electroforesis

22/7/2015 Electroforesis

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Electroforesis de protenasy de cidos nucleicos

ndice de tcnicas

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Definicin

La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica, cuya magnitud depende del pH del medio en elque se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un campo elctrico.

Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las biomolculas en disolucin cuandose ven sometidas a un campo elctrico. Se trata de una tcnica fundamentalmente analtica, aunque tambinse puede realizar con fines preparativos.

Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una velocidad constante alequilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) con la resistencia al avance (fuerza de friccin orozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.

Fuerza del campo elctrico = Fuerza de friccin

= carga (C) = intensidad del campo (V/m = N/C)

= coeficiente de friccin (CVs / m2 = kg/s)

= velocidad de la molcula (m/s)

El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca debida a las caractersticas de cada molcula,esencialmente su forma y su tamao. As, por ejemplo, las molculas grandes y asimtricas poseen un mayorcoeficiente de friccin que las pequeas y compactas.

La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electrofortica,

( = nmero entero; = carga del electrn)

En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molcula define suseparacin en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van separando progresivamente unas de otras.

Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, est constituido por iones, que son atrados y asrecubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de stos en el campo. Todo ello hace queel tratamiento terico cuantitativo de la electroforesis sea muy difcil y que esta tcnica resulte poco til paraobtener informacin precisa sobre la estructura de las molculas. Sin embargo, es enormemente til comotcnica analtica y preparativa.

Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:

1. De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la disolucin y se determinapticamente la posicin del frente de avance o frontera con el disolvente.

2. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a travs de undisolvente, utilizando adems un medio que soporta a ste. En este caso no se determina la movilidad,sino que el nico objetivo de la tcnica es separar los componentes de la muestra.

3. Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra continuamente a lo largo delproceso (para ms informacin, vanse las pp.250-2 de Freifelder, 1999).

Estudiaremos nicamente la electroforesis zonal, de uso ms extendido.

Finalmente, debe sealarse que, aunque es menos frecuente, tambin se puede aplicar la electroforesis parala separacin de clulas.

Medios de soporte para realizar la electroforesis

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones mecnicas ycorrientes de conveccin durante la separacin. En algunos soportes (papel o similares) la muestra quedasobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa friccin, por lo que el mecanismo principal deseparacin es la magnitud de la cargade cada componente de la muestra. Otros medios de soporte (geles,medios semislidos o gelatinosos) estn formados por polmeros que forman una malla, matriz o redtridimensional a travs de la cual deben avanzar las molculas de la muestra, que queda embebida en el

-

" 2

-

"

2

N

2

-

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medio de soporte electrofortico. Como consecuencia, la friccin es notable y los factores de forma y tamaoadquieren una alta relevancia en la separacin.

Medios de baja friccin Medios de elevada friccin

papelacetato de celulosa

gel de almidngel de agarosa

gel de poliacrilamidagel de agarosa+poliacrilamida

separacin principalmente por carga separacin por carga, tamao y forma

Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.

Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la adsorcin; baja tincin de fondo; esposible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar los componentes separados.

Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente (se hinchan). Actualmentese utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.

Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agar-agar). Se disuelve encaliente (50-60C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.

Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida ybisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se consiguen distintas porosidades,siempre menores que la de los geles de agarosa.

acrilamida: (forma polmeros lineales)

N,N-metileno-bis(acrilamida):

(introduce uniones cruzadas entre cadenas depoliacrilamida)

poliacrilamida:(vista parcial)

Agarosa+poliacrilamida: porosidad intermedia.

Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl Sulphate) es un detergente aninico que seune a las protenas, desnaturalizndolas en una conformacin extendida recubierta de molculas de SDS.Como consecuencia, el tamao de la molcula de protena es directamente proporcional a su longitud enaminocidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre, que es tambinproporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad electrofortica de la protena depende exclusivamentede su masa molecular.



H-(CH2) -SO4

Modos de disposicin del soporte

Horizontal

En papel, para aminocidos u otras molculas pequeas,y en soportes similares (especialmente, acetato decelulosa), para protenas.

En gel de almidn o de agarosa, para protenas yespecialmente para cidos nucleicos. Casi siempre eltampn cubre el gel (para evitar que se seque debido alcalentamiento sufrido al pasar la corriente),denominndose por ello electroforesis submarina.

Soporte impregnado de disolucin tampn porcapilaridad, disuelve la muestra y mantiene el contactoelctrico.

Se aplica la muestra depositndola (pipeta o aplicador especfico) como una gota sobre el soporte (papel,acetato de celulosa) o dentro de un pocillo creado en el gel.

Vertical

Casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms resistente fsicamente, no se desliza), para protenas opara cidos nucleicos de pequeo tamao.

El gel puede rellenar tubos de vidrio (cada vez se usa menos) o estar contenido entre 2 placas rectangulares.

Contacto elctrico y disolvente gracias al tampn que embebe el gel y llena las cubetas o compartimentos delnodo y ctodo.

La muestra se deposita con micropipeta llenando un pocillo creado al polimerizar el gel.

En cuanto a la composicin del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel) yelectroforesis discontinua (2 tramos de gel de composicin ligeramente diferente).

Ejemplos de separacin electrofortica

Separacin de protenas por SDS-PAGE discontinua vertical

SDS-PAGE = SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia dedodecilsulfato sdico.

12



pocillos demuestra

gelacumulador

gelseparador

composicin del gel resolucin

conseguida:

tamao

de DNA (kb)

% de

acrilamida

% de

agarosa

20 0,006 - 0,10

15 0,025 - 0,15

12 0,04 - 0,2

8 0,06 - 0,4

5 0,08 - 0,5

3,5 1 - 2

2 0,1 - 2

1,5 0,2 - 3

1,2 0,4 - 6

0,9 0,5 - 7

0,7 0,8 - 10

0,6 1 - 20

0,3 5 - 60

Gel de poliacrilamida, en placa, vertical.

Separacin de acuerdo con la masa molecular (estrictamente, con la longitudde la cadena polipeptdica).

La muestra se trata con SDS (a mayor concentracin que en la composicin delgel) y se calienta brevemente a 90-100C, para provocar la desnaturalizacin.Se suele aadir tambin -mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro,separando as las subunidades de la protena y permitiendo que se extiendanpor efecto del SDS.

En la preparacin del gel se mezclan:

un tampn de pH (comnmente Tris-HCl)acrilamida y bisacrilamidaun agente iniciador de la polimerizacin, como el persulfato amnico(genera radicales libres)un agente catalizador de la polimerizacin, como el TEMED (N,N,N,N-tetrametiletilenodiamina)SDS

Permite obtener una estimacin de la masa molecular de las protenasseparadas. Para ello es preciso analizar en la misma electroforesis unasprotenas patrn, de tamao conocido, con las que se construye una curva decalibrado, representando movilidad frente a logaritmo de masa molecular.

Para controlar el avance del frente de electroforesis (posicin demxima movilidad) se aade a la muestra un colorante marcador(tracking dye), molcula cargada y de pequeo tamao queavanza ms que cualquier componente de la muestra; el ms habitual es el azul de bromofenol.

Para mejorar la resolucin (obteniendo bandas ms compactas) se suele emplear electroforesisdiscontinua:

En la parte superior, un gel acumulador o concentrador (stacking gel), que tiene como efectoconcentrar la muestra en una banda estrecha.Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel) en el que tiene lugar laseparacin de los componentes.

El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador combinada con unadiferente composicin de los tampones de cubeta (Tris-glicina) y de gel (Tris-HCl) y distinto pHpara ambos geles.

Nota: Tris es tris(hidroximetil)aminometano, una sustancia habitual para preparar disoluciones tampn depH prximo a 7.

Separacin de DNA en geles de agarosa, electroforesis horizontalsubmarina

Las molculas de DNA de las clulas son excesivamente grandes paraavanzar a travs de un gel de electroforesis normal, pero pueden analizarsesi previamente se han fragmentado de forma controlada. Se suelen empleargeles de agarosa (concentracin entre 0,3% y 2%), ms porosos que los depoliacrilamida. Las caractersticas mecnicas de estos geles hacenaconsejable la realizacin de la electroforesis en horizontal, habitualmentesubmarina. Las muestras se aplican en pocillos practicados dentro del gel.

Una de las formas ms comunes de fragmentar el DNA es el empleo deendonucleasas de restriccin, que cortan en secuencias dianacaractersticas.



Bromuro de etidio: Agenteintercalante, se introduce entre las

bases apiladas del DNA, abre un pocola doble hlice, provoca un

desenrollamiento local. Sufluorescencia (color naranja al iluminarcon UV) aumenta mucho cuando se

une al DNA: mtodo de tincin orevelado del DNA, especialmente usado en electroforesis y en

centrifugacin.

La carga elctrica de una molcula de DNA depende de sus grupos fosfato, y el nmero de stos es igual aldoble del nmero de pares de bases. La forma de todas las molculas de DNA es esencialmente la misma. Enconsecuencia, resulta que la movilidad en electroforesis depende exclusivamente de la longitud de la molcula(medida habitualmente como nmero de pares de bases, pb): la electroforesis separa los fragmentos deDNA de acuerdo con su longitud en pb. De forma similar al caso de protenas en SDS-PAGE, se suelenaplicar patrones en uno de los pocillos para hacer una curva de calibrado de tamaos.

El avance del frente de electroforesis se observa gracias a colorantes como azul de bromofenol y xilenocianol, aadidos a la muestra.

Cuando los fragmentos de cido nucleico analizados son de tamao muy pequeo se utilizan geles depoliacrilamida, o de mezclas de agarosa y poliacrilamida cuando el tamao es intermedio.

Revelado o deteccin

Tincin de protenas y de cidos nucleicos

Se pueden emplear sustancias coloreadas ofluorescentes que se unan a las protenas o loscidos nucleicos.

En el primer caso suelen ser colorantesorgnicos que interaccionan con las protenas deforma poco selectiva, principalmenteelectrosttica. Ejemplos: azul brillante deCoomassie, negro amido, rojo Ponceau.

Para los cidos nucleicos se usa el azul de metileno o, ms frecuentemente, compuestos fluorescentes eintercalantes, como el bromuro de etidio (vase figura). Un compuesto intercalante es aqul que se introduceentre los pares de bases apilados del DNA.

Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolucin del colorante y se espera a queaqul se impregne y as el colorante se una a las molculas separadas en el gel. Tras lavar el gel paraeliminar el exceso de tincin no unida especficamente, se observa, fotografa o cuantifica mediantedensitometra.

deteccin por tincin con un agente fluorescente yobservacin bajo luz ultravioleta

deteccin por autorradiografa



Ensayo enzimtico

Si entre las molculas separadas hay una enzima, se puede detectar aadiendo sus sustratos (naturales osintticos) y sus cofactores, y detectando la aparicin del producto, generalmente coloreado.

Autorradiografa

Tanto protenas como cidos nucleicos pueden marcarse isotpicamente previamente a la electroforesis, encuyo caso la deteccin se hace mediante autorradiografa del gel (vase figura).

Inmunoensayo (Western)

En caso de disponer de ellos, los anticuerpos permiten la deteccin selectiva del componente de inters(protena o grupo marcador unido qumicamente a la protena o al cido nucleico antes de la electroforesis).La permeabilidad de los geles para el acceso del anticuerpo es limitada, por lo que se hace una transferenciade las molculas separadas en el gel hacia una membrana de nitrocelulosa o de nailon, la cual se someteluego a la disolucin que contiene el anticuerpo. Los detalles de esta tcnica de inmunotransferencia oensayo Western blot se tratarn en un tema posterior.

Deteccin de cidos nucleicos con sondas (Southern y Northern)

Las molculas con una secuencia determinada de nucletidos se pueden detectar mediante hibridacin consondas especficas, pequeas molculas de cido nucleico monocatenario (oligonucletidos) con la secuenciacomplementaria a la buscada y marcadas con un istopo radiactivo, un grupo fluorescente, etc. Para llevar acabo con xito la hibridacin se requiere tambin la transferencia desde el gel a una membrana denitrocelulosa o nailon. Los detalles de estos ensayos (Southern blot para DNA y Northern blot para RNA) seestudian en un tema posterior.

Tcnicas especiales

Isoelectroenfoque

(Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata de una variante deelectroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto seconsigue incluyendo en su preparacin molculas ionizables con valores de pK diferentes. Como consecuencia,al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH diferente, yeventualmente alcanzan una regin en la cual el pH es igual al punto isoelctrico de la molcula muestra y,en consecuencia, sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separacin de loscomponentes de la muestra de acuerdo con su punto isoelctrico, que adems se puede medir, pues seconoce el gradiente de pH del gel.

Electroforesis bidimensional

Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra de diferente mecanismo en direccinperpendicular. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilndrico estrecho que luego secoloca como muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen as mapas complejos de bandas, muy caractersticos decada muestra, cuya utilidad principal es la comparacin con el obtenido de otra muestra similar pero conocida.



Electroforesis de campo pulsante

Las molculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb no se pueden resolver (separar)empleando la electroforesis convencional en gel de agarosa. Esto se debe, en primer lugar, a la dificultad demanejo de los geles preparados con las bajas concentraciones de agarosa que requeriran (inferior al 0,4%).Adems, las molculas de DNA, que adoptan una conformacin ms o menos globular, poseen un tamaoexcesivamente grande para atravesar los poros del gel y no se separan en funcin de su tamao. Parasolventar este problema se ha ideado una modificacin de la tcnica, conocida como electroforesis de campopulsante (o pulsado, pulsed-field gel electrophoresis , PFGE). Se emplean geles de agarosa al 1%, pero sealtera peridicamente la orientacin del campo elctrico aplicado, activando alternativamente dos pares deelectrodos. El frecuente cambio de direccin del campo elctrico consigue que las molculas se desplieguen yavancen a travs de los poros en conformacin extendida. A mayor tamao, se reorientan con ms dificultad,por lo que avanzan ms despacio.

As se consigue separar fragmentos de DNA de hasta varias megabases, lo que supone unavance significativo pero an no sirve para estudiar los cromosomas humanos enteros (de 50a 250 Mb cada uno). S se han podido analizar as los cromosomas de levadura (figuraderecha).

Las muestras han de contener el DNA sin fragmentar, por lo se requiere una preparacinespecial (al purificar el DNA por los mtodos habituales se fragmenta por debajo de 100 kb).Para obtener preparaciones con los cromosomas intactos se mezclan las clulas con agarosacaliente (37C) y se vierte en pequeos moldes de unos milmetros, de forma que alsolidificarse la agarosa (4C) forma bloques (insertos) que incluyen las clulas intactas. Enstos se realiza la lisis celular y la digestin de las protenas (p.ej., con EDTA, SDS yproteinasa K, que difunden a travs de los poros del gel) sin que se alteren las grandesmolculas de DNA. Tras una dilisis para eliminar los restos de la digestin, se consigue unbloque de agarosa con el DNA intacto en su interior, y se deposita el bloque entero en unpocillo del gel de electroforesis.

Electroforesis preparativa

Se han desarrollado variantes preparativas, es decir, que permiten la obtencin de cantidadessignificativas de los componentes de la muestra por separado. No se detallarn aqu (vase Freifelder 1991,pp.256-7)

Inmunoelectroforesis

Combina una separacin electrofortica con una deteccin por inmunodifusin.

Aplicaciones



Determinacin de la masa molecular

Como se ha indicado, se puede obtener una estimacin de la masa molecular (en kDa) de protenasempleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando electroforesis en agarosa. En ambos casos,en uno de los pocillos del gel se carga una mezcla de molculas patrn de tamao conocido, con el fin depoder trazar la curva de calibrado. Para las protenas, la validez del dato obtenido depende de que ladesnaturalizacin con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las subunidades gracias a lareduccin con mercaptoetanol; adems, la presencia de oligosacridos en las glicoprotenas altera lamovilidad, que ya no proporciona valores de masa molecular fiables.

Se aplica en uno de los pocillos del gel unamezcla de fragmentos de DNA de tamaoconocido, denominados patrones,marcadores de masa molecular o

escalera de DNA (DNA ladder). Tras suseparacin en la electroforesis, se revelan yse representa para todas las bandas lamovilidad (distancia avanzada o, mejor,cociente entre sta y el avance del frente

de electroforesis) frente al logaritmo deltamao (longitud en pb). Sobre la rectaajustada se interpolan las distancias deavance de las muestras problema,calculando as su tamao en pb.

En este ejemplo, los patrones empleadosson fragmentos bien conocidos, aquellosobtenidos a partir del DNA del virus porla accin de las endonucleasas derestriccin EcoRI e HindIII.

Determinacin del punto isoelctrico

Como se ha indicado, mediante isoelectroenfoque se obtiene una medida del punto isoelctrico de lasprotenas (pHI o pI).

Isoenzimas

Las variantes de una enzima, con pequeas diferencias en su estructura y en su actividad enzimtica, seanalizan rutinariamente mediante electroforesis o, en especial, mediante isoelectroenfoque. De hecho, losnombres de las isoenzimas derivan a veces de su movilidad electrofortica. Se puede aplicar anlogamente alas isoformas de protenas no enzimticas.

Mapas de restriccin

Una de las formas de estudiar la secuencia de los cidos nucleicos, en especial el DNA, consiste en tratarlocon distintas enzimas de restriccin, analizar mediante electroforesis en gel de agarosa los fragmentosresultantes e intentar reconstruir la secuencia de la molcula original formando su mapa de restriccin, unode los tipos de mapa fsico.

Secuenciacin de cidos nucleicos

La obtencin de la secuencia completa, nucletido a nucletido, tambin depende del anlisis electroforticode fragmentos de DNA, tanto en el mtodo qumico de Maxam y Gilbert como en el mtodo enzimtico deSanger. Se utilizan en este caso geles de poliacrilamida, debido al tamao pequeo de los fragmentos,pudindose resolver fragmentos que se diferencian en un solo nucletido.

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