el elemento p y su distribución en el género drosophila filefragmentos de hasta 9.2 kb ......
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Una herramienta versátil y eficaz para la clonación de productos de
PCR a gran escala. .
El elemento P y su distribución en el género Drosophila
Dra. Alejandra Delprat, UAB
• Estudio de las causas y consecuencias evolutivas de las reordenaciones
cromosómicas naturales
• Elementos transponibles
Dra. Alejandra Delprat, UAB
Elemento Galileo
Elemento BuT5
Dra. Alejandra Delprat, UAB
BuT5 • Presente en al menos 3 especies del grupo Repleta
• Movilización reciente
Dra. Alejandra Delprat, UAB
Dra. Alejandra Delprat, UAB
3 bp TIRs 17 bp subTIRs 9 bp TSDs No coding sequence
¿Cómo se mueve?
BuT5
Objetivos
1.Estudiar la distribución de BuT5 en el grupo
de especies de D. repleta
2.Aislar la copia autónoma del elemento que
moviliza a BuT5
3.Clasificar a BuT5 y a su elemento maestro
dentro de una superfamilia y familia de TE
Dra. Alejandra Delprat, UAB
Análisis por PCR de 85 muestras de 41 especies con cebadores de los extremos de BuT5
Dra. Alejandra Delprat, UAB
Kits comerciales disponibles • Kit de clonación células
competentes.
• Ligación: 1 hora a TA- ON a 4ºC para mayor eficiencia.
• Medio SOC y TB.
• Tamaño: 0.5-3 kb.
• Precio por reacción .
• Kit de clonación y células competentes.
• Ligación: 5 min.
• Medio SOC y LB.
• Diferentes kits y protocolos para grandes fragmentos
• Precio por reacción .
Kit de clonación células competentes.
Ligación: 5 min.
Medio LB.
Fragmentos de hasta 9.2 kb
Precio por reacción < 1€ Dra. Alejandra Delprat, UAB
Dra. Alejandra Delprat, UAB
Modificaciones al protocolo:
- Fragmentos ~1 kb:
-50 ul de agua destilada estéril
- colonia blanca aislada
-Hervir 10’
-PCR para aislar el fragmento y secuenciar
BuT5 en el grupo repleta
BuT5: 37 / 41 especies
26 especies PCR +
(Tamaños entre 800-1200 bp)
15 especies PCR –
11 especies dot blot +
4 especies dot blot –
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¿El elemento maestro?
En el genoma de D. mojavensis:
Dos secuencias consideradas copias parciales de BuT5 comprenden una secuencia ~3kb. Esta secuencia, al ser analizada por blastx reveló identidad con transposasas de la superfamilia P.
En el genoma de D. buzzatii, se hallaron 4 copias.
Ninguna de ellas era funcional!!
Dra. Alejandra Delprat, UAB
Obtención de una copia funcional
Para encontrar un copia funcional se realizó una búsqueda por PCR en 50 líneas de 3 especies
42 de D. buzzatii 7 de D. mojavensis 1 de D. uniseta
Sólo una línea de D. buzzatii (BU-73) produjo resultados positivos para las
dos reacciones de PCR
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Estructura del elemento P en D. buzzatii
En la región de 2832 pares de bases comprendida entre los nucleótidos 164 y 2995 se predijeron manualmente 8 exones que codifican putativamente una transposasa
de 786 aninoácidos.
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Límites exón-intrón
RNA total se sintetizó cDNA, por medio de dos PCR anidadas y se clonó el producto de la segunda PCR Placa se seleccionaron entre 24 y 48 colonias blancas, minipreps, PCR.
Análisis de los clones permitió detectar las secuencias sin los intrones.
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El elemento P
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El elemento maestro
PCR inversa: Corte con HindIII, ligación, PCR.
HindIII
6.3 kb A-Tailing Siembra de los 200 ul de la transformación en dos placas. Screening de los clones.
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El elemento maestro
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P Superfamily
Genome Biol Evol 5(6): 1127-1141, 2013
Dra. Alejandra Delprat, UAB
Gracias
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