UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA

BIOLOGÍA

METODOLOGÍA CIENTÍFICA II

“Cuantificación de la proteína BADH purificada y evaluación del

rendimiento del método de purificación.  Determinacion de la pureza y del peso molecular de la BADH utilizando Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS

(SDS-page)”.

Grupo: 2207

                                                                              Integrantes:

Aparicio Moreno Cesar EduardoCastañeda Martinez Vanessa Citlalli

Facio Martinez Omar IvanMartínez Méndez Georgina

Perez Cortes Florencia FernandaSanchez Onofre Diana Laura

INTRODUCCION

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. sensibilidades. Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas e inconvenientes

Métodos Derivados Colorimétricos:

Biuret:Bastante específico para proteínas Muestra pocas interferencias Es barato Tiene poca sensibilidad

Lowry: Tiene bastante sensibilidad No todas las proteínas reaccionan igual Muestra muchas interferencias como detergentes no iónicos, sulfato amónico etc.

Bradford:Muy sensible Muestra interferencias con detergentes BCA Es el método mas sensible Es el que muestra menos interferencias (1)

Por lo cual tomando en estas caracteristicas se decidio tomar el metodo de colorimetrico de Bradfor que se basa  en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.(2)

El espectrofotómetro es un instrumento ampliamente utilizado en el análisis cualitativo y cuantitativo de moléculas biológicas. Esto quiere decir que este instrumento nos ayuda a determinar cuáles sustancias (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, entre otras), están presentes en una disolución y en qué cantidad. Los espectrofotómetros pueden emitir radiaciones de diferentes longitudes de onda tanto en el ultravioleta como en el visible. Muchas sustancias absorben radiación a diferente longitud de onda (puede ser en el espectro visible o en el ultravioleta), por tanto, cuando determinamos a qué longitud de onda absorbe una sustancia desconocida, podemos tener idea de qué tipo de molécula se trata. Esta misma propiedad se utiliza para cuantificar la sustancia: a mayor cantidad de radiación absorbida, mayor concentración de ésta. Si la sustancia no absorbe radiación en el ultravioleta o el visible, puede modificarse químicamente

para producir un compuesto que sí absorba en estas longitudes de onda. A este tipo de mediciones se les conoce como indirectas.(3)

La electroforesis es una herramienta de separación de biomoléculas, que en los últimos años ha tenido gran importancia en medicina; presenta la versatilidad de poder separar aminoácidos, ácidos orgánicos, iones inorgánicos, carbohidratos, esteroides, tioles, contaminantes alimenticios, material genético y algunos fármacos importantes en el estudio de diferentes ramas en el área de la salud (diagnósticos molecular y de laboratorio clínico (García-canas V, Cifuentes A., 2007)

La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. (Padilla-Peña C., et al, 2003)

OBJETIVOS Cuantificar la proteína presente en la fracciones Exp y ENZ. Calcular el

rendimiento del proceso de purificación utilizado en la unidad experimental I.

Calcular el coeficiente de absorción molar de la BADH, presuntamente pura en la fracción ENZ.

Determinar la pureza de la BADH obtenida en la actividad experimental I,por medio de electroforesis desnaturalizante.

Conocer el peso molecular de esta enzima a través del mismo método electroforético (SDS-PAGE).

METODOLOGÍA

Actividad de la enzima BADH

Para realizar el ensayo de la actividad de la enzima BADH en el extracto celular (ExP) y ENZ, se preincubaron las cubetas con medio de reacción (MR) por 10 min a una temperatura de 30 °C. Posteriormente se calibró el espectrofotómetro a cero colocando dos cubetas en los compartimentos de referencia y muestra, midiendo durante 1 min la absorbancia a una λ=340 nm para asegurarnos que no existe actividad reductora de la coenzima NADP+.Utilizamos la otra cubeta en incubación para medir la actividad enzimática en el extracto celular (ExP). Para ello, se agregaron 1 µL del extracto al medio de reacción, agitando rápidamente y midiendo de inmediato el cambio de absorbancia

durante 1 min. La cubeta restante se utilizó para medir de la misma forma la actividad de ENZ. *El cambio de absorbancia/min se registró.

Cuantificación de proteína por el método de Bradford.

Se descongelaron las muestras ExP y ENZ obtenidas en la práctica I. Posteriormente se preparó una curva patrón constituida por 12 tubos (de acuerdo al siguiente cuadro), en donde a los tubos 11 y 12 les fueron añadidas respectivamente las muestras ExP y ENZ.La curva se realizó en el orden en que se muestra la tabla:

Tras adicionar el reactivo de Bradford, se agitaron los tubos, dejando reposar 10 min a temperatura ambiente. Más tarde fueron llevados a una lectura en el espectrofotómetro a una λ de 595 nm. Realizando el registro de datos en la tabla anexada a la práctica, en donde se registraron la cantidad de BSA (µg) y la lectura.

Al obtener los datos fueron graficados en el papel milimétrico proporcionado en la práctica. Con ayuda de una calculadora se ajustaron los datos por mínimos cuadrados. Al mismo tiempo se obtuvo el valor del coeficiente de correlación (r) de los datos, e interpolaron las absorbancias de las muestras problema y calculó la concentración de proteína de cada una de ellas. Tras ellos de calculó la cantidad de proteína por mL de muestra.

Cálculo teórico del coeficiente de absorción molar de la BADH

Considerando en los cálculos que la proteína activa es un tetrámero se calculó el coeficiente de extinción de la BADH utilizando la siguiente ecuación:

εde una proteína = (nTrp x εTrp) + (nTyr x εTyr) + (nCys-Cys x εCys-Cys)

Dónde:

ε de Trp, Tyr y Cys-Cys son 5500, 1490 y 125 respectivamente, a 280 nm y se expresa en M-1 cm-1 (2, 7).

Obteniendo ε de la BADH.

ElectroforesisSe ensamblo en módulo de electroforesis retirando el peine del gel y enjuagando las pozas con agua desti lada, se colocó el cassette del gel en el bastidor de sujeción una vez hecho esto se agregó el amortiguador. Posteriormente se prepararon las muestras y se mezclaron en tubos eppendorf de 5 ml los volúmenes que se obtuvieron en la quinta columna del cuadro; después de esto se aplicó la muestra sobre el gen aplicando con cuidado las muestras estándares y de PM desde el carri l 2 hasta el 4 uti l izando una micro pipeta. Posteriormente se colocaron los geles en el interior del tanque, se tapó la cámara y se colocaron los electrodos de acuerdo a su color, se conectaron los cables y se inició la corrida aplicando 200 V de manera constante.

Una vez terminada la corrida se apagó la fuente de poder y se desconectaron los cables, se retiró la tapa y se recuperó el amortiguador, se retiró del bastidor de sujeción el cassette con el gel y se separó con cuidado las dos placas de vidrio, se despegue el gel desde la placa de vidrio a la que está adherido.

Se retiró el agua del recipiente y se f i jaron las proteínas cubriendo el gel durante 15 min con Solución fi jadora. Se midió la distancia recorrida por las proteínas estándares y la enzima purif icada; después se graficó el log del peso molecular de las proteínas estándares, que se proporcionaron en el cuadro, versus su distancia de migración; posteriormente se calculó el PM de la proteína purif icada interpolando su migración relativa en la línea patrón obtenida con los estándares.

Resultados y análisis

Concentración µ Absorbancia

0 0

5 0.078

10 0.132

20 0.147

40 0.182

60 0.306

80 0.312

120 0.528

160 0.639

200 0.649

(Exp)154.87 0.576

(ENZ) 66.15 0.285

tabla 1.- Resultados obtenidos de la curva patrón en términos de concentración (µg)/absorbancia.En el caso de Exp y ENZ se hicieron los cálculos correspondientes para interpolar la concentración basándonos en la absorbancia obtenida.

Gráfico 1.- Resultados obtenidos y la recta de la ecuación de predicción.

Stoscheck (1990) mencionó que el criterio para seleccionar un método de cuantificación  de proteínas está basado usualmente en la conveniencia, el rango de sensibilidad, la cantidad de muestra necesaria para hacer las pruebas y los detalles del procedimiento. En nuestro caso empleamos el método colorimétrico de Bradford por ser sensible, rápido y económico, con cuya reacción colorida resulta bastante estable. Dada la cantidad de proteína en una muestra que nos fue proporcionada aleatoriamente, dicha cantidad resultó proporcional a la cantidad de colorante y ajustable en rango, empleando albúmina como referencia.

Cálculo teórico del coeficiente de absorción molar de la BADH

e de la BADH= 214440.

Cuantificación de la BADH por su absorbancia a 280nmc= A/ eLc=   226 mg/ml

Azañero M., et al, en 2000 lleva a cabo una pureza de la enzima proteolítica obtenida luego de los dos pasos cromatográficos determinada en condiciones reductoras y no reductoras, encontrando en ambos casos una sola banda homogénea de proteína. Sus resultados indicaron que la diferencia encontrada en el peso molecular se debía a que la enzima tiene por lo menos un enlace disulfuro intracatenaria, de modo que cuando el enlace no es reducido, la proteína no es plegada por completo y por tanto, su movilidad se ve incrementada en considerable medida.

En el caso de la actividad enzimática obtenida por el equipo, esta fue casi nula, esperando un registro mucho mayor, y en dicho caso se comparó el contenido de Trp y Tyr.

En relación a la comparación de diferentes métodos (Cerna E., et al) opta que el mejor es el método de Brogdon, debido a que registró lecturas más altas de proteína en las muestras en un estudio que abarca Evaluación de métodos de cuantificación de proteínas en Tetranychus urticae para su uso potencial en la detección de resistencia a plaguicidas.

Electroforesis

Imagen 1 y 2.- Resultados de la electroforesis, se observa a la izquierda marcador de pesos moleculares. Las pequeñas líneas indican a la proteína purificada.

La electroforesis es un método analítico. Su ventaja es que las proteínas pueden visualizarse además de separarse, lo que permite al investigador hacer una

estimación rápida del numero de proteínas de una mezcla o del grado de pureza de una preparación proteíca determinada. La electroforesis también permite la determinación de propiedades cruciales de una proteína tales como su punto isoelectrico y su masa molecular aproximada(Lehninger,2009).

Despues de analizar los resultados, se observa un bandeo muy tenue aparte de la proteína analizada, por lo que se dice que esta no esta 100% purificada.

Con base al marcador de peso molecular, se ve que estaría entre 50 y 75 Kda.

El gel de poliacrilamida actua como tamiz molecular. Despues de la electroforesis se utilizo el colorante azul de Coomasie, que se fija a las proteínas pero al gel no.

Conclusión La cuantificación de la BADH por medio del método de Bradford y por la absorbancia de la BADH a 280 nm dieron resultados distintos, siendo 154.87 mg/ml y 226 mg/ml respectivamente, esto debido a que la reacción del reactivo de Bradford reacciona directamente con aminoácidos específicos y las estructuras terciarias de la proteína a 595 nm , a diferencia del método por absorbancia a 280nm, cuya lectura se da por medio de las tirosinas y los triptófanos. Se determino que la pureza fue casi del 100% y el peso molecular fue de 50 y 75 Kda.

Cuestionario

1. ¿Por qué cuando se cuantifica la proteína con el reactivo de Bradford se debe medir la absorbancia a 595 nm?R= La unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 nm.

2. Describa lo que es el coeficiente de absorción molar de una molécula y la relación que existe entre éste y el contenido de Trp y Tyr de la proteína que aquí se purifica.

R= El coeficiente de absorción molar es una medida de la fuerza con un tipo de especie química que  absorbe luz a una longitud de onda determinada; cabe mencionar que ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas absorbe luz en la zona del espectro visible, tres de ellos la tirosina, el triptófano y la fenilalanina, absorben luz en el espectro significativamente.

3. Explique por qué para el cálculo del coeficiente de absorción molar de esta proteína se le  pide que considere que la molécula es un tetrámero.

R= Que al calcular la absorción molar, como se da el número de los aminoácidos esto se debe multiplicar por 4 ya que la proteína es un tetrámero.

4. ¿Podría determinar la concentración de proteínas que tiene un extracto celular midiendo su absorbancia en una longitud de onda de 280 nm? Fundamente su respuesta. R= Sí, ya que la longitud de onda correspondiente a un pico de absorción máxima es de 280 nm en aminoácidos aromáticos como los presentes en BADH los cuales son Trp y Tyr.

5. En esta práctica la proteína de la muestra ENZ se cuantifica de dos maneras: a través del método de Bradford y midiendo su absorbancia a 280 nm. ¿Cuál de estos métodos podría ser más exacto y por qué?  

R= Es más el método de Bradford  ya que es un método rápido y una ventaja que tiene es que  el complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción lo cual es imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medición de proteínas.

6. Refiriéndonos a la tabla de purificación de esta práctica, ¿por qué el valor de la actividad específica se incrementa conforme se avanza en el proceso de purificación?  

R= Porque al ir purificando la proteína está cada vez queda menos disuelta en el medio en el que se encontraba por lo tanto se va haciendo más pura y tendrá una mayor actividad.7. Suponiendo que durante este proceso encontrara una disminución en la

Actividad específica, ¿cuáles podrían ser las razones de estos resultados?

R= Que no se hizo bien la purificación y por lo tanto la proteína seguiría  disuelta en el medio en el que se encontraba sin mostrar actividad.

  1. Explique el principio de la determinación de la masa molecular de una proteína a través de la utilización de electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). Haga

hincapié en la forma en que actúa el SDS y en el fenómeno de tamiz molecular.

 La técnica permite separar moléculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de un campo eléctrico. En la electroforesis  desnaturalizante (SDS-PAGE) como su nombre lo dice utilizan agentes desnaturalizantes de proteínas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS), caótropos (p.e. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). En la SDS-PAGE, la separación es función del tamaño (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las proteínas. Para ello se compara la movilidad   electroforética   (Rf)   de   la   proteína   de   peso  molecular   desconocido   con   el   de   proteínas   de referencia de peso molecular conocido. (Hames BD y Ricwood D 2002)

2. Suponga que Ud. ha aislado una proteína “X” utilizando las cromatografías de

intercambio iónico y de exclusión molecular, y este último análisis indica que el

peso molecular de la proteína es de 205 KDa. Un estudio posterior de la proteína

utilizando SDS-PAGE, en ausencia de mercaptoetanol, revela dos bandas con un

peso molecular de 135 y 70 KDa; sin embargo, en presencia del reductor los geles

de la SDS-PAGE muestran 1 banda de 70 KDa y otra de 45 KDa.

3. Describa a partir de estos datos el número de subunidades que componen a la

proteína “X”, el peso molecular de cada una de ellas, la estequiometría de las

subunidades y el tipo de interacciones covalentes que las mantienen juntas.

A partir de las unidades que interfieren entre las primera banda  y la segunda es su residuo de 70KDa que es parcialmente el mismo en ambas bandas, las subunidades que se revelan son de uno 

de 70 KDa y  tres de 45 KDa. Es un tetrámero.

  Bibliografia   (1)Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.    (2)lson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 7685. Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley & Sons, New York  (3) Genética General. Manual de prácticas de laboratorio. Regulación genética en el operónlac. Facultad de Química, UNAM. Ciudad Universitaria. México, 2002  Lehninger, A., Nelson, D., Cox, M., Principios de bioquimica.Quinta edicion. Editorial Omega. España. Pp. 88-89-

Klug SW, Cummings RM. Conceptos de genética. Ed. Prentice Hall. Madrid 1999. Pp. 5171. Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp. 115-125. Localización QH581.2 M 65   Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Reverté, pp.868-873.