trazas trazas

Plumavit paneles guarda botella nd nd nd nd nd nd 15,8 1280,4

Bins Madera trazas trazas 3,2 37,4 29,3 136,2 28,3 258,1

Pallet madera nd nd trazas trazas 14,8 29,3 18,3 78,2

Cartones nd nd nd nd 3,6 trazas 5,4 24,2

Tierra filtrante nd nd nd nd trazas nd 7,3 Trazas

Alternativos (chips) trazas nd nd nd nd nd 6,5 nd

Corchos (ng/tapón) 2,8 nd nd nd 4,7 12,3 16,4 29,4

Tapa Rosca (disco) nd nd nd nd trazas trazas 4,8 trazas

Ejemplo 14:Análisis de una bodega que presenta un defecto genérico de corcho

Vinos analizados

TCA TBA

Vino 1 nd nd

Vino 2 nd trazas

Vino 3 nd 2,1

Vino 4 nd trazas

Vino 5 nd nd

Vino 6 trazas 5,3

Vino 7 nd nd

Vino 8 nd 6

Vino 9 nd trazas

Vino 10 nd 7,3

Vino 11 nd nd

Vino 12 nd 9,3

Vino 13 nd nd

Vino 14 nd 3

Vino 15 nd 5,3

Vino 16 nd trazas

Vino 17 nd 5,5

Vino 18 nd nd

Ejemplo 15:Análisis de una bodega con muchas reclamaciones en exportación

¿TCA?

Análisis TBA Pallet 1 nd

Pallet 2 nd

Pallet 3 trazas

Pallet 4 trazas

Vino blanco mesa nd

Tinto D.O. 2007 nd

Tinto D.O. 2008 nd

Agua planta V. mesa 6

Agua planta V. D.O. 6,8

Tinto I D.O. Bot. 9:02 9,2

Tinto I D.O. Bot. 10:04 4,4

Tinto I D.O. Bot. 10:35 nd

Tinto I D.O. Bot. 11:05 nd

Tinto II D.O. Bot. 6:50 10,8



Tinto II D.O. Bot. 9.34 6



Análisis Balsa I Balsa II Balsa IIITCA (ng/l) nd nd trazas

TeCA (ng/l) nd nd nd

TBA (ng/l) 5,9 20,6 141

PCA (ng/l) nd nd nd

TCP (ng/l) 2,2 2,6 trazas

TeCP (ng/l) nd nd nd

TBP (ng/l) 13,1 44,5 6,2

PCP (ng/l) trazas trazas tarzas



57 ng/l321 ng/g

Chlorella

14

ANALISIS SENSORIAL VALIDACIÓN DE PANELES

DE CATA

Método de Investigación de la Sensibilidad Gustativa.

UNE 87-003-95

Ejemplo 16: Validación de un panel de cata:

Anova de dos vías. Las barras representan si existe efecto producto o catador para cada atributo. La barra de color (amarillo, naranja, rojo) significa que no parece ser tal y una barra gris que no la hay, (Amarillo: p <0,05, Naranja: p <0,01 y Rojo: p <0,001). La altura es el valor F. Sirve para investigar el grado de reproducibilidad de un panel. También da una idea de similitudes entre catadores de un mismo panel. Es útil para detectar falta de entendimiento, diferencias de escala y catadores con desviaciones.

Gráf icos Tucker-1: en la parcela cargas de correlación, el otro tipo, cada punto muestra el atributo de un asesor específico. Cuanto más ruido contiene un atributo de un evaluador, más cerca del centro aparecerá el punto. Cuanto más estructurada sea la información de un atributo, más cerca aparecerá del círculo exterior (100% varianza explicada para ese atributo y 50% el círculo interior).

Ejemplo 16: Validación de un panel de cata:

Ejemplo 17: Los aportes de O 2en bodega, aspectos prácticosEjemplo 17: Los aportes de O 2en bodega, aspectos prácticos

Oxígeno en trasiego y lavado de barricas

Medido por flourometr ía de precis ión: Presens

0

1

2

3

4

5

6

Dep ósit o Bar rica Depósito

BBL

BFE

BR

Llenado de barricas en 2

estaciones

Llenado cabezal especial

Empuje con nitrógeno

mg/L deOxígeno


Oxígeno en trasiego de depósito a depósito con bomba de tangencial a 2 velocidades

Medido por flourometr ía de precis ión: Presens


15

Figura 1 : representación de la evolución de l

oxígeno disuelto (mg(L) del vino D.O. Valencia

2009 en botella, copa y decantador al minuto, a

los 30, 75 y 120 minutos.

Figura 2 : representación del oxíg eno disuelto y

el potencial redox del vino D.O . Ribera del

Duero 1999 con y sin sedimentos alminuto y a

la media hora. (O2 : Oxígeno en ppm y EV:

Potencial redox en mV).


Oxígeno en el servicio y consumo del vino

CONCLUSIONES: CONCLUSIONES:

El Control de Calidad químico y microbiológico son herramientas preventivas y fundamentales en el vino del Siglo XXI.



Los defectos sensoriales hacen que los vinos sean iguales y no diferenciables. Para poder disfrutar de las virtudes de un vino, es necesario evitar los defectos.



El consumidor habitual de vino es capaz de discernir entre vinos “buenos” y “malos”, castigando a estos últimos con la no adquisición.



La viticultura y enología, como prácticas culturales muy tradicionalistas, se disfrutan más cuando la tecnología es un recurso de apoyo y control.



″LA TECNOLOGÍA ÚTIL ES AQUELLA QUE ESTÁ AL ALCANCE D E TODOS″

Henry Ford

″LA TECNOLOGÍA ÚTIL ES AQUELLA QUE ESTÁ AL ALCANCE D E TODOS″

Henry Ford

Univers idad de la RiojaUnivers idad de la RiojaUnivers idad de la RiojaLos aromas y el olfato son causa y efecto que nos permiten conocer el medio donde nos desenvolvemos. El viñedo forma parte del paisaje y acumula en su fruto miles de precursores que despiertan cuando es vino, convirtiéndose en uno de los perfumes mas complejos y agradables del mundo. Consumiendo vinos nos convertimos en parte del paisaje y lo hacemos nuestro…

el disfrute del vino-placer - enobiotec.files.wordpress.com · 3 desarrollo de la spme...

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