EL SULFURO DE HIDRÓGENO Y EL EL SULFURO DE HIDRÓGENO Y EL CARTÍLAGO ARTICULAR

Elena Fernández BurgueraCIBER-BBN, GBTTC-CHUACGrupo de Reumatología

INIBIC-Hospital Universitario A CoruñaA Coruña-España

EL SULFURO DE HIDRÓGENO (H2S)

Pequeña molécula gaseosa

Tóxico a altas concentraciones

2

Olor a huevos

podridos Inhibe la

citocromo C oxidasa

� Primeros estudios: Métodos de detección y prevención de riesgos

TERCER GASOTRASMISOR ENDÓGENO CONOCIDO

Gasotransmisor endógeno

3

Síntesis enzimática a partir de L-cistationina,

homocisteína o L-cisteína y las enzimas:

� CBS: Cistationina-β-sintasa - Citosólica

� CSE/CSH: Cistationina-γ-liasa – Citosólica

� MPST: Mercaptopiruvato azufre transferasa

Citosólica y mitocondrial

Múltiples efectos en diversas dianas biológicas:

� Mecanismos de acción:1) Interacción con los sistemas redox del organismo;2) Modulación de la actividad de los canales de K dependientes de ATP.3) Alteración de la expresión génica mediante la modulación de factores de

transcripción (NFκB), rutas de señalización (p38-MAPK) y otros genes;4) Otras reacciones con diversas proteínas, tales como quelación de

metaloproteínas, formación de enlaces per- y polisulfuro, o sulfuración deproteínas.

PRINCIPALES MECANISMOS DE ACCIÓN ENDÓGENOS

4

proteínas.

c

NIVEL DE H2S ESTÁ REDUCIDO EN ALGUNAS PATOLOGÍAS

5

PRODUCCIÓN ENDÓGENA DE H2S EN LA ARTROSIS

µM H2S en suero N vs OA

S.µ

M

56

150

S.µ

M/m

g te

jido

1,5

µM H2S/mg tejido en Cartílago N vs OA

� Método de medida: microelectrodo ion-selectivo

6

p=0.773N OA

H2S

.µM

p< 0.05

0

50

100

N OAH

2S.µ

M/m

g te

jido

0

0,5

1,0

*

ENZIMAS DE PRODUCCIÓN EN LA ARTICULACIÓN OA

Expresión de las enzimas de producción de H2S en los tejidos de la articulación:

� En hueso subcondral y sinovial no hay diferencias significativas

�En cartílago:

CBS CTH MPST

7

0,00,20,40,60,81,01,2

N OA

Exp

resi

ón re

lativ

a

0,00,20,40,60,81,01,21,4

N OA0,00,20,40,60,81,01,2

N OA

*

p<0.05

Cuantificación enzimas de producción de H2S en cartílago - IHQ

ENZIMAS DE PRODUCCIÓN EN LA ARTICULACIÓN OA

Normal OA

8

� En la OA, la producción endógena de H2S parece estar disminuida, por lo quela adición exógena podría ser beneficiosa.

� Cómo administrar H2S exógeno a las células:

1) Compuestos sintéticos

2) Fuentes naturales de H2S, por ej. aguas mineromedicinales sulfuradas

� Modelo in vitro: condrocitos/cartílago OA co-estimulados con IL-1β y H S

¿SUPLEMENTACIÓN EXÓGENA DE H2S?

9

� Modelo in vitro: condrocitos/cartílago OA co-estimulados con IL-1β y H2S

H2S de fuentes exógenas

CONDROCITOS+ IL-1β, 48h

CARTÍLAGO+ IL-1β, 21d

Efectos en marcadores pro-inflammatorios

SUPLEMENTACIÓN CON COMPUESTOS SINTÉTICOS

NO, iNOSPGE-2, COX2, PTGES

IL-6

Catabolismo

MMP13

� NaSH (disociación instantánea) o GYY4137 (hidrólisis lenta)

� Concentraciones de 50 a 1000 µM (48h)

RNS

10

02468

101214

BA

SA

L 50 100 200 500 1000

µM GYY4137

ROS

Flu

ore

scen

cia

O 2-

* * *

TINCIONES HISTOQUÍMICAS E INMUNOHISTOQUÍMICAS

11

39,6±7,8 4,9±1,1 49,3±6,2 54,4±9,1 31,9±3,4 56,3±5,7

TINCIONES INMUNOHISTOQUÍMICAS

0,5±0,2 10,4±3,2 7,6±3,5 4,3±0,1 0,3±0,1 1,0±0,5

4,0±1,0 84,1±8,2 77,8±5,6 41,4±7,3 33,2±2,9 12,5±3,5

29,7±2,2 18,5±6,7 25,6±3,8 36,1±2,0 24,1±5,6 30,9±3,2

12

AGUAS MINEROMEDICINALES SULFURADAS

� Fuente natural de H2S

� Tienen gran tradición como alternativa terapéutica no farmacológica

� Existen muchas emanaciones en Galicia

� Sector estratégico en Galicia

Carballo

Guitiriz

Lugo

Ley 5/1995, de 7 de junio, de regulación delas aguas minerales, termales, de manantial yde los establecimientos balnearios de laComunidad Autónoma de Galicia que sepromulgó “en atención a la notoria riquezapotencial en aguas minerales, termales y demanantial presentesen el territorio de la

13

Augas Santas

Lugo

21Cuntis Carballiño

manantial presentesen el territorio de laComunidad Autónoma gallega y al beneficioque su utilización -de indudable valorsanitario- tiene para la salud publica, asícomo al potencial desarrollo económico ysocial que su aprovechamiento racionalsupone, ya sea en establecimientosbalnearios por su valor terapéutico, yacomo aguas de bebida envasadas…”

� Reto 3 (RIS3): Novo modelo de vida saudable baseado no envellecemento activo:→ Deseñar novos produtos terapéuticos baseados no valor engadido dos

recursos termais de Galicia.

BALNEOTERAPIA

14

SUPLEMENTACIÓN CON AGUA SULFURADA

Manantial [H 2S] µM

1 70,6

2 27,6

3 64,93

4 16,1

5 14,26

� Agua sulfurada de 5 manantiales

Medio %W %SW

0 100 0

25 75 25

50 50 50

75 25 75

100 0 100

� Medio de cultivo con distintos % de SW

15

� Viabilidad celular en medio de cultivo con distintos % de SW

PTGES

Basal 0 25 50 75 1000

5

10

15

20

25[N

itrito

]

% Agua sulfurada en el medio de cultivo(todas con 5 ng/ml de IL-1β)

SUPLEMENTACIÓN CON AGUA SULFURADA

iNOS

100% W (Basal) IL-1β+100% W

� Condrocitos primarios OAC cultivados (48h) en DMEM reconstituido con distintasconcentraciones de agua sulfurada y estimulados con 5 ng/ml de IL-1β

Basal 0%SW 25%SW 50%SW 75%SW 100%SW0

50

100

150

200

250

300

PTGES

% agua sulfurada en el medio de cultivo

Exp

resi

ón

rela

tiva

Basal0%SW

25%SW50%SW

75%SW100%SW

02000400060008000

100001200014000

COX-2

% agua sulfurada en el medio de cultivo

Exp

res

ión

re

lativ

a

Basal0%SW

25%SW50%SW

75%SW100%SW

015

0030

0045

00

iNOS

% agua sulfurada en el medio de cultivo

Exp

res

ión

rel

ativ

a

Basal0%SW

25%SW50%SW

75%SW100%SW

0500

1000150020002500300035004000

MMP13

% agua sulfurada en el medio de cultivo

Exp

resi

ón

rela

tiva

IL-1β+25% SW

IL-1β+75% SW IL-1β+100% SW

IL-1β+50% SW

W: agua destilada; SW: agua sulfurada

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OBJETIVOS

� Valorar si los efectos beneficiosos encontrados en los modelos in vitro se

reproducen en la articulación artrósica in vivo.

Para ello:

� Inducir OA mecánica:

1. Cuantificar [H2S] en líquido sinovial y sangre durante el estudio.

MODELO IN VIVO –ARTROSIS QUIRÚRGICA

17

1. Cuantificar [H2S] en líquido sinovial y sangre durante el estudio.

2. Analizar escalas del dolor, valoración goniométrica y de la rigidez articular.

3. Cuantificar marcadores de la inflamación, de estrés oxidativo y degradación de

cartílago:

→Mediante histopatología y biología molecular en el tejido de la rodilla

→En suero

4. Estudiar la síntesis y la actividad de las enzimas de producción del H2S en la

articulación.

0 7 1530

CIRUGIA

TRATAMIENTO

[H2S] endógeno (sangre y liq. sinovial)

EUTANASIA1 mes

MODELO IN VIVO – ARTROSIS QUIRÚGICA

ACLIMATACIÓN

Se realizará el modelo de artrosis quirúrgica en ambas rodillas de cada una de lasratas, quitando el menisco medial y seccionando el ligamento colateral medial.

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Grado de dolor

- [H2S] endógeno (sangre y liq. sinovial)- Ejercicio y tamaño+goniometria

� IHQ y expresión génica de marcadores de inflamación, oxidación y degradación en tejido� IHQ Col II, agrecano, MMPs � IHQ y expresión génica de enzimas de producción de H2S� Marcadores de inflamación, oxidación y degradación de cartílago en suero

� Control 30: (5) Cirugía bilateral y ningún tratamiento.Eutanasia a los 30 días para estudiar la artrosis generada enel día 0.

� Control 60: (5) Cirugía bilateral y ningún tratamiento.Eutanasia a los 60 días para estudiar la artrosis generada ycompararla con los tratamientos.

� (6) Baño una vez al día en agua sulfurada (20 minutos). Cinco días de tratamiento y dos de descanso durante 3 semanas.

GRUPO CONTROL (10)

GRUPO BALNEOTERAPIA

(6+6)

TRATAMIENTOS

19

� (6) Placebo en agua corriente

� (6) Liberación de sulfuro de hidrógeno intra-articular losdías 0, 7 y 15.

� (6) Placebo inyección suero salino

(6+6)

GRUPO INTRAARTICULAR

(6+6)

GRUPO ORAL (6+6)

� (6) Una vez al día, durante 3 semanas, 1 ml de aguasulfurada mediante jeringa o sonda. Cinco días de terapiay 2 de descanso.

� (6) Placebo con agua corriente

19

CONCLUSIONES

� La biosíntesis de H2S en el cartílago OA está reducida

� La suplementación exógena con compuestos sintéticos que liberan H2S tiene

efectos anti-inflamatorios, anti-oxidantes y anti-catabólicos en condrocitos OA y

en cartílago OA

20

� La suplementación exógena con agua mineromedicinal sulfurada también tiene

efectos anti-inflamatorios y anti-oxidantes en condrocitos OA

� Mediante un modelo de artrosis quirúrgica se evaluará si estos efectos se

reproducen in vivo, y, en caso afirmativo, se determinará cual es la vía de

administración más efectiva

GBTTC

Elena F. BurgueraJoana Magalhães

Lucía GatoTamara Hermida

Dr. Francisco J. Blanco

Rheumatology GroupINIBIC-Hospital Universitario de A Coruña

Colaboradores

Ángela Vela AneroRosa Meijide Faílde

21

Noemí GómezMª Cristina ÁlvarezCristina Rodríguez

Purificación FilgueiraNoa Goyanes